Gräfe, Michael: Die Bedeutung entzündlicher Reaktionen für die Pathogenese der Arteriosklerose - Untersuchungen an einem in vitro Modell menschlicher kardialer Endothelzellen

Kapitel 5. Charakterisierung der L-Selectin abhängigen Adhäsion an kardialen mikrovaskulären Endothelzellen

5.1 Einleitung

Leukozytenadhäsion und Emigration in das umliegende Gewebe wird bei allen Entzündungsreaktionen beobachtet, zum Beispiel im Rahmen akuter bakterieller oder viraler Entzündungen ( 190 , 221 ), bei der Arteriosklerose ( 200 ) und bei Transplantatabstoßungsreaktionen ( 31 ). L-Selectin ist ein Adhäsionsmolekül, das auf Leukozyten exprimiert wird und sowohl bei der Lymphozyten-Rezirkulation als auch bei akuten und chronischen Entzündungsreaktionen für die Adhäsion von Leukozyten von Bedeutung ist ( 163 , 207 , 234 , 242 ). L-Selectin wird von fast allen Leukozyten und ihren Vorläuferzellen im Knochenmark exprimiert ( 36 , 233 ).

Auf hochendothelialen Venolen des Lymphgewebes wurden mehrere L-Selectin Liganden identifiziert, u.a. GlyCAM-1 ( 257 ), CD34 ( 16 ), MadCAM-1 ( 229 ) und ein Podocalyxin ähnliches Protein ( 208 ). Diese Liganden sind stark glykosilierte Proteine, die Ähnlichkeit mit Mucinen haben und die sowohl in vivo als auch in vitro als L-Selectin Liganden fungieren ( 158 ). Gemeinsam ist diesen Liganden, daß sie alle das MECA79 Epitop exprimieren und ihre Aktivität als Ligand durch Behandlung mit Neuraminidase verloren geht. Weiterhin sind posttranslationale Sulfatierungsreaktionen für ihre Aktivität notwendig, da eine Hemmung dieser Sulfatierungsreaktionen durch Perchlorat mit einem Aktivitätsverlust als L-Selectin Liganden einhergeht ( 112 ).

Neben der L-Selectin Abhängigkeit der Lymphozytenrezirkulation im Lymphgewebe ist L-Selectin-abhängiges Rollen und Adhäsion von Leukozyten auch an vaskulären Endothelzellen mehrfach beschrieben worden ( 143 , 144 , 149 , 240 , 250 ). Während die Bedeutung des L-Selectins für die Leukozytenrekrutierung in Tiermodellen gut etabliert ist, ist die Bedeutung


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der L-Selectin abhängigen Adhäsion im menschlichen Körper und bei der Pathogenese der Arteriosklerose bisher nicht bekannt. Erschwerend für die Beurteilung kommt hinzu, daß ein GlyCAM-1 homologes Molekül im humanen System bisher nicht identifiziert werden konnte. Im Gegensatz zu den Liganden in HEV ist es bisher nicht gelungen, endotheliale Liganden außerhalb der HEV zu isolieren und zu klonieren. Es gibt jedoch Hinweise, daß Proteoglykane ( 79 , 176 ) und/ oder Glykolipide ( 6 ) bei der L-Selectin abhängigen Adhäsion an vaskulärem Endothel eine Rolle spielen.

In ersten Untersuchungen konnte von uns L-Selectin abhängige Adhäsion an kardialen mikrovaskulären Endothelzellen beobachtet werden ( 269 ). Die Adhäsion von L-Selectin positiven NALM6-L Zellen war bei nicht stimulierten mikrovaskulären Endothelzellen nicht nachweisbar und trat erst nach Stimulation der Endothelzellen mit dem proinflammatorischen Zytokin TNFalpha auf. Ähnlich wie bei den bekannten Liganden auf HEV konnte durch Hemmung von Sulfatierungsreaktionen die Adhäsion gehemmt werden. Im Gegensatz zu Liganden auf HEV war die Aktivität des Liganden jedoch mit Neuraminidase nicht zu beeinflussen.

Die hier durchgeführten Untersuchungen sollten den putativen Liganden auf mikrovaskulären kardialen Endothelzellen weiter charakterisieren und insbesondere die Frage beantworten, in welche Substanzgruppe der Ligand eingeordnet werden kann und die Glykanstrukturen, die für die Funktion des Liganden notwendig sind, charakterisieren.


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5.2 Ergebnisse

5.2.1 Adhäsion von NALM6-L Zellen nach Stimulation mit TNFalpha

L-Selectin transfizierte NALM6-L Zellen adhärierten nach Stimulation mikrovaskulärer Endothelzellen mit TNFalpha an diesen Zellen besser als an nicht stimulierten. Ähnlich wie bei Verwendung von HL60 Zellen (siehe Seite 70#LINKCONTENT#70#/LINKCONTENT#) adhärierten in den Bereichen hoher Wandschubspannung an unstimulierten mikrovaskulären Endothelzellen keine oder nur vereinzelt NALM6-L Zellen (bei 2.0 dyn/cm2, 0.2 ± 0.09 (Mittelwert ± SEM) NALM6-L Zellen/Gesichtsfeld), in den Bereichen niedriger Wandschubspannung adhärierten regelmäßig einige Zellen (38 ± 7 Zellen/Gesichtsfeld). Nach Stimulation mit TNFalpha über 5 Stunden kam es zu einer starken Zunahme der Adhäsion: bei einer Wandschubspannung von 2.0 dyn/cm2 adhärierten 9 ± 1, bei 0.9 dyn/cm2 167 ± 10 Zellen/Gesichtsfeld (p < 0.01 gegen unstimulierte Kontrollen, Abbildung 5.1).

Um den L-Selectin abhängigen Anteil der Adhäsion zu überprüfen, erfolgte ein Vergleich mit L-Selectin negativen NALM6 Zellen. Dabei zeigte sich, daß in Bereichen hoher Wandschubspannung NALM6-L deutlich besser als NALM6 Zellen adhärierten. Bei 2 dyn/cm2 betrug die Zahl der adhärierten NALM6 nur 2,5 ± 0.8 Zellen, dies entspricht 29% der Adhäsion von NALM6-L Zellen und stieg bei 0,9 dyn/cm2 auf 49+7% der Positivkontrolle. Dies zeigt, daß in den Bereichen hoher Wandschubspannung der Anteil der L-Selectin abhängigen Adhäsion am größten ist und bei niedriger Wandschubspannung an Bedeutung verliert (Abbildung 5.1).

Um die L-Selectin Abhängigkeit der Adhäsion weiter zu verifizieren, wurden Inhibitionsexperimente mit einem adhäsionshemmenden Anti-L-Selectin Antikörper, LAM 1-3, und einer L-Selectin IgG Chimäre durchgeführt. Nach Zugabe der Chimäre und des Anti-L-Selectin Antikörpers wurde die Adhäsion der NALM6-L Zellen an TNFalpha stimuliertem Endothel fast auf Kontrollwerte reduziert. Damit konnte bestätigt werden, daß nach


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Stimulation mit TNFalpha L-Selectin abhängige Adhäsion an mikrovaskulären Endothelzellen induziert werden kann (Abbildung 5.2).

Interessanterweise konnte eine ähnlich starke L-Selectin abhängige Adhäsion an makrovaskulären koronaren Endothelzellen nicht beobachtet werden. Nach Stimulation mit TNFalpha unterschied sich die Adhäsion L-Selectin positiver NALM6-L und negativer NALM6 Zellen nicht signifikant voneinander. Es kann daraus geschlossen werden, daß L-Selectin abhängige Adhäsion vor allem in Gefäßen der Mikrozirkulation eine Rolle spielt.

Abbildung 5.1: L-Selectin abhängige Adhäsion an mikrovaskulären Endothelzellen. Die Adhäsion von L-Selectin positiven NALM Zellen (NALM6-L, gefüllte Kreise) nach Stimulation der mikrovaskulären Endothelzellen mit TNFalpha über 5 Stunden wurde als Positivkontrolle verwendet und mit der Adhäsion L-Selectin negativer NALM Zellen an TNFalpha stimulierte Endothelzellen (NALM6, geschlossene Vierecke) und NALM6-L an nicht stimulierte Endothelzellen (offene Kreise) verglichen (n= 12)


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Abbildung 5.2: Effekte des Anti-L-Selectin Antikörpers LAM 1-3 und der L-Selectin IgG Chimäre auf die Adhäsion von NALM6-L Zellen an TNFalpha stimulierte mikrovaskuläre kardiale Endothelzellen (n = 3, * = p<0.05).


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5.2.2 Adhäsion von NALM6-L Zellen nach Stimulation mit CD40 Ligand

Da Stimulation von Endothelzellen durch den CD40 Rezeptor in Bezug auf die Expression von Adhäsionsmolekülen und E-Selectin abhängige Adhäsion von HL60 Zellen ähnliche Wirkungen induzierte wie Stimulation des TNFalpha Rezeptors, sollte untersucht werden, ob auch die L-Selectin abhängige Adhäsion der NALM6-L Zellen durch CD40 Stimulation induziert werden kann. Dazu wurden mikrovaskuläre Endothelzellen mit CD154 positiven, P3x.TBA7 Zellen inkubiert und anschließend die Adhäsion der NALM6-L Zellen unter Flußbedingungen geprüft. Stimulation mit TNFalpha diente wiederum als Positivkontrolle und die Adhäsion der L-Selectin negativen NALM6 Zellen der Kontrolle der L-Selectin Abhängigkeit.

Es zeigte sich, daß nach CD40 Stimulation NALM6 und NALM6-L Zellen besser als an unstimulierten MEC adhärierten, daß jedoch kein Unterschied zwischen L-Selectin positiven und negativen NALM6 Zellen bestand. Es muss daraus geschlossen werden, daß anders als TNFalpha, CD154 keine Liganden, die L-Selectin abhängige Adhäsion vermitteln können, induziert (Abbildung 5.3).

5.2.3 Untersuchungen zur Wirkung von Neuraminidase

Ein wesentliches Charakteristikum der L-Selectin Liganden (CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1) auf hochendothelialen Venolen sind sialinsäurehaltige Zuckergruppen. Abspaltung der sialinsäurehaltigen Zuckergruppen führte zu einem Funktionsverlust der Liganden, die daraufhin nicht mehr L-selectin binden konnten. Es sollte daher untersucht werden, ob L-Selectin abhängige Adhäsion an mikrovaskulären Endothelzellen ebenfalls von der Anwesenheit sialinsäureahaltiger Zuckergruppen abhängig ist. Sialinsäurehaltige Zuckergruppen können durch Behandlung mit dem Enzym Neuraminidase abgespalten werden. Als Positivkontrolle dienten HL60 Zellen, die ebenfalls sialinsäurehaltige Liganden für P- und E-Selectin


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exprimieren ( 142 , 146 ).

Behandlung von HL60 Zellen mit Neuraminidase reduzierte die Adhäsion an TNFalpha stimulierte MEC auf 32% (Abbildung 5.4). Bei einer Wandschubspannung > 2 dyn/cm2 adhärierten 41 ± 6 HL-60 Zellen an dem mit TNFalpha stimulierten Endothel gegenüber 13 ± 3 (p=0,0019) neuraminidasebehandelten HL-60 Zellen. Die Adhäsion von HL-60 Zellen an unstimulierte Endothelzellen betrug 6 ± 8 Zellen.

Abbildung 5.3: L-Selectin abhängige Adhäsion von NALM6-L Zellen bei 2 dyn/cm2 nach Stimulation des CD40 Rezeptors. Mikrovaskuläre Endothelzellen wurden mit CD154 positiven P3x.TBA7 Zellen für 5 Stunden stimuliert. Als Positivkontrolle wurden Endothelzellen mit 500 U/ml TNFalpha stimuliert. L-Selectin negative NALM6 Zellen dienten als Negativkontrolle (n = 5)


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Abbildung 5.4: Wirkung von Neuraminidase auf L-Selectin abhängige Adhäsion von NALM6-L Zellen und E-Selectin abhängiger Adhäsion von HL60 Zellen an mikrovaskuläre kardiale Endothelzellen (n = 3)

Im Gegensatz dazu beeinflußte Neuraminidasebehandlung von mikrovaskulären Endothelzellen die L-Selectin abhängige Adhäsion nicht: NALM6-L Zellen adhärierten an behandelten und unbehandelten mikrovaskulären Endothelzellen vergleichbar gut. Die Adhäsion von NALM6-L Zellen betrug 0,7 ± 0,8 Zellen an unstimulierten, gegenüber 24 ± 5 Zellen an mit TNFalpha stimulierten mikrovaskulären Endothelzellen bei Wandschubspannungen > 2,0 dyn/cm2. Bei Zugabe von Neuraminidase adhärierten 22 ± 8 Zellen an TNFalpha stimulierte mikrovaskuläre Endothelzellen (Abbildung 5.4).


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5.2.4 Untersuchungen zur Wirkung von O-Sialoglykoprotein-Endopeptidase und Tunicamycin

Zuckergruppen von Glykoproteinen können prinzipiell über eine O- oder N-glykosidische Bindung an den Proteinanteil gebunden sein. Da auch der auf mikrovaskulären Endothelzellen nach Stimulation mit TNFalpha exprimierte L-Selectin Ligand vermutlich ein Glykoprotein ist, das mit seinen Zuckergruppen mit der Lectindomäne des L-Selectins interagiert, wurde in den folgenden Versuchen die Beteiligung von O- und N-glykosidisch gebundenen Zuckergruppen an der L-Selectin abhängigen Adhäsion untersucht. Tunicamycin hemmt die Bildung N-glykosidischer Zuckerseitenketten ( 53 ). Es wurde in einer Konzentration von 10 µg/ml 30 Minuten vor Stimulation mit TNF alpha zu den mikrovaskulären Endothelzellen gegeben.

O-Siaologlykoprotein-Endopeptidase (OSGP) ist eine Metalloproteinase (EC 3.4.24.57), die Proteine mit O-glykosidisch gebundenen sialinsäurehaltigen Oligosacchariden ( 1 ), meist mucinartige Moleküle wie PSGL-1, der Ligand des P-Selectins ( 177 , 225 ), spaltet. Es wurden bei dieser Versuchsserie wiederum Untersuchungen mit HL60 Zellen durchgeführt, da bereits gezeigt wurde, daß OSGP Liganden für P-Selectin inaktiviert ( 225 ) und Versuche mit HL60 Zellen als Positivkontrolle für die Wirksamkeit des Enzyms gelten konnten. O-Sialoglykoprotein Endopeptidase wurde in einer Konzentration 80 µg/ml verwendet.

Die Adhäsion von HL-60 Zellen an unstimulierten mikrovaskulären Endothelzellen betrug 0,7 ± 0,4 Zellen/ Gesichtsfeld bei Wandschubspannungen > 2,0 dyne/cm2. Nach Stimulation des Endothels mit TNFalpha für 5 Stunden kam es zu einem signifikanten Anstieg der Adhäsion der HL-60 Zellen auf 40 ± 4 Zellen/ Gesichtsfeld. Die Vorbehandlung der HL-60 Zellen mit O-Sialoglykoprotein-Endopeptidase führte zu einer signifikanten Verminderung der Adhäsion auf 21 ± 4 (p=0,0029, n=5, Abbildung 5.5).

Versuche mit NALM6-L Zellen zeigten eine geringe Adhäsion an unstimulierten mikrovaskulären Endothelzellen bei Wandschubspannungen > 2,0 dyn/cm2, im Mittel adhärierten 1 ± 0,7 Nalm6-L Zellen. Nach Stimulation mit TNFalpha stieg die Zahl der


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adhärierten Zellen auf 15 ± 2 Zellen an. Die Inkubation mikrovaskulärer Endothelzellen mit OSGP nach Stimulation mit TNFalpha hatte keinen Einfluß auf die Adhäsion der Nalm6-L Zellen, sie lag im Mittel bei 16 ± 2 Zellen (n=7, Abbildung 5.5).

Abbildung 5.5: L-Selectin abhängige Adhäsion nach Inkubation der mikrovaskulären Endothelzellen mit O-Sialoglykoprotein-Endopeptidase (OSGP, 80 µg/ml, links). Die Wirksamkeit der Behandlung mit OSGP wurde mit HL 60 Zellen verifiziert (rechts)

Im Gegensatz zu OSGP zeigte Behandlung mikrovaskulärer Endothelzellen mit Tunicamycin eine deutliche Wirkung: es reduzierte die L-Selectinabhängige Adhäsion auf Kontrollwerte. In


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dieser Versuchsreihe adhärierten keine NALM6-L Zellen an unstimulierten mikrovaskulären Endothelzellen, Stimulation mit TNFalpha erhöhte die L-Selectin abhängige Adhäsion auf 21 ± 5 NALM6-L Zellen bei Wandschubspannungen > 2dyn/cm2. Wurden die Endothelzellen vor Stimulation für 30 Minuten mit 10 µg/ml Tunicamycin inkubiert, kam es zur signifikanten Reduktion der TNFalpha induzierten NALM6-L Adhäsion auf 2 ± 1 Zellen (p<0.01, n= 5, Abbildung 5.6).

Abbildung 5.6: Hemmung der L-Selectin abhängigen Adhäsion von NALM6-L Zellen an TNFalpha stimulierten mikrovaskulären Endothelzellen durch Tunicamycin (10 µg/ml), einem Hemmer der N-Glykosilierung (n = 5)


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Aus diesen Versuchen kann geschlossen werden, daß für die Aktivität des auf mikrovaskulären Endothelzellen exprimierten Liganden N-glykosidisch gebundenen Zuckergruppen bedeutsam sind, während O-glykosidisch gebundene Gruppen keine Bedeutung für die L-Selectin Bindung an den Liganden haben.

5.2.5 Untersuchungen zur Wirkung von Cycloheximid und Trypsin

Da berichtet worden war, daß auch Glykolipide als Liganden für L-Selectin fungieren können ( 6 , 159 ), sollte überprüft werden, ob der auf mikrovaskulären Endothelzellen exprimierte Ligand Proteinanteile enthält. Dieses wurde durch Zugabe eines proteolytischen Enzyms, Trypsin, getestet. In Vorversuchen war die Konzentration ermittelt worden, mit der mikrovaskuläre Endothelzellen ausgesetzt werden können, ohne daß es zu einer sichtbaren strukturellen Veränderung oder Ablösung der Zellen von der Matrix kommt. Bei den Versuchen wurde eine Konzentration von 0,1 mg/ml Trypsin (1:250) eingesetzt.


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Abbildung 5.7: Wirkung von Trypsin und Cycloheximid auf die TNFalpha induzierte L-Selectin abhängige Adhäsion von NALM6-L Zellen bei Wandschubspannungen > 2 dyn/cm2

Nachdem die Versuche mit Trypsineinwirkung gezeigt hatten, daß der auf mikrovaskulären Endothelzellen exprimierte L-Selectin Ligand Proteinanteile enthält, sollte nun untersucht werden, ob zur Induktion der L-Selectin abhängigen Adhäsion eine Proteinneubildung notwendig ist. Die Proteinbildung wurde durch den Translationsblocker Cycloheximid (1 µg/ml) gehemmt. An unstimulierten mikrovaskulären Endothelzellen adhärierten bei diesen Versuchen im Mittel 0,3 ± 0,3 NALM6-L Zellen/ Gesichtsfeld, an TNFalpha stimulierten mikrovaskulären Endothelzellen 19 ± 3 Zellen/ Gesichtsfeld bei Wandschubspannungen > 2,0 dyn/cm2. Cycloheximid (1 µg/ml) reduzierte die Adhäsion bei TNFalpha stimulierten mikrovaskulären Endothelzellen wiederum auf Kontrollwerte von 0,8 ± 0,6 Zellen/ Gesichtsfeld (p = 1,8 x 10-5, n = 5, Abbildung 5.7).


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Die erhaltenen Ergebnisse lassen vermuten, daß Proteine während der Stimulation mit TNFalpha neu gebildet werden, die an der Adhäsion der NALM6-L Zellen beteiligt sind. Es ist dabei denkbar, daß entweder die Bildung des Liganden selber oder andererseits Enzyme, die den Liganden modifizieren, z.B. glykosilieren, neu gebildet werden.

5.2.6 Untersuchungen zur Wirkung von Heparinasen

Varki et al ( 129 , 176 ) und Spertini et al ( 79 ) hatten dargestellt, daß Proteoglykane als Liganden an bovinen Endothelzellen mit L-Selectin interagieren können. Auch bei mikrovaskulären Endothelzellen kommen Proteoglykane als Liganden für L-Selectin in Frage. Um dies zu untersuchen, bieten sich Heparinasen an, die unterschiedliche Spezifitäten besitzen. Heparinase I spaltet Heparin, während Heparinase III (Heparitinase I) Heparansulfat, das u.a. auch von Endothelzellen gebildet wird ( 176 ), spaltet.

Heparinase I wurde in mehreren Konzentrationen des Enzyms bis max 0,2 IU/ml untersucht. Dabei führte eine Behandlung des stimulierten Endothels mit Heparinase I in keiner der untersuchten Konzentrationen zu einer signifikanten Reduktion der Adhäsion der NALM6-L Zellen. 1 ± 0,8 NALM6-L Zellen/ Gesichtsfeld adhärierten bei einer Wandschubspannung von > 2,0 dyn/cm2 an unstimulierten mikrovaskulären Endothelzellen. Nach Stimulation mit TNFalpha stieg die Adhäsion auf 19 ± 3 Zellen (=100%). Die Inkubation der mit TNFalpha stimulierten Endothelzellen mit 0,2 IU/ml Heparinase I zeigte keinen Einfuß auf die Adhäsion der NALM6-L Zellen. Die Adhäsion war mit 29 ± 18 Zellen (n=3) sogar etwas höher gegenüber den alleine mit TNFalpha stimulierten mikrovaskulären Endothelzellen.

Heparinase III Behandlung (0,2 IU/ml) reduzierte - im Gegensatz zu Heparinase I - die TNFalpha induzierte Adhäsion signifikant auf 12 ± 1 Zellen (63% der Positivkontrolle, p=0,0162, n=3, Abbildung 5.8).

Die Aktivität des Enzyms Heparinase I wurde in einem Assay entsprechend den Angaben des Herstellers zur Überprüfung der Aktivität des Enzyms bestätigt. Dabei wurde die Spaltung


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von Heparin photometrisch bei 234 nm gemessen.

Abbildung 5.8: Die Wirkung von Heparinase I und Heparinase III (Heparitinase I) auf die L-Selectin abhängige Adhäsion von NALM-6 Zellen an TNFalpha stimulierten mikrovaskulären Endothelzellen (n = 3). * = p < 0,05 gegen TNFalpha


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5.3 Diskussion

Die hier durchgeführten Untersuchungen zeigten, daß L-Selectin abhängige Adhäsion in vitro an kardialen mikrovaskulären Endothelzellen nachweisbar war. In einem Wandschubspannungsbereich von ca. 1 - 2,6 dyn/cm2 adhärierten stabil mit L-Selectin transfizierte NALM6 Zellen (NALM6-L) stärker als nicht-transfizierte Wildtypzellen nach fünfstündiger Stimulation der mikrovaskulären Endothelzellen mit TNFalpha. An ruhenden, nicht stimulierten Endothelzellen ließ sich dagegen keine L-Selectin abhängige Adhäsion nachweisen. Die weiteren Versuche zur Charakterisierung der L-Selectin Bindung ließen vermuten, daß die die Adhäsion vermittelnden Liganden Proteinanteile besitzen, da sie durch milde Trypsinbehandlung ihre Bindungsfähigkeit verloren. Des weiteren konnte durch Inkubation mit Enzymen, die spezifische Glykanstrukturen abbauen, bzw. die Bildung dieser Strukturen hemmen, gezeigt werden, daß vor allem N-glykosidisch gebunden Zuckerseitenketten für die Bindungsfähigkeit an das L-Selectin wichtig sind. Da Heparitinase, ein Heparansulfat abbauendes Enzym, die L-Selectinbindung ebenfalls hemmte, kann vermutet werden, daß auch Proteoglykane an der L-Selectinbindung der auf kardialen mikrovaskulären Endothelzellen exprimierten Liganden beteiligt sind.

In vivo und in vitro Untersuchungen anderer Autoren hatten gezeigt, daß auch im Bereich des Gefäßsystems L-Selectin abhängige Adhäsion nachweisbar ist ( 129 , 143 , 148 , 240 ). Im Gegensatz zu den übereinstimmenden funktionellen Daten über L-Selectin abhängige Adhäsion an vaskulären Endothelzellen ist die Identität der Liganden aus dem Gefäßbereich jedoch noch nicht geklärt.

Die hier dargestellten Untersuchungen zeigten ebenfalls, daß L-Selectin abhängige Adhäsion an humanen kardialen mikrovaskulären Endothelzellen nachweisbar war, allerdings nicht an


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ruhenden, unstimulierten Endothelzellen, sondern erst nach Stimulation der Endothelzellen mit TNFalpha. Die Tatsache, daß an nicht stimulierten Endothelzellen keine L-Selectin abhängige Adhäsion nachweisbar ist, charakterisiert einen wichtigen Unterschied der L-Selectin abhängigen Adhäsion zwischen kardialen Endothelzellen und HEV des Lymphgewebes. Die bisher bekannten Liganden auf HEV werden konstitutiv exprimiert, eine Modulation durch Zytokine, wie auf vaskulären Endothelzellen, ist bisher nicht berichtet worden ( 113 , 257 ).

Während CD40 Stimulation die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 sowie auch die E-Selectin abhängige Adhäsion ähnlich induziert wie TNFalpha (siehe Seite 74#LINKCONTENT#74#/LINKCONTENT#), induzierte die Stimulation des TNFalpha Rezeptor-ähnlichen CD40 Rezeptors keine vermehrte Adhäsion der NALM6-L Zellen.

In anderen Zellsystemen ist gezeigt worden, daß sich die Signaltransduktion des CD40- und des TNFalpha Rezeptors unterscheiden ( 55 , 82 , 230 ). Möglicherweise ist die Signaltransduktion des TNF- und des CD40 Rezeptors auch in Endothelzellen unterschiedlich und kann als eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche Fähigkeit von TNFalpha und CD154, L-Selectin abhängige Adhäsion zu induzieren, angesehen werden.

Stimulation mikrovaskulärer Endothelzellen in Anwesenheit von Cycloheximid hemmte die Induktion L-Selectin abhängiger Adhäsion durch TNFalpha. Cycloheximid hemmt die Proteinbiosynthese auf der Ebene der Translation ( 166 ). Die Hemmung der Adhäsion durch Cycloheximid weist darauf hin, daß die Induktion der Adhäsion mit Proteinsynthese einhergeht. Dies kann bedeuten, daß die Synthese des Liganden selbst gehemmt wird. Alternativ wäre auch denkbar, daß der Ligand bereits synthetisiert in der Zelle vorliegt und durch TNFalpha Stimulation den Liganden prozessierende Enzyme, z.B. glykolisierende Enzyme, induziert werden, die die funktionell aktive Form des Liganden fertigstellen, bevor er an die Zellmembranoberfläche transportiert wird.

Als L-Selectin Liganden des Lymphsystems sind GlyCAM-1 ( 135 ), MadCAM-1 ( 229 ) CD34 ( 16 ) und Podocalyxin-like protein ( 208 ) identifiziert worden. Diese Liganden sind mucinähnliche, stark glykolisierte Proteine. Neben diesen Glykoproteinen können aber offensichtlich auch Glykolipide als Liganden des L-Selectins fungieren ( 6 , 118 ). Da der auf


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kardialen mikrovaskulären Endothelzellen exprimierte L-Selectin Ligand jedoch durch milde Trypsinbehandlung inaktiviert wurde (siehe Seite 81#LINKCONTENT#81#/LINKCONTENT#), spricht dies dafür, daß der L-Selectin Ligand kein Glykolipid, sondern ein Protein ist.

Ein gemeinsames Charakteristikum der L-Selectin Liganden GylCAM-1, MadCAM-1 und CD34 ist ihre starke Glykosilierung ( 213 ). Diese mucinähnlichen Liganden exprimieren alle das MECA79 Epitop, eine Zuckerstruktur, in der sulfatierte Komponenten für die Bindung des MECA79 Antikörpers und ihre Funktion als L-Selectin Ligand notwendig sind ( 103 ). Dies erklärt auch, daß Hemmung der Sulfatierungsreaktionen mit einem Aktivitätsverlust der L-Selectin Liganden einhergeht ( 112 ). Weiterhin zeichnen sich diese Liganden dadurch aus, daß O-glykosidisch gebundene Oligosaccharide für die L-Selectinbindung wichtig sind. Diese Glykanstrukturen können durch das Enzym O-Glykoprotein-Endopeptidase (OSGP) abgespalten werden und inaktivieren damit die mucinähnlichen L-Selectin Liganden ( 81 , 225 ). Sialyl-Lewisx-haltige Zucker sind weitere Komponenten der Selectinliganden. Diese werden von OSGP jedoch nicht gespalten, wie von Ley et al. ( 144 ) gezeigt wurde. Neuraminidase, gewonnen von Clostridium perfringens, spaltet dagegen die Sialyl-Lewisx haltigen Zuckerkomponenten ( 97 , 255 ) und inaktiviert so ebenfalls L-Selectin Liganden ( 239 ). Im Gegensatz zu diesen an den mucinähnlichen Liganden beobachteten Befunden hatten weder OSGP noch Neuraminidase einen hemmenden Effekt auf die L-Selectin abhängige Adhäsion an mikrovaskulären Endothelzellen. Das läßt vermuten, daß weder O-glykosidisch gebundenen Oligosaccharide noch Sialyl Lewisx haltige Zuckerkomponenten für die Funktion der L-Selectin Liganden auf kardialen mikrovaskulären Endothelzellen von Bedeutung sind. Allerdings sind kürzlich auch L-Selectin Liganden im Lymphsystem beschrieben worden, die unempfindlich gegen OSGP waren ( 50 ). Auch auf Lymphozyten konnten Liganden identifiziert werden, die unempfindlich gegen Neuraminidasebehandlung waren ( 205 ) und damit wahrscheinlich ebenfalls einer anderen Gruppe von Molekülen angehören, als die bisher bekannten Liganden des Lymphgewebes.

Norgard-Sumnicht et al ( 176 ) und Koenig et al ( 129 ) hatten beschrieben, daß L-Selectin abhängige Adhäsion durch Heparine gehemmt werden könne. Dies gab zu der Vermutung Anlaß, daß Proteoglykane vom Heparansulfattyp als Liganden für L-Selectin fungieren


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könnten. Norgard-Sumnicht et al. konnten zudem nachweisen, daß sowohl zellgebundene als auch sezernierte Proteoglykanfraktionen auftreten, die an L-Selectin binden. Es waren selten vorkommende, an den Aminogruppen nicht substituierte Heparansulfate ( 175 ). Allerdings konnte keine Abhängigkeit der Heparansulfatbildung von einer Stimulation der Endothelzellen, in diesen Versuchen mit Lipopolysacchariden, festgestellt werden.

In die gleiche Richtung weisen Untersuchungen von Guiffre et al. ( 79 ), die zeigten, daß die Adhäsion von Monozyten an TNFalpha stimulierten bovinen aortalen Endothelzellen durch Behandlung der Endothelzellen mit Heparitinase, einem Heparansulfat abbauendem Enzym, zum größten Teil gehemmt werden konnte. Unter den gewählten Bedingungen waren 60-80% der Monozytenadhäsion L-Selectin abhängig und 80% der L-Selectin abhängigen Adhäsion durch Heparitinase I hemmbar.

Um zu überprüfen, ob der auf mikrovaskulären kardialen Endothelzellen exprimierte putative L-Selectin Ligand gegen Heparansulfat abbauende Enzyme empfindlich ist, wurden die Endothelzellen nach Stimulation mit TNFalpha mit Heparitinase I, einem Heparansulfat abbauenden Enzym, und Heparinase I, einem Heparin abbauenden Enzym, inkubiert. Nach Vorbehandlung mit Heparitinase I konnte eine signifikante Hemmung der L-Selectin abhängigen Adhäsion beobachtet werden. Inkubation unter den gleichen Bedingungen mit Heparinase I zeigte keine Hemmung der Adhäsion. Dies läßt vermuten, daß Heparansulfate an der L-Selectin abhängigen Bindung beteiligt sind. Auch die Beobachtung, daß Tunicamycin die Adhäsion hemmt (siehe Seite 81#LINKCONTENT#81#/LINKCONTENT#), unterstützt diese Vermutung, da gezeigt worden war, daß Tunicamycin die Bildung von Proteoglykanen inhibiert ( 227 , 263 ). Ob der Ligand selbst ein Heparansulfat ist oder ob Heparansulfate den Liganden, ähnlich wie es für das Chemokin IL-8 beschrieben worden ist ( 219 , 258 ), an der Zelloberfläche präsentieren, ist anhand der durchgeführten Untersuchungen nicht zu entscheiden.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß mit Hilfe der mikrovaskulären kardialen Endothelzellen ein System vorhanden ist, mit dem L-Selectin abhängige Adhäsion in vitro unter Flußbedingungen nachweisbar ist. Es erlaubt, die Liganden, die auf diesen Endothelzellen exprimiert werden, zu charakterisieren. L-Selectin abhängige Adhäsion ließ sich - im Gegensatz zu hochendothelialen Venolen - nicht an unstimulierten ruhenden Endothelzellen


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nachweisen, sondern erst nach Stimulation mit dem inflammatorischen Zytokin TNFalpha. Stimulation des TNFalpha Rezeptor ähnlichen CD40 Rezeptors induziert keine L-Selectin abhängige Adhäsion. Der auf kardialen mikrovaskulären Endothelzellen exprimierte Ligand unterscheidet sich von bisher bekannten mucinähnlichen Liganden auf hochendothelialen Venolen des Lymphgewebes, da er unempfindlich gegen O-Sialoglykoprotein-Endopeptidase und Neuraminidase ist. Der Ligand enthält wahrscheinlich Proteinanteile, an den N-glykosidisch Zuckerseitenketten, z. B. Glykane vom Heparansulfattyp, gebunden sind.

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