Gräfe, Michael: Die Bedeutung entzündlicher Reaktionen für die Pathogenese der Arteriosklerose - Untersuchungen an einem in vitro Modell menschlicher kardialer Endothelzellen

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Kapitel 6. Material und Methoden

6.1 Isolierung humaner kardialer mikrovaskulärer Endothelzellen (HMCEC)

6.1.1 Präparation

Explantierte humane Herzen von Patienten im Endstadium einer dilatativen Kardiomyopathie wurden für die Gewinnung mikrovaskulärer Endothelzellen verwendet. Unter sterilen Bedingungen wurde ein ca. 6 x 8 cm großes Myokardstück aus dem Bereich der Herzspitze herauspräpariert. Es wurde ein ca. 2 cm langer Gefäßabschnitt zur Kanülierung und Perfusion belassen. Die Präparate wurden in 4°C kalter Ringerlösung (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) bis zur Bearbeitung aufbewahrt. Die weitere Verarbeitung erfolgte innerhalb von maximal 24 Stunden. Innerhalb dieser Zeit konnte keine Veränderung in der Zellausbeute beobachtet werden. Zur weiteren Isolierung der Endothelzellen wurde das Präparat in eine modifizierte Langendorffapparatur eingehängt.

In sterilen Perfusionsleitungen (Typ N, Luer-Lock, B. Braun Melsungen AG, Melsungen) wurde mit Hilfe einer Rollpumpe (Ismatec SA Laboratoriumstechnik, Zürich, CH) die Perfusionsflüssigkeit zunächst in einen Temperaturaustauscher (Anfertigung durch Glasbläser nach Angabe) und dann in das Gewebestück geleitet. Die abtropfende Flüssigkeit wurde nach der Gewebepassage in einem temperierten Trichter (Anfertigung durch Glasbläser nach Angabe) aufgefangen und dem Kreislauf erneut zugeführt (siehe Abb. 6.1).

Die Anschlüsse der Leitungssysteme an die Glaswaren wurden mit Hilfe von ca. 4 cm langen Schlauchstücken (Tygon, Norton, Bezug über Merck, Berlin) über Rotieradapter (Berg Medizintechnik GmbH, Berlin) durchgeführt. Am Ausgang des Wärmetauschers wurde eine


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weitere Perfusorleitung als Druckmesseinrichtung über einen Dreiwegehahn (Connecta, Pfrimmer-Viggo GmbH + Co KG, Erlangen) angeschlossen. Der Perfusionsdruck wurde in Zentimeter Wassersäule gemessen. Während der gesamten Perfusion des Gewebes erfolgte eine Begasung der eingesetzten Flüssigkeiten mit Carbogengas (95 % O2, 5 % CO2, AGA Edelgas GmbH, Berlin). Abbildung 6.1 verdeutlicht den Aufbau der hier verwendeten Perfusionsanlage.


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Abbildung 6.1: Schematische Darstellung des Aufbaus zur Perfusion der Myokardstücke

Das durch eine Kanüle (Venflo 2, 1,0 mm Ø, Pfrimmer-Viggo GmbH + Co KG, Erlangen) im distalen Bereich des Ramus interventricularis anterior intubierte und in die Apparatur eingefügte Präparat wurde für wenige Minuten zuerst mit 50 ml sterilem Krebs-Henseleit Puffer (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen) mit 1,3 mM CaCl2 (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen) und 2,1g/l Natriumhydrogencarbonat (Merck, Darmstadt) bei einem pH-Wert von 7,4 perfundiert. Anschließend erfolgte die Perfusion mit 50 ml Krebs-Henseleit Puffer ohne Ca2+-Ionen bei einem Perfusionsdruck von ca. 100 cm Wassersäule. Daran schloß sich die Perfusion mit einer Enzymlösung folgender Zusammensetzung: 0,74 g/l Collagenase Typ II (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen), 0,12 g/l Trypsin 1: 250 (Serva GmbH, Heidelbarg), Dispase Grad I, 50 U/ml (Collaborative Research Inc., Becton Dickinson, Heidelberg), 2000 U Dispase I (Boehringer Mannheim, Mannheim), 0,27 % Albumin (Fraktion V, 7,5 % Lösung, (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen) in 50 ml Krebs-Henseleit Puffer über 20 Minuten an.

Das enzymatisch dissoziierte Gewebe wurde mit Hilfe einer Schere und eines Skalpells mechanisch zerkleinert und vom umliegenden Fettgewebe und nicht verdauten Gewebeanteilen befreit. Der Enzym/ Gewebebrei wurde nun in dem Auffangtrichtergefäß für 30 Minuten im Carbogengas Blasenstrom bei 37°C weiter zersetzt. Anschließend erfolgte eine Filtration über ein Nylonnetz mit 200 µm Porengröße (Merck, Berlin).

Die Kapillar- und Zellsuspension wurde in sterilen 50 ml Gefäßen (Falcon, Heidelberg) aufgefangen. Nach der Zentrifugation bei 200 g für 8 Minuten erfolgte das Absaugen des Überstandes und Resuspension des Zellpeletts mit Zellkulturmedium.

Das benutzte Zellkulturmedium für humane mikrovaskuläre Endothelzellen und makrovaskuläre koronare Endothelzellen wurde aus folgenden Substanzen zubereitet: Medium 199 Earle (2,2 g/l NaHCO3, Seromed, Biochrom KG, Berlin), 20 % fötales Kälberserum (Seromed, Biochrom KG, Berlin), 200 mM Glutamin (Seromed, Biochrom KG,


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Berlin), 100 U/ml Penicillin (Grünenthal GmbH, Stollberg), 100 µg/ml Streptomycin (Sigma, Deisenhofen), 10 mM/l HEPES (Sigma, Deisenhofen), sowie 1 % Retina Derived Growth Faktor (RDGF, eigene Herstellung nach ( 80 )) oder 10 ng/ml Endothelilal Cell Growth Factor (ECGF, Boehringer Mannheim, Mannheim).

Die Zellsuspension wurde auf mit 0,2 % iger Gelatine beschichteten Zellkulturgefäßen (T 75, 250 ml, Falcon, Heidelberg) ausgesät und in einem Brutschrank bei 37°C, 5 % CO2 und 95 % Luft inkubiert.

Nach der Adhäsion der Endothelzellen erfolgte das Spülen der Zellkultur nach max. 24 Stunden zum Entfernen von nicht anhaftenden Zellen, wie Kardiomyozyten oder Erythrozyten. Hierbei wurde der Kulturüberstand abgesaugt und die Kultur mit 10 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS mit Ca2+ und Mg2+) gespült. Nach Wiederauffüllen mit 10 ml Zellkulturmedium erfolgte erneut die Inkubation im Brutschrank. Im weiteren wurde die Zellkultur zweitägig mit frischem Medium versorgt.

6.2 Isolierung humaner kardialer makrovaskulärer Endothelzellen (CEC)

6.2.1 Präparation

Zur Gewinnung makrovaskulärer koronarer Endothelzellen wurden aus explantierten Herzen unter sterilen Bedingungen Koronargefäße herauspräpariert und in 25 ml Medium 199 mit Penicillin/ Streptomycin/ Hepes Zusatz bei 4°C für max. 24 Stunden gelagert. Bei der Präparation wurde darauf geachtet, möglichst lange, unverletzte und mit wenig Abzweigungen versehene Gefäßabschnitte zu erhalten.

Die Koronargefäße wurden im Labor mit Hilfe eines Mikropräparationsbesteckes vom umliegenden Fettgewebe befreit und in 10 ml Medium 199 mit 0,2 % Collagenase (Collagenase II, Sigma Chemie, Deisenhofen) für 30 Minuten. bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurden die Gefäßabschnitte erneut mehrfach mit Medium 199 durchspült, um


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die abgelösten Zellen aus den Koronararterien herauszuspülen, und die Zellsuspension wurde bei 200 g für 5 Minuten. zentrifugiert.

Nach Absaugen des Überstandes und Resuspension des Zellpellets mit 5 ml Zellkulturmedium erfolgte das Aussäen auf eine Kulturflasche (T25, Falcon, Heidelberg). Die weitere Versorgung erfolgte wie unter für mikrovaskuläre Endothelzellen angegeben.

6.3 Anreicherung von humanen Endothelzellkulturen

Polystyrene paramagnetische Kügelchen (Dynabeads M-450, Dynal, Hamburg) mit 4,5 µm Durchmesser, 3-5 m2/g Oberfläche, wurden vom Hersteller durch p-Toluenesulfonylchlorid zur Proteinbindung aktiviert. Sie wurden an das Lektin Ulex Europaeus I (Sigma, Deisenhofen) gekoppelt, entsprechend den Angaben des Herstellers ( 247 ).

Eine von der Kulturschale mit Trypsin/EDTA abgelöste Zellsuspension wurde mit ca. 1 ml Medium 199 und 15 µl Ulex Europaeus I gekoppelten Dynabeads gemischt (angestrebtes Zell- Dynabeads - Verhältnis für die Positivtrennung lag bei 10:1), für 30 Minuten. bei 4°C rotiert und anschließend gesammelt.

Die an Endothelzellen gekoppelten Dynabeads wurden mit 10 ml Kulturmedium resuspendiert und auf T 75 Kulturgefäße ausgesät. Dieser Reinigungsschritt erfolgte routinemäßig während der 1. Zellpassage, sowohl für mikro- als auch für makrovaskuläre koronare Endothelzellen.

6.4 Charakterisierung von humanen Endothelzellen

Zur Charakterisierung humaner Endothelzellen wurden sowohl lichtmikroskopische, als auch


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fluoreszensmikroskopische Verfahren herangezogen.

Die auf 3,5 cm Durchmesser (ca. 10 cm2 Kulturfläche, Falcon, Heidelberg) Kulturschalen gezüchteten Endothelzellen wurden in unbehandeltem Zustand im Phasenkontrast bei 20 facher Vergrößerung nach morphologischen Kriterien (Pflastersteinrelief, Zellmonolayer) beurteilt. Für den Nachweis humaner endothelzellspezifischer Antigenstrukturen auf Endothelzellen wurde die Immunfluoreszenz Mikroskopie eingesetzt.

Auf gekammerten, beschichteten Objektträgern (Chamber Slide, 8 well, Nunc Inc., Heidelberg) wurden kultivierte Endothelzellen in einer -20°C kalten Methanollösung (Merck, Darmstadt) für 20 Minuten bei -20°C fixiert und anschließend mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+ ) über 10 Minuten bedeckt. Nach Entfernen der PBS-Lösung erfolgte die Inkubation der Zellen mit dem Primärantikörper (100 µl/ Kammer der im folgenden angegebenen Verdünnungen) für 45 Minuten.

Eingesetzt wurden folgende Primärantikörper:

Verdünnungen der Antikörper wurden mit Aqua destillata mit 0,1 % fötalem Kälberserum durchgeführt. Nach dreimaligem Spülvorgang für je 5 Minuten mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) erfolgte die Inkubation mit dem zweiten Antikörper für ebenfalls 45 Minuten. Als zweite Antikörper wurden benutzt:

Bei FITC (Fluorescein Isothiocyanat) gekoppelten zweiten Antikörpern erfolgte eine dreimalige Spülung für 5 Minuten mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+), eine Bedeckung des Präparates mit Aqueous Mounting Medium (Shandon Southern Products Ltd., GB) und einem Deckglas. Die Präparate wurden unter der Anregung bei 490 nm im Fluoreszensmikroskop beurteilt.

Bei der Verwendung des Anti-Maus Biotin Antikörpers als zweiten Antikörper folgte nach dreimaligem Spülvorgang für 5 Minuten mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) die Inkubation mit Streptavidin-Rhodamin. 100 µl des 1:200 verdünnten Streptavidin-Rhodamin Farbstoffkomplexes (Dianova, Hamburg) wurden für 45 Minuten auf das Präparat gebracht. Nach erneutem dreimaligen Spülen mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) erfolgte wiederum das Eindecken und das Bedecken mit einem Deckglas. Die mikroskopische Beurteilung wurde, durch Licht der Wellenlänge 540 nm angeregt, im Fluoreszensmikroskop durchgeführt.

Als weiteres Charakteristikum der Endothelzellen wurde die Aufnahme von actyliertem LDL in die Zellen herangezogen.

Auf gekammerten Objekträgern kultivierte Endothelzellen wurden mit 10 µg/ml Dil- Ac-LDL (Dil-Ac-LDL, Paesel und Lorei, Frankfurt/Main) für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt, mehrmals mit frischem Medium gespült, dreimal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gewaschen und für 20 Minuten in 3,7 %-iger Formaldehydlösung (Verdünnung in PBS) bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Spülen mit Aqua destillata erfolgte das Eindecken und Auflegen eines Deckglases. Die Auswertung erfolgte durch Anregung bei 540 nm im Fluoreszensmikroskop.


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6.5 Immunhistologie

Herzgewebe wurde in neutralem 10% Formalin fixiert, in Paraffin gebettet und 2µm dicke Schnitte angefertigt. Es folgte eine Entparafffinierung in Xylen, mit reinem Aceton und 30% Aceton in Tris-Puffer (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 7.4). Für die Färbung mit Antikörpern gegen von Willebrandt Faktor erfolgte eine zusätzliche Behandlung mit 0,1% Pronase (Merck, Darmstadt). Folgende Antikörper wurden zur Charakterisierung des Herzmuskelgewebes verwendet:

Endogene alkalische Phophatase Aktivität wurde durch 1 mM Levamisol (Sigma, Deisenhofen) geblockt. Die Detektion der gebundenen Antikörper erfolgte mit einem APAAP Detektionssystem entsprechen Cordell ( 54 ). Die Schnitte wurden mit Hämatoxilin gegengefärbt.

Die Detektion der alkalischen Phosphatase Aktivität erfolgte mit einem Kit zum Nachweis alkalischer Leukozyten Phosphatase wie bei Spanel-Borowski et al. ( 218 ) beschrieben. Herzmuskelgewebe wurde dazu mit flüssigem Stickstoff schockgefroren. Es wurden 6 µm dicke Schnitte angefertigt, mit 100% Aceton fixiert und bei Raumtemperatur über 10 Minuten getrocknet. Aus Zellkulturen gefertigte Präparate wurden mit 3,8% Formalin in reinem Methanol fixiert.

Es erfolgte nun eine Inkubation mit der alpha-Naphthyl Phosphat enthaltenen Reaktionslösung über 15 Minuten, gefolgt von einer Färbung mit Neutralrot. Eine positive Reaktion zeigte sich in einer tiefroten Anfärbung.


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6.6 Isolierung von Low Density Lipoproteinen (LDL)

6.6.1 LDL Präparation

Humanes Vollblut von freiwilligen Probanden wurde zur Antikoagulation und zum Schutz vor Autooxidation ( 107 ) direkt nach der Entnahme mit 1mg/ml EDTA versetzt. Nach der Zentrifugation mit 1200 g für 10 Minuten, zur Trennung von Plasma und zellulären Bestandteilen, erfolgte die Lagerung des Plasma für max. 7 Tage bei 4°C.

LDL (Dichte 1,019-1,063 g/ml) wurde aus dem so gewonnenen Plasma durch schrittweise Ultrazentrifugation nach der Methode von Havel et al. ( 101 ) über einem Kalium-Bromid Gradienten isoliert. Das isolierte LDL wurde in einem Reagenzglas bei 4°C für max. 3 Wochen zur weiteren Bearbeitung gelagert.

Nach der Isolierung der LDL erfolgte eine Konzentration durch Zentrifugenultrafiltration (Centricon 30, Ausschlußgrenze 30 KDa, Amicon, Witten) bei 1200 g/min. für 40 Minuten. und eine Reinigung über eine Gelfiltrationssäule.

In einer HiLoad 16/60 Superdex 75 Gelfiltrationssäule (Pharmacia LKB Biotechnology, Freiburg), äquilibriert mit Tyrode Lösung (pH=7,4), Gibco BRL Life Technologies GmbH, Berlin) + 0,2 mM EDTA und 20 µM BHT (Butylhydroxytoluene, Sigma, Deisenhofen), erfolgte die Reinigung der LDL ( 108 ) durch das Prinzip unterschiedlicher Molekülradien. Die in einem Vorratsbehälter befindliche Pufferlösung wurde mit einer Rollerpumpe (Ismatec SA Laboratoriumstechnik, Zürich, CH.) durch die Gelfiltrationssäule gepumpt und in einem Probenfraktionierer (Waters fraction collector, Millipore) in 1,2 ml Fraktionen aufgefangen.

Die Absorption der Proben wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm in einem Spektrometer (Unicam 8625 UV/VIS Spectrometer, Unicam Limited, GB) gemessen. Der Maximalpunkt der Absorptionen bei 280 nm entsprach der LDL-Fraktion. Im Anschluß an diese Aufarbeitung erfolgte eine modifizierte Proteinbestimmung nach der Methode von Lowry et


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al. ( 147 ).

Probenaliquots (1 mg/ml LDL Protein) wurden mit einem 0,22 µm Sterilfilter steril filtriert und im Dunkeln bei 4°C für maximal 4 Wochen in 1,5 ml Eppendorfgefäßen gelagert.

6.6.2 LDL Charakterisierung

Zum Nachweis der LDL wurden folgende Methoden angewandt:

  1. Agarose Gelelektrophorese
  2. Cholesterin/Triglyceridquotient

6.6.2.1 Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese wurde mit dem Lipidophor ALL IN 12 System (Immuno GmbH, Heidelberg) durchgeführt.

Die Auftragungsstelle des Agarosemediumträgers wurde mit 10 µl eines Gemisches aus LDL/ Plasma und Agarosemedium im Verhältnis 1:1 vol/vol bestückt. Nach dem Aufbringen des Versiegelungsmediums (ca. 2 µl) auf die Auftragsstelle wurde der Agarosemediumträger in die mit Kammerpuffer (je 300 ml) gefüllte Elektrophoresekammer gelegt und diese verschlossen. Der Kammerpuffer bestand aus folgenden Substanzen: 62,1 % (g/g) 5,5'-Diethylbarbitursäure Natriumsalz , 29,2 % (g/g) Natriumacetat und 8,7 % (g/g) Zitronensäure. Der Elektrophoreselauf erfolgte bei 2 Gelträgern (4 Proben) mit konstantem Strom von 30 mA für 80 Minuten.

Im Anschluß daran erfolgte das Aufbringen von 5 ml Entwicklerlösung 1, nach 30 Minuten. Inkubationszeit Aufbringen der Entwicklerlösung 2 (5 ml zur Klärung der Träger). Die Entwicklerlösung 1 enthielt folgende Substanzen: 7 mmol Phosphorwolframsäure, 0,2 mol Magnesiumchlorid, 0,15 mol Natriumchlorid und 15 mmol Natriumazid. Entwicklerlösung 2 bestand aus 7 mmol Phosphorwolframsäure und 0,3 mol Natriumchlorid.


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Die Beurteilung der Gelträger erfolgte nach 30 Minuten gegen einen dunklen Hintergrund. Laufstreckenunterschiede wurden mit einem Lineal ausgemessen.

6.6.2.2 Cholesterin und Triglyceridbestimmung

Die Cholesterin und Triglyceridbestimmung erfolgte in einem Hitachi Großlaborgerät (Hitachi System 717). Zum Cholesterin- und Triglyceridnachweis wurde enzymatische Farbtestmethode ( 214 , 253 ) verwendet.

6.6.3 Normale LDL (n-LDL)

Als normale LDL (n-LDL) bezeichnete Lipoproteine wurden von EDTA und Antioxidantien (EDTA und BHT) mit Hilfe der Gelfiltration befreit (Verfahren wie unter Punkt LDL Präparation beschrieben).

Die Säule wurde jedoch mit einem 0,02 M Phosphatpuffer (pH=7,4, Natriumhydrogenphosphat, Sigma Chemie, Deisenhofen) äquilibriert. Gereinigtes LDL (Konzentration 1 mg/ml) wurde erneut steril filtriert und sofort in die Versuche eingesetzt.

6.6.4 LDL Modifizierung

Zur Modifizierung wurde das wie unter Normale LDL (n-LDL) aufbereitete n-LDL verwendet (frei von Zusätzen).

6.6.4.1 Herstellung oxidierter LDL (ox-LDL)


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n-LDL wurden mit 5 µM CuSO4 (Sigma Chemie, Deisenhofen) über 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert ( 73 ). Mit Hilfe der Gelfiltration wurde ox-LDL wieder von CuSO4 befreit, erneut mit einem Zentrifugenkonzentrator konzentriert und anschließend steril filtriert. Die Proteinkonzentration der LDL Proben betrug 1 mg/ml. Die gewonnenen ox-LDL wurden sofort in die Versuche eingesetzt.

6.6.5 Nachweis der Modifizierung der LDL

Zum Nachweis des Oxidationsgrades wurden folgende Methoden angewandt:

  1. Relative Beweglichkeit in der Agarosegelelektrophorese ( 174 , siehe )
  2. Fraktionierung des Apoproteins B 100 in der Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE, ( 224 ))
  3. Malondialdehydgehalt der Lipoproteine in der Thiobarbitursäure Reaktiven Substanzen Methode (TBARS, ( 33 )).

6.6.5.1 Relative Beweglichkeit in der Agarosegelelektrophorese

n - und ox-LDL Proben (10 µl) wurden auf die Agarosegelträger des Lipidophor All IN 12 - Systems (Beschreibung unter Agarose-Gelelektrophorese) aufgetragen und nach dem Elektrophoreselauf zur Auswertung nebeneinander gelegt. Nach Messung des Abstandes Auftragstelle-Proteinbande wurde die relative Mobilität der verschiedenen Proben als Verhältnis zum n-LDL errechnet.


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6.6.5.2 Fraktionierung des Apoproteins B 100

Die SDS-PAGE wurde nach der Methode von Laemmli et al ( 133 ) auf 4 - 20 % igen Gradientengelen (Mini-Protean II Ready Gel, Bio-Rad, München) in einer Elektrophoresekammer (Mini-Protean II Cell, Bio-Rad, München) durchgeführt.

20 µl Probe wurden 1:4 mit Probenpuffer, bestehend aus 4 ml Aqua dest., 1 ml 0,5 M Tris-HCl, pH =6,8, 0,8 ml Glycerol, 1,6 ml 10 % (w/v) SDS, 0,4 ml ß-Mercaptoethanol, 0,2 ml 1% Bromophenolblau verdünnt, für 4 Minuten auf 95°C erhitzt und bei konstant 200 V Spannung für 30 Minuten. in der Elektrophorese getrennt. Anschließend erfolgte eine Silberfärbung der Proteine ( 261 ).

6.6.5.3 Bestimmung des Malondialdehydgehalts (TBARS)

Der Malondialdehydgehalt, als Ausdruck der Lipidperoxidation, gemessen mit der TBARS Methode, wurde wie folgt bestimmt :

1 ml Probe wurde mit 1 ml 0,5 %-iger Thiobarbitursäure (4,6-Dihydroxypyrimidin-2-thiol, Sigma Chemie, Deisenhofen) für 90 Minuten bei 60°C erhitzt, nach dem Abkühlen mit 1 ml 70 % iger Trichloressigsäure versetzt und mit 3 ml Chloroform gemischt. Nach Zentrifugation für 10 Minuten mit 1200 g/min. wurde die optische Dichte des Überstandes bei 532 nm im Fotometer (MR 7000, Dynatech, Denckendorf) gemessen. Die Standardkurve wurde aus bekannten Konzentrationen von 1,1,3,3-Tetraethoxypropan (Malonaldehyde-bis-diethylacetal, Sigma, Deisenhofen) über einen Konzentrationsbereich von 10-7 - 10-9 M in gleicher Weise ermittelt. Die Ergebnisse wurden in nmol Malondialdehyd/mg LDL Protein angegeben.

6.7 Endotoxinnachweis

Zum Nachweis des Endotoxingehaltes in den LDL Aufarbeitungen (n- und ox-LDL) wurde der Limulus Amebocyte Lysate Endo-LAL Test (Chromogenix AB, Pharmacia LKB,


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Freiburg) eingesetzt.

Grundlage des Testes ist eine Gelbildung durch Endotoxin im Limulus Amöbozyten Lysat (LAL), welches letztlich sichtbar ist ( 141 ). Endo-LAL wurde mit den Proben zu gleichen Teilen gemischt und für 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Ein positives Ergebnis zeigte einen Endotoxingehalt der Proben von mindestens der Höhe der bekannten Standardkonzentrationen an.

100 µl Proben wurden mit 100 µl Endo-LAL (0,03 EU/ml) für 60 Minuten bei 37 ° C inkubiert. Eine negative Kontrolle bestehend aus 100 µl endotoxinfreiem Wasser und 100 µl einer positiven Kontrolle mit bekannten Standardkonzentrationen (0,5, 0,25, 0,12, 0,06, 0,03 EU/ml) wurden mit 100 µl Endo-LAL gemischt und ebenfalls 60 Minuten bei 37 ° C inkubiert.

Ein positives Ergebnis zeigte ein festes Gel am Grund der Probenröhrchen, ein negatives Ergebnis ein visköses Gel, bzw. keine Gelbildung. Anhand der Gelbildung und Vergleich mit den mitgeführten Kontrollen ließ sich der Endotoxingehalt der Proben in EU/ml bestimmen.

6.8 Messung von Gewebeplasminogen Aktivator (t-PA)

t-PA wurde in Zellkulturüberständen mit Hilfe eines Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), in Anlehnung an das von Rijken et al ( 198 ) beschriebene Verfahren, gemessen.

Als Proben wurden die Überstände von konfluenten Kulturen, die 24 Stunden bei 37°C mit serumfreiem Medium (SFM, Gibco BRL Life Technologies GmbH, Berlin) und mit 3 - 100 µg/ml LDL-Protein inkubiert wurden, verwendet. Die Endothelzellkulturen befanden sich in der 3. Passage und wurden auf mit 0,2 %-iger Gelatine beschichteten 24er well Kulturplatten (Falcon, Heidelberg) kultiviert. Die verwendeten Überstände wurden für max. 8 Wochen bei -20°C in 1,5 ml Eppendorfcups gelagert.

Kontrollen, Standards und Proben (je 100 µl/well) wurden für 60 Minuten bei 37°C in einer


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96 well Mikrotiterplatte (Falcon, Heidelberg) inkubiert. Die Mikrotiterplatte wurde zuvor über 24 Stunden bei 4°C mit 100 µl/well eines anti human t-PA Antikörpers (Biogenesis, Berlin) in der Verdünnung 1:10000 beschichtet. Der hierbei verwendete Puffer bestand aus folgenden Substanzen : 4,3 g/l Na2CO3, 2,9 g/l NaHCO3, 0,9 % NaCl, 200 mg/l NaN3, pH-Wert 9,5.

Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (je 300 µl/well) erfolgte die Zugabe von 100 µl/ well des zweiten Antikörpers (Rabbit anti human t-PA, Biogenesis, Berlin) in der Verdünnung 1:5000 und erneut eine Inkubation bei 37°C für 60 Minuten.

Der Waschpuffer setzte sich aus folgenden Substanzen zusammen : 0,1 M TRIS, 0,9 % NaCl, 200 mg/l NaN3, 0,5 ml/l Tween 20, pH-Wert 7,4.

Dreimaliges Waschen, Zugabe von 100 µl/well des mit alkalischer Phosphatase gekoppelten dritten Antikörpers (Goat anti rabbit IgG-alkalische Phosphatase conjugiert, Dianova, Hamburg) in einer Konzentration von 1:2000 und erneutes Waschen schlossen sich an.

Nun wurden 100 µl/well Substratlösung (p-Nitrophenyl-Phosphat, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen) der Konzentration 1mg/ml in 1 M Diethanolamin-Puffer, pH 9,8, hinzugefügt und die Absorption bei 405 nm Wellenlänge innerhalb von 30 Minuten. gemessen.

Über eine Standardkurve wurden die t-PA Konzentrationen in ng/ml ermittelt. Die Standardkurve wurde durch bekannte Konzentrationen von humanem t-PA (Boehringer, Mannheim) erstellt. Der lineare Messbereich des ELISA reichte von 0,07 - 5 ng/ml t-PA.


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6.9 Messung von Plasminogen Aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) Aktivität

Die PAI-1 Aktivität wurde mit dem COATEST PAI (Chromogenix AB, Schweden, über Pharmacia LKB, Freiburg) ermittelt.

Im Überschuß zu den Proben gegebenes t-PA (40 AU/ml) bildete mit PAI-1 einen inaktiven Komplex. Das verbleibende nicht inaktivierte t-PA katalysierte unter Einwirkung eines Stimulators (humane Fibrinogenfragmente) die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin. Der Plasmingehalt wurde durch die Messung der amidolytischen Aktivität von Plasmin am chromogenen Substrat S-2403 bestimmt und die Freigabe von p-Nitroanilin bei 405 nm photometrisch gemessen.

In einer Standardkurve, ermittelt mit bekannten Konzentrationen von PAI (0 - 40 AU/ml), konnten die PAI Aktivitäten abgelesen wurden. Die Angabe erfolgte in arbiträren Einheiten (AU/ml).

Die Kulturüberstände konfluenter Kulturen der 3. Passage wurden bei -20°C für max. 8 Wochen gelagert. Die Zellen wurden 24 Stunden bei 37°C in einem speziellen serumfreiem Medium (Serum Free Medium, SFM, Gibco BRL Life Technologies GmbH, Berlin) auf 24 er well Kulturplatten (Falcon, Heidelberg) kultiviert. Während der 24 Stunden erfolgte eine Inkubation mit 3 - 100 µg/ml LDL Protein.

6.10 Messung der Sekretion von Plasminogen Aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) Antigen

Zur Bestimmung der PAI-1 Antigenkonzentration wurde eine ELISA (Chromogenix AB, Schweden, Pharmacia LKB, Freiburg) verwendet und entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt.


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6.11 Messung der Prokoagulanten Aktivität (PKA)

Die Prokoagulante Aktivität (PKA) wurde mit Hilfe einer einfachen Koagulationsmessung ( 194 ) in einem Koagulometer (Boehringer, Mannheim) bestimmt.

Nach 24 stündiger Stimulation der Zellkulturen mit 3 -100 µg/ml LDL (siehe „Messung von Gewebeplasminogen Aktivator (t-PA)“) wurde das Medium entfernt und die Kulturen mit PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) dreimal gespült. In die Versuche wurden konfluente Kulturen der 3. Passagen eingesetzt.

Je 10 cm2 Kulturschale wurden 200 µl PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) hinzugefügt und es erfolgte ein fünfmaliges Einfrieren/Auftauen bei -20°C. Die Zellreste wurden danach noch mechanisch mit einem Gummischaber von der Kulturschale entfernt und in das Zellhomogenat bei -20°C bis zur Messung aufbewahrt.

Die Zeitmessung wurde durch das Hinzufügen von 100 µl CaCl2 zu 100 µl Zellhomogenat bei 37°C gestartet und bei der Formation eines Thrombus gestoppt.

Kontrollen wurden ohne Zellsuspension mit einem sonst üblichen Starterreagenz (Boehringer, Mannheim, Mannheim) und CaCl2 durchgeführt. Als Positivkontrolle diente gepooltes Plasma. Die Ergebnisse wurden in Sekunden (s) angegeben. Die Spezifität der Messung wurde mit einem die Gewebefaktoraktivität hemmenden Antikörper (Biotrend, Köln) bestätigt.


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6.12 Messung der Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Aktivität aus Zellkulturüberständen von HMCEC und HCEC

Zur Messung der ACE Aktivität in Zellkulturüberständen wurde eine fluorometrische Methode benutzt ( 69 , 121 ).

2 Tage postkonfluente HMCEC/HCEC Kulturen der 3. Passage auf 10 cm2 Kulturschalen wurden 24 Stunden in serumfreien Medium mit Lipoproteinkonzentrationen von 3 - 100 µg/ml bei 37°C inkubiert.

Nach dem Entfernen des Zellkulturüberstandes erfolgte ein dreimaliges Spülen mit folgendem Puffer: 137 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 11,1 mM Glucose, pH = 7,4. Anschließend wurden die Zellen mit 0,5 ml des Puffers + 5 mM/l Hippuryl-L-histidyl-leucine (H-H-L, Sigma, Deisenhofen) für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. 100 µl Probenvolumen wurden entnommen und mit 1,4 ml 0,5 M NaOH versetzt. Nach der Zugabe von 100 µl Reagenz 1 (o-Phtaldialdehyd, 10 mg/ml in DMSO, Sigma, Deisenhofen) und einer 5 minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur erfolgte das Abstoppen der Reaktion mit 250 µl 6 N HCl.

Die Fluoreszenz der Proben wurde in einem Spectrofluorometer (Shimatzu, Japan) bei einer Excitationswellenlänge von 365 nm und einer Emissionswellenlänge von 495 nm gemessen. Die Schlitzeinstellung betrug 3 nm/5 nm (Ex./Em.).

Die Standardkurve wurde mit bekannten Konzentrationen (10-4 - 10-6 M) von Histidyl-L-Leucine (Sigma, Deisenhofen) im gleichen Verfahren ermittelt. Die Ergebnisse wurden in Enzymaktivitäten umgerechnet und in mU/1 Mio. Zellen angegeben. 1mU Enzymaktivität stellte die Enzymmenge dar, die 1 nmol Substrat/min. bei 37°C hydrolisierte.


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6.13 Adhäsionsassay

6.13.1 Aufbau der Flußkammer

Um Adhäsion unter Flußbedingungen zu untersuchen, wurde eine Flußkammer verwendet, die im Institut für Physiologie, Freie Universität Berlin, Prof. Gaehtgens entwickelt ( 270 ) und in etwas modifizierter Form neu gebaut wurde. Die Kammer bestand aus einem ausgehöhlten Plexiglasblock, der den Körper der Flußkammer darstellte. Er wurde zur Temperierung mit auf 37°C erwärmten Wassers durchspült. Auf einer Seite war in den Plexiglasblock ein Einfluß eingearbeitet, über den das Perfusionsmedium über einen Lueranschluß in die Kammer geleitet wurde. Auf der gegenüberliegenden Seite des Plexiglasblocks war der Ausfluß angeordnet. Er bestand aus einer y-förmigen Vertiefung, in der das abfließende Perfusionsmedium sich sammelte und durch einen Abflußkanal an einen Abflußschlauch, der wiederum durch einen Luerverschluss angeschlossen werden konnte, geleitet wurde. Beim Zusammenbau der Kammer wurde eine Schablone, die aus 120 µm dicker durchsichtiger Folie gefertigt worden war, auf den Plexiglasblock gelegt und durch dünne Metallstifte in der richtigen Position gehalten. Auf die Folie wurden die mit Zellen bewachsenen Deckgläschen (24 x 60 mm) gelegt, und zwar mit der Zellseite auf die Folie. Dadurch war die Kammer geschlossen und ihre geometrischen Abmessungen wurden durch die Dicke und Form der Folienschablone bestimmt. Die Form der Schablone war so gewählt worden, daß der Flußkanal anfangs eng war und sich zum Ende hin hyperbolisch aufweitete. Dadurch nahm die entstehende Wandschubspannung linear zum Ende der Kammer hin ab. Das Deckgläschen wurde durch einen abnehmbaren Schraubverschluß auf dem Plexiglasblock fixiert. Durch geeignete Wahl der Perfusionsgeschwindigkeit konnten nahezu physiologische Flußbedingungen, in vitro mit niedriger Reynoldszahl über dem Zellmonolayer, erzeugt werden. Die örtlich wirksame Wandschubspannung wurde nach folgender Gleichung errechnet:

tau= 6 eta Q (1-l/L) / (h2w)

Dabei bedeuten:

tau = Wandschubspannung, eta = Viskosität des Perfusionsmediums (0.75 centipoise), Q =


121

Flußrate, l = Entfernung vom Anfang der Kammer (5 mm to 30 mm), L = Länge des Flußkanals (38 mm), h = Höhe des Flußkanals (Foliendicke, 120 µm), w = Weite des Kanals am Anfang der Kammer (2,2 mm). Abbildung 6.2 verdeutlicht den Aufbau der Flußkammer.

6.13.2 Durchführung des Adhäsionsassays

Zur Durchführung der Versuche wurden Zellen auf Deckgläschen, die zuvor mit 1µg/cm2 Fibronectin (Seromed-Biochrom, Berlin) beschichtet worden waren, ausgesät. Bei Konfluenz der Endothelzellen wurden diese entsprechend des Protokolls behandelt und dann das Deckgläschen mit der Zellseite auf die Schablone gerichtet, auf den Plexiglasblock gelegt und fixiert. Die zusammengebaute Flußkammer wurde mit der das Deckplättchen enthaltenden Seite nach unten an einem Invertmikroskop zur Beobachtung und Auswertung mittels einer Haltevorrichtung befestigt. Die Flußkammer wurde nun für ca. 5 Minuten mit Perfusionsmedium perfundiert. Das Perfusionsmedium enthielt Medium 199, 10 mM HEPES, Antibiotika und 0.1% bovines Serumalbumin (Sigma, Deisenhofen).


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Abbildung 6.2: Schematische Darstellung der Flußkammer. Die Form der Kammer wurde so gewählt, daß die Wandschubspannung linear mit der Entfernung vom Anfang zum Ende der Kammer abnimmt. Die Flußgeschwindigkeit des Perfusionsmedium wurde so justiert, daß die Wandschubspannung 2,6 dyn/cm2 am Anfang und ca. 0,6 dyn/cm2 am Ende der Kammer betrug.

Der Fluß durch die Kammer wurde so gewählt, daß eine Wandschubspannung zwischen 2,6 dyn/cm2 am Anfang der Kammer und 0,6 dyn/cm2 am Ende der Kammer wirkten. In dem Zuleitungsschlauch befand sich direkt vor der Flußkammer ein Dreiwegehahn. In diesen konnte eine Zellsuspension in die Flußkammer injiziert werden. Das Totvolumen des Dreiwegehahns betrug ca. 25 µl, so daß jeweils 125 µl einer 106/ ml Zellen enthaltenden Zellsuspension injiziert wurden. Innerhalb von 5 Minuten wurde das Zellaliquott ausgespült und nach diesem Zeitraum die Zahl der fest adhärierten Zellen bei weiter bestehender Perfusion pro Gesichtsfeld bei einer 100-fachen Vergrößerung und Anregung bei 490 nm, zur Sichtbarmachung der fluoreszenzmarkierten Zellen, ausgezählt. Es wurde die Zellzahl bei 5, 7,7, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25 und 30 mm, vom Anfang der Kammer aus gemessen, bestimmt.


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6.13.3 Verwendete Leukozyten

Für die Durchführung der Adhäsionsassays wurden Zellinien verwendet, die den Vorteil haben, bei gleichbleibenden Eigenschaften sich gut in Kultur zu vermehren. Zur Untersuchung E- und P-Selectin abhängiger Adhäsion wurden HL60 Zellen verwendet, eine promyeloische Zelline, die stark Sialyl Lewisx haltige Liganden für E- und P-Selectin auf ihrer Zelloberfläche exprimiert ( 146 ).

Zur Untersuchung L-Selectin abhängiger Adhäsion wurde eine prä-B Zellinie, NALM6 Zellen, verwendet ( 120 ). Diese waren stabil mit L-Selectin transfiziert worden und wurden uns freundlicherweise vom Institut für Physiologie der Freien Universität Berlin, Prof. Gaehtgens, zur Verfügung gestellt. Mock-transfizierte NALM6 Zellen dienten als Negativkontrolle. HL60 Zellen und NALM6 Zellen wurden in Suspensionskultur vermehrt. Das Medium bestand aus RPMI 1640 Medium, 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin. Zu den Kulturen transfizierter NALM6 Zellen wurde zusätzlich 200 µg/ml Geniticin (Boehringer Mannheim) gegeben.

Die in den Versuchen verwendeten Zellen wurden vor Versuchsbeginn für 30 Minuten mit 10-4 M 5(6) Carboxyfluoreszein-Diacetet (Sigma, Deisenhofen) bei 4°C in Kulturmedium inkubiert. Die Zellen wurden dann einmal mit Kulturmedium gespült und auf eine Konzentration von 106 Zellen/ ml eingestellt.

Zur Stimulation des CD40 Rezeptors wurden Endothelzellen mit P3x.TBA7 Zellen für 5 Stunden inkubiert. Prof. Kroczek, Robert Koch Institut Berlin, stellte uns freundlicherweise diese mit CD40 Ligand (CD154) stabil transfizierte Myelomzellinie ( 84 ) zur Verfügung. Als Negativkontrolle wurden CD154 negative Wildtypzellen, P3xWT Zellen, verwendet. Um parakrine Effekte auszuschließen, wurden die P3x Zellen zuvor mit 2% Paraformaldehyd fixiert. Die P3x Zellen wurden in RPMI 1640 Medium mit 10 % fötalem Kälberserum, Antibiotika und 200 µg/ml Geniticin kultiviert.


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6.13.4 Behandlung der Zellen für Adhäsionsassay

Die für einen Flußkammerversuch benutzten Endothelzellen wurden auf mit Fibronektin (1 µg/cm2) beschichteten Deckgläschen (24 x 60 mm) ausgesät. Nachdem die Endothelzellen einen konfluenten Monolayer gebildet hatten, wurden sie mit 500 oder 1000 U/ml TNF alpha für die Dauer von 5 Stunden stimuliert.

Um den Einfluß verschiedener Substanzen auf die Interaktion von NALM6 Zellen mit stimulierten Endothelzellen zu untersuchen, wurden Endothelzellen mit den unten angegebenen Zeiten und unter den angegebenen Bedingungen inkubiert. Für nachfolgende Substanzen - außer Cycloheximide - wurden außerdem Konzentrations-Wirkungs-Versuche durchgeführt, und die Substanz dann bei der wirksamsten Konzentration eingesetzt.

  1. Cycloheximide wurde in einer Konzentration von 1 µg/ml 30 Minuten vor Stimulation mit TNF alpha auf die Zellkultur gegeben.
  2. Tunicamycin wurde in einer Konzentration von 10 µg/ml 30 Minuten vor Stimulation mit TNF alpha eingesetzt.
  3. Trypsin (1:250) wurde unmittelbar vor Versuchsbeginn in einer Konzentration von 100 µg/ml in Medium 199 für 30 Minuten auf die Endothelzellen gegeben.
  4. Neuraminidase (Clostridium perfringens) wurde vor Versuchsbeginn in einer Konzentration von 0,1 U/ml in PBS (angereichert mit 0,1 % bovinem Serumalbumin und 0,25 % Glucose, eingestellt auf den pH-Wert 6,3) für 60 Minuten auf die Zellen gegeben.
  5. O-Sialoglykoprotein Endopeptidase wurde entsprechend der vom Hersteller empfohlenen Konzentration von 50 und 80 µg/ml verwendet. Die Einwirkzeit dieses Enzymes bei einer Konzentration von 80 µg/ml betrug 60 Minuten bei 37 OC.
  6. Heparinase I wurde in einer maximalen Konzentration von 0,2 IU/ml angewendet,

    125

    die Temperatur betrug 37 OC, der pH-Wert 7,4 und die Einwirkzeit 120 Minuten.
  7. Heparinase III wurde in einer maximalen Konzentration von 0,2 IU/ml verwendet, bei einer Temperatur von 37 OC, ph-Wert 7,4 und einer Einwirkzeit von 120 Minuten.

Nach Ablauf der jeweiligen Einwirkzeit der entsprechenden Substanz wurde die Zellkultur ausgiebig gespült.

6.14 Zell-ELISA

Endothelzellen der 2. und 3. Passage wurden dazu auf mit Gelatine beschichteten Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon, Heidelberg) ausgesät. Bei Konfluenz der Zellen wurden diese entsprechend dem Protokoll stimuliert. Danach wurden die Platten zweimal mit PBS gespült und mit dem ersten Antköper für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Als Antikörper wurden verwendet: Anti-E-Selectin (BBA2, 2 µg/ml, R&D, Bad Nauheim), Anti-VCAM-1 (BBA5, 5 µg/ml, R&D Bad Nauheim), Anti-ICAM-1 (BBA3, 5 µg/ml, R&D Bad Nauheim), Anti-CD31 (20 µg/ml, Dianova, Hamburg). Daraufhin erfolgte ein dreimaliges Spülen mit PBS, gefolgt von der Inkubation mit einem alkalische Phosphatase markiertem anti-Maus Antikörper (0.3 µg/ml Sigma, Deisenhofen), wiederum für 30 Minuten bei 37°C. Es schloß sich ein erneutes dreimaliges Waschen mit PBS an und die Inkubation mit 100 µl 3,8 mM p-Nitrophenyl-Phosphat in 1 M Diethanolamin-Puffer, pH 9.8. Nach 30-45 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln erfolgte die Auswertung in einem ELISA Meßgerät (MR7000) bei 405 nm.

6.15 RT-Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die zu untersuchenden Zellen wurden hierzu auf mit Gelatine beschichteten 35 mm Kulturschalen ausgesät und bei Konfluenz entsprechend dem Protokoll stimuliert. Die Zellen


126

wurden dann mit Trypsin/ EDTA von den Kulturschalen abgelöst, mit 200 g zentrifugiert und das Pellet bei -70°C bis zur weiteren Verarbeitung aufgehoben. Totale RNA wurde nach der von Chomczynski und Sacchi ( 48 ) beschriebenen Methode isoliert. cDNA wurde durch reverse Transkription mit dem Enzym M-MLV Reverse Transcriptase (GIBCO BRL, Berlin, Germany) unter Verwendung von oligo (dT) Primern in einem Reaktionsvolumen von 20µl bei 42°C über 50 Minuten synthetisiert. Die nachfolgende PCR wurde auf einem Perkin Elmer DNA Cycler (PE 9600 Perkin Elmer, Überlingen) durchgeführt. Die Reakion erfolgte als Duplex PCR in 25 µl Reaktionsvolumen. Für jedes verwendete Primerpaar erfolgte eine gesonderte Optimierung der Reaktion. Die Reaktionsbedingungen sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

 

E-Selectin

VCAM-1

ICAM-1

PDH

 

 

 

 

 

Primermenge (pM)

8 pM

8 pM

16

16

DNTPs (µM)

200

200

200

200

MgCl (mM)

2,5

3,5

2,5

-.-

Amplifikatlänge (mRNA) (Basenpaare)

254

523

215

103

Amplifikatlänge (DNA) (Basenpaare)

380

667

300

185

Zyklenzahl

26

25

28

-.-

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


127

5 µl der Amplifikatlösung wurden in einem 3% Agarosegel elektrophoretisch in TBE-Buffer (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA, pH 8,0) getrennt und mit 0.5 µg/ml Ethidium Bromid getrennt. Zur weiteren quantitativen Auswertung der PCR Reaktion wurde die Amplifikatlösung durch HPLC analysiert. Dazu wurden 20µl Amplifikatlösung mit 80µl Aqua dest. über einer TSK-DEAE Säule (3.5 x 4.6 mm, Perkin Elmer, Überlingen) aufgetrennt wie bei Katz und Haff ( 124 ) beschrieben. Die Elution erfolgte mit einem Trishydroxy-Aminomethan/NaCl, pH 9,0 Gradienten. Das Eluat wurde photometrisch ausgewertet und die Mengen der Amplifikatprodukte durch Integration der Elutionskurve bestimmt. Das Verhältnis der Amplifikationsprodukte PDH zu E-Selectin, VCAM-1 oder ICAM-1 wurde für die Auswertung verwendet.

6.16 Statistische Auswertung der Ergebnisse

Die Zahl der durchgeführten Versuche wurde mit n angegeben. Bei jedem Versuch wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt, bei Adhäsionsversuchen erfolgten Doppelbestimmungen. Die Ergebnisse mehrerer Versuche wurden als Mittelwert ± Standardfehler angegeben. Zur Ermittlung statistisch signifikanter Unterschiede wurde zunächst die Normalverteilung der Daten nach Komogorov-Smirnov für kontinuierliche Variablen ( 102 ) überprüft. Alle Versuchsergebnisse der verwendeten Versuche waren normal verteilt. Es schloß sich dann bei Vergleich von 2 Meßwerten ein Student-T-Test ( 7 ) an, bei Vergleich mehrerer Meßwerte eine Multivarianzanalyse (ANOVA) mit Korrektur nach Bonferoni ( 63 ). Ein statistisch signifikanter Unterschied wurde angenommen, wenn p-Werte < 0,05 errechnet wurden.


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