zur Erlangung der venia legendi

Der Medizinischen Fakultät
Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dr. med. Michael Gräfe

Prof. Dr. med. W. Dudenhausen

Gutachter:
Prof. Dr. Andreas Zeiher, Frankfurt/Main
Prof. Dr. Markus Hecker, Göttingen

eingereicht: 01. 08 2000

Datum der Habilitation: 17. 07. 2001

Kurzfassung:

Während die zellulären Mechanismen der Pathogenese der Arteriosklerose intensiv untersucht worden sind, ist über die Mechanismen, die zu einer bevorzugten Lokalisation arteriosklerotischer Läsionen in bestimmten Gefäßarealen führen, weniger bekannt. Zur Untersuchung dieser Mechanismen wurden Endothelzellen aus menschlichen Koronararterien, einem Gefäßbereich, in dem häufig arteriosklerotische Läsionen beobachtete werden, isoliert und kultiviert. Endothelzellen der Mikrozirkulation menschlicher Herzen wurden unter gleichen Bedingungen kultiviert und die Reaktionen beider Zellarten verglichen. Inkubation der Zellen mit den in Bezug auf die Bildung arteriosklerotischer Plaques besonders pathogenen oxidierten LDL induzierte in makrovaskulären koronaren Endothelzellen eine stärkere Zunahme der PAI-1 Aktivität (182%, p<0,05) als in mikrovaskuläre Zellen (144%, p < 0,05) während nicht oxidierte n-LDL die sezernierte PAI-1 Aktivität nicht beeinflußten. Nach Stimulation mit Angiotensin II (10-11 - 10-5 M) zeigte sich auf makrovaskulären koronaren Endothelzellen eine stärkere Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selectin als auf mikrovaskulären Endothelzellen. Die Angiotensin II induzierte E-Selectin Expression führte in vitro auch funktionell zu einer erhöhten Adhäsion von HL60 Zellen unter Flußbedingungen. Dagegen wurde die für die Leukozytenrekrutierung im Rahmen inflammatorischer Reaktionenen wichtige L-Selectin abhängige Adhäsion von Angiotensin II nicht induziert. Stimualtion mit TNF führte überwiegend an mikrovaskulären Endothelzellen zum Auftreten einer L-Selectin abhängigen Adhäsion. Die unterschiedliche Reaktion mikro- und makrovaskulärer kardialer Endothelzellen bietet eine Möglichkeit, zellspezifische Differenzierung und preferentielle Lokalisation arterioklerotischer Läsionen in makrovaskulären Gefäßbereichen einerseits und das Auftreten entzündlicher Reaktionen im Bereich der Mikrozirkulation andererseits zu erklären.

Schlagwörter:
Endothelzellen, E-SelectinL-Selectin, oxidierte LDL.

Abstract

While the cellular mechanisms of atherosclerosis have been intensively studied, the mechanisms leading to preferential localization of atherosclerotic lesions are less well understood. To further define these mechanisms, endothelial cells from coronary arteries, i.e. vessels with frequent atherosclerotic lesions, were isolated and grown in vitro. In order to compare the reactions of both cell types, endothelial cells derived from microvessels of human hearts were isolated and cultured under identical conditions. Incubation of endothelial cells with oxidized LDL (75 µg/ml protein) induced a significant increase in PAI-1 activity (182 %, p<0.05) in coronary macrovascular endothelial cells. This stimulatory effect of ox-LDL was less significant in microvascular endothelial cells (144%, p<0,05). n-LDL did not influence secreted PAI-1 activity. Stimulation with angiotensin II induced expression of E-selectin more effectively in coronary macrovascular than in microvascular endothelial cells. In addition, angiotensin II-induced E-selectin expression led to increased E-selectin-dependent adhesion of HL60 cells to coronary macrovascular endothelial cells under flow conditions, while only little effects were observed with cardiac microvascular endothelial cells. In contrast, L-selectin-dependent adhesion, which has been shown to play an important role in inflammatory reactions, was preferentially observed in cardiac microvascular endothelial cells and could only be stimulated with TNF, not by angiotensin II. Therefore, these cellular differences may in part explain specific properties of cardiac endothelial cells: Such that atherosclerotic lesions are localized in macrovascular vessel segments, whereas inflammatory responses are predominantly found in the microvasculature.

Keywords:
endothelial cells, E-Selectin, L-Selectin, oxidized LDL.

Inhaltsverzeichnis
Titelseite	Die Bedeutung entzündlicher Reaktionen für die Pathogenese der Arteriosklerose - Untersuchungen an einem in vitro Modell menschlicher kardialer Endothelzellen
1	Zusammenfassung
2	Isolierung und Charakterisierung humaner kardialer makrovaskulärer und mikrovaskulärer Endothelzellen
2.1	Ergebnisse
2.1.1	Histologische Untersuchung von menschlichem Myokardgewebe:
2.1.2	Isolierung mikrovaskulärer Endothelzellen:
2.1.3	Isolation makrovaskulärer Endothelzellen aus Koronararterien:
2.1.4	Beurteilung der isolierten Zellen
2.1.5	Zelltrennung mit paramagnetischen Dynabeads
2.2	Diskussion der Ergebnisse
3	Wirkungen von normalen und oxidiertem LDL auf mikro- und makrovaskuläre kardiale Endothelzellen
3.1	Einleitung
3.2	Ergebnisse
3.2.1	Isolierung und Charakterisierung der LDL
3.2.1.1	Isolierung
3.2.1.2	Aufarbeitung der LDL
3.2.1.3	Charakterisierung der n-LDL
3.2.1.4	Herstellung und Charakterisierung der ox-LDL
3.2.1.5	Endotoxinnachweis
3.2.2	Wirkungen der LDL Fraktionen auf die t-PA-Sekretion mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen
3.2.3	Wirkungen der LDL Fraktionen auf die PAI-1 Aktivität und PAI-1 Sekretion mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen
3.2.4	Wirkungen der LDL Fraktionen auf die prokoagulante Aktivität (PKA) mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen
3.2.5	Wirkungen der LDL Fraktionen auf die Angiotensin Converting Emzyme Aktivität (ACE) mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen
3.3	Diskussion der Ergebnisse
4	Untersuchungen zur Expression von Adhäsionsmolekülen und der Adhäsion von Leukozyten auf kardialen Endothelzellen
4.1	Einleitung
4.2	Ergebnisse
4.2.1	Charakterisierung der Expression von Adhäsionsmolekülen und ihrer mRNA in kardialen Endothelzellen
4.2.1.1	Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit TNF
4.2.1.2	Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit IL4
4.2.1.3	Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit Phorbolester
4.2.1.4	Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit Angiotensin II
4.2.1.5	Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit CD40-Ligand
4.2.2	Charakterisierung der Adhäsion von HL60 Zellen an kardialen Endothelzellen
4.2.2.1	Adhäsion von HL60 Zellen nach Stimulation mit TNF
4.2.2.2	Adhäsion von HL60 Zellen nach Stimulation mit Angiotensin II
4.2.2.3	Adhäsion von HL60 Zellen nach Stimulation mit CD40 Ligand
4.3	Diskussion der Ergebnisse
5	Charakterisierung der L-Selectin abhängigen Adhäsion an kardialen mikrovaskulären Endothelzellen
5.1	Einleitung
5.2	Ergebnisse
5.2.1	Adhäsion von NALM6-L Zellen nach Stimulation mit TNF
5.2.2	Adhäsion von NALM6-L Zellen nach Stimulation mit CD40 Ligand
5.2.3	Untersuchungen zur Wirkung von Neuraminidase
5.2.4	Untersuchungen zur Wirkung von O-Sialoglykoprotein-Endopeptidase und Tunicamycin
5.2.5	Untersuchungen zur Wirkung von Cycloheximid und Trypsin
5.2.6	Untersuchungen zur Wirkung von Heparinasen
5.3	Diskussion
6	Material und Methoden
6.1	Isolierung humaner kardialer mikrovaskulärer Endothelzellen (HMCEC)
6.1.1	Präparation
6.2	Isolierung humaner kardialer makrovaskulärer Endothelzellen (CEC)
6.2.1	Präparation
6.3	Anreicherung von humanen Endothelzellkulturen
6.4	Charakterisierung von humanen Endothelzellen
6.5	Immunhistologie
6.6	Isolierung von Low Density Lipoproteinen (LDL)
6.6.1	LDL Präparation
6.6.2	LDL Charakterisierung
6.6.2.1	Agarose-Gelelektrophorese
6.6.2.2	Cholesterin und Triglyceridbestimmung
6.6.3	Normale LDL (n-LDL)
6.6.4	LDL Modifizierung
6.6.4.1	Herstellung oxidierter LDL (ox-LDL)
6.6.5	Nachweis der Modifizierung der LDL
6.6.5.1	Relative Beweglichkeit in der Agarosegelelektrophorese
6.6.5.2	Fraktionierung des Apoproteins B 100
6.6.5.3	Bestimmung des Malondialdehydgehalts (TBARS)
6.7	Endotoxinnachweis
6.8	Messung von Gewebeplasminogen Aktivator (t-PA)
6.9	Messung von Plasminogen Aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) Aktivität
6.10	Messung der Sekretion von Plasminogen Aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) Antigen
6.11	Messung der Prokoagulanten Aktivität (PKA)
6.12	Messung der Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Aktivität aus Zellkulturüberständen von HMCEC und HCEC
6.13	Adhäsionsassay
6.13.1	Aufbau der Flußkammer
6.13.2	Durchführung des Adhäsionsassays
6.13.3	Verwendete Leukozyten
6.13.4	Behandlung der Zellen für Adhäsionsassay
6.14	Zell-ELISA
6.15	RT-Polymerase Kettenreaktion (PCR)
6.16	Statistische Auswertung der Ergebnisse
Bibliographie	Literaturverzeichnis
Danksagung

Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1:	Interaktionen von Endothelzellen, Leukozyten und Thrombozyten und ihre Modulation durch Zytokine, Angiotensin II und oxidierte LDL bei der Pathogenese der Arteriosklerose
Abbildung 2.1:	Histologische Präparate menschlichen Herzens wurden mit Antikörpern gegen von Willebrand Faktor (a), CD31 (b) gefärbt. Zusätzlich erfolgte eine Anfärbung mit dem Ulex Europaeus Lectin (c) und der alkalischen Phosphataseaktivität (d)
Abbildung 2.2:	Ein bei der Isolierung mikrovaskulärer Endothelzellen gewonnenes Kapillarfragment. a) Phasenkontrastdarstellung. b) Färbung mit FITC Ulex Europaeus Lectin (Vergrößerung 1:100)
Abbildung 2.3:	Aufnahme von Ac-DiI-LDL durch mikrovaskuläre und makrovaskuläre koronare Endothelzellen. Nach Inkubation der Zellen über 4 h mit Ac-DiI-LDL wurde die Fluoreszenz der Zellen im Durchflußzytometer analysiert. a) makrovaskuläre koronare Endothelzellen. b) mikrovaskuläre Endothelzellen nach Abtrennung nicht-endothelialer Zellen. c) mikrovaskuläre Endothelzellen vor Abtrennung nicht-endothelialer Zellen mit paramagnetischen Dynabeads. d) Fibroblasten dienten als Negativkontrolle
Abbildung 2.4:	Analyse von mikrovaskulären und makrovaskulären koronaren Endothelzellen im Durchflußzytometer nach Färbung mit CD31 Antikörpern. Die Reinheit der Kulturen nach Abtrennung nicht-endothelialer Zellen wurde mit Hilfe des CD31 Antikörper beurteilt. a) makrovaskuläre koronare Endothelzellen. b) mikrovaskuläre Endothelzellen. Nabelschnurvenen Endothelzellen (c) dienten als Positivkontrolle, Fibroblasten (d) als Negativkontrolle
Abbildung 2.5:	Darstellung der alkalischen Phosphataseaktivität mikrovaskulärer Endothelzellen vor (a) und nach (b) Abtrennung nicht endothelialer Zellen durch paramagnetische Dynabeads. Alkalische Phosphataseaktivität stellte sich rot dar
Abbildung 3.1:	Agarose Gel Elektrophorese. n-LDL (untere Bande) und ox-LDL (obere Bande) zeigen eine unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit. Der Auftragungspunkt derProben ist rechts
Abbildung 3.2:	Thiobarbitursäure reaktive Substanzen (TBARS) Assay: Der TBARS Assay wurde verwendet, um den Oxidationsgrad von n-LDL und mit Cu2+ oxidierten LDL zu bestimmen (n = 4)
Abbildung 3.3:	Sekretion von t-PA in den Kulturüberstand nach Stimulation von mikrovaskulären (a) und makrovaskulären koronaren Endothelzellen (b) mit n-LDL (Dreiecke) oder ox-LDL (Rauten). # = p<0,05 gegen Kontrollen, * = p<0,05 gegen n-LDL
Abbildung 3.4:	PAI-1 Aktivtät von mikrovaskuläre Endothelzellen (a) und koronare Endothelzellen (b) unter Inkubation mit n-LDL (Dreicke) und ox-LDL (Rauten). # = p<0,05 gegen Kontrollen, * = p<0,05 gegen n-LDL
Abbildung 3.5:	Sekretion von PAI-1 Antigen durch makrovaskuläre koronare Endothelzellen unter Inkubation mit n-LDL (Dreiecke) und ox-LDL (Rauten). # = p < 0,05 gegen Kontrollen, * = p<0,05 gegen n-LDL
Abbildung 3.6:	Prokoagulante Aktivität mikrovaskulärer Endothelzellen (a) und koronare Endothelzellen (b) unter Inkubation mit n-LDL (Dreiecke) und ox-LDL (Rauten). # = p<0,05 gegen Kontrollen, * = p<0,05 gegen n-LDL
Abbildung 4.1:	Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 auf makrovaskulären und mikrovaskulären kardialen Endothelzellen. Die Zellen wurden 4 h (E-Selectin), 12 h (VCAM-1) oder 24 h (ICAM-1) mit TNF stimuliert und die Expression der Adhäsionsmoleküle mit einem Zell-ELISA quantifiziert. (n = 12, *, +, # = p<0,05; **, ++, ## = p < 0,01).
Abbildung 4.2:	Duplex PCR für E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 und PDH als Standard. Es wurde jeweils die mRNA der Adhäsionsmoleküle in koronaren makrovaskulären Endothelzellen im Zeitverlauf von nicht stimulierten Zellen und von Zellen die über 4, 8, 12 und 24 Stunden mit 1000 U/ml TNF stimuliert wurden, dargestellt.
Abbildung 4.3:	Duplex PCR für E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 mit PDH als Standard. Die PCR Produkte wurden durch HPLC quantifiziert. Die mRNA nichtstimulierter makrovaskulärer Endothelzellen (offene Symbole) und mit 1000 U/ml TNF stimulierter Zellen (gefüllte Symbole) wurde im Zeitverlauf analysiert und vergleichend dargestellt (n=3). **, ++, ## = p < 0,01.
Abbildung 4.4:	Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 auf mikrovaskulären und makrovaskulären koronaren Endothelzellen unter Stimulation mit IL-4. Die Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle wurde mit einem Zell-ELISA gemessen. (n=5, *,#,+ =p<0,05, **,++,## = p<0,01)
Abbildung 4.5:	Makrovaskuläre koronare Endothelzellen wurden mit IL-4 (200 U/ml) über 24 h stimuliert und die mRNA der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in einer Duplex-PCR mit PDH als Standard zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert. (n=3, + = p<0,05)
Abbildung 4.6:	Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach Stimulation mit Phorbolester (PMA, 10-11 - 10-7 M). Die Expression der Adhäsionsmoleküle auf der Endothelzelloberfläche wurde mit Hilfe eines Zell-ELISA bestimmt. (n=5, *,#,+ =p<0,05, **,++,## = p<0,01)
Abbildung 4.7:	mRNA der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach Stimulation mit IL-4 (200 U/ml). Makrovaskuläre koronare Endothelzellen wurden mit Phorbolester (PMA, 10-8 M) über einen Zeitraum von 24 Stunden stimuliert und die mRNA der Adhäsionsmoleküle in einer Duplex-PCR mit PDH als Standard zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert. (n=3, *, +, # = p<0,05)
Abbildung 4.8:	E-Selectin Expression auf mikro- und makrovaskulären Endothelzellen nach Stimulation mit Angiotensin II. Die Zellen wurden über 4 Stunden mit Angiotensin II stimuliert und anschließend mit Hilfe eines Zell-ELISA die Expression von E-Selectin bestimmt (n=4, *=p<0,05, **=p<0,01)
Abbildung 4.9:	Nach Stimulation mit Angiotensin II über 4 Stunden wurde die Expression von VCAM-1 (Dreiecke) und ICAM-1 (Quadrate) untersucht. (n=5, *=p<0,05, **=p<0,01)
Abbildung 4.10:	E-Selectin mRNA nach Stimulation mit Angiotensin II. Makrovaskuläre koronare Endothelzellen wurden über 4 Stunden mit Angiotensin II (10-7 M) stimuliert. Nach RNA Extraktion erfolgte eine Duplex PCR mit PDH als Standard. A) Agarose Gel der Amplifikationsprodukte. B) HPLC Chromatogramm der Amplifikationsprodukte
Abbildung 4.11:	Stimulation von Endothelzellen aus Nabelschnurvenen mit TNF und CD40 Ligand (CD154) über 4 Stunden. Die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 wurde nach Färbung mit spezifischen monoklonalen Antikörpern im Durchflußzytometer analysiert (n = 3).
Abbildung 4.12:	Adhäsion von HL60 Zellen an TNF stimulierte kardiale Endothelzellen. Die Zellen wurden mit 1000 U/ml TNF über 4 Stunden stimuliert und anschließend die Adhäsion von HL60 Zellen bestimmt. Gezählt wurde die Anzahl der fest adhärierenden Zellen pro Gesichtsfeld (Vergrößerung 1:100, n=4-12, * = p < 0,05, ** p < 0,01 TNF gegen TNF + BBA2, # = p<0,05, ## = p<0,01 Kontrolle gegen TNF)
Abbildung 4.13:	Adhäsion von HL60 Zellen an Angiotensin II stimulierte kardiale Endothelzellen. Die Zellen wurden mit 10-7 M Angiotensin II über 4 Stunden stimuliert und anschließend die Adhäsion von HL60 Zellen bestimmt. Gezählt wurde die Anzahl der fest adhärierenden Zellen pro Gesichtsfeld (Vergrößerung 1:100). Die Zahl der adhärierten Zellen wurde in Prozent der Positivkontrolle (TNF stimulierte Zellen) dargestellt. n=4-12, * = p < 0,05, ** p < 0,01 Angiotensin II gegen Kontrolle, # = p<0,05, ## = p<0,01 Angiotensin II gegen Angiotensin II + BBA2
Abbildung 4.14:	Wirkungen der Angiotensin II Rezeptorblocker DUP 753 (Typ1 Rezeptorblocker) und PD 123177 (Typ2 Rezeptorblocker) auf die Angiotensin II induzierte E-Selectin abhängige Adhäsion von HL60 Zellen. Makrovaskuläre koronare Endothelzellen wurden in Anwesenheit von DUP 753, PD123177 oder beiden Substanzen stimuliert und die Adhäsion von HL60 Zellen bestimmt. (n=5, * = p < 0,05; ** = p<0,01)
Abbildung 4.15:	E-Selectin abhängige Adhäsion von HL60 Zellen nach Stimulation von CD40. a) Nabelschnurvenen Endothelzellen wurden mit CD40 Ligand exprimierenden P3x.TBA7 Zellen für 4 Stunden stimuliert und anschließend die Adhäsion von HL60 Zellen im Wandschubspannungsbereich 1 - 1,9 dyn/cm2 bestimmt. b) Vergleich der Adhäsion nach Stimulation mit TNF (500 U/ml), CD40 Ligand (200 000 P3x.TBA7 Zellen/cm2), CD40 Ligand negativen Zellen (P3xWT) sowie in Anwesenheit eines Anti-CD40 Antikörpers (MoAB TRAP, 10µg/ml) und eines Anti-E-Selectin Antikörpers (MoAB BBA2, 10 µg/ml). n=5, *=p<0,05, **=p<0,01 Kontrolle gegen TNF; #=p<0,05, ##=p<0,01 gegen CD40 Ligand alleine; ++=p<0,01 TNF gegen CD40 Ligand
Abbildung 5.1:	L-Selectin abhängige Adhäsion an mikrovaskulären Endothelzellen. Die Adhäsion von L-Selectin positiven NALM Zellen (NALM6-L, gefüllte Kreise) nach Stimulation der mikrovaskulären Endothelzellen mit TNF über 5 Stunden wurde als Positivkontrolle verwendet und mit der Adhäsion L-Selectin negativer NALM Zellen an TNF stimulierte Endothelzellen (NALM6, geschlossene Vierecke) und NALM6-L an nicht stimulierte Endothelzellen (offene Kreise) verglichen (n= 12)
Abbildung 5.2:	Effekte des Anti-L-Selectin Antikörpers LAM 1-3 und der L-Selectin IgG Chimäre auf die Adhäsion von NALM6-L Zellen an TNF stimulierte mikrovaskuläre kardiale Endothelzellen (n = 3, * = p<0.05).
Abbildung 5.3:	L-Selectin abhängige Adhäsion von NALM6-L Zellen bei 2 dyn/cm2 nach Stimulation des CD40 Rezeptors. Mikrovaskuläre Endothelzellen wurden mit CD154 positiven P3x.TBA7 Zellen für 5 Stunden stimuliert. Als Positivkontrolle wurden Endothelzellen mit 500 U/ml TNF stimuliert. L-Selectin negative NALM6 Zellen dienten als Negativkontrolle (n = 5)
Abbildung 5.4:	Wirkung von Neuraminidase auf L-Selectin abhängige Adhäsion von NALM6-L Zellen und E-Selectin abhängiger Adhäsion von HL60 Zellen an mikrovaskuläre kardiale Endothelzellen (n = 3)
Abbildung 5.5:	L-Selectin abhängige Adhäsion nach Inkubation der mikrovaskulären Endothelzellen mit O-Sialoglykoprotein-Endopeptidase (OSGP, 80 µg/ml, links). Die Wirksamkeit der Behandlung mit OSGP wurde mit HL 60 Zellen verifiziert (rechts)
Abbildung 5.6:	Hemmung der L-Selectin abhängigen Adhäsion von NALM6-L Zellen an TNF stimulierten mikrovaskulären Endothelzellen durch Tunicamycin (10 µg/ml), einem Hemmer der N-Glykosilierung (n = 5)
Abbildung 5.7:	Wirkung von Trypsin und Cycloheximid auf die TNF induzierte L-Selectin abhängige Adhäsion von NALM6-L Zellen bei Wandschubspannungen > 2 dyn/cm2
Abbildung 5.8:	Die Wirkung von Heparinase I und Heparinase III (Heparitinase I) auf die L-Selectin abhängige Adhäsion von NALM-6 Zellen an TNF stimulierten mikrovaskulären Endothelzellen (n = 3). * = p < 0,05 gegen TNF
Abbildung 6.1:	Schematische Darstellung des Aufbaus zur Perfusion der Myokardstücke
Abbildung 6.2:	Schematische Darstellung der Flußkammer. Die Form der Kammer wurde so gewählt, daß die Wandschubspannung linear mit der Entfernung vom Anfang zum Ende der Kammer abnimmt. Die Flußgeschwindigkeit des Perfusionsmedium wurde so justiert, daß die Wandschubspannung 2,6 dyn/cm2 am Anfang und ca. 0,6 dyn/cm2 am Ende der Kammer betrug.

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