Thema „Strukturelle und funktionelle Zusammenhänge und Unterschiede archaebakterieller und eukaryontischer 20S-Proteasome“

Habilitationsschrift

zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach
Biochemie

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von
Herrn Dr. Michael Groll


geboren am 23.09.1971 in Donauwörth

Dekane:Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen
Prof. Dr. med Martin Paul

eingereicht am: 09/2003

öffentlich-wissenschaftlicher Vortrag am: 22.11.2004

Gutachter:
1. Prof. Dr. Walter Sebald
2. Prof. Dr. Udo Heinemann

Widmung:

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

• 1  Zusammenfassung
• 2  Einleitung
  • 2.1 Proteolytische Enzyme
  • 2.2 Das Proteasom
    • 2.2.1 Funktion und Aufgabe des Proteasoms
    • 2.2.2  Vorkommen des Proteasoms
    • 2.2.3 Struktur und Aufbau des 20S-Proteasomkomplexes
    • 2.2.4 Aufgaben der proteasomalen α- und β-Untereinheiten
    • 2.2.5 Das proteolytisch aktive Zentrum im 20S-Proteasom
    • 2.2.6  Spezifitäten der S1-Taschen in eukaryontischen 20S-Proteasomen
    • 2.2.7 Generierung von Oligopeptiden durch das 20S-Proteasom
    • 2.2.8 Substratzugang in das 20S-Proteasom
  • 2.3 Inhalt der vorliegenden Arbeit
• 3  Ergebnisse und Diskussion
  • 3.1 Strukturelle Einblicke in die Reifung archaebakterieller 20S-Proteasome
    • 3.1.1 Das 20S-Proteasom aus A. fulgidus
    • 3.1.2 Der α-Ring aus A. fulgidus: ein frühes Assemblierungsintermediat
    • 3.1.3 Die α7β7β7α7-Proteasommutante aus A. fulgidus: ein spätes Assemblierungs­intermediat
  • 3.2 Proteolyse- und Autolysemechanismus von 20S-Proteasomen
    • 3.2.1 Der Mechanismus der Autoproteolyse
    • 3.2.2 Die Funktion der β-Propeptide
    • 3.2.3 Die Funktion von Lys33 in der Proteolyse
  • 3.3 Substratzugang zum proteolytisch aktiven Zentrum in 20S-Proteasomen
    • 3.3.1 Strukturelle Unterschiede prokaryontischer und eukaryontischer 20S-Protea­some
    • 3.3.2  Der Mechanismus der Kanalbildung in eukaryontischen 20S-Proteasomen
    • 3.3.3 Die Regulatoren von eukaryontischen 20S-Proteasomen
    • 3.3.4 Das YDR-Motiv in archaebakteriellen 20S-Proteasomen
  • 3.4 Inhibitoren des 20S-Proteasoms
    • 3.4.1 Kovalent bindende 20S-Proteasominhibitoren
    • 3.4.2 Nicht kovalent bindende 20S-Proteasominhibitoren
• Danksagung
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungen
• Lebenslauf und Publikationen
• Eidesstattliche Versicherung
• Sonderdrucke

Tabellen

• Tabelle 1 : Bevorzugte Schnittpräferenzen eukaryontischer 20S-Proteasome

Bilder

• Abb. 1 : Kugelmodell (A, D und G), Ribbonplot (B, E und H) und Ober­flächenmodell (C, F und I) der 20S-Proteasome aus T. acidophilum (Löwe et al., 1995), S. cerevisiae (Groll et al., 1997) und E. coli (Bochtler et al., 1997). Für die Oberflächenmo­delle wurden die Mole­küle entlang der nichtkri­stallographischen Sym­metrie- bzw. Pseudo­symmetrieachse aufge­schnitten. Die Schnitt­flächen sind weiß einge­färbt und die aktiven β-Untereinheiten mit dem Calpain-In­hibitor I komplexiert. Der Inhibitor ist als ball-and-sticks in gelb eingezeich­net.
• Abb. 2 : Ribbonplot der α- und β-Untereinheit aus T. acidophilum (Löwe et al., 1995). Die Helices und Faltblätter sind in blau bzw. grün eingezeichnet und die Sekundär­strukturelemente von H0 bis H5 bzw. von S1-S10 schwarz beschrif­tet..
• Abb. 3 : a)Ribbonplot der hslV-Prote­ase. Eine der hslV-Untereinheiten ist in blau ein­ge­zeichnet, wäh­rend die rest­lichen in braun dargestellt sind. b) Überla­gerung einer hslV-Unter­einheit mit der β-Unterein­heit des Thermo­plasma -20S-Proteasoms. Die Struk­tur­überlagerung der beiden Moleküle zeigt eine nahezu iden­tische Faltung; aller­dings enthal­ten die hslV-Untereinheiten nicht die in 20S-Proteasomen gefun­dene C-terminale Helix H5. c) Struktureller Vergleich des hexa­meren hslV-Ring­systems mit dem heptameren Thermo­plasma-20S-Proteasom-β-Ring. In der Abbildung wurden die be­schrifteten Untereinheiten strukturell über­lagert und anhand der neu generierten Koor­dinaten die jeweiligen Ringsysteme aufge­baut (Bochtler et al., 1997).
• Abb. 4 : a) Sequenzüberlagerung der einzelnen α-Untereinheiten aus S. cerevisiae und T. acidophilum. Konser­vierte Aminosäuren sind in rot eingefärbt, β-Stränge in Pfeil und Zylinderform dargestellt. b) Ribbonplot der einzelnen α-Untereinheiten aus S. cerevisiae. Die Orientierung ist identisch zu der in Abb. 2 dargestellten Unter­einheiten aus T. acidophilum. c) Sequenzüberlagerung der einzelnen β-Untereinheiten aus S. cerevisiae und T. acidophilum. Für β1 (grün), β2 (gelb) und β5 ( blau) sind zusätzlich die humanen Untereinheiten mit den ent­sprechenden γ-interferon-induzierbaren Austauschkomponenten dargestellt. Konservierte Aminosäuren sind in rot eingefärbt, β-Stränge in Pfeil und Zylinderform dargestellt. Die Aminosäuren 20, 31, 35 und 45 für β1 sind als spezifische Reste der S1-Tasche orange eingefärbt. d) Ribbonplot der einzelnen β-Untereinheiten aus S. cere­visiae.
• Abb. 5 : Ausschnitt aus der Hefe-20S-Protea­somstruktur. Die Cα-Ketten der Unterein­heiten β1, β2, β3, β6’ und β7’ sind in den Farben blau, rot, grün, zyan und lila dargestellt. Die für die verschiedenen Unterein­heiten charakteris­tischen Wechselwirkungen sind als verstärkte Linien her­vorgehoben
• Abb. 6 : Stereoabbildung der räumlichen Anordnung der Aminosäuren rund um das Thr1 der proteolytisch aktiven Untereinheit β1. Der Protein-backbone ist als weißer coil und die Aminosäuren Thr1, Asp17, Lys33, Ser129, Asp166 und Ser169, welche hauptsächlich für das nukleophile Zentrum verantwortlich sind, als balls-and-sticks dargestellt. Lys33 ist aufgrund der Bildung einer Salzbrücke mit Asp17 positiv geladen (zyane Rasterpunkte; beide Aminosäuren sind gelb eingezeichnet). Hierüber wird das elektrostatische Potential der Thr1Oγ-Gruppe abgesenkt. In unmittelbarer Nachbarschaft zum Thr1 befinden sich die Aminosäuren Ser129, Asp166 und Ser169 (schwarz), welche für die konformelle Stabilität des Thr1 verantwortlich sind (lila Raster­punkte). Das Wassermolekül NUK, eingezeichnet als grüne Kugel, befindet sich in der Elektronendichte nahe dem Thr1Oγ und N und vermittelt einerseits über eine Shuttle-Funktion die Protonenübertragung, vom Thr1Oγ zum N-Terminus (grüner Kreis) andererseits die Hydrolyse das Acylesterintermediats (Groll&Huber, 2003b).
• Abb. 7 : a-c) Oberflächenmodell der drei verschiedenen proteolytisch aktiven Untereinheiten β1, β2 und β5 des Hefe-20S-Proteasoms. Die einzelnen Abbildungen zeigen das nukleophile Thr1 als balls-and-sticks. Basische Atome sind als blaue, saure Atome als rote und hydrophobe Atome als weiße Oberflächen eingezeichnet. In grün ist die für die jeweilige Untereinheit charakteristische Proteaseaktivität dargestellt.
• Abb. 8 : Stereoabbildung der strukturellen Überla­gerung der Cα-Atome von der α-Untereinheit aus dem α7-Ring (gelb) mit der α-Unter­einheit aus dem 20S-Protea­som (blau) von Archaeoglo­bus fulgidus. Die N- bzw. C-Termini der jeweiligen Unter­einheiten sind in schwarz beschriftet.
• Abb. 9 : Ribbonplot des Archaeoglobus-20S-Proteasoms aus Wildtyp und der β-Thr1Gly-Mutante. Die in der Kristallstruktur geordneten Aminosäuren sind in blau eingezeichnet, die fehlgeordneten Aminosäuren sind in rot dargestellt. Die schwarzen gestrichelten Linien deuten mit einer Länge von 69Ả den gemeinsamen Schwerpunkt halber 20S-Proteasome an. Im Falle der β-Thr1Gly-Mutante sind im Unterschied zum Wildtyp die halben 20S-Partikel über eine 4.5Ả Lücke voneinander getrennt. b) Ribbonplot von drei benachbarten β-Untereinheiten der β-Thr1Gly-Mutante mit struktureller Fehlordnung innerhalb der β-β-Schnittfläche.
• Abb. 10 : Stereoabbildung der räumlichen Anordnung der Aminosäuren rund um das Thr1. Vorgeschlagener Reaktionsmechanismus der Autolyse und der Substratproteolyse am Beispiel der Untereinheit β1 des Hefe-20S-Proteasoms. Der Protein-backbone ist in Form von weißen coils, das Thr1 als schwarze balls-and-sticks dar­gestellt. Der Calpain-Inhibitor I sowie das β1-Propeptid sind als gelbe beziehungsweise braune coils einge­zeichnet. Die Überlagerung der β1-Hauptkettenatome aus Wildtyp und β1T1A-Mutante ergeben eine rms-Abweichung von 0.19Ẵ und erlauben somit den Austausch der Koordinaten von Ala1 mit Thr1. Das resul­tierende Modell zeigt, daß die Autolyse als auch die Proteolyse (lila Rasterpunkte) durch die Protonenübertra­gung vom Thr1Oγ zum N-terminus unter Zuhilfenahme des Wassermoleküls NUK (grüne Kugel) eingeleitet wird. Gly47N (dargestellt in schwarz) besitzt die Funktion des Oxyanion-holes für Substrate und Inhibitoren, indem es durch Energieabsenkung den tetraedrischen Addukt-Übergangszustand stabilisiert. Hingegen ist Ser129N (eingezeichnet in schwarz) hauptsächlicher Bestandteil des Oxyanion-holes für die Propeptide und steht in Wechselwirkungen mit der Carbonylsauerstoffgruppe des Gly(-1), während Lys33Nε mit der Carbonylsauer­stoffgruppe der Aminosäure in Position (-2) interagiert. Wasserstoffbrückenbindungen sind als schwarze Raster­punkte illustriert. Der Additonsreaktion des Thr1Oγ mit dem Carbonylkohlenstoff des Gly(-1) (Autolyse) oder mit dem Carbonylkohlenstoff des Nle1 (Proteolyse) folgt die Esterbildung, welche in beiden Mechanismen durch die Einlagerung des nukleophilen Wassermoleküls NUK zum Produkt hydrolysiert wird.
• Abb. 11 : a) Sequenzalignierung der verschiedenen N-Termini von den proteasomalen α-Untereinheiten aus T. acidophilum (TA) und S. cerevisiae (SC). Die Numerierung der Aminosäuren der α-Untereinheiten aus Hefe ist der Primärsequenz der α-Untereinheit aus Thermoplasma angepaßt. Mit Aminosäure Thr13 beginnt in den α-Untereinheiten von Thermoplasma definierte Elektronendichte (vertikale blaue Umrandung). Links vom Kasten befinden sich die N-terminalen Aminosäuren (N-terminal tails), die im Falle der Hefeuntereinheiten jeweils eine entsprechende Farbkodierung besitzen. Aminosäuren mit struktureller Fehlordnung sind in grau dargestellt; Aminosäuren, die in den Kristallstrukturen des Thermoplasma-20S-Proteasoms sowie der Hefe-20S-α3ΔN-Mutante definierte Elektronendichten zeigen, sind über einen grauen Hintergrund hervorgehoben. Es wurden ausschließlich die über N-terminale Sequenzanalyse identifizierten Aminosäuren verwendet. Die konservierte Helix H0 ist als gelber Balken eingezeichnet. b-d) Ribbonplot der α-Ringe aus T. acidophilum und Hefe. Für Hefe sind die N-terminalen tails mit der in (a) verwendeten Farbkodierung in Klammern angegeben. In den Hefestrukturen ist die pseudosiebenzählige Symmetrieachse als schwarzer Kreis (c) bzw. als schwarze Raster­linie (d) und (e) eingezeichnet.
• Abb. 12 : Elektronendichtekarten der α-Ringe des Hefe-20S-Proteasoms aus a) Wildtyp und b)α3ΔN-Zellen. Die Elektronendichten sind mit 2FoFc-Koeffizienten nach zweifacher Mittelung bei 1σ konturiert. Die N-terminalen tails sind entsprechend der Farbkodierung von Abbildung 11a wiedergegeben.
• Abb. 13 : a) Einfluß von modifizierten synthetischen α3-N-terminalen tail-Peptiden auf die proteolytische Aktivität der α3ΔN-Mutante gegenüber chromogenen Substraten. Die proteolytische Aktivität der Proteasom­mutante wird auf 100% festgelegt. Abhängig von der Sequenzfolge (Polyalaninscan, eingezeichnet in rot) zeigen die Peptide mit Ausnahme des Asp9Ala-Ersatzes bei Konzentrationen von 5mM und einer Vorinkubation von 15min starke Wechselwirkungen mit der Mutante. Ebenso wie die Asp9Ala-Substitution besitzt der konservierte Austausch von Asp9Glu oder Asp9Asn im Peptid (eingezeichnet in grün) wenig bzw. kaum einen Einfluß auf die proteolytische Aktivität der α3ΔN-Mutante. b) Atomarer Ausschnitt des Eingangsportals in der geschlos­senen Konformation des Hefe-20S-Proteasoms aus Wildtypzellen. Die N-terminalen Reste sind in gleicher Farb­kodierung dargestellt wie in Abb. 11a. Interaktionen zwischen den verschiedenen Aminosäuren sind nur für das YDR-Motivs als schwarze Rasterlinien eingezeichnet. Die Carboxylatgruppe von Asp9 der Untereinheit α3 bildet sowohl eine Salzbrücke mit der Guanidiniumgruppe von Arg10 als auch eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Hydroxylgruppe des Tyr8 der benachbarten Untereinheit α4. Die Carboxylatgruppe wechselwirkt ebenso mit den Amidstickstoffen der Proteinhauptkette Ser10 und Arg11 der Untereinheit α3. Die Ergebnisse erlaubten Planung und Umsetzung der α3-Asp9Ala-Mutante (dargestellt in blau), Diese besitzt gegenüber chromogenen Substraten eine ähnliche proteolytische Aktivität wie die α3ΔN-Mutante (a). Asp9 nimmt somit eine Schlüssel­funktion für den Regulationsmechanismus des Öffnens und Schließens ein.
• Abb. 14 : Ribbonplot der α-Ringe von a) A. fulgidus und b) Hefe (dargestellt in blau). Die N-terminalen Segmente sind in rot eingezeichnet. Das YDR-Motiv ist als balls-and-sticks gezeigt und Kontakte mit benach­barten Untereinheiten sind schwarz gefärbt. In A. fulgidus und in Hefe liegt jeweils eine Wasserstoffbrückenbin­dung zwischen Asp9 und dem benachbarten Tyr8 vor, jedoch unterscheiden sich die Tertiärstrukturen vonein­ander deutlich. In a) ist für das YDR-Motiv die siebenfach gemittelte Elektronendichte mit 2FO-FC-Koeffizienten bei 1σ dargestellt.
• Abb. 15 : a) Stereoabbildung der Hefe-20S-Proteasom-Untereinheiten (dargestellt in weiß und grau) kom­plexiert mit den Inhibi­toren (darge­stellt in grün) a) Lactacystin, b) Epoxomicin, c) MB1 und d) TMC95A. Die Elektro­nendichte­karten (dargestellt in blau) sind über 1σ kontu­riert und zeigen jeweils eine ähnliche Orientierung des Thr1 (darge­stellt in schwarz) mit 2FO-FC-Koeffizienten nach zweifacher zy­klischer Mittelung. Es wurden keine großen strukturellen Verän­derungen im Proteinmolekül mit Ausnahme des ge­bundenen Inhibitors gefunden. Die Temperaturfaktorverfeinerung deutet auf eine vollständige Beset­zung aller Inhibitor-Bindestellen hin. Die Inhibitoren wurden für die Berechnungen der Elektronendich­ten ausgeschlossen. a) Die Unter­einheit β5 kovalent gebundnen an den Streptomyces-Metaboliten Lac-tacystin. Die P1-Taschen der Unter­einheiten β1 und β2 unter­scheiden sich von der P1-Tasche in der Untereinheit β5 und zeigen keine Komplexbildung mit Lacta­cystin. Met45 der Untereinheit β5 (darge­stellt in schwarz) ist haupt­sächlich für den hydrophoben Cha­rakter der β5-S1-Tasche verant­wortlich und bestimmt auf­grund der Wechselwir­kung mit der ver­zweig­ten Seiten­kette von Lactacystin die Unterein­heitenspezifität. b) Die Untereinheit β2 kova­lent gebunden mit dem na­türlich vorkommenden 20S-Protea­sominhibitor Epoxo­micin. Die Elektronendichte zeigt eine hexa­mere Ringbil­dung von Epoxomicin am proteolytisch akti­ven Zen­trum. Dieses Morpholino­derivat resultiert aus der Addukt­formation zwischen Epoxomicin und dem protea­somalen Thr1Oγ und N und erklärt die Selek­tivität von Epoxo­micin gegenüber der Klasse der Ntn-Hydrolasen. c) Die Unter­einheit β2 kovalent gebunden mit dem spe­zifischen synthetischen Inhibitor Ac-PRLN-vs. Günstige Wasserstoffbrückenbindungen zwi­schen der Arg-Seitenkette des Vinylsul­fons mit den für die P3-Tasche ver­antwortlichen Aminosäuren β2-Asp28 und β3-Cys118 sind als orange Punkte dargestellt und verantworten die Selektivität dieses Inhibitors. Die Untereinheiten β1 und β5 zeigen keine Inhi­bitor-Bindestellen. d) Die Unter­einheit β2 nicht-kovalent gebunden mit dem Naturprodukt TMC-95A aus Apio­spora montagnei. TMC-95A bindet lediglich in die Substratbindetaschen aller aktiven Untereinheiten und modi­fiziert somit nicht das nukleophile Thr1Oγ. Die Wechselwirkungen des Inhibitors sind begründet durch die Fal­tung des Proteinmo­leküls, so daß die Klasse der TMC-95-Verbindungen keine Effekte bezüglich anderer Protea­sen aufzeigt.
• Abb. 16 : a) Chemische Strukturformel der TMC-95-Verbindungen mit den Diastereomeren A-D. b) Überla­gerung der β5-Untereinheiten komplexiert mit TMC-95A und Epoxomicin. Die Abbildung ist auf die Inhibitoren (TMC-95A, dargestellt in gelb und Epoxomicin, dargestellt in grün) und das proteolytisch aktive Thr1 (darge­stellt in schwarz) beschränkt. Die Überlagerung deutet auf eine analoge Anordnung der Seitenketten für die P1- und P3-Tasche für beide Inhibitoren hin und erlaubt somit das Design einer möglichen Leitstruktur von Protea­sominhibitoren. c) Leitstruktursegment der TMC-95-Verbindungen, das für die spezifische Hemmung der Proteasome verantwortlich ist. Die Reste S1 und S2, dargestellt in blau, markieren die spezifischen Seitenketten, die hauptsächlich die Selektivität der verschiedenen Untereinheiten bestimmen.