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2  Einleitung

2.1 Proteolytische Enzyme

Eukaryontische Zellen besitzen zwischen 6000 und 50000 verschiedene Enzyme, von denen jedes eine bestimmte chemische Reaktion katalysiert. Eine der am längsten bekannten Klassen von Enzymen stellen die Proteasen dar. Sie gehören systematisch zu den C-N-Hydrolasen und spalten Peptidbindungen. Je nach Angriffspunkt innerhalb der Peptidkette des Substrats unterscheidet man zwischen Exopeptidasen (spalten Aminosäuren vom N- oder C-Terminus ab, z.B. Aminopeptidasen, Carboxypeptidasen) und Endopeptidasen (spalten inner­halb der Polypeptidkette, z.B. Pepsin, Trypsin). Heute sind mehr als 500 Proteasen bekannt, die anhand der reaktiven Gruppen des aktiven Zentrums wie folgt eingeteilt werden:

1. Serin-Proteasen:

Ser- und His-Rest im aktiven Zentrum

2. Cystein-Proteasen:

Cys-Rest im aktiven Zentrum

3. Aspartat-Proteasen:

Asp-Reste im aktiven Zentrum

4. Metallo-Proteasen:

Metallion im aktiven Zentrum

5. Nicht klassifizierte Proteasen

 

Die meisten Proteasen sind spezifisch für bestimmte Sequenzen von Aminosäuren der zu spaltenden Polypeptidkette. Um einen regulierten Proteinabbau in der Zelle zu gewährleisten, werden viele Peptidasen in Form inaktiver Vorstufen, sogenannter Zymogene, synthetisiert. Die spezifische Spaltung des Zymogens führt über Konformationsänderungen von Amino­säuren im aktiven Zentrum zur katalytisch aktiven Protease.

Ursprünglich wurde der Proteinabbau als primär lysosomal angesehen (Darnell et al., 1990). Lysosomen sind membranumschlossene Organellen, die etwa 50 verschiedene hydro­lytische Enzyme, unter anderem Proteasen wie Cathepsine und Kollagenasen, enthalten. Diese Enzyme sind an den sauren pH-Wert der Lysosomen von 4.8 angepaßt (Bainton, 1981) und bauen nach Fusion mit Endosomen und Autophagosomen exogene und endogene Sub­strate ab (Goldberg et al., 1974). Die Beobachtung, daß der Proteinabbau unter anaeroben Bedingungen inhibiert ist, führte zur Entdeckung eines cytosolischen, ATP-abhängigen Proteolysesystems, das vom lysosomalen System unabhängig ist (Etlinger et al., 1977). Durch die Identifizierung von Zellen, die trotz des Fehlens von Lysosomen, mutierte und fehlge­faltete Proteine selektiv verdauen (Hershko et al., 1986), wurde gezeigt, daß Eukaryonten nicht nur einen lysosomalen, sondern auch einen ATP-abhängigen Weg des Proteinabbaus [Seite 3↓]besitzen. Die Analyse von Retikulozyten zeigte, daß bestimmte Proteine für den Abbau markiert (Waxman et al., 1987) und durch einen Multiproteinkomplex schnell zu kleinen Frag­menten zerlegt werden (Hershko et al., 1998). Dieser Multiproteinkomplex besitzt eine Masse von ca. 2000kDa und wird heute 26S-Proteasom genannt (Arrigo et al., 1988); (DeMartino et al., 1989); (Hoffman et al., 1992).

2.2 Das Proteasom

2.2.1 Funktion und Aufgabe des Proteasoms

Mittlerweile ist bekannt, daß eukaryontische Zellen die Mehrzahl der Proteine über den ATP-abhängigen Mechanismus abbauen (Ciechanover, 1994). Das 26S-Proteasom ist hierfür das wichtigste proteolytische Element (für eine Übersicht siehe (Coux et al., 1996); (Bochtler et al., 1999); (Groll et al., 2003b). Es reguliert über seine verschiedenen aktiven Zentren eine Vielzahl biologischer Prozesse in der Zelle wie z.B.:

Für die Proteolyse von Enzymen durch das Proteasom müssen diese unter ATP-Verbrauch über eine Isopeptidbindung kovalent mit Ubiquitin, einem Polypeptid von 76 Aminosäuren, verknüpft werden (Hershko&Ciechanover, 1998). Erst die so markierten Moleküle werden ebenfalls in einer ATP-abhängigen Reaktion vom 26S-Komplex erkannt, entfaltet und hydrolysiert (Voges et al., 1999). Das 26S-Proteasom besteht aus dem zentralen 20S-Protea­som (KP, Kernpartikel) und zwei peripheren 19S-Regulatorkappen (RP, auch PA-700-Komplex genannt), welche über ATP-Hydrolyse die Ubiquitinerkennung, die Proteinentfal­tung und die Proteintranslokation verantworten. Die proteolytische Schlüsselkomponente des 26S-Proteasekomplexes ist das 20S-Proteasom (E.C. Nummer 3.4.99.46 (Enzyme Nomen­clature Recommendations, 1984)). Die vorliegende Arbeit befaßt sich hauptsächlich struk­turell und funktionell mit dem 20S-Kernpartikel.


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2.2.2  Vorkommen des Proteasoms

In Säugern befindet sich der höchste 20S-Proteasomenanteil, mit Konzentrationen bis zu einem Prozent der löslichen Zellproteine, in Leber und in Niere (Peters, 1994). In eukaryon­tischen Zellen kann die Protease im Nukleus, im Cytosol und als Assoziat mit dem endoplasmatischen Retikulum sowie mit dem Zytoskelett nachgewiesen werden (Scherrer et al., 1994). Sie wurde bereits aus vielen Organismen unter verschiedensten Namen isoliert (Woese et al., 1990). Heute hat sich die Bezeichnung 20S-Proteasom durchgesetzt (Falkenburg et al., 1988); (Arrigo et al., 1988).

Die fundamentale Bedeutung des 20S-Partikels deutete sich bereits nach der Isolierung und Charakterisierung des Proteins aus Archaebakterien wie T. acidophilum an (Dahlmann et al., 1989). Anfangs wurde vermutet, daß in Eubakterien keine proteasomverwandten Proteine vorkommen. Mit der Aufklärung des Genoms von Escherichia coli wurde aber die Existenz eines Gens einer proteasomähnlichen Untereinheit ClpP (hslV) gefunden (Chuang et al., 1993). Homologe Sequenzen konnten daraufhin auch in den Organismen Pasteurella haemoly­tica, Bacillus subtilis und Mycobacterium leprae identifiziert werden (Lupas et al., 1994), sowie in Rhodococcus erythropolis (Tamura et al., 1995), womit sich eine ubiquitäre Verbreitung dieser Protease in allen drei Lebensbereichen zeigt. Mittlerweile sind mehr als 70 Sequenzen von 20S-Proteasomuntereinheiten aus verschiedenen Organismen publiziert, die eine eigene Klasse von Proteinen darstellen. Sie weisen bislang keine Ähnlichkeit zu anderen Proteasefamilien auf. Zueinander besitzen die Untereinheiten eine hohe Sequenzhomologie und deuten auf einen gemeinsamen Vorläufer hin (Löwe et al., 1995); (Coux et al., 1996); (Bochtler et al., 1999). Die 20S-Proteasomsequenzen werden bezüglich der archaebakteriellen Untereinheiten in zwei Gruppen, α und β, klassifiziert - das 20S-Proteasom aus dem Archae­bakterium T. acidophilum wurde deshalb auch als 'Urproteasom' bezeichnet (Zwickl et al., 1992).

2.2.3 Struktur und Aufbau des 20S-Proteasomkomplexes

Das Molekulargewicht von 20S-Proteasomen beträgt ca. 700kDa. Anfangs lieferten elektronenmikroskopische Untersuchungen an humanen Erythrozyten nur eine niederaufge­löste Struktur der 20S-Partikel. Dabei zeigen die Moleküle eine zylinderförmige Struktur mit den ungefähren Abmessungen von 120Å x 160Å (Harris, 1968). Der Komplex bildet sich aus vier Lagen übereinanderliegender Ringe, von denen jeder einzelne aus je sieben Unterein­heiten besteht (Hegerl et al., 1991); (Pühler et al., 1992) (siehe Abb. 1a,d,g). Der strukturell [Seite 5↓]detaillierte Aufbau von 20S-Proteasomen konnte jedoch erst mit Hilfe der Röntgenstruktur­analyse aufgeklärt werden. Im folgenden wird auf die Kristallstrukturen von 20S-Proteasomen aus Archaebakterien (T. acidophilum), Eubakterien (E. coli) und Eukaryonten (Saccharomyces cerevisiae) eingegangen.

Abb. 1 : Kugelmodell (A, D und G), Ribbonplot (B, E und H) und Ober­flächenmodell (C, F und I) der 20S-Proteasome aus T. acidophilum (Löwe et al., 1995), S. cerevisiae (Groll et al., 1997) und E. coli (Bochtler et al., 1997). Für die Oberflächenmo­delle wurden die Mole­küle entlang der nichtkri­stallographischen Sym­metrie- bzw. Pseudo­symmetrieachse aufge­schnitten. Die Schnitt­flächen sind weiß einge­färbt und die aktiven β-Untereinheiten mit dem Calpain-In­hibitor I komplexiert. Der Inhibitor ist als ball-and-sticks in gelb eingezeich­net.

Das 20S-Proteasom aus dem Archaeon T. acidophilum

Die Kristallstruktur des Thermoplasma-20S-Proteasoms bei 3.4Å Auflösung zeigt dieses als ein zylinderförmiges Partikel (148Å x 113Å) mit einem durchgängigen zentralen Kanal und drei großen Kammern (Löwe et al., 1995); (Stock et al., 1996) (siehe Abb. 1a-c). Aus dem Strukturmodell ergibt sich für den 20S-Komplex eine α7β7β7α7-Stöchiometrie mit einer 72 Punktgruppensymmetrie. Die beiden äußeren Kammern werden von den α- und β-Ringen gebildet und die mittlere Kammer, in der die Proteolyse stattfindet, wird alleine von den β-Ringen aufgebaut. Obwohl die Primärsequenzen der α- und β-Untereinheiten zueinan­der nur geringe Homologien aufweisen, ist deren Tertiärstruktur ähnlich (Löwe et al., 1995); (Stock et al., 1996). Die Cα-Atome können mit nur geringfügiger Abweichung übereinander gelegt werden. Dabei besteht jede Untereinheit aus einem fünfsträngigen antiparallelen β-Faltblatt. Die Topologie ist S8, S1, S2, S9 und S10 im oberen und S7, S6, S5, S4 und S3 im unteren β-Faltblatt. Diese werden von den Helices H3, H4 und H5 sowie von den Helices H1 und H2 flankiert (siehe Abb. 2).

Abb. 2 : Ribbonplot der α- und β-Untereinheit aus T. acidophilum (Löwe et al., 1995). Die Helices und Faltblätter sind in blau bzw. grün eingezeichnet und die Sekundär­strukturelemente von H0 bis H5 bzw. von S1-S10 schwarz beschrif­tet..


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Das 20S-Proteasom aus Eubakterien

Bislang existiert keine Kristallstruktur von 20S-Proteasomen aus Eubakterien. Sequenz­überlagerungen erlauben aber eine Vorhersage, daß die 20S-Komplexe in diesen Organismen eine ähnliche Quartärstruktur wie die der archaebakteriellen 20S-Partikel aufweisen (Löwe et al., 1995). Beispielsweise enthält das 20S-Proteasom aus Rhodococcus. erythropolis vier verschiedene Untereinheiten, wobei zwei der α- und zwei der β-Familie zugeordnet werden können (Tamura et al., 1995). Die Anordnung und Zusammensetzung dieser Untereinheiten im 20S-Partikel ist nicht verstanden. Mit Ausnahme der Actinomyceten besitzen die Eubak­terien keine 20S-Proteasome. Jedoch exprimieren diese Organismen, wie beispielsweise E. coli, mit dem Operon HslV einen Proteinasekomplex, der auf eine starke strukturelle Verwandtschaft mit der β-Familie der 20S-Proteasome hindeutet (Bochtler et al., 1997). Der Komplex unterscheidet sich aber deutlich von dem der 20S-Proteasome (Rohrwild et al., 1996). So verfügt HslV über keine sequenzverwandten α-Untereinheiten, und die beiden Ringe setzen sich jeweils aus nur sechs Untereinheiten zusammen (β6β6-Stöchiometrie; siehe Abb. 1g-i). Für die Abweichung in der Stöchiometrie der Ringzusammensetzung in HslV könnte ein wesentlicher Grund das Fehlen der proteasomalen C-terminalen Helix H5 sein, wodurch für die Untereinheiten in HslV eine dichtere Packung und somit eine hexamere Anordnung zulässig ist (siehe Abb. 3).

Abb. 3 : a)Ribbonplot der hslV-Prote­ase. Eine der hslV-Untereinheiten ist in blau ein­ge­zeichnet, wäh­rend die rest­lichen in braun dargestellt sind. b) Überla­gerung einer hslV-Unter­einheit mit der β-Unterein­heit des Thermo­plasma -20S-Proteasoms. Die Struk­tur­überlagerung der beiden Moleküle zeigt eine nahezu iden­tische Faltung; aller­dings enthal­ten die hslV-Untereinheiten nicht die in 20S-Proteasomen gefun­dene C-terminale Helix H5. c) Struktureller Vergleich des hexa­meren hslV-Ring­systems mit dem heptameren Thermo­plasma-20S-Proteasom-β-Ring. In der Abbildung wurden die be­schrifteten Untereinheiten strukturell über­lagert und anhand der neu generierten Koor­dinaten die jeweiligen Ringsysteme aufge­baut (Bochtler et al., 1997).

Das 20S-Proteasom aus Eukaryonten

Eukaryontische 20S-Proteasome enthalten mindestens 14 verschiedene Untereinheiten von 21-34kDa (Rivett, 1989). Die Quartärstruktur des 20S-Proteasoms aus S. cerevisiae ist [Seite 7↓]der des Komplexes aus T. acidophilum homolog (Groll et al., 1997) (siehe Abb. 1d-f). Es handelt sich ebenfalls um ein zylinderförmiges Partikel (148 Å x 113 Å) mit drei großen Kavitäten. Die Moleküle besitzen eine pseudo-siebenzählige Symmetrie und bestehen aus zwei identischen Hälften (α1—7β1—7;β1—7α1—7)) die über eine zweizählige Rotationssymmetrie zueinander in Beziehung stehen (Kopp et al., 1993). Die Kristallstruktur des 20S-Proteasoms aus S. cerevisiae zeigt die räumliche Anordnung und Faltung der 14 verschiedenen Unterein­heiten im 20S-Komplex (Groll et al., 1997). Mit Hilfe der Struktur wurde eine neue Nomen­klatur der 20S-Proteasomuntereinheiten eingeführt, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wird. Die Numerierung der Aminosäuren in den Untereinheiten erfolgt analog einer Sequenz­überlagerung mit der α- und β-Untereinheit aus T. acidophilum (siehe Abb. 4a,c). Alle 14 verschiedene Untereinheiten nehmen in der Struktur des Moleküls definierte Positionen ein. Sie sind mit Ausnahme weniger Insertionssegmente und Kettenenden in der Elektronendichte vollständig repräsentiert. Analog der α- und β-Untereinheit aus T. acidophilum besitzen sie je zwei fünfsträngige antiparallele β-Faltblätter, flankiert von Helices (siehe Abb. 4b,d).


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Abb. 4 : a) Sequenzüberlagerung der einzelnen α-Untereinheiten aus S. cerevisiae und T. acidophilum. Konser­vierte Aminosäuren sind in rot eingefärbt, β-Stränge in Pfeil und Zylinderform dargestellt. b) Ribbonplot der einzelnen α-Untereinheiten aus S. cerevisiae. Die Orientierung ist identisch zu der in Abb. 2 dargestellten Unter­einheiten aus T. acidophilum. c) Sequenzüberlagerung der einzelnen β-Untereinheiten aus S. cerevisiae und T. acidophilum. Für β1 (grün), β2 (gelb) und β5 ( blau) sind zusätzlich die humanen Untereinheiten mit den ent­sprechenden γ-interferon-induzierbaren Austauschkomponenten dargestellt. Konservierte Aminosäuren sind in rot eingefärbt, β-Stränge in Pfeil und Zylinderform dargestellt. Die Aminosäuren 20, 31, 35 und 45 für β1 sind als spezifische Reste der S1-Tasche orange eingefärbt. d) Ribbonplot der einzelnen β-Untereinheiten aus S. cere­visiae.

Die Überlagerung der sieben α- und sieben β-Untereinheiten aus S. cerevisiae mit den T. acidophilum-Homologen deutet auf eine große Ähnlichkeit der Sekundärstruktur der protea­somalen Elemente hin. Allerdings befinden sich Unterschiede zwischen den einzelnen Unter­einheiten in um bis zu zwei Aminosäureresten verlängerten Schleifen, langen Insertionen mit Sekundärstrukturelementen und den N- bzw. C-Termini (für die im Detail beschriebenen Abweichungen der Tertiärstrukturen der einzelnen Untereinheiten wird auf die Publikation Groll et al 1997 verwiesen). Viele dieser spezifischen strukturellen Besonderheiten in den einzelnen Untereinheiten sind an den Kontaktflächen zwischen den Untereinheiten beteiligt. Diese bestimmen alle 14 verschiedene Untereinheiten je zweimal an wohldefinierten Posi­tionen im 20S-Partikel (siehe Abb. 5).

Abb. 5 : Ausschnitt aus der Hefe-20S-Protea­somstruktur. Die Cα-Ketten der Unterein­heiten β1, β2, β3, β6’ und β7’ sind in den Farben blau, rot, grün, zyan und lila dargestellt. Die für die verschiedenen Unterein­heiten charakteris­tischen Wechselwirkungen sind als verstärkte Linien her­vorgehoben


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Bislang konnten elektronenmikroskopische Studien mit monoklonalen Antikörpern im 20S-Komplex aus H. sapiens die Besetzung der Untereinheiten analog zu S. cerevisiae identi­fizieren (Dahlmann et al., 1999). Eine 20S-Proteasomkristallstruktur von Säugern gibt es nur von Rinderleber, die bezüglich der dreidimensionalen Struktur dem Hefe-20S-Proteasom identisch ist (Unno et al., 2002). Diese Ergebnisse deuten eine universelle Architektur der Untereinheiten aller eukaryontischer 20S-Proteasome an.

2.2.4 Aufgaben der proteasomalen α- und β-Untereinheiten

Aufgaben der α-Untereinheit

Die N-Termini der α-Untereinheiten enthalten mit der Helix H0 ein konserviertes Strukturmotiv, welches in den β-Untereinheiten fehlt, das aber für die 20S-Proteasomassem­blierung wesentlich ist (Löwe et al., 1995). Bestimmte α-Untereinheiten besitzen ebenso eine 'shuttling sequence', die den Austausch der 20S-Proteasome zwischen Cytosol und Kern ermöglicht (Tanaka et al., 1990); (Lehmann et al., 2002). Es wird vermutet, daß der Import des 20S-Proteasoms in den Kern auf phosphorylierungsbedingte Konformationserkennungen bestimmter Untereinheiten zurückzuführen ist. Eine weitere Eigenschaft der α-Untereinheiten ist es, eine Ringstruktur auszubilden, die für die Bindung der β-Untereinheiten und damit für die 20S-Proteasomformation notwendig ist (Zwickl et al., 1991). Im gereiften 20S-Komplex bildet der α-Ring eine physikalische Sperre (siehe 2.2.8 und 3.3), welche den Zugang gefal­teter, cytosolischer Proteine in die innere proteolytische Kammer einschränkt (Löwe et al., 1995). Zusätzlich befinden sich am α-Ring Bindemotive für den 19S- (PA700), 11S- (PA28, PA26) und Blm3-Regulationskomplex, welche die proteolytischen Aktivitäten des 20S-Proteasoms modulieren (Voges et al., 1999); (Li et al., 2001); (Ustrell et al., 2002).

Aufgaben der β-Untereinheiten

Die Sequenzen der β-Untereinheiten sind untereinander weniger homolog als die der α-Un­tereinheiten. Nahezu alle β-Untereinheiten besitzen N-terminale Propeptide, die größten­teils während der Partikelformation abgespalten (Autolyse) oder partiell prozessiert werden. Über den Schritt der Autolyse entstehen in den β-Untereinheiten mit den N-terminalen Threoninen die proteolytisch aktiven Zentren (Löwe et al., 1995); (Ditzel et al., 1998). In archaebakteriellen 20S-Proteasomen verhindert die Deletion der Prosequenz nicht die Synthese des funktionsfähigen Komplexes (Zwickl et al., 1994), während in Eukaryonten diese Segmente für den Aufbau der 20S-Proteasome notwendig sind. So besitzen Hefe­[Seite 10↓]stämme, in denen die 20S-Proteasomuntereinheiten ohne Propeptide exprimieren, einen Phänotyp, der im schlimmsten Fall nicht überlebensfähig ist, wie am Beispiel der Untereinheit β5 gezeigt wurde (Chen et al., 1996). Eine wesentliche Funktion der Propeptide ist der spezi­fische Einbau von β-Untereinheiten in das 20S-Proteasom. So bewirkt die Deletion des Propeptids von β5i, daß das gereifte 20S-Proteasom nur die β5 und nicht mehr die β5i-Unter­einheit enthält (Schmidt et al., 1999).

Regulierte Expression von 20S-Proteasomuntereinheiten in Säugern

In höheren Eukaryonten wird die Untereinheitenzusammensetzung des 20S-Proteasoms in Abhängigkeit vom Organismus reguliert. Beispielsweise induziert in humanen Zellen γ-Interferon den Austausch von drei β-Untereinheiten (β1, β2 und β5) gegen drei neu syntheti­sierte LMP-Untereinheiten (β1i, β2i und β5i) (Frentzel et al., 1993); (Brown et al., 1993); (Akiyama et al., 1994); (Groettrup et al., 1997). Das Vorkommen der Untereinheiten ist abhängig vom Zellentwicklungsstadium und der Gewebeart. Beispielsweise wurden in der Rinderhypophyse keine LMP-Untereinheiten nachgewiesen (Yu et al., 1993) und in Mäusen variiert die Verteilung der 20S-Proteasomuntereinheiten zwischen Leber und Muskel deutlich (Van Kaer et al., 1994). Modifikationen diesbezüglich können zu schweren degenerativen Veränderungen führen (Kloetzel, 2001). Der Mechanismus der Substitution von Unterein­heiten ist bislang kaum verstanden, lediglich, daß deren Einbau von der Stärke der Expression und zusätzlichen Assemblierungs-Cofaktoren abhängt (Früh et al., 1994); (Ramos et al., 1998); (Krüger et al., 2001). Es gibt erste Befunde, daß die sogenannten immunoproteaso­malen βi-Untereinheiten wichtigen Einfluß auf die Antigenpräsentation haben (Sibille et al., 1995); (Stohwasser et al., 1996); (Kloetzel, 2001) (siehe 2.2.6).

2.2.5 Das proteolytisch aktive Zentrum im 20S-Proteasom

In der Thermoplasma-20S-Proteasomstruktur mit gebundenem kompetitiven Inhibitor Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal (Calpain-Inhibitor I) konnten die aktiven Zentren des Enzyms innerhalb der zentralen Kammer in jeder β-Untereinheit lokalisiert werden (Löwe et al., 1995) (siehe Abb. 1c,f,i). Der Tripeptidinhibitor bindet in einer ausgestreckten Konformation in die durch eine Schleife von zwei β-Faltblättern ausgeprägten hydrophoben Tasche. Die funktio­nelle Aldehydgruppe bildet mit der Hydroxylgruppe des N-terminalen Threonins ein Hemi­acetal. Damit wurde als Nukleophil für die Hydrolyse der Peptidbindungen das Oγ der Hydro­xylgruppe des N-terminalen Threonins der β-Untereinheiten identifiziert. Das 20S-Proteasom [Seite 11↓]ist somit das erste Beispiel einer Threoninprotease, der detaillierte Reaktionsmechanismus blieb jedoch aufgrund der niederen Auflösung offen. Struktur- und Mutageneseuntersu­chungen im Thermoplasma-20S-Proteasom konnten allerdings das katalytische System mit Thr1, Glu17 und Lys33 definieren. Zusätzlich befinden sich die Aminosäuren Ser129, Asp166 und Ser169 in der Nähe von Thr1 und tragen zur proteolytischen Aktivität bei, da sie für die strukturelle Integrität des aktiven Zentrums erforderlich sind (Löwe et al., 1995); (Seemüller et al., 1995). Die Röntgenkristallstruktur des Hefe-20S-Proteasoms bei 1.9Ả Auf­lösung zeigt, daß im eukaryontischen 20S-Komplex nur drei der sieben verschiedenen β-Untereinheiten, nämlich β1, β2 und β5 ein proteolytisch aktives Zentrum ausbilden (Groll et al., 1997). Mit Hilfe der Thermoplasma- und der Hefe-20S-Proteasomstrukturen wurde erkannt, daß in allen proteolytisch aktiven Untereinheiten die Aminosäuren Thr1, Asp/Glu17, Lys33, Ser129, Asp166 und Ser169 invariant sind. Dieser Befund deutet auf einen identischen Proteolysemechanismus in 20S-Proteasomen hin.

Abb. 6 : Stereoabbildung der räumlichen Anordnung der Aminosäuren rund um das Thr1 der proteolytisch aktiven Untereinheit β1. Der Protein-backbone ist als weißer coil und die Aminosäuren Thr1, Asp17, Lys33, Ser129, Asp166 und Ser169, welche hauptsächlich für das nukleophile Zentrum verantwortlich sind, als balls-and-sticks dargestellt. Lys33 ist aufgrund der Bildung einer Salzbrücke mit Asp17 positiv geladen (zyane Rasterpunkte; beide Aminosäuren sind gelb eingezeichnet). Hierüber wird das elektrostatische Potential der Thr1Oγ-Gruppe abgesenkt. In unmittelbarer Nachbarschaft zum Thr1 befinden sich die Aminosäuren Ser129, Asp166 und Ser169 (schwarz), welche für die konformelle Stabilität des Thr1 verantwortlich sind (lila Raster­punkte). Das Wassermolekül NUK, eingezeichnet als grüne Kugel, befindet sich in der Elektronendichte nahe dem Thr1Oγ und N und vermittelt einerseits über eine Shuttle-Funktion die Protonenübertragung, vom Thr1Oγ zum N-Terminus (grüner Kreis) andererseits die Hydrolyse das Acylesterintermediats (Groll&Huber, 2003b).

Die hohe Auflösung im Hefe-20S-Proteasom lieferte weitere Kenntnisse bezüglich des proteolytischen Reaktionsmechanismus. So bildet das Thr1N eine Wasserstoffbrückenbin­dung zu Ser129Oγ, Asp168O und Ser169Oγ; Thr1Oγ zu Lys33Nε. Asp17 erzeugt Wasserstoff­brücken über Oγ1 zu Arg19N und Gly170N und über Oγ2 zu Thr/Ser2N und Lys33Nε. Der pKa-Wert und die Protonierung der relevanten ionisierbaren funktionellen Seitengruppen sind [Seite 12↓]unbekannt, aber das Muster der Wasserstoffbrückenbildung läßt vermuten, daß sowohl Asp17 als auch Lys33 geladen sind. Die positive Ladung von Lys33Nε würde den intrinsischen pKa-Wert des Thr1Oγ sowie des Thr1N verschieben und deren Nukleophilie verstärken. Thr1Oγ reagiert daher mit den elektrophilen funktionellen Gruppen von Substraten und Inhibitoren, während Thr1N den Protonenakzeptor darstellt. Zusätzlich befindet sich in allen proteolytisch aktiven Untereinheiten nahe dem Thr1Oγ und N, Ser129Oγ und N sowie Gly47N ein voll­ständig gebundenes Lösungsmittelmolekül, bezeichnet als NUK. Die Funktion des Wasser­moleküls liegt sowohl in der Protonenübertragung des Wasserstoffs vom Thr1Oγ zum N-Terminus als auch in der Spaltung und damit Neugenerierung des Thr1Oγ im Acylesterinter­mediat (siehe Abb. 6). Diese Annahme wird durch die Kristallstruktur des Komplexes des Hefe-20S-Proteasoms mit Lactacystin bekräftigt, in dem eine Esterbildung zwischen Lacta­cystin und Thr1Oγ als Ergebnis einer β-Lactonringöffnung nach einem nukleophilen Angriff durch Thr1Oγ zu beobachten ist. Eine analoge Reaktionssequenz wird für die Hydrolyse von peptidischen oder chromogenen Substraten vermutet.

Die Faltung der 20S-proteasomalen Untereinheiten stimmt weitgehend mit der Faltung einer Reihe von Hydrolasen überein, die jedoch zueinander keine Ähnlichkeiten in der Primärsequenz aufweisen. Bislang sind von dieser Proteinklasse 19 dokumentierte Kristall­strukturen in der PDB-Datenbank hinterlegt, wie beispielsweise die lysosomale Aspartylglu­cosaminidase (Oinonen et al., 1995), die Penicillinacylase (Duggleby et al., 1995), die Gluta­min-PRPP-amidotransferase (Smith et al., 1994) und die Glycosylasparaginase (Xu et al., 1999). Die Proteine weisen zueinander kaum konservierte Aminosäuren im aktiven Zentrum auf, besitzen aber neben ihrem gemeinsamen Strukturmotiv alle einen nukleophilen N-Termi­nus (Brannigan et al., 1995). Dies führte zu der Einteilung der Proteine in eine neue Familie, die Klasse der Ntn (N-terminal nukleophile)-Hydrolasen. Das im 20S-Proteasom zuvor beschriebene Lys33 ist in den Ntn-Hydrolasen nicht konserviert und deutet ebenso wie experimentelle Befunde an, daß der N-Terminus der Protonenakzeptor während der Peptidhy­drolyse ist. Gleichermaßen zeigen die hinterlegten Kristallstrukturen von Ntn-Hydrolasen mit hoher atomarer Auflösung, wie beispielsweise die Penicillinacylase, am katalytischen Zentrum ein definiertes Wassermolekül, das in idealer räumlicher Anordnung für die Pro­tonenübertragung sorgt. Es kann davon ausgegangen werden, daß der Reaktionsmechanismus aller Ntn-Hydrolasen in identischer Folge abläuft.


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2.2.6  Spezifitäten der S1-Taschen in eukaryontischen 20S-Proteasomen

Eine besondere Eigenschaft eukaryontischer 20S-Proteasome ist die Vereinigung verschiedener Proteaseaktivitäten. So ergeben in vitro-Untersuchungen an eukaryontischen Zellen, daß die 20S-Partikel die Möglichkeit besitzen, nahezu nach jeder Aminosäure zu spalten (Arendt et al., 1997); (Orlowski et al., 2000). Allerdings zeigt die proteolytische Aktivität gegenüber chromogenen Testsubstraten fünf bevorzugte Schnittpräferenzen, die Tabelle 1 zusammenfaßt (Orlowski et al., 1993):

Tabelle 1 : Bevorzugte Schnittpräferenzen eukaryontischer 20S-Proteasome

Name:

Chromogenes Substrat:

Chymotrypsin like activity (CL)

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC

Trypsin like activity (TL)

Bz-Val-Gly-Arg-AMC

Peptidyl-glutamyl-protein-hydrolysing

activity (PGPH); Caspase like activity

Z-Leu-Leu-Glu-βNA

Branched chain aminoacid preferring (BrAAP)

Cbz-Gly-Gly-Leu-AMC

Small neutral aminoacid preferring (SNAAP)

Cbz-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-AMC

Bereits vor der Kenntnis des atomaren Aufbaus eukaryontischer 20S-Proteasome konnten im speziellen für die Untereinheit β5 die Proteolyseeigenschaften experimentell identifiziert werden. So besitzen 20S-Proteasome, deren Prosegment in β5 nicht mehr prozes­siert wird (Chen&Hochstrasser, 1996) oder deren Mutation die β5-S1-Tasche deutlich ver­kleinert (Heinemeyer et al., 1997), eine reduzierte chymotryptische Aktivität. Ebenso bewirkt der Inhibitor Lactacystin, der selektiv nur an die Untereinheit β5 bindet, lediglich Einfluß auf die CL-Aktivität (Fenteany et al., 1995). Diese Ergebnisse schließen eine gegenseitige allo­sterische Beeinflussung der proteolytisch aktiven Untereinheiten aus und stellen die Ursache für die verschiedenen Spaltungsspezifitäten im Molekül durch die vorhandenen charakteris­tischen S1-Taschen der proteolytisch aktiven Untereinheiten dar. Die Kristallstrukturen des Hefe-20S-Proteasoms in Komplex mit den Inhibitoren Calpain-Inhibitor I und Lactacystin lieferten eine ausführlichere Erklärung (Groll et al., 1997). So befindet sich im Zentrum der S1-Tasche von β1 in Position 45 ein Arg, das mit Glutamaten gut interagieren kann und dieser Untereinheit die PGPH- oder Caspase-ähnliche Spaltungspezifität verleiht (siehe Abb. 7a). Die vorhergesagte Spaltpräferenz wurde durch Mutageneseexperimente am proteolytisch aktiven Zentrum der Untereinheit β1 bestätigt (Heinemeyer et al., 1997); (Ditzel et al., 1998). Allerdings wurde in Abbauuntersuchungen von Enolase gefunden, daß die Untereinheit β1 neben der PGPH- auch limitierte BrAAP-Aktivität besitzt (Nussbaum et al., 1998). Eine mög­liche Erklärung für die duale Spalteigenschaft liefert die Kristallstruktur des Hefe-20S-Protea­[Seite 14↓]soms in Komplex mit dem Calpain-Inhibitor I, in der die apolare Inhibitor-Nle-Seitenkette mit der positiv geladenen S1-Tasche verankert vorliegt. Die Komplexstruktur zeigt zusätzliche Elektronendichte am Arg45, identifiziert als Bicarbonat-Anion, und begründet hierüber die Nle-Arg-Wechselwirkung. Die S1-Tasche der Untereinheit β2 ist durch das Gly45 sehr geräumig und deshalb bevorzugt für die Bindung großer Seitenketten geeignet. Neben einer großen Anzahl negativ geladener Aminosäuren, die der Untereinheit die charakteristisch tryptisch-ähnliche proteolytische Aktivität zuweisen, bildet Glu53 das Zentrum der S1-Tasche (siehe Abb. 7b). Diese Annahme wurde durch strukturelle Inhibitionsstudien von 20S-Protea­somen mit Mal- βAla-Val-Arg-CHO bzw. durch gezielten Thr1Ala-Austausch in der Unter­einheit β2 bestätigt (Loidl et al., 1999a); (Groll et al., 1999); (Jäger et al., 1999). Wie bereits angedeutet, besitzt die Untereinheit β5 die chymotrypsin-ähnliche proteolytische Aktivität. Nach der Struktur ist für diese Eigenschaft überwiegend das Met45 der Untereinheit β5 verantwortlich (siehe Abb. 7c). Jedoch ergeben Mutagenesestudien, daß die β5-Untereinheit auch Substrate nach kleinen neutralen oder verzweigten Aminosäuren spaltet (SNAAP-, BrAAP-Aktivität) (Groll et al., 1999). Eine Erklärung hierfür ist die freie Beweglichkeit des Met45, wodurch sich die Größe der S1-Tasche variieren läßt. So ist Met45 im Falle der Bindung von Lactacystin durch den engen Kontakt mit der verzweigten Seitenkette des Inhibitors Schlüsselkomponente für dessen Spezifität, während im 20S-Proteasom:Calpain-Inhibitor I-Komplex die sterisch anspruchsvolle Norleucinseitenkette die Met45-Seitenkette verschiebt und die S1-Tasche geräumiger erscheinen läßt (Groll et al., 1997).

Abb. 7 : a-c) Oberflächenmodell der drei verschiedenen proteolytisch aktiven Untereinheiten β1, β2 und β5 des Hefe-20S-Proteasoms. Die einzelnen Abbildungen zeigen das nukleophile Thr1 als balls-and-sticks. Basische Atome sind als blaue, saure Atome als rote und hydrophobe Atome als weiße Oberflächen eingezeichnet. In grün ist die für die jeweilige Untereinheit charakteristische Proteaseaktivität dargestellt.

Wie bereits beschrieben, findet in 20S-Säugerproteasomen über γ-Interferon ein konstitutiver Ersatz der aktiven Untereinheiten β1, β2 und β5 durch β1i, β2i und β5i statt. Es wurde gezeigt, daß diese ‚immuno’-Untereinheiten die Anzahl der an der Zelloberfläche vorliegenden MHC-Klasse I-Moleküle regulieren (Fehling et al., 1994); (Sibille et al., 1995). Die Substitution der aktiven Untereinheiten durch die ‚immuno’-Untereinheiten führt zur [Seite 15↓]Generierung von Peptiden, die über den C-terminalen Anchorresidue bevorzugt an MHC-Klasse I-Moleküle binden. Allerdings weisen die konstitutiven und die dazugehörigen ‚immuno’-Untereinheiten einen hohen Grad an Sequenzidentität auf. Lediglich β1i besitzt in der S1-Tasche zwei auffällige Unterschiede gegenüber der nicht γ-Interferon-induzierten Untereinheit, nämlich die Substitution von Thr31 zu Phe und von Arg45 zu Leu (siehe Abb. 3c). Modellierungen mit Hilfe der Hefe-20S-Proteasomkoordinaten zeigen, daß der Phe-Austausch die β1i-S1-Tasche verkleinert und der Leu-Ersatz der β1i-Spezifität apolaren Charakter verleiht. Dies bewirkt in ‚immuno’-20S-Proteasomen einerseits eine reduzierte PGPH-, andererseits eine verstärkte chymotryptische und BRAAP-Aktivität (Groll et al., 1997). Experimente in Zell-Linien von Mäusemutanten, denen die Expressionsfähigkeit der ‚immuno’-Untereinheit β1i fehlt, besitzen eine verminderte MHC-Klasse I-Präsentation (Driscoll et al., 1993); (Gaczynska et al., 1993); (Van Kaer et al., 1994). Ein Grund für diese Beobachtungen liegt in der Antigenpräsentation, da die MHC-Klasse I-Moleküle bevorzugt Peptide mit basischen oder hydrophoben C-terminalen Aminosäuren einbauen (Engelhard, 1994). Bemerkenswerterweise führt die Substitution von β2 und β5 mit β2i und β5i zu keiner grundlegenden Änderung in der Anordnung und Spezifität der S1-Tasche. Jedoch ergaben in vivo-Experimente in mutierten Mäusen eine mechanistische Beeinflussung der MHC-Klasse I-Präsentation bezüglich der β2i- und β5i-Untereinheiten (Fehling et al., 1994); (Stohwasser et al., 1996). Die vorliegenden Kristallstrukturen der 20S-Proteasome aus Hefe und Rinderle­ber (Groll et al., 1997); (Unno et al., 2002) liefern hierfür keine Erklärung. Möglicherweise bewirkt der konservierte Ersatz der β2 und β5-Untereinheiten eine Einschränkung in der Flexibilität und Größe der Spezifitätstaschen, wodurch ein entscheidender Einfluß auf die Schnittpräferenz entstehen könnte (siehe 2.2.7).

2.2.7 Generierung von Oligopeptiden durch das 20S-Proteasom

Das 20S-Proteasom generiert in der Regel Oligopeptide mit einer Länge von acht bis fünfzehn Aminosäuren. Es stellt sich daher die Frage, wie das Zusammenspiel der aktiven Untereinheiten die Produktverteilung steuert. Durch die reduzierte Anzahl proteolytisch aktiver Zentren in eukaryontischen 20S-Partikeln wurde anfangs vermutet, daß zusätzliche nicht Thr1-abhängige proteolytische Zentren existieren, die die Substrate unspezifisch nach bestimmter Länge spalten (Groll et al., 1997). Einen Grund für diese Annahme lieferten die in der Kristallstruktur des Hefe-20S-Proteasoms ermittelten definierten Elektronendichten von den intermediär prozessierten inaktiven Untereinheiten β6 und β7, deren Prosegmente jeweils [Seite 16↓]an der Grenzfläche der zentralen Kammer verankert vorliegen. Zusätzlich ergaben kristallo­graphische Untersuchungen von verschiedenen Hefe-20S-Proteasommutanten, in denen proteolytisch aktive Zentren durch gezielte Punktmutationen inaktiviert wurden, weiterhin die definierte Elektronendichte sowie charakteristische Längenverteilung aller im Wildtyp auftretenden Prosegmente. Allerdings zeigt die N-terminale Sequenzierung der Untereinheiten β6 und β7 in 20S-Proteasommutanten mit proteolytisch deaktiviertem β2 im Vergleich zum Wildtyp verlängerte N-terminale Sequenzen, so daß diese Bereiche in den β2-Mutanten lediglich einer kristallographischen Fehlordnung unterliegen (Ditzel et al., 1998); (Groll et al., 1999). Diese Ergebnisse schließen zusätzlich vorkommende Endopeptidasestellen in 20S-Proteasomen aus und weisen auf eine starke Umlagerung der teilprozessierten Propeptide β6 und β7 nach Hydrolyse an den proteolytisch aktiven Zentren hin.

Mit der Aufklärung der Kristallstruktur des 20S-Proteasoms aus T. acidophilum wurde postuliert, daß die Generierung der Oligopeptide vom Abstand der proteolytisch aktiven β-Untereinheiten abhängt (Löwe et al., 1995). So beträgt die Distanz zweier benachbarter Threonine etwa 30Ả und Peptide aus acht bis zehn Aminosäuren können diese in gestreckter Konformation gerade noch erreichen. In Hefe ist die Zahl der Proteolysezentren auf sechs reduziert. Zusätzlich ist es möglich, vier der sechs proteolytisch aktiven β-Untereinheiten, β1 und β2, über einen Thr1Ala-Austausch zu inaktivieren (Heinemeyer et al., 1997). Der Abstand der verbleibenden katalytisch aktiven β5-Threonine beträgt etwa 49Ả. Nach dem vorgeschlagenen Mechanismus der Thermoplasma-20S-Proteasom-Kristallstruktur wären in der Doppelmutante Produkte mit einer Länge von fünfzehn bis achtzehn Aminosäuren zu erwarten. Inkubationsversuche mit thermolabiler Hefe-Enolase zeigten jedoch, daß die Doppelmutante analog dem Wildtyp Proteolyseprodukte mit einer durchschnittlichen Längenverteilung von acht bis fünfzehn Aminosäuren liefert (Nussbaum et al., 1998). Die einzelnen Fragmente der jeweiligen Experimente, Wildtyp und Doppelmutante, wurden über reversed phase LC-MS und N-terminale Sequenzierung identifiziert und wiesen lediglich Unterschiede in Bezug auf die Schnittstellen auf. Somit bildet in 20S-Proteasomen der etwa acht Aminosäure lange Kanal zum Thr1 eine Andockstelle für Substrate und ist das mittlere Maß für die Produktverteilung. Die Charakteristika der S1-S8-Taschen in den verschiedenen Untereinheiten bewirken für Substrate je nach Bindung unterschiedlich lange Verweilzeiten am Katalysezentrum und geben hierüber die Wahrscheinlichkeit einer möglichen Proteolyse und damit die auftretende Schnittpräferenz wieder. Die Aufenthaltsdauer der Edukte und Produkte im 20S-Proteasom ist durch das gesamte Kanalsystem im Molekül vorgegeben und [Seite 17↓]erlaubt in der Regel eine Produktverteilung von 8-15 Aminosäuren (siehe 2.2.8 und 3.3). Eine Begründung hierfür liefert die ähnlich hohe mittlere Umsatzrate von thermolabiler Hefe-Enolase im Wildtypproteasom als auch in den proteolytisch reduzierten 20S-Proteasommu­tanten. Damit ist in 20S-Proteasomen der geschwindigkeitsbestimmende Schritt die Zugäng­lichkeit der Substrate in das Molekülinnere sowie die Freilassung der Produkte aus der zentralen Kammern und nicht die Proteolysereaktion an den aktiven Untereinheiten. Möglicherweise ist dies ein Grund für die reduzierte Anzahl proteolytisch aktiver Unterein­heiten in eukaryontischen 20S-Proteasomen, die sich über den Evolutionsverlauf gebildet haben. Nennenswert in diesem Zusammenhang sind jedoch die voneinander unterschiedlichen S1-Taschen in den wenigen verbleibenden proteolytisch aktiven Zentren, die eine nahezu unspezifische Spaltung der selektierten Substrate bezüglich der P1-Position ermöglichen (siehe 2.2.6).

2.2.8 Substratzugang in das 20S-Proteasom

Wie beschrieben befinden sich die proteolytisch aktiven Zentren des 20S-Proteasoms innerhalb der zentralen Kammer. Die Substrate müssen um prozessiert zu werden somit in das Partikelinnere eindringen und werden daraufhin zu Oligopeptiden fragmentiert, die an­schließend wieder freigesetzt werden. Das 20S-Proteasom aus T. acidophilum zeigt in der Kristallstruktur an den α-Ringen zwei Eintrittsöffnungen von 13Ả, die durch eine Ringfläche von Schleifen-formierenden Tyr126-Gly-Gly-Val-Segmenten der sieben identischen α-Unter­einheiten begrenzt sind. Der Durchmesser der Öffnung in den β-Ringen ist mit 22Ả etwas größer (Löwe et al., 1995) (siehe Abb. 1c). Die N-terminalen 12 Aminosäuren der α-Unterein­heiten befinden sich nahe der Eintrittsöffnung, sind aber in der Elektronendichte nicht definiert. Über die Funktion der N-Termini kann lediglich spekuliert werden. Allerdings ist die Eingangspore mit 13Ả nur geringfügig größer als der Durchmesser einer α-Helix, so daß der Zugang für den Durchlaß von gefalteten Proteinen nicht ausreicht. Dadurch entsteht im Thermoplasma-20S-Proteasom eine wichtige Steuerstelle für den regulierten und stufen­weisen Abbau von Substraten, da die engen Einschnürungen für einen limitierten Zugang der Proteine sorgen und verhindern, daß teilweise abgebaute Polypeptide den Proteinkomplex vorzeitig verlassen (siehe 2.2.7).

Im Gegensatz zum Thermoplasma-20S-Proteasom ist die hydrolytische Kammer des Hefe-20S-Proteasoms für Substrate nahezu unerreichbar (siehe Abb. 1f). Die N-Termini im speziellen von α2, α3 und α4 bilden ineinander eine aus mehreren Schichten bestehende [Seite 18↓]Struktur, die den α-Ring vollständig verschließt und somit einen Substrateintritt ohne Umla­gerung nicht mehr gewährleistet. Das 19S-Partikel, welches für die ATP- und ubiquitinab­hängige Proteolyse durch das Proteasom verantwortlich ist, bindet ATP-abhängig an die beiden Pole des 20S-Zylinders und bildet damit das 26S-Proteasom. Diese Assoziation führt zu einer vielfachen Erhöhung der katalytischen Aktivität gegenüber chromogenen und natür­lichen Substraten (DeMartino et al., 1994); (Hoffman et al., 1996). Es konnte gezeigt werden, daß die Regulatorkappen Konformationsänderungen der α-Ringsysteme und somit Zugang in das 20S-Partikel bewirken (siehe 3.3).

2.3 Inhalt der vorliegenden Arbeit

Die proteasomalen Kristallstrukturen aus den verschiedenen Organismen konnten bereits viele Fragen beantworten und neue Ideen bereitstellen. Einige funktionelle Zusam­menhänge sind jedoch mit den bisher erarbeiteten Strukturkenntnissen der 20S-Proteasome nicht erklärbar, wie der Mechanismus des Partikelzusammenbaus, der Einfluß benachbarter Aminosäuren für das proteolytisch aktive Thr1, der Transport von markierten und entfalteten Substraten in das Molekülinnere eukaryontischer 20S-Proteasome sowie die Wirkung einer Vielzahl von Inhibitoren und deren therapeutisches Interesse.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde durch Kombination von biochemischen und kristallographischen Untersuchungen eine strukturbasierte Funktionsanalyse an 20S-Protea­somen durchgeführt: (1) Strukturelle Untersuchungen von frühen und späten Assemblie­rungsintermediaten des 20S-Proteasoms aus A. fulgidus. (2) Aufklärung des Mechanismus der Autolyse, Beiträge einzelner benachbarter Aminosäuren zum Mechanismus der Proteolyse durch ortsgerichtete Mutagenese, Einfluß der Prosegmente auf die Ausbildung der proteoly­tisch aktiven Zentren und Reaktivierungsstudien inaktiver β-Untereinheiten im Hefe-20S-Proteasom. (3) Untersuchungen zum Mechanismus des regulierten Substrattransports in eukaryontische und archaebakterielle 20S-Proteasome. (4) Kristallstrukturanalysen, Model­lierungen, Totalsynthesen und Ermittlungen der Bindemodi von synthetischen und natürlichen spezifischen 20S-Proteasominhibitoren. Für eine ausführlichere Darstellung der in der vorlie­genden Arbeit zusammengefaßten Ergebnisse wird auf die im Anhang unter dem Kapitel: Eigene publizierte Arbeiten aufgeführten Veröffentlichungen verwiesen.


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22.02.2005