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3  Ergebnisse und Diskussion

3.1 Strukturelle Einblicke in die Reifung archaebakterieller 20S-Proteasome

3.1.1 Das 20S-Proteasom aus A. fulgidus

20S-Proteasome erreichen über ein kompliziertes Wechselspiel der Untereinheiten bezüglich Faltung, Zusammenbau und Prozessierung ihren letztendlich gereiften und proteo­lytisch aktiven Zustand. Im Gegensatz zu eukaryontischen 20S-Proteasomen erfolgt der Partikelaufbau in Archaeen ohne Verwendung von zusätzlichen Chaperonen (Zwickl et al., 1992). Beispielsweise ist es möglich, rekombinant in E. coli die α- und β-Untereinheiten aus dem Organismus Archaeoglobus fulgidus getrennt zu exprimieren und zu reinigen (Groll et al., 2003a). Nach dem Mischen von stöchiometrischen Mengen der α- und β-Untereinheiten wird augenblicklich proteolytische Aktivität gemessen und die SDS-Gelelektrophorese des Gemisches deutet mit der vollständig autoproteolytischen Abspaltung der Prosegmente von den β-Vorläufern auf eine effiziente und augenblickliche Partikelassemblierung hin. Die Ergebnisse zeigen somit einen intakten Zusammenbau des Archaeoglobus-20S-Proteasoms unter in vitro Bedingungen und liefern die Grundlage für eine Untersuchung früher und später Assemblierungsintermediate. Für einen strukturellen Vergleich verschiedener Zwischenstufen wurde zu Beginn die Kristallstruktur des gereiften 20S-Proteasoms sowie des 20S-Protea­som:Calpain-Inibitor I-Komplexes aus A. fulgidus bei 2.25Ả bzw. 2.8 Ả bestimmt. Die Gesamtstruktur des Archaeoglobus-20S-Proteasoms ist erwartungsgemäß analog zum Thermoplasma-20S-Partikel: das Molekül ist zylinderförmig aufgebaut und besteht aus drei Kammern, die in sich mit engen Einschnürungen in Verbindung stehen; die ersten elf Amino­säuren der α-Untereinheiten sind in der Elektronendichte ähnlich wie im Thermoplasma-20S-Proteasom nicht definiert und vermitteln den Eindruck eines zentralen offenen Kanals (siehe Abb. 9a). Zusätzlich läßt die hohe Auflösung des Archaeoglobus-20S-Partikels am proteo­lytisch aktiven Zentrum ebenfalls das bereits im Hefe-20S-Proteasom gefundene nukleophile Wassermolekül erkennen und belegt den universell vorgeschlagenen proteolytischen Reak­tionsmechanismus archaebakterieller und eukaryontischer 20S-Proteasome (siehe 2.2.5 und 3.2).

3.1.2 Der α-Ring aus A. fulgidus: ein frühes Assemblierungsintermediat

Es ist bekannt, daß sich archaebakterielle proteasomale α-Untereinheiten spontan zu einem Siebenring zusammenlagern, während die β-Untereinheiten alleine keinen Ringschluß [Seite 20↓]eingehen, jedoch mit den α-Ringen zum funktionellen 20S-Proteasom assemblieren (Zwickl et al., 1994). Überraschenderweise ist der Aufbau proteolytisch aktiver chimärer 20S-Protea­some über die α-Untereinheiten aus A. pernix und die β-Untereinheiten aus A. fulgidus möglich (Groll et al., 2003a). Nennenswert in diesem Zusammenhang ist die voneinander weitentfernte phylogenetische Entwicklung der verwendeten Archaeen: A. fulgidus gehört zu der Familie der Euryarchaeota und A. pernix zu der Familie der Crenarchaeota. Ebenso ergibt die strukturelle Überlagerung der Cα-Atome der Koordinaten der α- bzw. β-Untereinheiten aus A. fulgidus mit denen aus T. acidophilum eine weitgehende Übereinstimmung, was prinzipiell für einen zeitlich allgemeinentwickelten Assemblierungsmechanismus archaebak­terieller 20S-Proteasome spricht. Für die unassemblierten β-Untereinheiten ergeben Aktivi­tätsuntersuchungen gegenüber chromogenen Testsubstraten eine defiziente Proteolyse und die N-terminale Sequenzierung zeigt ein Ausbleiben der intramolekularen Autoproteolyse (siehe 3.2.1). Somit ist für die proteolytische Aktivität als auch für die Fähigkeit der Substratspal­tung eine oligomere Assemblierungsanordnung der β-Untereinheiten in 20S-Proteasomen von grundlegender Bedeutung. Dieser Befund ist nur über konformelle Strukturumlagerungen in den Untereinheiten während der 20S-Partikelreifung zu erklären. Allerdings ist bislang noch keine Kristallstruktur für eine unkomplexierte β-Untereinheit verfügbar, um den Mechanis­mus detailliert beschreiben zu können. Hingegen war es möglich, eine Röntgenkristallstruktur für den α7-Ringvorläufer aus A. fulgidus bei 2.45Ả Auflösung zu erhalten (Groll et al., 2003a). Überraschenderweise zeigt dieser alleine eine identische Konformation zum α7-Ring aus dem gereiften 20S-Proteasom mit Ausnahme des N-terminalen Bereichs, der im α7-Assembly strukturell geordnet vorliegt (siehe Abb. 8).

Abb. 8 : Stereoabbildung der strukturellen Überla­gerung der Cα-Atome von der α-Untereinheit aus dem α7-Ring (gelb) mit der α-Unter­einheit aus dem 20S-Protea­som (blau) von Archaeoglo­bus fulgidus. Die N- bzw. C-Termini der jeweiligen Unter­einheiten sind in schwarz beschriftet.


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Das Ergebnis der Strukturüberlagerung der α-Untereinheiten aus den verschiedenen Archaeo­globus-Komplexen ergibt, daß der α7-Ring während der 20S-Partikelzusammensetzung bereits ein stabiles und starres Gerüst bildet und damit das Fundament für die Anlagerung der β-Precursorproteine darstellt. Sogar die Kontaktflächen in den α-Untereinheiten des 20S-Proteasoms besitzen keine signifikanten strukturellen Unterschiede zu den α-Untereinheiten im α7-Ring und belegen eine bereits voreingenommene Erhaltung der α-β-Kontaktoberfläche.

Während die Assemblierung in Archaeen als konserviert erscheint wechselt der Mecha­nismus der Reifung mit Anstieg der Komplexizität. In eukaryontischen 20S-Proteasomen erfordert der Zusammenbau der unterschiedlichen Untereinheiten zusätzliche regulatorische Faktoren, die möglicherweise als Chaperone für korrekte Faltung sorgen und lediglich transient mit dem sich aufbauenden Komplex assoziieren (Ramos et al., 1998); (Witt et al., 2000). Jedoch ist es notwendig, daß in der Entstehung und in der Reifung der 20S-Proteasome eine etablierte Ordnung eingehalten wird, um den unkontrollierten und vorzeitigen Proteinab­bau in der Zelle zu verhindern. Diese Voraussetzung erfordert ein grundlegendes Prinzip für den Zusammenbau von 20S-Proteasomen aus allen Organismen. Der detaillierte Assemblie­rungsmechanismus ist weiterhin fraglich und erfordert weitere Experimente.

3.1.3 Die α7β7β7α7-Proteasommutante aus A. fulgidus: ein spätes Assemblierungs­intermediat

In eukaryontischen 20S-Proteasomen bilden sich die proteolytisch aktiven β-Unterein­heiten über intramolekulare Autolyse unabhängig von der Anwesenheit anderer aktiver Zentren (siehe 3.3.2) (Heinemeyer et al., 1997); (Ditzel et al., 1998); (Groll et al., 1999). Dieser Prozeß ist der letzte Schritt in der 20S-Proteasom-Reifung und generiert das funk­tionstüchtige Kernpartikel. Es ist gelungen, von einer proteolytisch inaktiven 20S-βThr1Gly-Proteasommutante aus A. fulgidus bei 4Ả Auflösung eine Kristallstruktur zu bestimmen (Groll et al., 2003a). Durch die Mutation kann der Komplex den Reifungsprozeß nicht abschließen und stellt damit eines der letzten 20S-Proteasom-Assemblierungsintermediate dar. In den aufgenommen Reflexen ergibt die Selbstrotationssuche nach zweizähligen Achsen in der Patterson-Karte nur eine schwache 72-Symmetrie des Moleküls und deutet auf eine beträchtliche Fehlordnung hin. Die Kristallstrukturanalyse und Positionierung der Unterein­heiten konnte lediglich mit Hilfe der einzelnen α- und β-Ringe des Archaeoglobus-20S-Par­tikels über Patterson-Such-Methoden ermittelt werden, gefolgt von einer individuellen rigid body Minimierung. Die Strukturüberlagerungen der Hauptkettenatome der α-Ringe aus [Seite 22↓]Wildtyp und β-Thr1Gly-Mutante zeigen identische Schwerpunkte sowie analoge α7β7-Anordnungen halber 20S-Proteasomkomplexe. Jedoch befindet sich im Vergleich zum Wild­typ in der Mutante zwischen den beiden Hälften ein Abstand von 4.5Ả der die α7β7-Assoziate voneinander separiert (siehe Abb. 9a).

Abb. 9 : Ribbonplot des Archaeoglobus-20S-Proteasoms aus Wildtyp und der β-Thr1Gly-Mutante. Die in der Kristallstruktur geordneten Aminosäuren sind in blau eingezeichnet, die fehlgeordneten Aminosäuren sind in rot dargestellt. Die schwarzen gestrichelten Linien deuten mit einer Länge von 69Ả den gemeinsamen Schwerpunkt halber 20S-Proteasome an. Im Falle der β-Thr1Gly-Mutante sind im Unterschied zum Wildtyp die halben 20S-Partikel über eine 4.5Ả Lücke voneinander getrennt. b) Ribbonplot von drei benachbarten β-Untereinheiten der β-Thr1Gly-Mutante mit struktureller Fehlordnung innerhalb der β-β-Schnittfläche.

Die berechnete 2FO-FC-Elektronendichtekarte der β-Thr1Gly-Mutante ergibt eine deutlich niederaufgelöstere Elektronendichte als die zu erwartende und deutet auf eine umfassende Fehlordnung im Kristall hin. Im speziellen konnten keine Elektronendichten für die Proseg­mente und Aminosäuren im Bereich der β-β-Schnittfläche erkannt werden. Allerdings zeigt die N-terminale Sequenzierung sowie die Analyse der SDS-Gelelektrophorese, daß in der Mutante die Vorläufer der β-Untereinheiten noch intakt sind und somit keiner Autolyse unterliegen.

Bereits am Beispiel von Hefe-20S-Proteasom-Mutanten wurde eine Umorientierung der β-Propeptide nach fortgeschrittener proteolytischer Spaltung durch benachbarte aktive β-Untereinheiten gefunden (Ditzel et al., 1998); (Groll et al., 1999) (siehe 2.2.7). Dabei nehmen die prozessierten Prosegmente eine analoge Konformation wie gebundene Inhibitoren an den aktiven Zentren ein (siehe 3.4.1), in denen sie den Spalt zwischen den Faltblättern der Amino­säuren 19-22, 45-52 und 112-120 besetzen. Teile dieser Sequenzen sind in der Kristallstruktur der βThr1Gly-Mutante aus A. fulgidus nicht definiert und weisen auf ein proteolytisch nicht [Seite 23↓]funktionstüchtiges aktives Zentrum hin. Des weiteren sind in der Mutante die beiden α7β7-Doppelringe strukturell nicht assoziiert (siehe Abb. 9b). Allerdings ergibt die Gelfiltrations­chromatographie der Mutante bezüglich der Retentionszeit Hinweise auf bereits assemblierte α7β7β7α7–Precursorkomplexe, und die dynamische Lichtstreuung zeigt eine im Vergleich zum Wildtyp leicht verlängerte Molekülform. Diese Experimente bestätigen den nahezu abgeschlossenen Reifungszustand des Archaeoglobus-20S-βThr1Gly-Proteasoms, so daß diese Mutante einem späten Assemblierungsintermediat gleichzusetzen ist.

Archaebakterielle und eukaryontische 20S-Proteasome sind in ihrer Sequenz und Struktur zueinander ähnlich (Bochtler et al., 1999); (Groll et al., 2003a). Die eukaryontischen 20S-Partikel assemblieren aus halben 13-16S-Komplexen (Schmidtke et al., 1997) und besitzen gleiche Eigenschaften hinsichtlich der Autolyse ihrer Propeptide (Ditzel et al., 1998); (Groll et al., 1999). Es erscheint somit wahrscheinlich, daß erste Schritte im Zusammenbau, im speziellen die initiale Ausbildung der α-Ringe, auch in eukaryontischen 20S-Proteasomen existieren. Hingegen zeigen die Prosegmente der β-Untereinheiten in Eukaryonten zueinander nur wenige Homologien. Die Kristallstruktur der βThr1Gly-Mutante aus A. fulgidus läßt trotz Erhalt der Rotationssymmetrie keine eindeutigen Kontakte der beiden halben 20S-Proteasome zu. Möglicherweise haben die unterschiedlichen β-Prosegmente in eukaryontischen 20S-Proteasomen unter Zuhilfenahme von Chaperonen wie ump/pomp (Ramos et al., 1998); (Witt et al., 2000) die Funktion eines stringenten Aufbaus der C2-Symmetrie im Molekül während der Partikelreifung.

3.2 Proteolyse- und Autolysemechanismus von 20S-Proteasomen

3.2.1 Der Mechanismus der Autoproteolyse

Wie bereits ausführlich beschrieben, zeigen die Kristallstrukturanalysen der 20S-Protea­some aus T. acidophilum, S. cerevisiae und A. fulgidus die Ursache der proteolytischen Spal­tung in den β-Untereinheiten (Groll&Huber, 2003b). Dabei exprimieren diese in Form von Precursorkomplexen und aktivieren sich im finalen Assemblierungsschritt durch eine intra­molekulare Autoprozessierung der Gly(-1)-Thr1-Bindung (siehe 3.1.3). Mit der Freisetzung von Thr1 entsteht im Falle der eukaryontischen 20S-Proteasome in den Untereinheiten β1, β2 und β5 das katalytisch aktive Zentrum. Die Autolyse der Aminosäure in Position eins findet nicht statt, wenn die katalytische Umgebung variiert, wie in den Untereinheiten β3, β4 und β6, denen Thr1 fehlt, sowie der Untereinheit β7, in der in Position 33 Lys gegen Arg und in Position 129 Ser gegen Phe ausgetauscht ist (Groll et al., 1997). Reaktivierungsversuche der [Seite 24↓]inaktiven Untereinheiten über Mutagenese blieben bislang erfolglos, obwohl der Verlauf der Hauptkettengeometrie sowie die überwiegende Zahl der für das proteolytische Zentrum notwendigen Aminosäuren auch in den inaktiven Untereinheiten vorhanden ist. Für eine aus­führliche Darstellung der Experimente wird auf die Publikation Groll et al., 1999 verwie­sen. Ebenso ist in Eukaryonten, anders als in Archaebakterien, der Aufbau von chimären 20S-Proteasomen über den Austausch von homologen Untereinheiten aus verschiedenen Organis­men nur im Fall von Drosophila/Maus betreffend der α2-Untereinheit gezeigt worden (Seelig et al., 1993), während in Hefen bislang keine chimären CPs gefunden wurden (Heinemeyer, persönliche Mitteilung). Diese Ergebnisse zeigen, daß die fehlerfreie Assemblierung der 20S-Protease weitaus mehr Aminosäuren benötigt, als letztendlich diejenigen, die im gereiften Molekül für die proteolytischen Aktivitäten analysiert worden sind. Umgekehrt lassen sich alle aktiven Untereinheiten durch Einzelmutationen in den katalytisch notwendigen Amino­säuren beeinflussen. So führt der Austausch von Thr1 zu Ala in den Untereinheiten β1 und β2 zu deren Inaktivierung. In Hefezellen ist dieser Ersatz für die Untereinheit β5 letal, jedoch kann diese Untereinheit durch Mutation von Lys33 zu Ala oder Arg inaktiviert werden (Heinemeyer et al., 1997); (Groll et al., 1999); (Jäger et al., 1999).

Kristallographische und biochemische Untersuchungen der active-site-Mutanten erge­ben, daß die Autolyse intramolekular und innerhalb einer Untereinheit erfolgt (Ditzel et al., 1998). Die Reaktionsfolge der Autolyse beinhaltet eine N-O-Umlagerung, wie es erstmals für acetylierte γ-Amino-β-buttersäure durch Isolierung des Oxazolin-Intermediats gezeigt wurde (Bergmann et al., 1923). O-N-Acyl-Umlagerungen mit Hydroxyloxazolidin-Inter­mediaten wurden ebenfalls schon in der Schutzgruppenabspaltung von N-terminalen Threonin-enthal­tenen Peptiden beobachtet (Hübener et al., 1992). Für die Thr1-Hydroxylgruppe des 20S-Pro­teasoms wäre ein Angriff auf die Carbonylgruppe der vorangehenden Peptideinheit unter Ausbildung eines Hydroxyloxazolidin-Intermediats als einleitender Schritt für die Auto­proteolyse zur aktiven β-Untereinheit denkbar (siehe Abb. 10). Für die Aufklärung des Reak­tionsmechanismus wurde die β1-Thr1Ala-Hefe-20S-Proteasommutante chemisch und struk­turell charakterisiert (Ditzel et al., 1998). Die β-Untereinheiten werden analog des Wildtyp­proteins prozessiert, mit Ausnahme der Untereinheit β1, die zwischen Arg(-10) und Leu(-9) gespalten ist. Das komplette Prosegment der Untereinheit β1 ist in der Elektronendichte defi­niert. Die strukturelle Überlagerung der Untereinheit β1 aus Mutante und Wildtyp ergibt kaum eine Abweichung der jeweiligen Hauptkettenatomen und ermöglicht somit die Model­lierung des Ala1 in der Mutante durch Koordinaten des Thr1, erhalten aus dem Wildtyp. Das [Seite 25↓]Ergebnis ist eine selbstspaltende aktive β1-Untereinheit. Die Konformation des Segments Leu(-2) bis Thr1N enthält eine Wölbung am Gly(-1) mit einer kurzen Wasserstoffbrücken­bindung zwischen Leu(-2O) und Thr1N (2.5Ả), klassifiziert als ein γ-turn, bestehend aus drei Aminosäuren, wie erstmals in Thermolysin gezeigt wurde (Colman et al., 1972). Die Amino­säure Gly(-1) ist in allen proteolytisch aktiven β-Untereinheiten strikt konserviert. Die Kristallstruktur der β1-Thr1Ala-Mutante läßt hierfür sterische Gründe vermuten, da im Falle von Seitenketten diese mit den benachbarten Aminosäuren zusammenfallen würden. Die Aminosäuren von Val(-4) bis Leu(-2) befinden sich antiparallel zum Segment 20-22 und besetzen die S1- und S3-Spezifitätstaschen. Analoge Haupt- und Seitengruppenwechsel­wirkungen werden bei der Bindung des Calpain-Inhibitor I mit der hefeproteasomalen Unter­einheit β1 gefunden (siehe Abb. 10 und 3.4).

Abb. 10 : Stereoabbildung der räumlichen Anordnung der Aminosäuren rund um das Thr1. Vorgeschlagener Reaktionsmechanismus der Autolyse und der Substratproteolyse am Beispiel der Untereinheit β1 des Hefe-20S-Proteasoms. Der Protein-backbone ist in Form von weißen coils, das Thr1 als schwarze balls-and-sticks dar­gestellt. Der Calpain-Inhibitor I sowie das β1-Propeptid sind als gelbe beziehungsweise braune coils einge­zeichnet. Die Überlagerung der β1-Hauptkettenatome aus Wildtyp und β1T1A-Mutante ergeben eine rms-Abweichung von 0.19Ẵ und erlauben somit den Austausch der Koordinaten von Ala1 mit Thr1. Das resul­tierende Modell zeigt, daß die Autolyse als auch die Proteolyse (lila Rasterpunkte) durch die Protonenübertra­gung vom Thr1Oγ zum N-terminus unter Zuhilfenahme des Wassermoleküls NUK (grüne Kugel) eingeleitet wird. Gly47N (dargestellt in schwarz) besitzt die Funktion des Oxyanion-holes für Substrate und Inhibitoren, indem es durch Energieabsenkung den tetraedrischen Addukt-Übergangszustand stabilisiert. Hingegen ist Ser129N (eingezeichnet in schwarz) hauptsächlicher Bestandteil des Oxyanion-holes für die Propeptide und steht in Wechselwirkungen mit der Carbonylsauerstoffgruppe des Gly(-1), während Lys33Nε mit der Carbonylsauer­stoffgruppe der Aminosäure in Position (-2) interagiert. Wasserstoffbrückenbindungen sind als schwarze Raster­punkte illustriert. Der Additonsreaktion des Thr1Oγ mit dem Carbonylkohlenstoff des Gly(-1) (Autolyse) oder mit dem Carbonylkohlenstoff des Nle1 (Proteolyse) folgt die Esterbildung, welche in beiden Mechanismen durch die Einlagerung des nukleophilen Wassermoleküls NUK zum Produkt hydrolysiert wird.


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Ähnlich wie die Seitengruppen des Tripeptidaldehyds reicht die Leu(-2)-Seitenkette in die S1-Tasche von β1 (siehe 2.2.6). Dabei interagiert die Guanidiniumgruppe der Aminosäure Arg45 analog wie im Falle des Hefe-20S-Proteasom:Calpain-Inhibitor I-Komplexes mit einem Bicarbonatanion, wodurch die Polarität der S1-Tasche vermindert wird, was wiederum eine Wechselwirkung mit der Leu(-2)-Seitengruppe ermöglicht. Lys33Nε befindet sich in zentraler Position und besitzt Wasserstoffbrückenbindungen zur Asp17-Seitengruppe und zum Carbo­nylsauerstoff von Arg19. Zwischen der Carbonylgruppe von Leu(-2) und Lys33Nε finden ebenfalls Wechselwirkungen statt. Die Carbonylsauerstoffe von Gly(-1) und Thr1 zeigen in Richtung der helikalen Windung um Ser129 und bilden je zwei Wasserstoffbrücken zum N von Ser129 und Gly130. Ser129Oγ interagiert mit Asp166. Thr1Oγ ist zentral zum γ-turn positioniert und in unmittelbarer Nähe der beiden Carbonylkohlenstoffatome von Leu(-2) und Gly(-1), so daß bei weiterer Rotation der Thr1Oγ-Seitengruppe sich ein pyramidaler Über­gangszustand der Carbonylkohlenstoffatome ausbildet, dem eine nukleophile Additionsreak­tion folgt (siehe Abb. 10). Beide Carbonylkohlenstoffatome sind über Wasserstoffbrücken stark polarisiert, so daß der nukleophile Angriff analog der Bindung von zu spaltenden Peptidgruppen in Oxyanionholes erleichtert wird. Als Intermediat entsteht ein Hydroxazoli­din, gefolgt von einer Esterbildung durch die Spaltung der C-N-Bindung. In der Umgebung von Thr1Oγ befindet sich keine basische funktionelle Aminosäure mit Ausnahme eines nukleophilen Wassers, das auch in den Wildtyp 20S-Proteasomstrukturen gesehen wird. Dies führt zu der Vermutung, daß das NUK die Base in der Additionsreaktion ist und somit als Protonendonor für den Amidostickstoff fungiert, wenn die C-N-Bindung unter der Ausbil­dung des Esters gespalten wird. Die Autoproteolyse endet mit der Esterhydrolyse, bei der das NUK letztendlich in das Produkt eingebaut wird.

3.2.2 Die Funktion der β-Propeptide

Alle β-Untereinheiten exprimieren als Precursoruntereinheiten, die ihr Prosegment während der Partikelreifung teilweise oder im Falle der aktiven Untereinheiten autoproteoly­tisch abspalten. Es stellt sich daher die Frage nach der Funktion der β-Propeptide. In Archae­bakterien besitzen die Propeptide keine wesentliche Funktion für eine korrekte Molekülas­semblierung sowie Generierung der proteolytisch aktiven Zentren. Anders hingegen in Eukaryonten: so konnte in Hefen gezeigt werden, daß das Propeptid der Untereinheit β5 für die Zellen lebensnotwendig ist und Einfluß im 20S-Proteasomaufbau besitzt (Chen&Hochstrasser, 1996); (Ramos et al., 1998). Die Prosegmente der restlichen aktiven [Seite 27↓]Untereinheiten sind in Hefen ebenfalls für den Molekülaufbau erforderlich, bewirken jedoch bei chromosomaler Deletion keinen Zelltod (Arendt et al., 1999). Um die Funktion des Pro­peptids der Untereinheit β1 im Detail zu verstehen, wurde das Prosegment dieser Untereinheit durch Ubiquitin ersetzt (Groll et al., 1999); (Jäger et al., 1999). Wie in anderen linearen Ubiquitinfusionen (Bachmair et al., 1986) wird Ubiquitin augenblicklich nach der Translation über C-terminale Ubiquitinhydrolasen von der β1-Untereinheit abgespalten, gefolgt von der Generierung des N-terminalen Threonins. Überraschenderweise besitzt aber das mutierte 20S-Partikel trotz geordneter Assemblierung keine proteolytische Aktivität in der Untereinheit β1. Die davon ermittelte Kristallstrukturanalyse ergibt für die Untereinheit β1 im Vergleich zum Wildtyp keine signifikanten strukturellen Unterschiede mit Ausnahme von zusätzlicher Elektronendichte an der Aminogruppe des Thr1. Diese konnte mit Hilfe von Massenspektro­graphie als Acetylgruppe identifiziert werden, so daß das β1-Propeptid die co- oder posttranslationale Acetylierung und damit Inaktivierung der proteolytischen Zentren verhindert. Der Verlust der enzymatischen Aktivität der N-Acetyl-β1-Mutante bekräftigt den für die Katalyse bereits vorgeschlagenen Mechanismus (Groll&Huber, 2003b) (siehe Abb. 6) und schreibt wiederum der Aminogruppe des Thr1, nicht aber dem Lys33 die Funktion des Protonenakzeptors zu (siehe 2.2.5). Ebenso wäre durch die Acetylgruppe eine sterische Hinderung der Substratbindung und damit Inaktivierung der Untereinheit denkbar. Allerdings liefert die Kristallstruktur als wesentlichen Grund für die unterdrückte Autolyse in der Mutante die sterische und elektrostatische Anordnung der Acetylgruppe. Parallel zu den strukturellen Ergebnissen zeigten genetische Experimente, daß die Nα-Acetyltransferase für die posttranslationale Modifizierung verantwortlich ist und im Falle der chromosomalen Deletion die über Ubiquitin transformierten Untereinheiten β1, als auch β2 und β5 weiterhin proteolytisch aktiv vorliegen (Arendt&Hochstrasser, 1999).

3.2.3 Die Funktion von Lys33 in der Proteolyse

Die grundlegende Aufgabe der konservierten Lys33-Reste in den proteolytisch aktiven Untereinheiten liegt in der Aufrechterhaltung der räumlichen Struktur sowie des elektro­statischen Potentials des Katalysezentrums und nicht in der Protonenakzeptorfunktion. So verhindert im Thermoplasma-20S-Proteasom der konservierte Ersatz von Lys33 mit Arginin in den β-Untereinheiten die Proteolyse als auch die Autolyse (Seemüller et al., 1996). Über­raschenderweise ist diese Substitution in eukaryontischen 20S-Partikeln für die Untereinheit β7 bereits im Wildtyp vorhanden. Die Kristallstruktur des Hefe-20S-Proteasoms erklärt die [Seite 28↓]fehlende proteolytische Aktivität als auch die unterbleibende Autolyse für β7, da die im Vergleich zum Lys33 sterisch anspruchsvollere Seitenkette des Arg33 die Position des Thr1 verschiebt und somit das nukleophile Zentrum zerstört. Reaktivierungsversuche der Unterein­heit β7 durch Mutation von Arg33Lys und Phe129Ser blieben jedoch erfolglos (Groll et al., 1999). Für eine ausführlichere Charakterisierung des Lys33-Restes wurde in Hefe diese Amino­säure in der proteolytisch aktiven Untereinheit β5 durch Arg ersetzt (Groll et al., 1999). Die Kristallstrukturanalyse der Mutante ergibt für die Untereinheit β5 mit Ausnahme des Arginins analog zur Wildtypstruktur eine identische Anordnung aller Aminosäuren in der Umgebung des aktiven Zentrums, einschließlich der Position des Thr1. Die strukturelle Überlagerung der β5-Untereinheiten von Mutante und Wildtyp zeigen für das Arg33 eine ähnliche Orientierung wie für das Lys33 mit der Einschränkung, daß die Guanidinogruppe zur Aminogruppe des Lys33 verkippt vorliegt und der dominierenden Position des Thr1 ausweicht. Trotz der strukturellen Homologien erzeugt die Mutation jedoch einen Verlust der chymotryptischen Aktivität gegenüber chromogenen Substraten. Somit findet entgegen Beobachtungen im Thermoplasma-20S-Proteasom weiterhin die intramolekulare Autolyse­reaktion statt. Diese Tatsache hat möglicherweise ihre Ursache in einer eingeschränkten verbleibenden proteolytischen Aktivität der mutierten Untereinheit, so daß durch die kovalente Bindung des Propeptids die Autolyse weiterhin erfolgt, jedoch die mittlere Verweilzeit der Substrate am aktiven Katalysezentrum für die Spaltung nicht mehr ausreicht. Die Mutante ist im Vergleich zur β5-Thr1Ala-Mutante überlebensfähig, weist aber bereits bei 30°C einen starken Wachstumsdefekt sowie eine proteasomale Überexpression auf. Der Auslöser des Phänotyps kann einerseits durch den Verlust der chymotryptischen Aktivität oder aber durch eine beeinträchtigte Reifung der 20S-Proteasome erklärt werden. Genetische und biochemische Studien der Mutante deuten auf eine Anreicherung von 20S-Precursor­intermediaten hin (Heinemeyer et al., 1997); (Jäger et al., 1999) und favorisieren somit die verzögerte Partikelassemblierung.

Da die Autolyse in der β5-Lys33Arg-Mutante unmerklich stattfindet, ist im nächsten Schritt die β5-Lys33Ala-Mutante strukturell charakterisiert worden (Groll et al., 1999). Der Hefestamm ist überlebensfähig, obwohl die Zellen bei 30°C kaum Wachstumstendenz sowie ein zehnfach vergrößertes Volumen im Vergleich zum Wildtyp haben und ähnlich wie in der β5Lys33Arg-Mutante ungewöhnlich große Mengen an 20S-Proteasom bilden (Heinemeyer et al., 1997); (Jäger et al., 1999). Die Kristallstrukturanalyse der Mutante zeigt definierte Elektronendichte für das β5-Propeptid und eine wesentliche Neuorientierung des Thr1, das [Seite 29↓]die Kavität, generiert durch den Lys-Ala-Ersatz, ausfüllt (Groll et al., 1999). Die strukturellen Änderungen der β5Lys33Ala-Mutante erklären die fehlende Autolyse und Proteolyse in der Untereinheit und teilen dem Lys33 neben der Aufrechterhaltung des elektrostatischen Potentials die Funktion des strukturellen Aufbaus des Katalysezentrums zu.

3.3 Substratzugang zum proteolytisch aktiven Zentrum in 20S-Proteasomen

3.3.1 Strukturelle Unterschiede prokaryontischer und eukaryontischer 20S-Protea­some

Der strukturelle Aufbau eukaryontischer 20S-Proteasome trennt die proteolytischen Kammern räumlich von den zellulären Komponenten ab, so daß einerseits der unvorher­gesehene Abbau von endogenen Proteinen verhindert, andererseits die vollständige Prozes­sierung von zu spaltenden Polypeptiden ermöglicht wird (siehe Abb.1 und 2.2.8). Jedoch bewirkt diese strukturelle Gliederung hohe Anforderungen für den Zugang von Substraten in das Partikelinnere sowie für die Freigabe der bereits vollständig gespaltenen Produktfrag­mente. Das Thermoplasma-20S-Proteasom besitzt zwei Eingangsportale an den vertikalen Enden des zylinderförmigen Partikels, deren ringförmige Öffnungen aufgrund von schleifen-formierenden Segmenten in den sieben identischen α-Untereinheiten auf etwa 13Ả Durch­messer beschränkt sind (siehe Abb. 11b) (Löwe et al., 1995). Nennenswert in diesem Zusam­menhang sind jedoch die Fehlordnungen der N-terminalen 12 Aminosäuren aller α-Unterein­heiten im Kristall, wodurch die strukturelle Zuordnung dieser Reste nicht möglich ist. Im Gegensatz zum archaebakteriellen 20S-Komplex zeigt das Hefe-20S-Proteasom eine fest verschlossene hydrolytische Kammer, mit Ausnahme weniger Seitenöffnungen an der Grenz­fläche der α- und β-Ringe (siehe Abb. 1f) (Groll et al., 1997). Allerdings erscheinen diese Fenster für einen regulierten Substratzutritt als zu engmaschig. Im eukaryontischen 20S-Komplex füllen die N-terminalen Aminosäuren der α-Untereinheiten die in archaebakteriellen 20S-Proteasomen gefundenen Öffnungen der α-Ringe in mehreren Schichten durch stark ineinandergreifende Wechselwirkungen der Seitenketten komplett aus (siehe Abb. 11c). Experimentelle Befunde zeigen aber, daß die Peptidaseaktivität eukaryontischer 20S-Protea­some von vielen Faktoren abhängt: (1) Die Aktivierung erfolgt im Falle der Bindung von 20S-Proteasomen mit den 19S-Regulatorkomplexen zu 26S-Proteasomen (DeMartino et al., 1994); (Hoffman&Rechsteiner, 1996); (2) es existieren weitere endogene Regulatoren wie beispielsweise der γ-Interferon-abhängige PA28- oder der PA200/Blm3-Komplex, die mit dem 20S-Proteasom einen stabilen Komplex formieren (Gray et al., 1994); (Realini et al., [Seite 30↓]1997); (Ustrell et al., 2002); (3) chemische Detergenzien, wie niedere Mengen an Natrium­dodecylsulfat (SDS), können Einfluß auf die proteolytische Aktivität des 20S-, nicht aber des 26S-Proteasoms ausüben (Orlowski et al., 1991).

Abb. 11 : a) Sequenzalignierung der verschiedenen N-Termini von den proteasomalen α-Untereinheiten aus T. acidophilum (TA) und S. cerevisiae (SC). Die Numerierung der Aminosäuren der α-Untereinheiten aus Hefe ist der Primärsequenz der α-Untereinheit aus Thermoplasma angepaßt. Mit Aminosäure Thr13 beginnt in den α-Untereinheiten von Thermoplasma definierte Elektronendichte (vertikale blaue Umrandung). Links vom Kasten befinden sich die N-terminalen Aminosäuren (N-terminal tails), die im Falle der Hefeuntereinheiten jeweils eine entsprechende Farbkodierung besitzen. Aminosäuren mit struktureller Fehlordnung sind in grau dargestellt; Aminosäuren, die in den Kristallstrukturen des Thermoplasma-20S-Proteasoms sowie der Hefe-20S-α3ΔN-Mutante definierte Elektronendichten zeigen, sind über einen grauen Hintergrund hervorgehoben. Es wurden ausschließlich die über N-terminale Sequenzanalyse identifizierten Aminosäuren verwendet. Die konservierte Helix H0 ist als gelber Balken eingezeichnet. b-d) Ribbonplot der α-Ringe aus T. acidophilum und Hefe. Für Hefe sind die N-terminalen tails mit der in (a) verwendeten Farbkodierung in Klammern angegeben. In den Hefestrukturen ist die pseudosiebenzählige Symmetrieachse als schwarzer Kreis (c) bzw. als schwarze Raster­linie (d) und (e) eingezeichnet.


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3.3.2  Der Mechanismus der Kanalbildung in eukaryontischen 20S-Proteasomen

Der Aktivierung in 20S-Proteasomen wurde ebenso wie in anderen ATP-abhängigen Proteasen oft eine allosterische Regulation der proteolytisch aktiven Zentren zugemessen. Dahingegen gibt es für das eukaryontische 20S-Partikel aus struktureller Sicht keine Anzei­chen, die obige Annahme bestätigen. Alternativ kann die Aktivierung des eukaryontischen 20S-Komplexes in Zusammenhang mit einer Ausbildung eines zentralen Kanals in das Mole­külinnere gebracht werden. Diese Vorstellung erfordert jedoch eine beträchtliche Reorganisa­tion der N-terminalen Segmente verschiedener α-Untereinheiten und legt aufgrund der Aktivierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt für die Substrathydrolyse über den Zugang zu den proteolytisch aktiven Zentren fest. Mit der Kristallstrukturanalyse einer N-terminalen Deletionsmutante des Hefe-20S-Proteasoms konnte das Prinzip und der Mecha­nismus des regulatorischen Öffnens und Schließens aufgeklärt werden (Groll et al., 2000a). Als Ansatz für die Deletion wurde das N-terminale Segment der Untereinheit α3 gewählt, da es gegenüber den anderen N-Termini quer über den α-Ring ragt, orthogonal zur pseudo-siebenzähligen Achse orientiert ist, Kontakte mit allen anderen α-N-Termini eingeht und in einer einzigartigen Strukturanordnung vorliegt (siehe Abb. 11c und 11d). Mit Hilfe der strukturellen Ergebnisse aus dem Thermoplasma-20S-Proteasom und dem Sequenzvergleich der α-Untereinheiten aus Archaeen und Eukaryonten wurde eine ähnliche Kanalbildung wie im Thermoplasma-20S-Proteasoms vermutet und somit die ersten neun Aminosäuren der Untereinheit α3 chromosomal entfernt (diesbezüglich die Bezeichnung α3ΔN-Mutante) (siehe Abb. 11a). Überraschenderweise wies die α3ΔN-Mutante keine besonderen Phäno­typen auf, jedoch ließ die Kristallstruktur dieser Mutante einen offenen Kanal mit ähnlichen Dimensionen wie bei den Eintrittsöffnungen im Thermoplasma-20S-Partikel durch das gesamte Molekül erkennen (siehe Abbildung 12). Der Wegfall der Elektronendichte begründete sich sowohl aus der chemischen Entfernung der N-terminalen Aminosäuren der Untereinheit α3 als auch aus den Fehlordnungen der N-Termini der anderen α-Untereinheiten. In der Deletionsmutante zeigt die Untereinheit α3 keine Einschränkungen in der Faltung und widerlegt Annahmen der Kanalbildung in der α3ΔN-Mutante durch möglicherweise auftretende Assemblierungsdefekte.


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Abb. 12 : Elektronendichtekarten der α-Ringe des Hefe-20S-Proteasoms aus a) Wildtyp und b)α3ΔN-Zellen. Die Elektronendichten sind mit 2FoFc-Koeffizienten nach zweifacher Mittelung bei 1σ konturiert. Die N-terminalen tails sind entsprechend der Farbkodierung von Abbildung 11a wiedergegeben.

Im Vergleich zum Wildtyp besitzt das 20S-Proteasom der α3ΔN-Mutante gegenüber den chromogenen Peptid­substraten eine stark erhöhte proteolytische Aktivität, die ähnlich zu der in 26S-Proteasomen ist. Die strukturellen Überlagerungen der β-Untereinheiten der α3ΔN-Mutante und des Wild­typs zeigen zueinander keine Unterschiede und schließen somit eine allosterischen Einfluß aus. Des weiteren findet in der α3ΔN-Mutante keine wie im Wildtyp gefundene Aktivitäts­steigerung bei SDS-Zusatz statt, so daß der Detergenseffekt für natürlich vorkommende eukaryontische 20S-Proteasome über eine Kanalöffnung im α-Ring zu erklären ist. Die α3ΔN-Mutante verändert nicht die Stabilität oder Abundanz von 26S-Proteasomen, und die Holoenzyme des Wildtyps und der N-terminalen Deletionsmutante haben gleiche proteo­lytische Aktivität gegenüber chromogenen Testsubstraten. Diese Beobachtung ergibt, daß die Bindung des regulatorischen 19S-Partikels an das 20S-Proteasom eine Umlagerung der N-terminalen Aminosäuren der Untereinheit α3 auslöst und analog der α3ΔN-Mutante eine ähnliche Struktur im 20S-Komplex generiert. Der verschlossene Kanal, wie auch in der Kristallstruktur des Hefe-20S-Proteasoms gefunden, ist somit die überwiegend auftretende Konformation von eukaryontischen 20S-Partikeln in Lösung und stellt für die Substrathydro­lyse den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt dar.

Ein bemerkenswertes Ergebnis liefert die Vorinkubation der α3ΔN-Mutante mit dem synthetischen Nonapeptid, das die N-terminale α3-Sequenzfolge aufweist, da sich innerhalb von 15 Minuten die erhöhte proteolytische Aktivität der Deletionsmutante wieder auf die des Wildtyps zurücksetzen läßt. Dieser Befund veranlaßte eine vereinzelte Alaninabfrage im [Seite 33↓]synthetischen Nonapeptid und zeigte, daß mit Ausnahme der Aminosäure Asp9 alle anderen Substitutionen im Peptid die proteolytische Aktivität der α3ΔN-Mutante inhibieren. Ein Austausch des Asp9 zum Asn im Nonapeptid ergab erwartungsgemäß und analog zur Asp9Ala-Substitution ebenfalls kaum einen Einfluß auf die proteolytische Aktivität der α3ΔN-Mutante (siehe Abb. 13a). Auch die chromosomale α3-Asp9Ala-Punktmutation wies eine proteolytisch verstärkte Aktivität ähnlich wie die der α3ΔN-Mutante auf, so daß dem α3-Asp9 im 20S-Komplex eine Schlüsselfunktion bezüglich des regulierten Öffnens und Schließens der α-Ringe zuzuschreiben ist. In der Wildtypstruktur des Hefe-20S-Proteasoms als auch in der Kristallstruktur des Rinder-20S-Proteasoms (Groll et al., 1997); (Unno et al., 2002) geht die Aminosäure α3-Asp9 charakteristische Wechselwirkungen mit den räumlich benachbarten Aminosäuren α4-Tyr8 und α4-Arg10 ein. In eukaryontischen 20S-Proteasomen erfolgt der spezifische Regulationsmechanismus somit über dieses signifikante Strukturmotiv (YDR-Motiv) (siehe Abb. 12a und Abb. 13b).

Abb. 13 : a) Einfluß von modifizierten synthetischen α3-N-terminalen tail-Peptiden auf die proteolytische Aktivität der α3ΔN-Mutante gegenüber chromogenen Substraten. Die proteolytische Aktivität der Proteasom­mutante wird auf 100% festgelegt. Abhängig von der Sequenzfolge (Polyalaninscan, eingezeichnet in rot) zeigen die Peptide mit Ausnahme des Asp9Ala-Ersatzes bei Konzentrationen von 5mM und einer Vorinkubation von 15min starke Wechselwirkungen mit der Mutante. Ebenso wie die Asp9Ala-Substitution besitzt der konservierte Austausch von Asp9Glu oder Asp9Asn im Peptid (eingezeichnet in grün) wenig bzw. kaum einen Einfluß auf die proteolytische Aktivität der α3ΔN-Mutante. b) Atomarer Ausschnitt des Eingangsportals in der geschlos­senen Konformation des Hefe-20S-Proteasoms aus Wildtypzellen. Die N-terminalen Reste sind in gleicher Farb­kodierung dargestellt wie in Abb. 11a. Interaktionen zwischen den verschiedenen Aminosäuren sind nur für das YDR-Motivs als schwarze Rasterlinien eingezeichnet. Die Carboxylatgruppe von Asp9 der Untereinheit α3 bildet sowohl eine Salzbrücke mit der Guanidiniumgruppe von Arg10 als auch eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Hydroxylgruppe des Tyr8 der benachbarten Untereinheit α4. Die Carboxylatgruppe wechselwirkt ebenso mit den Amidstickstoffen der Proteinhauptkette Ser10 und Arg11 der Untereinheit α3. Die Ergebnisse erlaubten Planung und Umsetzung der α3-Asp9Ala-Mutante (dargestellt in blau), Diese besitzt gegenüber chromogenen Substraten eine ähnliche proteolytische Aktivität wie die α3ΔN-Mutante (a). Asp9 nimmt somit eine Schlüssel­funktion für den Regulationsmechanismus des Öffnens und Schließens ein.


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Das YDR-Motiv ist am Außenrand der Pforte lokalisiert und gewährleistet durch Wechselwirkungen mit dem regulatorischen 19S-Komplex die Bildung eines durchgängigen Kanals. Ebenso sind die N-terminalen Segmente durch ihre Lage strukturell nicht einge­schränkt und zeigen größtenteils keine Sekundärstrukturen, wodurch die Konformations­änderungen im α-ring über einzelne Aminosäuren und energetisch rationell gesteuert werden. Der Erhalt des Tyr8 ist in allen α-Untereinheiten stringent, während Asp9 in sechs der sieben α-Untereinheiten auftaucht und Arg10 weniger konserviert vorliegt. Nennenswert ist, daß Überlagerungen aller bislang ermittelten eukaryontischen Sequenzen in den Untereinheiten α3 und α4 das YDR-Motiv aufweisen (Groll et al., 2000a). Eine Begründung der Evolution liegt in der natürlichen Mutation, die bevorzugt an oberflächenexponierten Aminosäuren mit fehlenden Strukturmotiven erfolgt. Die Primärsequenzen der sieben verschiedenen N-Termini in den α-Untereinheiten sind zueinander mit Ausnahme des Tyr8 und Asp9 nicht homolog, besitzen aber nahezu Identität mit den Sequenzen anderer eukaryontischer Organismen. Beispielsweise zeigen die beiden Spezies S. cerevisiae und H. sapiens nahezu gleiche Anord­nung in ihren N-terminalen Aminosäuren der α-Untereinheiten, trotz der schon früh einge­tretenen Differenzierung. Diese Beobachtung läßt vermuten, daß bereits eukaryontische Vorfahren über Besitz, Funktion und Struktur des YDR-Motivs verfügten. Nicht zu erklären ist jedoch der bislang noch fehlende Phänotyp der α3ΔN-Mutante in Hefen.

3.3.3 Die Regulatoren von eukaryontischen 20S-Proteasomen

Wie bereits kurz beschrieben stimulieren endogene Regulatoren die Peptidhydrolyse über das 20S-Proteasom (DeMartino et al., 1999). Kürzlich konnte die Kristallstruktur des Hefe-20S-Proteasoms komplexiert mit einem zur PA28-Familie (REGα, REGβ und REGγ) homologen PA26-Molekül aus Trypanosomen aufgeklärt werden (Whitby et al., 2000). Die Struktur zeigt wie die α3ΔN-Mutante eine Kanalbildung im α-Ring des 20S-Proteasoms. Dabei sind die N-terminalen Segmente der α-Untereinheiten größtenteils fehlgeordnet und können nicht mehr in der Elektronendichtekarte zugeordnet werden. Die Umlagerung der α-N-Termini bewirkt die gegenüber fluorophoren Testsubstraten gesteigerte proteolytische Aktivität und weist Parallelen zur bereits beschriebenen α3ΔN-Mutante auf. PA26 besitzt in seiner Struktur und Funktion nicht die Fähigkeit Nukleotide zu binden. Die Öffnung der α-Ringe erfolgt hierbei durch Wechselwirkungen der C-Termini von PA26 mit reversen turns, die zwischen der Helix H0 und den N-terminalen Segmenten der α-Untereinheiten im 20S-Komplex zu finden sind. Obwohl der regulatorische 19S- als auch der PA26/28-Komplex an [Seite 35↓]die α-Ringe des 20S-Proteasoms binden, unterscheiden sich beide Komponenten voneinander im Aktivierungsmechanismus. So besitzt PA26 keine ersichtliche Sequenzähnlichkeit zu den Untereinheiten des 19S-Regulators und liegt als heptamerer Ring vor, während der 19S-Komplex an der 20S-Proteasom-Kontaktfläche einen sechsgliedrigen Ring aus sequenzver­wandten ATPase-Untereinheiten bildet (Glickman et al., 1998). Ebenso zeigen Experimente in denen das Nukleotidbindemotiv in der ATPase-Untereinheit Rpt2 über Mutagenese gestört wurde, ein 26S-Proteasom mit eingeschränkter proteolytischer Aktivität gegenüber chromo­genen Substraten, ähnlich wie das latente 20S-Proteasom (Köhler et al., 2001).

3.3.4 Das YDR-Motiv in archaebakteriellen 20S-Proteasomen

Im Vergleich zu eukaryontischen 20S-Proteasomen besitzen die einfacher aufgebauten prokaryontischen Kernpartikel nicht die Fähigkeit ein multifunktionales 26S-Proteasom aufzubauen, da in diesen Organismen die meisten Gene für den regulatorischen 19S-Komplex fehlen. Trotzdem enthalten alle bislang sequenzierten archaebakteriellen 20S-Proteasomen in ihren α-Untereinheiten das YDR-Motiv. Diese Beobachtung läßt vermuten, daß der Mecha­nismus des Öffnens und des Schließens von 20S-Proteasomen Allgemeingültigkeit hat. Die Kristallstrukturanalysen der 20S-Proteasome aus T. acidophilum und A. fulgidus zeigen jedoch eine strukturelle Fehlordnung in den N-terminalen Segmenten der α-Untereinheiten und illustrieren demgemäß einen zentralen durchgängigen Kanal in den Molekülen (Löwe et al., 1995); (Groll et al., 2003a). Innerhalb dieser fehlgeordneten Aminosäuren befindet sich unter anderem das YDR-Motiv. N-terminale Sequenzierungen ergeben keinen Abbau oder posttranslationale Modifikation der α-N-Termini und deuten auf eine intakte Funktion dieser Reste hin. Würden jedoch die N-terminalen Segmente für jeden einzelnen Strang eine für die Untereinheit charakteristische Struktur einnehmen, die einer siebenfachen Symmetrie nicht mehr gehorcht, so wäre diesem Bereich durch die statistische Anordnung der Moleküle im Kristall keine Elektronendichte zuzuschreiben und die Interpretation der Kristallstruktur eine artifizielle Annahme. Allerdings besitzt die α3-Asp9Ala-Mutante des Hefe-20S-Proteasoms eine im Vergleich zum Wildtyp zwanzigfach gesteigerte Aktivität gegenüber chromogenen Substraten, während die α-Asp9Ala-Mutante des Archaeoglobus-20S-Partikels nur wildtyp­ähnliche Aktivität aufweist (Groll et al., 2000a); (Groll et al., 2003a). Dieses Ergebnis wider­legt angesichts der zentralen Funktion des Asp9 im YDR-Motiv den in eukaryontischen 20S-Proteasomen gefundenen Regulationsmechanismus für die Ausbildung und Stabilität des Steuerelements. Überraschenderweise ergab die Kristallstrukturanalyse des α-Rings von A. [Seite 36↓] fulgidus alleine eine definierte Elektronendichte für den gesamten N-Terminus (siehe 3.1.2) (Groll et al., 2003a). Die N-Termini besitzen in dieser Struktur eine siebenfache Symmetrie, ragen vom Molekülzentrum nach außen und folgen der Sekundärstruktur einer 310-Helix (siehe Abb. 14a).

Abb. 14 : Ribbonplot der α-Ringe von a) A. fulgidus und b) Hefe (dargestellt in blau). Die N-terminalen Segmente sind in rot eingezeichnet. Das YDR-Motiv ist als balls-and-sticks gezeigt und Kontakte mit benach­barten Untereinheiten sind schwarz gefärbt. In A. fulgidus und in Hefe liegt jeweils eine Wasserstoffbrückenbin­dung zwischen Asp9 und dem benachbarten Tyr8 vor, jedoch unterscheiden sich die Tertiärstrukturen vonein­ander deutlich. In a) ist für das YDR-Motiv die siebenfach gemittelte Elektronendichte mit 2FO-FC-Koeffizienten bei 1σ dargestellt.

Ausgebildet durch die individuellen α-Untereinheiten formiert diese Anordnung im α-Ring einen Kanal von ca. 13Ả Durchmesser, der über die Schleifensegmente Tyr126, Gly127 und Gly128 begrenzt wird und identisch zur 20S-Proteasom-Wildtypstruktur ist. Die N-terminalen Segmente sind miteinander ausschließlich über das YDR-Motiv in Wechselwirkung. Im speziellen interagiert Asp9 mit Tyr8 der benachbarten Untereinheit, während Arg10 auf die Pore ausgerichtet ist und dem Kanal ein stark positives Potential verleiht. Es ist unwahr­scheinlich, daß die unterschiedliche Konformation der N-terminalen Segmente im α-Ring des 20S-Proteasoms verglichen mit der des freien α-Rings allosterisch durch die β-Untereinheiten verursacht wird, da die α-Untereinheiten mit Ausnahme der N-Termini einschließlich der αβ-Grenzflächen in beiden Molekülen nahezu identische Tertiärstrukturen aufweisen (siehe Abb. 8 und 3.1.2). Eine mögliche Erklärung für diese strukturellen Abweichungen könnten die verschiedenen Kristallisationspufferbedingungen sein. Voraussichtlich ist die globale Konformation der archaebakteriellen N-Termini in 20S-Proteasomen mit nur geringer Diskrepanz in den einzelnen α-Untereinheiten ähnlich zu der im α-Ring aus A. fulgidus ermittelten. Jedoch rufen die geringfügig unterschiedlichen Konstellationen die kristallo­graphischen Fehlordnungen der N-terminalen Bereiche hervor. Die starke Sequenzhomologie der α-Untereinheiten beginnt mit dem YDR-Motiv, während die vorhergehenden Aminosäure­[Seite 37↓]reste zueinander keine Ähnlichkeiten in ihrer Länge und ihrer Ladungsverteilung aufweisen. Die strukturellen Ergebnisse zeigen, daß die N-terminalen Segmente miteinander aus­schließlich über das YDR-Motiv in Wechselwirkungen stehen. Somit könnten willkürliche Mutationen im YDR-Motiv die Ausbildung der 310-Helix in den N-Termini unterbinden und im ungünstigsten Fall den Kanal des α-Rings für den Substratzugang abriegeln. In eukaryontischen 20S-Proteasomen ist das YDR-Motiv unter den sieben verschiedenen α-Untereinheiten nicht konserviert. Die Ursache hierfür könnte sich aus der Genduplikation in der frühen Entwicklungsgeschichte ergeben haben, bei der sich die Neubildung eines regulierten Öffnungs- und Schließmechanismus durch die voneinander verschiedenen α-N-Termini ereignet hat. Somit entsteht durch den Verlust der Symmetrie in eukaryontischen 20S-Komplexen eine neue Steuerkomponente für den Substratzugang, die in prokaryon­tischen Kernpartikeln fehlt. Die gewonnene Erkenntnis über das YDR-Motiv ist außerge­wöhnlich, da es einerseits in der Primärstruktur der α-Untereinheiten aller Organismen erscheint, andererseits aber in Eukaryonten und Archaebakterien voneinander unabhängige Tertiärstrukturen mit unterschiedlichen Funktionen annimmt.

3.4 Inhibitoren des 20S-Proteasoms

3.4.1 Kovalent bindende 20S-Proteasominhibitoren

Der regulierte Abbau von ubiquitinierten Proteinen über das Proteasom hat einen wesentlichen Einfluß auf den streng kontrollierten Ablauf einer großen Zahl biologischer Prozesse in der Zelle wie Apoptose, Zellteilung, Zelldifferenzierung und Entzündungsbildung (Kloetzel, 1998). Somit liegt es nahe, daß spezifische Proteasominhibitoren als Medikamente für die Bekämpfung von Karzinomen oder alsAntiphlogistikazukünftig eingesetzt werden könnten. Einer der zuerst gefundenen unspezifischen Proteasominhibitoren war die Verbin­dung N-Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal (Ac-LLnL-al, Calpain-Inhibitor I), die im wesentlichen Kenntnisse bezüglich der Proteolyseeigenschaften des 20S-Proteasoms gebracht hat (Vinitsky et al., 1994). Die Kristallstrukturanalyse des Thermoplasma-20S-Proteasoms mit Ac-LLnL-al zeigt den Inhibitor reversibel als Hemiacetal an das N-terminale Thr1Oγ gebunden (Löwe et al., 1995). Der Inhibitor nimmt in der Struktur eine ausgedehnte Konformation an und besetzt unter Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen den Spalt zwischen den Faltblättern der Aminosäuren 19-22, 45-52 und 112-120 als antiparalleles β-Faltblatt. Die S1-Norleucin-Seitenkette des Inhibitors bildet dabei starke Wechselwirkungen mit dem Protein, während die Leucin-Seitenkette in S2 keine Kontakte mit dem Protein eingeht. Die S3-Leucin-Seiten­[Seite 38↓]kette von Ac-LLnL-al interagiert mit Aminosäuren der benachbarten 20S-Proteasomunterein­heit, so daß der Inhibitor im 20S-Komplex generell stark verankert vorliegt. In eukaryon­ti­schen 20S-Proteasomen blockiert der Inhibitor bevorzugt die CL-Aktivität, während die TL- und PGPH-Aktivität nur mäßig unterdrückt werden (Figueiredo-Pereira et al., 1994). Hinge­gen ergibt die Kristallstrukturanalyse des Hefe-20S-Proteasoms in Komplex mit dem Calpain-Inhibitor I aufgrund der hohen eingesetzten Konzentrationen an Inhibitor (Ac-LLnL-al: 1mM) eine vollständige Besetzung aller proteolytisch aktiven Untereinheiten (Groll et al., 1997). Allerdings können die unterschiedlichen Polaritäten der S1-Taschen in eukaryontischen 20S-Proteasomen den Einfluß des Inhibitors auf die verschiedenen proteolytisch aktiven Zentren erklären (siehe 2.2.6).

Der zuerst gefundene natürlich vorkommende Proteasominhibitor war Lactacystin aus Streptomyces. Es wurde festgestellt, daß der Metabolit Auswirkungen auf das Nerven­wachs­tum von Neuroblastoma-Zellinien in Mäusen hat (Fenteany et al., 1995). Radioaktiv-Experi­mente mit Tritium-markiertem Lactacystin zeigten nach Inkubation mit humanem 20S-Proteasom die Verbindung kovalent gebunden an die proteasomale Untereinheit β5, obwohl Lactacystin unter bestimmten Bedingungen alle proteolytischen Aktivitäten beeinflußt. Ursprünglich wurde angenommen, daß das Naturprodukt spezifisch für 20S-Proteasome ist, jedoch wurden später auch Kreuzreaktionen mit anderen Proteinasen wie lysosomales Cathepsin A nachgewiesen. In wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von acht hydrolysiert Lactacystin augenblicklich zu clasto-Lactacystin-β-lacton, welches die reaktive Binde­kompo­nente mit dem Thr1Oγ des Proteasoms darstellt. Die Kristallstruktur des Komplexes des Hefe-20S-Proteasoms mit Lactacystin zeigt das Inhibitormolekül nur an die Untereinheit β5 gebun­den (Groll et al., 1997) und steht damit in Übereinstimmung mit den zuvor gefun­denen Er­gebnissen (Fenteany et al., 1995). Grundsätzlich ist der Inhibitor am proteolytisch aktiven β5-Zentrum über eine große Anzahl an Wasserstoffbrückenbindungen mit Protein­hauptketten­atomen stabilisiert. Die irreversible Hemmung des 20S-Proteasoms durch Lacta­cystin ist auf eine kovalente Esterbindung des Inhibitors mit dem N-terminalen Thr1 zurück­zuführen (siehe Abb. 15a). Obwohl Lactacystin ebenso gleiche Interaktionen mit den Unter­einheiten β1 und β2 eingehen kann, ergibt die Kristallstrukturanalyse des Komplexes in diesen Untereinheiten keine definierte Elektronendichte für den Inhibitor. Wesentliche Gründe hierfür sind die Abweichungen der S1-Taschen der Untereinheiten β1 und β2 verglichen mit der Untereinheit β5. Eine Hauptfunktion der Spezifitätstaschen ist, die mittlere Verweilzeit von Substraten am aktiven Zentrum durch charakteristische Wechselwirkungen zu verlängern, damit die proteo­[Seite 39↓]lytische Reaktion ablaufen kann. Die Dimethylseitenkette des Lactacystins imitiert ein Valin oder Leucin und interagiert im speziellen mit der Aminosäure Met45 der Untereinheit β5, während in den Untereinheiten β1 und β2 die große Anzahl polarer Seitenketten den Inhibitor destabilisiert und damit die Reaktion verhindert.

Abb. 15 : a) Stereoabbildung der Hefe-20S-Proteasom-Untereinheiten (dargestellt in weiß und grau) kom­plexiert mit den Inhibi­toren (darge­stellt in grün) a) Lactacystin, b) Epoxomicin, c) MB1 und d) TMC95A. Die Elektro­nendichte­karten (dargestellt in blau) sind über 1σ kontu­riert und zeigen jeweils eine ähnliche Orientierung des Thr1 (darge­stellt in schwarz) mit 2FO-FC-Koeffizienten nach zweifacher zy­klischer Mittelung. Es wurden keine großen strukturellen Verän­derungen im Proteinmolekül mit Ausnahme des ge­bundenen Inhibitors gefunden. Die Temperaturfaktorverfeinerung deutet auf eine vollständige Beset­zung aller Inhibitor-Bindestellen hin. Die Inhibitoren wurden für die Berechnungen der Elektronendich­ten ausgeschlossen. a) Die Unter­einheit β5 kovalent gebundnen an den Streptomyces-Metaboliten Lac-tacystin. Die P1-Taschen der Unter­einheiten β1 und β2 unter­scheiden sich von der P1-Tasche in der Untereinheit β5 und zeigen keine Komplexbildung mit Lacta­cystin. Met45 der Untereinheit β5 (darge­stellt in schwarz) ist haupt­sächlich für den hydrophoben Cha­rakter der β5-S1-Tasche verant­wortlich und bestimmt auf­grund der Wechselwir­kung mit der ver­zweig­ten Seiten­kette von Lactacystin die Unterein­heitenspezifität. b) Die Untereinheit β2 kova­lent gebunden mit dem na­türlich vorkommenden 20S-Protea­sominhibitor Epoxo­micin. Die Elektronendichte zeigt eine hexa­mere Ringbil­dung von Epoxomicin am proteolytisch akti­ven Zen­trum. Dieses Morpholino­derivat resultiert aus der Addukt­formation zwischen Epoxomicin und dem protea­somalen Thr1Oγ und N und erklärt die Selek­tivität von Epoxo­micin gegenüber der Klasse der Ntn-Hydrolasen. c) Die Unter­einheit β2 kovalent gebunden mit dem spe­zifischen synthetischen Inhibitor Ac-PRLN-vs. Günstige Wasserstoffbrückenbindungen zwi­schen der Arg-Seitenkette des Vinylsul­fons mit den für die P3-Tasche ver­antwortlichen Aminosäuren β2-Asp28 und β3-Cys118 sind als orange Punkte dargestellt und verantworten die Selektivität dieses Inhibitors. Die Untereinheiten β1 und β5 zeigen keine Inhi­bitor-Bindestellen. d) Die Unter­einheit β2 nicht-kovalent gebunden mit dem Naturprodukt TMC-95A aus Apio­spora montagnei. TMC-95A bindet lediglich in die Substratbindetaschen aller aktiven Untereinheiten und modi­fiziert somit nicht das nukleophile Thr1Oγ. Die Wechselwirkungen des Inhibitors sind begründet durch die Fal­tung des Proteinmo­leküls, so daß die Klasse der TMC-95-Verbindungen keine Effekte bezüglich anderer Protea­sen aufzeigt.


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Im Gegensatz zu Lactacystin bindet der Calpain-Inhibitor I trotz hydrophober S1-Reste auch an die Untereinheiten β1 und β2. Die Aldehydgruppe stellt aber im Vergleich zum β-Lactonring eine weitaus reaktivere funktionelle Gruppe dar und sorgt somit für eine schnellere Reaktion des Calpain-Inhibitor I am Thr1Oγ, was die unterschiedlichen Spezifitäten der beiden Inhibitoren erklärt. Dieses Ergebnis lieferte den Anstoß zur ersten strukturbasierten Entwicklung von Inhibitoren für einzelne proteolytisch aktive Untereinheiten im 20S-Komplex ((Loidl et al., 1999a). Da allerdings das 20S-Proteasom für den Abbau von entfal­teten Polypeptiden unspezifisch bezüglich der Selektion des Substrates und der Erkennung des Spaltmusters ist, gestaltete sich ein Design von peptidbasierten selektiven Inhibitoren anfangs als problematisch. Aufgrund der Kenntnis der Kristallstruktur des Hefe-20S-Protea­soms konnte jedoch für die Untereinheit β2 ein erster bifunktionaler Inhibitor, Maleoyl-β-alanyl-valyl-arginal geplant und erfolgreich umgesetzt werden. So befindet sich die Seiten­kette von Cys118 der Untereinheit β3 in der S3-Tasche des proteolytisch aktiven Zentrums von β2. Die Orientierung dieser Aminosäure wurde für die rationale Synthese eines biva­lenten Inhibitors mit einer Malenimid-Gruppe in der S3-Position für die kovalente Bindung mit der Thiolgruppe und einer carboxyterminalen Aldehydgruppe für die Hemiacetalforma­tion mit der Thr1-Hydroxylgruppe am aktiven Zentrum genutzt. Die strukturbasierte Model­lierung lieferte das Verständnis für den optimalen Abstand der Maleinimidgruppe zum P1-P2-Dipeptidaldehyd, und durch die Spezifität der S1-Tasche konnte die inhibitorische Aktivität für die Untereinheit β2 begrenzt werden. Die Röntgenstrukturanalyse des Hefe-20S-Protea­som:Inhibitor-Addukts bestätigt die zusätzliche irreversible Bindung des Inhibitors in der S3-Tasche. Bezogen auf die TL-Aktivität deutet der Vergleich des IC50-Wertes von Mal-βAVR-al (0.5μM) dem IC50-Wert von Calpain-Inhibitor I (200μM) die potentielle Inaktivierung der Untereinheit β2 an und gibt erste Ideen für die Synthese neuer Inhibitoren.

Andererseits kann der eben beschriebene Mal-βAVR-al-Inhibitor aufgrund der Reak­tivität der Malenimidgruppe mit sämtlichen Thiolgruppen nur für proteasomale in vitro-Untersuchungen verwendet werden und steht für eine medizinische Anwendung nicht zur Verfügung. Mit Hilfe der strukturellen Daten des Hefe-20S-Proteasoms besteht allerdings auch Kenntnis über die einzigartige Topographie der Untereinheiten und die damit verbun­denen Abstandskriterien der proteolytisch aktiven Zentren im 20S-Komplex. Somit bietet sich die Gelegenheit einer Synthese von homo- und heterobivalenten Inhibitoren, basierend auf Aldehyd-Kopfgruppen, die mit einem Zwischenstück entsprechend der Distanz der proteo­lytisch aktiven Untereinheiten zueinander verknüpft sind. In ersten Versuchen wurden als [Seite 41↓]Abstandshalter Peptide wie Gastrin (17mer) oder Sekretin (27mer) verwendet, die jedoch augenblicklich durch die Protease abgebaut werden. Diese Ergebnisse waren Anlaß für die Suche nach einem geeigneteren Zwischenstück, das in seiner Erscheinungsform einer entfal­teten Polypeptidkette ähnelt und deshalb für die proteolytische Kammer des 20S-Partikels zugänglich ist, aber durch das 20S-Proteasom selber nicht mehr gespalten wird. Polyethylen­glykole (PEG) sind durch ihre Flexibilität, Linearität und Proteasebeständigkeit für diese Art von Verwendung ideal geschaffen. So ergibt das Koppeln der N-Termini zweier Tripeptidal­dehyde mit dem Polymerspacer, der passend für die simultane Bindung an zwei unterschied­lichen proteolytisch aktiven Untereinheiten von den nonprimed-Spezifitätstaschen ausgewählt wurde, proteaseresistente bivalente Proteasominhibitoren (Loidl et al., 1999b). Die Röntgen­kristallstrukturen der synthetisierten Verbindungen mit dem Hefe-20S-Proteasom definieren jedoch nur die Aldehyd-Kopfgruppen und zeigen aufgrund der Flexibilität des PEG-Spacers hierfür keine Elektronendichten. Hingegen deuten die um zwei Größenord­nungen reduzierten IC50-Werte der bifunktionalen Verbindungen (im nM-Bereich) verglichen mit den pegylierten monovalenten Aldeyhden (im μM-Bereich) klar auf die bivalente Bindung hin. Das Prinzip der Multivalenz ist in der Natur allgegenwärtig und wurde bereits erfolgreich in der Ver­gangenheit für die Verbesserung von Affinitäten und von molekularen Erkennungsprozessen für Liganden eingesetzt. Die gegenwärtigen Resultate bestätigen, daß dieses Prinzip auch in bemerkenswerter Art und Weise für die Inhibition von multikata­lytischen Proteasen genützt werden kann. Des weiteren ist PEG für seine Atoxizität, niedere Immunogenität, harmlose Entsorgung, hohe Wasserlöslichkeit und im wesentlichen für den erleichterten Molekültrans­port über Zellmembranen bekannt. Bislang wurde jedoch nicht überprüft, ob die Verbin­dungen zellpermeabel oder zytotoxisch sind und eine zukünftige Anwendung in der intrazel­lulären Medizin finden könnten.

Kürzlich wurde gezeigt, daß das Naturprodukt Epoxomicin, ein peptidisches α’,β’-Epoxyketon, irreversibel die proteolytisch aktiven Zentren von 20S-Proteasomen inhibiert (Meng et al., 1999). Anders als bei einer Vielzahl von Proteasominhibitoren geht Epoxomicin spezifisch nur Bindungen mit dem 20S-Komplex ein, nicht aber mit Proteasen wie Calpain, Papain, Cathepsin A, Trypsin oder Chymotrypsin. Die Bestimmung der Kristallstruktur des Hefe-20S-Proteasom:Epoxomicin-Komplexes konnte die molekulare Grundlage für diese charakteristische und spezifische Eigenschaft der α’,β’-Epoxyketon-Inhibitoren aufklären (Groll et al., 2000b). Die Elektronendichte läßt einen unerwarteten Morpholinoringschluß zwischen dem aminoterminalen Thr1 der aktiven β-Untereinheiten und Epoxomicin erkennen [Seite 42↓]und liefert erste Ideen bezüglich der einzigartigen Spezifität von Epoxomicin gegenüber 20S-Proteasomen (siehe Abb. 15b). So setzt sich das Morpholinoderivat höchstwahrscheinlich in einem Zweistufenprozeß zusammen. Im ersten Schritt wird das Thr1Oγ über die N-terminale Amingruppe mit Hilfe eines Wassermoleküls zum Nukleophil aktiviert, welches augen­blick­lich mit dem Carbonylkohlenstoff des Epoxyketon-Pharmakophor unter Ausbildung eines Hemiacetals abreagiert, in analoger Reaktion wie bereits für den Calpain-Inhibitor I:20S-Proteasom-Komplex beschrieben. Die Formation des Hemiacetals erlaubt daraufhin die Produktbildung zum Morpholinoring. Während dieser Zyklisierung öffnet der N-Terminus des Thr1 den Epoxidring über eine intramolekulare Umlagerung unter Inversion des Kohlen­stoffs in der C2-Position. Somit ist die beobachtete stringente Spezifität von Epoxomicin gegenüber 20S-Proteasomen aufgrund der Forderung nach jeweils einer N-terminalen nukleophilen Aminogruppe und einer nukleophilen Seitenkette für die Reaktion zu erklären und deutet darauf hin, daß die funktionelle Epoxyketon-Gruppe lediglich mit der kleinen Klasse der Ntn-Hydrolasen reagiert. Allerdings zeigt Epoxomicin aufgrund der irreversiblen Bindung an das proteolytisch aktive Zentrum zytotoxisches Verhalten gegenüber Zellen und ist somit als Therapeutikum nicht geeignet.

Eine neue Klasse von Proteasominhibitoren umfaßt Peptide mit einer funktionellen Vinylsulfon-Gruppe, welche im Vergleich zu der Aldehydgruppe weniger reaktiv ist (Bogyo et al., 1997). Jedoch besitzen diese Verbindungen ähnlich begrenzte medizinische Relevanz wie die bereits aufgeführten Peptidaldehyde, da gefunden wurde, daß sie ebenso intrazelluläre Cysteinproteasen wie beispielsweise Cathepsin S hemmen und an 20S-Proteasome irrever­sibel binden. Die Kristallstruktur des Hefe-20S-Proteasom:Ac-YLLN-vs-Komplexes läßt eine kovalente Bindung zwischen den Thr1Oγs aller proteolytisch aktiven Untereinheiten mit dem β-Kohlenstoffatom der Vinylsulfon-Gruppe erkennen (Groll et al., 2002). Aufgrund von zwischenzeitlich gefundenen Ergebnissen von peptidbasierenden kovalenten Proteasom­inhi­bitoren wurde nach wesentlichen Grundbestandteilen, die selektiv an einzelne proteo­lytisch aktive proteasomale Untereinheiten binden, gesucht (Loidl et al., 1999b); (Loidl et al., 1999a) und für die Synthese neuer spezifischer Vinylsulfon-Inhibitoren verwendet (Nazif et al., 2001). Dank des Vergleichs der Bindemodi von Peptidaldehyden mit dem 20S-Partikel konnte die Synthese eines proteasomspezifischen Vinylsulfons Ac-PRLN-vs, geplant und umgesetzt werden. Diese Verbindung besitzt im Vergleich zur Ausgangsverbindung Ac-YLLN-vs lediglich unterschiedliche Seitenketten in der P3- und P4-Position und inhibiert auch in Konzentrationen bis zu 10mM nur die Untereinheit β2. Die Kristallstrukturanalyse [Seite 43↓]des Hefe-20S-Proteasoms mit dem Vinylsulfon erklärt die stringente Inhibitionseigenschaft der Verbindung infolge der günstigen Wechselwirkungen zwischen der P3-Seitenkette des Inhibitors und der großen S3-Tasche im 20S-Komplex, generiert durch die Grenzfläche der benachbarten β-Untereinheiten (siehe Abb. 15c) (Groll et al., 2002). Bemerkenswert ist der Befund, daß lediglich der Austausch der S3- und S4-Seitenkette diesen Einfluß auf die Selek­tivität der proteasomalen Untereinheiten bewirkt, während die S1-Seitenkette Asparagin entgegen unspezifischer elektrostatischer Wechselwirkungen keinen Einfluß auf die Spezifität nimmt. Somit ist ein Design von zukünftigen Inhibitoren mit spezifischen Aminosäuren für Interaktionen mit Proteinseitenketten ausschließlich in der S3-Tasche möglich. Die zuvor schon beschriebene bivalente Verbindung Maleoyl-β-alanyl-valyl-arginal, die für eine kova­lente Bindung mit dem Cys118 der S3-Tasche geplant wurde und spezifisch die TL-Aktivität des Hefe-20S-Proteasom hemmt, lieferte ebenfalls erste Ideen für eine zukünftige struktur­basierte Modellierung rationaler Inhibitoren. Folglich erlauben die hier in Kürze zusammen­gefaßten Ergebnisse aufgrund der charakteristischen Spezifitätsmerkmale der S1- und S3-Positionen im 20S-Proteasom die einfache Synthese neuer Verbindungen, die zweifelsohne noch wirksamere, spezifischere und abstimmbarere 20S-Proteasominhibitoren mit IC50 Werten weit im subnanomolaren Bereichen darstellen.

3.4.2 Nicht kovalent bindende 20S-Proteasominhibitoren

Das Proteasom besitzt eine notwendige Rolle für viele intrazelluläre irreversible Prozesse wie Mitose/Meiose, Zelldifferenzierung, Signalübertragung und Immunantwort. Alle bislang aufgeführten Proteasominhibitoren hemmen den 20S-Komplex jedoch kovalent und damit irreversibel, so daß ein möglicher Einsatz dieser Verbindungen im medizinischen Sektor weiterhin fraglich bleibt, da durch diese Eigenschaft die Apoptose in den Zellen induziert und folglich der Zelltod verursacht wird (Orlowski, 1999). Eine reversible und zeitbegrenzende Inaktivierung der spezifischen Untereinheiten im 20S-Partikel könnte eventuell die Zytotoxi­zität unterdrücken. Kürzlich wurde entdeckt, daß die Naturprodukte des japanischen Berg­pilzes Apiospora montagnei, klassifiziert als TMC-95A-D, die proteolytische Aktivität von 20S-Proteasomen selektiv und im niederen nanomolaren Bereich blocken (Koguchi et al., 2000); (Kohno et al., 2000). Die Grundstruktur der Inhibitoren besteht aus modifizierten Amino­säuren, die miteinander ein heterocyclisches Ringsystem aufbauen und damit keinerlei Ähnlichkeiten zu den bisher bekannten Proteasominhibitoren haben (siehe Abb. 16a). Die Kristallstrukturanalyse des Hefe-20S-Proteasoms komplexiert mit TMC95A zeigt definierte Elektronendichte für den Inhibitor in allen proteolytisch aktiven Zentren (Groll et al., 2001). [Seite 44↓]Die strukturellen Ergebnisse veranschaulichen, daß der Inhibitor nicht-kovalent und nur in Nähe der Thr1Oγs bindet und entgegen den Befunden von allen anderen Proteasominhibitoren das N-terminale Threonin nicht modifiziert (siehe Abb. 15d). TMC95A wird in erster Linie durch eine große Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Protein stabilisiert. Im besonderen sind alle auftretenden Interaktionen über Wechselwirkungen zwischen TMC95A und Proteinhauptkettenatomen bzw. konservierten Aminosäuren im 20S-Proteasom definiert und weisen auf einen allgemeingültigen Bindungsmodus dieser Verbindungen mit Protea­somen verschiedenster Organismen hin. Die Anordnung von TMC-95A im 20S-Komplex ist ähnlich wie für die bereits beschriebenen Aldehyd- und Vinylsulfonverbindungen sowie Epoxomicin (siehe Abb 16b). So ragt die n-Propylenseitengruppe in die P1-Spezifitätstasche und wird zusätzlich über schwache hydrophobe Kontakte mit Lys33 gefestigt, während die S2-Subsite keinen Beitrag zur Stabilisierung des Naturprodukts liefert. Die Seitenkette des Asparagins von TMC95A ist tief in die S3-Spezifitätstasche inseriert und übernimmt dadurch einen großen Anteil für die unterschiedlichen IC50-Werte betreffend der verschiedenen proteolytisch aktiven Untereinheiten.

Abb. 16 : a) Chemische Strukturformel der TMC-95-Verbindungen mit den Diastereomeren A-D. b) Überla­gerung der β5-Untereinheiten komplexiert mit TMC-95A und Epoxomicin. Die Abbildung ist auf die Inhibitoren (TMC-95A, dargestellt in gelb und Epoxomicin, dargestellt in grün) und das proteolytisch aktive Thr1 (darge­stellt in schwarz) beschränkt. Die Überlagerung deutet auf eine analoge Anordnung der Seitenketten für die P1- und P3-Tasche für beide Inhibitoren hin und erlaubt somit das Design einer möglichen Leitstruktur von Protea­sominhibitoren. c) Leitstruktursegment der TMC-95-Verbindungen, das für die spezifische Hemmung der Proteasome verantwortlich ist. Die Reste S1 und S2, dargestellt in blau, markieren die spezifischen Seitenketten, die hauptsächlich die Selektivität der verschiedenen Untereinheiten bestimmen.


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Aufgrund der strukturbedingten Vorgabe inhibiert die Klasse der TMC-95-Verbin­dungen keine anderen Proteasen. Die hohe Spezifität und die niederen IC50-Werte des natür­lich vorkommenden Inhibitors erklären sich aus der Überlagerung der NMR-Struktur von TMC-95A in Lösung mit der Struktur der Verbindung im 20S-Proteasomkomplex, die keine konformellen Unterschiede des Inhibitors zwischen gebundenem und ungebundenem Zustand erkennen läßt. Verantwortlich für die starre Konformation des TMC95-Inhibitors ist die starke Ringspannung im Molekül, die sich aufgrund der Querverbindung zwischen dem Tyrosin und der Oxoindolseitenkette bildet. Somit entstehen bei der Komplexbildung des 20S-Proteasoms mit den TMC-95-Verbindungen gegensätzlich zu den flexiblen Liganden keine wesentlichen Umlagerungen und Einschränkungen von Freiheitsgraden, so daß die niedrigen IC50-Werte entropischen Ursprungs sind. Eine bemerkenswerte Übereinstimmung zeigt die Überlagerung der β2-Untereinheiten der Hefe-20S-Proteasomkristallstrukturen mit TMC-95A und mit Ac-PRLN-vs: die backbone-Amide und die S1- und S3-Seitenketten nehmen trotz nicht-kova­lenter Bindung im Falle vom TMC-95A nahezu identische Positionen ein. Mit Hilfe der Informationen der strukturellen Ergebnisse besteht nun die Möglichkeit, über eine Leitstruk­tur basierend auf der Geometrie der Bindung von TMC-95A an das Hefe-20S-Proteasom neue reversible, selektive und für die Untereinheiten spezifische Inhibitoren zu planen (siehe Abb. 16c), die möglicherweise zukunftsnahe medizinisch relevante Verbindungen darstellen. Erste Ergebnisse liegen bereits mit der Totalsynthese der Leitstruktur, die ähnliche inhibitorische Eigenschaften wie das TMC-95-Naturprodukt aufweist, vor (Kaiser et al., 2002).


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22.02.2005