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1.  Einleitung

1.1. Historischer Rückblick

In unserer Umwelt befinden sich zahlreiche chemische und physikalische Noxen, die neben mikrobiellen Erregern dem Körper unterschiedlich starke Schädigungen durch akute oder chronische Einwirkungen zufügen können. Bei dem Kontakt zwischen dem Organismus und seiner Umwelt spielen dabei neben der Haut die Atemwege aufgrund ihrer großen Oberfläche eine bedeutende Rolle. Zum Schutz vor exogenen Noxen hat die Natur im Laufe der Evolution eine Vielzahl von Abwehrmechanismen entwickelt, die zur Erkennung und Beseitigung schädlicher Einflüsse notwendig sind. Das Spektrum dieser Abwehrmechanismen ist bei höher entwickelten Organismen wie dem Menschen sehr komplex und lässt sich in verschiedene, zusammenwirkende Systeme wie die angeborene und adaptive, erworbene Abwehr einteilen. In ihrer Gesamtheit führen diese durch viele Überschneidungen gekennzeichneten integrativen Systeme des körpereigenen Immunsystems zu einer zielgerichteten Abwehrreaktion gegenüber äußeren Noxen, die zu den Merkmalen einer Entzündungsreaktion führt.

Bereits in der Antike wurden durch Celsius (30 vor bis 38 nach Christus) und Galen (130 bis 201 n. Chr.) die vier heute noch gültigen Kardinalsymptome der Entzündung, „Tumor“, „Rubor“, „Calor“ und „Dolor“ beschrieben, welche Rudolf Virchow im Jahr 1858 noch durch das fünfte Symptom, „Functio laesa“ ergänzte. Diese fünf klinischen Symptome spiegeln in ihrer Gesamtheit die akute Entzündungsreaktion wider, welche zusammen mit den Formen der chronischen Entzündung im vergangenen Jahrhundert auf der [Seite 2↓]pathophysiologischen und pathobiochemischen Ebene durch eine Vielzahl von Studien genauer charakterisiert werden konnte. Letztlich sind der Sitz des Entzündungsreizes und die Art der auslösenden Noxe bestimmend, welcher Abwehrmechanismus zur Wirkung kommen wird. Dabei wird die Regulation der Immunantwort durch zelluläre, humorale und auch nervale Einflüsse gesteuert.

Stellt die Entzündung primär einen lebenserhaltenden Abwehrmechanismus dar, ohne den der Organismus seine Individualität gegenüber Fremdorganismen verlieren würde, so gibt es auf der anderen Seite auch überschießende Entzündungsreaktionen, welche einen schädigenden Einfluss haben. Wird in dieser Hinsicht körpereigenes Gewebe durch eine inadäquate Antwort des Immunsystems gegenüber exogenen Noxen geschädigt, so spricht man von einer Überempfindlichkeit oder Allergie, wobei die sozioökonomisch bedeutendsten Formen der Allergie das allergische Asthma bronchiale, die atopische Dermatitis, sowie die Rhinokonjunktivitis sind.

Im Gegensatz zu der großen Anzahl an Studien, die eine wesentliche Bedeutung zellulärer und humoraler Bestandteile des Immunsystems bei der Entstehung und Progression allergischer Erkrankungen nachweisen konnten, wurde die Bedeutung des Nervensystems und seiner Mediatoren diesbezüglich in den letzten Jahrhunderten sehr unterschiedlich gewichtet.

Diese wechselnde Bedeutung lässt sich am Beispiel des Asthma bronchiale darlegen: Schon früh nach den ersten detaillierten anatomischen Beschreibungen des Nervensystems der menschlichen Lunge durch Vesalius (1543) wurde die funktionelle Bedeutung der pulmonalen Innervation bezüglich der Pathophysiologie des Asthma bronchiale diskutiert (Willis, 1681). Gestützt [Seite 3↓]wurde diese Theorie ebenfalls durch Konzepte von Ärzten und Wissenschaftlern wie Johann Juncker (1718), René Théophile Hyacinthe Laennec (1826) und Henry Hyde Salter (1860), die im Wesentlichen auf klinischen Beobachtungen beruhten.

Demgegenüber leiteten ebenfalls klinische Beobachtungen zur Abhängigkeit asthmatischer Symptome von Pollen [Blackley, 1873] die Epoche der immunologischen Ursachenforschung ein. Diese führte zu Beginn des zwanzigsten Jahrhunderts mit der Entdeckung der „Anaphylaxie“ durch Portier und Richet (1902) sowie durch von Pirquet (1907) zur Gründung der modernen Allergologie und damit zur weitgehenden Verdrängung von Theorien zu nervalen Einflüssen.

Die geringe Beachtung nervaler Komponenten bei der Entstehung und Fortführung allergischer Erkrankungen wurde erst in den achtziger Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts mit der durch Peter J. Barnes(1986) aufgestellten Hypothese beendet, dass Asthma möglicherweise als ein Axonreflex zu verstehen sei. Im Gegensatz zur Allergologie wiesen andere Forschungsgebiete schon weitaus früher auf die Rolle des autonomen Nervensystems und die von ihm freigesetzten Mediatoren bei entzündlichen Erkrankungen hin. In dieser Hinsicht zeigte Bayliss schon 1901, dass die Aktivierung von Spinalganglienneuronen nicht nur afferente, sondern auch efferente Effekte hat [Bayliss, 1901].

Eine Vielzahl an Studien konnten in den Folgejahren zeigen, dass die Aktivierung peripherer afferenter Nervenendigungen zu einer lokalen Freisetzung verschiedener Mediatoren führen kann, deren periphere Wirkung [Seite 4↓]ganz erheblich in der Pathophysiologie und Pathobiochemie vieler entzündlicher Erkrankungen eine wesentliche Rolle spielt. Aufgrund dieser entzündungsregulierenden Wirkung der freigesetzten Mediatoren wurde letztlich der Begriff der „neurogenen Entzündung“ eingeführt [Jancso, et al., 1967].

1.2. Neurogene Entzündung

In Anbetracht der weitreichenden Entwicklungen der neuro-immunologischen Forschung hat sich die Frage, ob Asthma oder auch die als „Neurodermitis“ bezeichnete atopische Dermatitis (AD) primär nervale oder primär immunologische Erkrankungen sind, darin aufgelöst, dass es sich bei diesen allergologischen Erkrankungen um komplexe Krankheitsentitäten handelt, die von bidirektionalen Wechselwirkungen beider Systeme geprägt sind.

Die den entzündlichen Veränderungen zugrunde liegenden Mechanismen werden von einer Vielzahl an Mediatoren beeinflusst. Im Bereich der Pathophysiologie und -biochemie des Asthma bronchiale sind dabei mittlerweile bereits über fünfzig Mediatoren mit Effekten auf verschiedenste pulmonale Funktionen beschrieben worden [Chung and Barnes, 1999].Fortschritte auf diesem Gebiet wurden vor allem durch die Entwicklung neuer, potenter Inhibitoren gemacht, die entweder die Rezeptoren der Mediatoren blockieren oder sie selbst inhibieren [Eynott, et al., 2002; Eynott, et al., 2003; Gozes, et al., 1995; Joos and Pauwels, 2001]. Der Syntheseort der einzelnen Mediatoren liegt sowohl im Bereich von Entzündungszellen wie Mastzellen, Eosinophile, Basophile, Neutrophile oder T-Lymphozyten, als auch im Bereich [Seite 5↓]gewebsständiger Zellen wie Epithelzellen, Endothelzellen, Myozyten oder Atemwegsneuronen [Barnes, et al., 1998].

Die als neurogene Entzündung beschriebene Komponente bewirkt durch die lokale Freisetzung peptiderger Mediatoren unter anderem klassische Entzündungsmerkmale wie „Calor“, „Rubor“ und „Dolor“ [Richardson and Vasko, 2002].


Abbildung 1: Ziele von Entzündungsmediatoren im Atemtrakt


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Neben den klassischen Mediatoren Noradrenalin in postganglionären sympathischen und Azetylcholin in parasympathischen Nervenfasern, existiert eine Reihe von peptidergen Mediatoren, die ausgeprägte funktionelle Effekte auf verschiedenste respiratorische Funktionen wie den Muskeltonus der Gefäße und Atemwege, die Drüsensekretion und auf Entzündungs- und Immunzellen haben [van der Velden and Hulsmann, 1999].

Die Neuropeptide gehören zu keinem morphologisch eingrenzbaren Nervensystem innerhalb der Atemwege, und ihre Effekte wurden deshalb unter dem Begriff des nicht-adrenergen, nicht-cholinergen (NANC)-System zusammengefasst [Widdicombe, 1998]. Aufgrund physiologischer und pharmakologischer Erkenntnisse wurden die NANC-Mediatoren in die zwei funktionell divergenten Gruppen des exzitatorischen NANC-Systems (e-NANC) und des inhibitorischen NANC-Systems (i-NANC) eingeordnet [Linden, 1996].

1.3. Peptiderge Mediatoren

1.3.1. Pro-inflammatorische peptiderge Mediatoren

Zu den pro-inflammatorischen e-NANC Mediatoren gehören neben Calcitonin Gene-related Peptide (CGRP) [Springer, et al., 2003] auch die Familie der Tachykinine [Joos, et al., 2000], deren ältester Vertreter der 1931 durch von Euler und Gaddum beschriebene Mediator Substanz P (SP) ist [von Euler and Gaddum, 1931]. Nach der Sequenzierung von Substanz P [Chang, et al., 1971; Tregear, et al., 1971] und weiterer Tachykinine zeigte sich, dass diese Neuropeptide alle durch die C-terminale Aminosäuresequenz Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2 (X = variable Aminosäure) gekennzeichnet sind [Maggi, 1996; [Seite 7↓] Maggi, et al., 1995]. Die Tachykinin-Mediatoren Substanz P, Neurokinin A (NKA), sowie Neuropeptid K (NPK) und Neuropeptid γ werden vom Präprotachykinin A (PPT-A)-Gen kodiert und durch alternatives Splicing vier verschiedener mRNA-Formen gebildet [Nawa, et al., 1984]. Ein weiterer Vertreter der Tachykininfamilie ist das in den Atemwegen bisher nicht nachgewiesene Neurokinin B (NKB), welches durch das PPT-B-Gen kodiert wird [Kotani, et al., 1986; Maggi,et al., 1995].

Substanz P und Neurokinin A werden als Mediatoren von Atemwegs-projizierenden Neuronen freigesetzt und immunhistochemische Studien konnten ihre Expression in Nervenfasern der unteren Atemwege des Menschen und des Meerschweinchens nachweisen, wobei jedes Kompartiment der unteren Atemwege mit Ausnahme der Knorpelspangen von Tachykinin-haltigen Axonen durchzogen wird [Hua, et al., 1985; Lundberg, et al., 1984]. Diese Nervenfasern enthalten neben den Tachykininen zum größten Teil auch das ebenfalls pro-inflammatorische CGRP [Lundberg, et al., 1985]. Kombinierte retrograde neuronale Markierungsstudien und Immunhistochemien konnten die sensiblen Vagusganglien sowie die oberen thorakalen Spinalganglien als die Ursprungsorte Substanz P/ NKA/ CGRP-exprimierender Atemwegsneurone im Meerschweinchen identifizieren [Kummer, et al., 1992].

Die pulmonalen Wirkungen der pro-inflammatorischen Tachykinine wird über verschiedene Tachykinin-Rezeptoren induziert [Canning, et al., 1998; Maggi, 1995], wobei Rezeptoren in den Bereichen von Tracheal- und Bronchialmuskel, Drüsen sowie im respiratorischen Epithel und in Lamina propria-Zellen nachgewiesen werden konnten [Fischer, et al., 1992].


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Aufgrund unterschiedlicher Affinitäten der einzelnen Tachykinine zu deren Rezeptoren lassen diese sich pharmakologisch differenzieren. Substanz P vermittelt dabei seine Wirkung bevorzugt über den NK1-Rezeptor, wohingegen Neurokinin A bevorzugt über den NK2-Rezeptor wirkt [Maggi, 1995].

Insgesamt gibt es ein profundes Wissen über die pro-inflammatorische Wirkung der Tachykinin-Mediatoren im Rahmen der Pathophysiologie und Pathobiochemie einer Vielzahl von allergischen Erkrankungen [Baraniuk, 2001; Howarth, 1997; Kraneveld and Nijkamp, 2001]. In dieser Hinsicht konnte die Induktion der Tachykiningenexpression in Atemwegsneuronen in einem Tiermodell des allergischen Asthma bronchiale nachgewiesen werden [Fischer, et al., 1996] und auch wurden erhöhte Tachykinin-Spiegel bei anderen allergischen Erkrankungen gefunden, wobei die Gesamtheit der Befunde für eine pro-inflammatorische Wirkung der tachykinerger Mediatoren spricht [Joos, et al., 2001; Scholzen, et al., 1998; Tai and Baraniuk, 2002].

1.3.2. Anti-inflammatorische peptiderge Mediatoren

Im Gegensatz zu den Mediatoren des exzitatorischen NANC-Systems, welchen in der jüngeren Vergangenheit eine aggravierende Rolle bei der Entstehung und Fortführung allergischer Erkrankungen zugeordnet wurde [Belvisi, 2003; Widdicombe, 2003], spiegeln andererseits die zum inhibitorischen NANC-System (i-NANC) gehörenden Mediatoren eine wesentlich inhomogenere Gruppe wider, deren Einflüsse bei allergischen Erkrankungen größtenteils noch ungeklärt sind. Zu den i-NANC Mediatoren gehören Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP) [Groneberg, et al., 2001], Neuropeptid Y (NPY) [Bedoui, et al., [Seite 9↓]2003], das gasförmige Stickstoffmonoxid (NO) [Fischer, et al., 2002] oder auch endogene Opioide [Groneberg and Fischer, 2001]. In den vorliegenden Arbeiten wurde insbesondere der Einfluss des Mediators VIP an pathophysiologischen und pathobiochemischen Prozessen untersucht, weshalb seine Struktur und Funktion an dieser Stelle genauer erläutert werden.

1.3.3. Vasoaktives Intestinales Polypeptid

Unter der Vielzahl der potentiell anti-inflammatorischen Mediatoren spielt der 1969 von Said und Mutt identifizierte Mediator VIP eine besondere Rolle aufgrund zahlreicher tierexperimenteller Hinweise bezüglich immunmodulierender Effekte [Goetzl, et al., 2001] und seiner hohen Expression in Organen wie dem Atemtrakt oder der Haut [Groneberg,et al., 2001].

1.3.3.1. Struktur und Lokalisation

Das 28 Aminosäuren umfassende Polypeptid VIP wurde erstmals aus dem Duodenum aufgrund seiner vasodilatorischen Effekte isoliert [Said and Mutt, 1969; Said and Mutt, 1970; Said and Mutt, 1970]. Das Gen des Mediators ist auf Chromosom 6q24 lokalisiert und kodiert Pro-VIP, welches ebenfalls die Sequenz des verwandten Mediators Peptide-Having-Carboxyterminal-Methionine (PHM-27) enthält [Gozes, et al., 1987]. Zusammen mit anderen Peptiden wie „Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide“ (PACAP), „Peptide Having Carboxy-terminal Methionine/Isoleucine“ (PHM/PHI), Peptide Histidine Valine (PHV), Sekretin, Glukagon, Growth hormone-releasing factor (GRF) und Helodermin bildet VIP eine Familie von Peptiden, die aufgrund [Seite 10↓]ähnlicher Strukturen durch eine Gemeinsamkeit mehrerer biologischer Effekte gekennzeichnet ist [Gozes and Brenneman, 1989].

VIP kann durch Enzyme wie Neutrale Endopeptidase (NEP) oder Mastzelltryptase inaktiviert werden, wobei humanes VIP hauptsächlich durch NEP zu inaktiven Metaboliten prozessiert wird [Hachisu, et al., 1991; Lilly, et al., 1993](Abb. 2).

Abbildung 2: Enzymatische Inaktivierung von humanem VIP. Die Hauptstelle der Inaktivierung liegt bei Position Ser25-Ile26 während eine zweite Position bei Thr7 – Asp8 vorhanden ist (aus [Groneberg,et al., 2001].


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VIP-positive Nervenfasern konnten im humanen Atemtrakt im Bereich der glatten Muskulatur von Atemwegen und Gefäßen (Abb. 3), in der Umgebung von Drüsen und in der Lamina propria nachgewiesen werden, wobei die Faserdichte mit der Größe der Atemwege abnimmt [Baraniuk, et al., 1990; Lundberg, et al., 1984]. VIP wird je nach Spezies mit verschiedenen anderen Mediatoren koexprimiert. So wurde es beispielsweise im Atemtrakt des Meerschweinchens sowohl in sympathischen [Bowden and Gibbins, 1992] als auch parasympathischen [Fischer and Hoffmann, 1996] Nervenfasern nachgewiesen.

Abbildung 3: VIP-positive Nervenfasern in der glatten Muskulatur der humanen Trachea (aus [Groneberg,et al., 2001].


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Auf der Rezeptorebene konnten bis zur Durchführung der vorliegenden Arbeiten Bindungsstellen für VIP in den Atemwegen und der Haut nur durch autoradiographische Bindungsstudien mit niedriger Auflösung nachgewiesen werden [Carstairs and Barnes, 1986]. Demgegenüber standen seit der Identifizierung von VIP-Rezeptoren in den neunziger Jahren [Harmar, et al., 1998] und der Etablierung kombiniert molekularbiologisch-morphologischer Methoden wie der nicht-radioaktiven In Situ-Hybridisierung [Fischer, et al., 2002] Techniken zur Verfügung, die einen Nachweis von Rezeptoren für VIP auf der transkriptionellen Ebene ermöglichen können.


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1.3.3.2.  Rezeptoren

Nachdem in der Vergangenheit autoradiographische Bindungsstudien zur Lokalisation von VIP-Rezeptoren herangezogen wurden [Carstairs and Barnes, 1986], konnte durch die Klonierung zweier unterschiedlicher Rezeptoren eine molekularbiologische Grundlage für die vielfältigen Wirkungsmechanismen des Mediators VIP gefunden werden. Dabei handelt es sich bei den VIP-Rezeptoren um zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen (Abb. 4).


VPAC1-Rezeptor

Der VPAC1-Rezeptor war ursprünglich der einzig bekannte VIP-Rezeptor [Ishihara, et al., 1992]. Später wurde er in VIP1-Rezeptor [Lutz, et al., 1993], VIP/PACAP Typ II Rezeptor [Ciccarelli, et al., 1994] und PVR 2 [Rawlings, et al., 1995] umbenannt. In der jüngsten Nomenklatur der Internationalen Union der Pharmakologie wurde der Rezeptor als VPAC1 -Rezeptor terminiert[Harmar,et al., 1998]. Er wurde erstmals aus der Rattenlunge [Ishihara,et al., 1992] und später auch aus humanen Geweben isoliert [Couvineau, et al., 1994; Couvineau, et al., 1996]. Es sind bis zum heutigen Zeitpunkt keine Splicevarianten bekannt. Demgegenüber existieren signifikante Spezies-spezifische Unterschiede in der Pharmakologie des Rezeptors [Sreedharan, et al., 1993]. Bis jetzt konnten mehrere VPAC1 -Rezeptoragonisten beschrieben werden: Das VIP/GRF-Hybrid [Lys15, Arg16, Leu27]VIP(1-7)GRF(8-27)-NH2 stellt einen selektiven VPAC1 –Rezeptoragonisten dar, der Growth hormone-releasing factor (GRF)-Rezeptoren nicht aktiviert [Gourlet, et al., 1997]. [Arg16]-[Seite 14↓]Sekretin ist ein Agonist von VPAC1 -und Sekretinrezeptoren. [Acetyl-His1, D-Phe2, Lys15, Arg16] VIP (3-7)GRF(8-27)-NH2 (PG 97-269) ist ein selektiver Antagonist von VPAC1 -Rezeptoren [Gourlet, et al., 1997].


VPAC2-Rezeptor

Ein zweiter, vormals als VIP2 -Rezeptor [Lutz,et al., 1993], PACAPR-3 [Inagaki, et al., 1994], oder PVR3 [Rawlings,et al., 1995] bezeichneter Rezeptor wurde in der letzten Nomenklatur VPAC2 -Rezeptor genannt [Harmar,et al., 1998]. Dieser Rezeptor bindet sowohl VIP als auch PACAP mit einer gleichwertigen Affinität und wurde in Geweben von Ratte [Lutz,et al., 1993; Usdin, et al., 1994], Maus [Inagaki,et al., 1994] und Mensch identifiziert [Svoboda, et al., 1994; Wei and Mojsov, 1996]. Auch bei diesem Rezeptor sind bislang keine Splicevarianten identifiziert worden. In Zelllinien exprimiert, bindet der Rezeptor VIP, PACAP-38, PACAP-27, sowie PHV und PHI. Demgegenüber besteht nur eine sehr geringe Affinität gegenüber GRF und Sekretin. Es gibt hochselektive VPAC2 -Agonisten, die von ihrer Struktur zyklische Peptide sind. Neben Ro 25-1553 [Gourlet, et al., 1997], welches zuerst als ein anti-inflammatorisches bronchorelaxierendes Medikament entwickelt wurde [O'Donnell, et al., 1994] [O'Donnell, et al., 1994], existiert Ro 25-1392 [Xia, et al., 1997].


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Abbildung 4: Struktur der VIP-Rezeptoren. Bei beiden Proteinen handelt es sich um G-Protein gekoppelte Membranenproteine mit sieben Transmembrandomänen und einem intrazellulär gelegenen carboxyterminalen Ende.



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1.3.3.3.  Biologische Funktionen

Gefäßregulation

VIP wurde aufgrund seiner vasodilatorischen Eigenschaften identifiziert und gehört auch in den Atemwegen zu den stärksten endogenen Vasodilatatoren. Dabei relaxiert es potent Gefäße in den oberen Atemwegen [Lundberg, et al., 1981; Lung and Widdicombe, 1987;], Trachea, Bronchien [Laitinen, et al., 1987] sowie die Pulmonalarterien [Hamasaki, et al., 1983; Hamasaki, et al., 1983; Nandiwada, et al., 1985; Obara, et al., 1989]. Bezüglich der Stärke seiner Effekte konnte gezeigt werden, dass die VIP-induzierte Vasodilatation stärker in der trachealen als in der bronchialen Zirkulation ist [Matran, et al., 1989]. Darüber hinaus ist der vasodilatorische Effekt VIPs ca. zweihundertfach stärker als der von Prostazyklinen [Saga and Said, 1984] und unabhängig von der Integrität des Endothels [Barnes, et al., 1986; Greenberg, et al., 1987].

Atemwegsmuskulatur

VIP besitzt ebenfalls starke bronchodilatorische Eigenschaften in vivo und in vitro. Mit einer fast einhundertfach erhöhten bronchodilatorischen Potenz gegenüber Isoproterenol ist VIP der stärkste endogene Bronchodilator [Palmer, et al., 1986], wobei der Ort der maximalen Wirkung hauptsächlich im Bereich der zentralen Atemwege anzusiedeln ist. Die VIP-bedingte Bronchodilatation ist unabhängig von adrenergen oder cholinergen Rezeptoren oder Cyclooxygenasen [Altiere and Diamond, 1984; Hand, et al., 1984; Saga and Said, 1984]. Im Gegensatz zu Isoproterenol beziehen sich die Effekte VIPs eher auf die Resistance als auf die dynamische Compliance [Diamond, et al., 1983]. [Seite 17↓]In dieser Hinsicht konnte ebenfalls gezeigt werden, dass VIP eine größenabhängige Wirkung zeigt, die parallel zu der Größe der Atemwege abnimmt [Altiere and Diamond, 1984]. Diese Wirkungsabnahme ist konsistent mit der Verteilung von VIP-positiven Nervenfasern, die in den peripheren Atemwegen ebenfalls abnimmt [Lundberg,et al., 1984]. So konnte auch autoradiographisch eine Abnahme von Bindungsstellen nachgewiesen werden [Carstairs and Barnes, 1986].

Trotz der in vitro nachgewiesenen starken bronchodilatorischen Effekte VIPs in humanen Atemwegen, die die Effekte anderer konstriktorischer Mediatoren wie Histamin, Prostaglandin F2α , Endothelin, Leukotriene D4, Kallikrein und NKA signifikant inhibiert [Boomsma and Said, 1992; Hamasaki,et al., 1983], konnte der Mediator aufgrund seiner starken vasodilatorischen Potenz nicht systemisch im klinischen Bereich eingesetzt werden.

Die inhalative Gabe von VIP führte trotz seiner berichteten Wirkung gegenüber der Histamin- und Prostaglandin F2α-induzierten Bronchokonstriktion in Kaninchen [Cox, et al., 1983] zu keinem signifikanten Effekt beim humanenBelastungs-Asthma [Bundgaard, et al., 1983]. Ebenso zeigten sich nur geringe Effekte bei der Histamin-induzierten Bronchokonstriktion beim Menschen [Altiere, et al., 1984]. Diese unerwartet schwachen Effekte nach inhalativer VIP-Gabe können durch eine mangelnde Penetration des Peptids durch das Bronchialepithel sowie durch eine schnelle Inaktivierung durch epitheliale Peptidasen erklärt werden [Altiere,et al., 1984; Morice, et al., 1983]. Aufgrund seiner Größe von 28 Aminosäuren kann der Mediator dabei nicht von Peptidtransportern wie PEPT1 und PEPT2 transportiert werden, die in den [Seite 18↓]Atemwegen [Groneberg, 2003; Groneberg, et al., 2002; Groneberg, et al., 2001] und dem peripheren Nervensystem [Groneberg, et al., 2001] exprimiert werden.

Bezüglich einer mangelhaften Penetration nach inhalativer Gabe führte die Denudierung des Epithels zu einer Verstärkung der VIP-induzierten Relaxation von Trachealsegmenten [Sharaf, 1993]. Es zeigten auch Peptidase-resistente VIP-Analoga stärkere Effekte [Bolin, et al., 1993; Ito and Tachibana, 1991]. In jüngsten Arbeiten mit dem selektiven VPAC2-Rezeptoragonisten Ro 25-1553 konnte bei 24 Patienten mit moderatem Asthma nach Inhalation von 600 µg Ro 25-1553 ein mit Formoterol vergleichbarer bronchodilatorischer Effekt innerhalb von drei Minuten nachgewiesen werden, der im Gegensatz zu Formoterol (24 h) allerdings nach fünf Stunden nachließ [Linden, et al., 2003]. Dieser klinischen Studie gingen in vitro Arbeiten voran, welche die dilatorische Potenz des Agonisten in der humanen Bronchialmuskulatur und in Pulmonalarterien bewiesen [Schmidt, et al., 2001].

[Seite 19↓]Mukussekretion

Ein weiterer pathophysiologischer Mechanismus, der zu einer wesentlichen Verschlechterung der Atemfunktion bei schwerem Asthma bronchiale führen kann, ist die Mukushypersekretion. Dabei spielen in den oberen [Groneberg, et al., 2003] und unteren Atemwegen [Groneberg, et al., 2002] gebildete Muzinproteine die Matrix des Atemwegsmukus. Im Falle des fatalen Status asthmaticus können diese Proteine aufgrund einer massiven reflexartigen Sekretion zu der Verlegung der Atemwege und zum Tode führen [Groneberg, et al., 2002; Groneberg, et al., 2004].

Im Gegensatz zu der klaren Datenlage bezüglich der broncho- und vasodilatorischen Wirkung VIPs werden dessen regulatorische Effekte bezüglich der Mukussekretion kontrovers diskutiert. Es gibt ein enges Netzwerk VIP-positiver Nervenfasern im Bereich der Drüsen [Dey, et al., 1981], so dass die Partizipation VIPs in der Regulation der Drüsenaktivität nahe liegt. Demgegenüber wurden bis jetzt eine Reihe widersprüchlicher Ergebnisse zum Einfluss von VIP auf die Sekretion publiziert: Auf der einen Seite stehen Befunde, die eine Stimulation der Mukussekretion durch VIP in Frettchentrachealdrüsen [Peatfield, et al., 1983] oder Rattentrachealzellen [Wagner, et al., 1998] in vitro nachgewiesen haben. Auf der anderen Seite gibt es Arbeiten, die eine Inhibition der cholinerg-stimulierten Sekretion durch VIP in der Frettchentrachea in vitro nachweisen konnten [Webber and Widdicombe, 1987]. In der Trachea von Katzen wurde demgegenüber die cholinerg-stimulierte Sekretion durch VIP in vitro gefördert [Shimura, et al., 1988]. Für die Hundetrachea konnte schließlich gezeigt werden, dass VIP die aktive Sekretion [Seite 20↓]von Chlorid-Ionen in vitro stimuliert [Nathanson, et al., 1983]. Auch führte die Kombination von VIP mit anderen sekretorischen Agonisten zu Veränderungen in der Schleimsekretion. So wurde eine potente VIP-stimulierte Induktion der sekretorischen Antwort auf Phenylephrine berichtet [Richardson and Webber, 1987], sowie eine VIP-induzierte Zunahme der Zilienschlagfrequenz in kultivierten Kaninchentrachealepithelzellen, die durch Zugabe eines VIP-Antagonisten aufgehoben wurde [Sakai, et al., 1991].

Im Gegensatz zu den Befunden in Tiermodellen, die teilweise auf eine stimulierende Eigenschaft VIPs hindeuten, konnte für die humane Trachea in vitro bis jetzt nur ein inhibitorischer Effekt gegenüber Metacholin-stimulierter Glycoproteinsekretion gefunden werden [Coles, et al., 1981]. Im Bereich der oberen Atemwege konnte für Zellen aus der nasalen Mukosa in vitro gezeigt werden, dass VIP die Sekretion von Lactoferrin stimulieren kann, ohne jedoch eine große Wirkung auf Mukusglykoproteinsekretion zu haben [Baraniuk,et al., 1990].

Zur Klärung der Einflüsse VIPs auf die Mukussekretion wurde in Zusammenarbeit mit P. Staats und U. Wagner, Marburg, die Wirkung von VIP auf die basale Mukussekretion in der humanen Trachealzelllinien MM-39 untersucht (Abb. 5).Dabei konnte in dieser standardisierten Zelllinie [Merten, et al., 1996]mittels etablierter Messverfahren [Wagner,et al., 1998] gezeigt werden, dass VIP und der VPAC1 Rezeptor-Agonist [Ala 11,22,28 ]VIP die Mukussekretion Dosis-abhängig inhibieren.

Die Inhibition durch VIP wurde durch den PKA Inhibitor H-89 (100nM) aufgehoben, was auf einen Zusammenhang zwischen VIP-induzierter [Seite 21↓]cAMP/PKA Aktivität und Mukussekretion hindeutet. Letztlich stützten diese Daten aus einer humanen Drüsenzelllinie diejenigen Beobachtungen, die eine inhibitorische Wirkung des Mediators VIP in vitro für humane Atemwege aufzeigen [Coles,et al., 1981].


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Abbildung 5: VIP-Effekte auf Mukusekretion in humanen MM-39 Zellen. Die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von VIP und [Ala11,22,28] VIP über 30 min inkubiert. Die Ergebnisse der Experimente (je n= 10 für VIP und n = 5 für [Ala11,22,28] VIP) wurden als Mittelwert ± SD der prozentualen basalen Sekretion von 35SO4 –markierten Makromolekülen dargestellt. **, p < 0.01, ***, p < 0.001. Der Kolmogoroff-Smirnoff Test und Varianzanalyse dienten zur Überprüfung auf Signifikanzen gegenüber der Basalsekretion.


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1.4.  1.4Fragestellung und Ziel

Nach dem Kenntnisstand zu Beginn der experimentellen Untersuchungen der vorliegenden kumulativen Arbeit war bekannt, dass neben der Bedeutung pro-inflammatorischer Mediatoren wie Substanz P für die Atemwegsentzündung auch weitere, anti-inflammatorische Mediatoren eine regulatorische Rolle spielen können.

Allerdings fehlte zur Aufklärung der Rolle solcher anti-inflammatorischer peptiderger Mediatoren eine Vielzahl (patho-)physiologischer und (patho-) biochemischer Grundlagen. Im Gegensatz zu den Tachykininen war es für den potentiell anti-inflammatorischen Kandidaten VIP nicht klar, wo molekular definierte Rezeptoren in den Primärorganen allergisch-entzündlicher Erkrankungen, den oberen und unteren Atemwegen und der Haut, lokalisiert sind. Darüber hinaus fehlten Daten bezüglich der Regulation der Expression und Funktion verschiedener Mediatoren und Rezeptoren bei pathophysiologischen und pathobiochemischen Prozessen.

Unter der Annahme, dass anti-inflammatorische Mediatoren wie VIP eine bedeutende Rolle bei der Regulation entzündlicher Erkrankungen haben und möglicherweise ein Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren als zusätzlicher Mechanismus in der Pathogenese entzündlicher Erkrankungen bedeutsam ist, bestand die Zielstellung der Arbeit darin, am Beispiel von VIP zu neuen Erkenntnissen bezüglich der Rolle von peptidergen Entzündungsmediatoren zu gelangen.

Folgende Fragen sollten dabei beantwortet werden:


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Wo sind potentielle Rezeptoren für VIP und verwandte Mediatoren in den Primärorganen allergisch-entzündlicher Erkrankungen lokalisiert?


Gibt es an Beispielen entzündlicher Erkrankungen der Atemwege krankheitsspezifische Änderungen des peptidergen Mediatorprofils?


Lässt sich am Beispiel der Hypoxie eine Regulation der Genexpression von Mediatorrezeptoren identifizieren?


Wie verhalten sich am Beispiel von c-Jun mit Mediatoren interferierende intrazelluläre Signaltransduktionsmechanismen bei allergisch-entzündlichen Erkrankungen?


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