9. Apoptose

Unter physiologischen Bedingungen wird in körpereigenen Geweben durch regulatorische Mechanismen eine Homöostase der Zellzahl aufrechterhalten. Zellen in der sogenannten G0- oder G1-Phase sind proliferationsfähig und können über Synthese und Teilung zu einem Anstieg der Zellzahl oder zur Zelldifferenzierung führen. Alternativ zur Proliferation kann es über den Weg der Apoptose zur Abnahme der Zellzahl kommen, um funktionslose, geschädigte oder für den Organismus schädliche Zellen zu eliminieren (Wagener 1995). Diese morphologisch definierte Form des Zelltodes, 1972 durch Kerr erstmals beschrieben, wurde in Anlehnung an den griechischen Begriff für Laubabwurf "Apoptose“ genannt (Kerr et.al.1972). Die Apoptose ist ein physiologischer Vorgang zur Aufrechterhaltung des Gleichgewichtes zwischen Zellneubildung und Zelluntergang. Sie bezeichnet die aktive Selbstzerstörung einer isolierten Einzelzelle. Während die Nekrose auf einer unvorhergesehenen und unmittelbar tödlichen Zellschädigung beruht, handelt es sich bei der Apoptose um ein vorbereitetes Programm, das in bestimmten Situationen durch den Zellstoffwechsel aktiviert wird. Der Untergang von Zellen nach physiologischen Bedingungen stellt einen geregelten Prozess unter strikter molekularer Kontrolle dar. Sowohl die Sensitivität einer Zelle gegenüber einem Zelltod induzierenden Stimulus als auch der Ablauf des „Zelltodprogramms“ unterliegen einer komplexen genetischen Steuerung. Diese erfolgt komplementär zum Prozess der Proliferation (Jäckel 1998, Wiezorrek et.al.2000). Eine Störung im Prozeß des Zellunterganges kann zur unbalancierten Expansion des vorhandenen Zellpools führen, im Sinne des Verlustes des Gleichgewichts zwischen Zellzuwachs und Absterberate. Als extreme Konsequenz kommt es zum Zusammenbruch der Gewebshomöostase, wie sie im Rahmen eines malignen Tumorwachstums zu beobachten ist (Wiezorrek et.al.2000). Nach externer oder interner Determinierung kann das Apoptose-Programm in jeder Körperzelle in einer ultrastrukturell charakteristischen Sequenz ablaufen (Jäckel 1998).

Dabei kommt es zunächst durch Kondensation des Chromatins entlang der nukleären Membran zur Schrumpfung der Zelle. Morphologisch rundet sich die Zelle dabei ab und tritt - ähnlich wie bei der Mitose - aus dem umgebenden Gewebsverband heraus. Nachfolgend entstehen Protuberanzen an der Plasmamembran ("membrane blebbing"). Im Zellkern lassen sich charakteristische Chromatinverklumpungen beobachten, denen eine systematische [Seite 96↓]Zerlegung der DNA in nukleosomale Fragmente zugrunde liegt (Jäckel 1998). Der DNA-Abbau über Kondensierung und Fragmentierung in Mono- und Oligonukleosome durch Proteinasen und Kalzium-abhängige endogene Nukleasen endet in der Abschnürung von Kernbruchstücken. Am Ende des nur wenige Stunden dauernden Prozesses gliedert sich die betroffene Zelle in mehrere membranumschlossene Körperchen auf („apoptotic bodies"). Makrophagen phagozytieren die Endprodukte der Apoptose (Wiezorrek et.al.2000). Verglichen mit der Nekrose behält die apoptotische Zelle somit eine intakte Membranen, so daß ihre möglicherweise schädigenden Inhaltsstoffe nicht unkontrolliert in den Extrazellularraum freigesetzt werden und eine Entzündungsreaktion ausbleibt (Jäckel 1998).

Das Wachstum eines bösartigen Tumors resultiert aus dem Verhältnis von Zellteilungen zu Zellverlusten. Während man in der Zellteilung traditionell den maßgeblichen Parameter für die Progression und die Prognose eines Tumorleidens sah, findet in den letzten Jahren der Zelltod als ein Faktor negativen Wachstums zunehmend Beachtung (Jäckel 1998). Ein Tumor weist in der Regel einen mehr oder weniger großen Nettozuwachs an Zellen auf, d.h. die das Normalgewebe kennzeichnende Homöostase ist zugunsten der Zellproliferation verschoben. Nach dem Zufluß-Abfluß-Prinzip kann dieser Störung sowohl ein gesteigerter Input als auch ein verminderter Output zugrunde liegen. Neuere Untersuchungen zeigen, daß eine Hemmung der Apoptose ein wesentlicher Vorgang im Rahmen der Karzinogenese ist und insbesondere den Prozeß der beginnenden Tumorinvasion begleitet (Bedi et.al.1995, Birchall et.al.1995). Neben der zumeist erhöhten Proliferationsrate scheint somit eine regulative Störung des Zelltods zur Vermehrung maligner Zellen beizutragen (Hickman 1996).

Apoptose-Gene (bcl-2 Familie)

Unter den zahlreichen Modulatoren der Apoptose kommt den Genen der bcl-2-Familie eine zentrale Rolle zu (Jäckel 1998). Ihr regulativer Angriffspunkt liegt am Ende der zum Zelltod führenden Signalkaskade, so daß sie den überwiegenden Teil apoptotischer Prozesse beeinflussen können. Der genaue Wirkmechanismus ist noch unbekannt, er scheint jedoch teilweise durch eine Regulation der ICE (Interleukin-lß-converting-Enzym) - Gene zustande zu kommen, die für verschiedene Proteasen kodieren und damit die mit der Apoptose verbundenen biochemischen Vorgänge einleiten (Rao und White 1997). Das erste und bislang am besten untersuchte Mitglied der bcl-2 Familie wurde in malignen Lymphomen der B-Zellreihe entdeckt und erhielt daher den Namen "B-cell-lymphoma-" (- bcl -). Seine [Seite 97↓]Überexpression führt zu einer Blockade des programmierten Zelltods, wodurch den Tumorzellen ein selektiver Überlebensvorteil entsteht. Abnorme Expressionsmuster von Genen der bcl-2-Familie finden sich in zahlreichen epithelialen Tumoren, wobei die der Deregulation zugrundeliegenden Mechanismen noch unklar sind. Je nach Tumorlokalisation weist bcl-2 dabei erstaunlicherweise unterschiedliche Beziehungen zu herkömmlichen klinisch-prognostischen Parametern auf. Im Gegensatz zu Tumoren der Mamma, der Schilddrüse und des Magen-Darm-Trakts scheint in Karzinomen der Kopf-Hals-Region eine hohe bcl-2 Expression mit einer geringen Differenzierung, einem fortgeschrittenen Stadium und - teilweise - mit einer ungünstigen Prognose der Erkrankung assoziiert zu sein (Jäckel 1998).

Welche Kenntnisse existieren hinsichtlich des programmierten Zelltodes in der Plazenta?

Eine Apoptose findet in allen Trimestern der Schwangerschaft statt (Kim et.al.1995). Die intrazytoplasmatische Expression von bcl-2, als Maß für die Zahl der apoptoseinhibierten Zellen, wurde in villösen und extravillösen Trophoblastzellen, in Synzytiotrophoblastzellen, im Intermediärtrophoblasten, im Zottenstroma, in Kapillarendothelien, Hofbauerzellen, in der Dezidua und in Amnionepithelien nachgewiesen (Kim et.al. 1995). Über 50% der apoptotischen Zellen in der Plazenta sind Trophoblastzellen, weniger als 5% Endothelzellen. Die Häufigkeit des Auftretens der Apoptose variiert im Verlaufe der Schwangerschaft. Ihren Höhepunkt erreicht sie im dritten Trimester, hier weisen 0,07 bis 0,25% der untersuchten Zellen Zeichen der Apoptose auf. Ein Anstieg der Apoptose ist ab der 32. Schwangerschaftswoche in Zyto- und Synzytiotrophoblast nachweisbar (Kim et.al. 1995, Reed 1994). Die abnehmende bcl-2 Expression in der Plazenta mit fortschreitendem Gestationsalter ist korrelliert mit der physiologischen Funktion von bcl-2, daß ab einem bestimmten Zeitpunkt das Zellüberleben keine zwingende Notwendigkeit mehr besitzt und der programmierte Zelltod am physiologischen Geburtstermin oder kurz davor einsetzen kann. Differenzen zwischen den Lokalisationen der apoptotischen Veränderungen in der Plazenta (Randbereich/ zentraler Anteil) waren nicht nachweisbar (Gerber et.al.1998, Nör et.al.1999, Spyridopoulos et.al. 1997)..

Aufgrund des oben beschriebenen Sachverhaltes erschien es von Wichtigkeit zu überprüfen, ob die Apoptoserate in Plazenten mit pathologischem Gefäßgehalt, insbesondere bei den [Seite 98↓]angesprochenen hamartomatösen Läsionen, verändert ist. Es war denkbar, daß das Chorangiomwachstum, ähnlich dem anderer Tumoren, durch eine Störung im apoptotischen Prozeß bedingt ist.

In der vorliegenden Studie wurden die Zahl der sich darstellenden bcl-2 positiven Zellen in verschiedenen Zellkompartimenten der Plazenta untersucht, um eine mögliche Apoptoseinhibition in Zusammenhang mit dem Chorangiomwachstums zu untersuchen. Zur Komplettierung der Aussage hinsichtlich des Zellzyklus wurde die Zahl der proliferierenden Zellen im Plazentaparenchym sowie innerhalb der Chorangiome ebenfalls erfaßt.

Material und Methode:

Material: Wir untersuchten fünf Chorangiome der 38.- 42. Schwangerschaftswoche zwischen 1,2mm bis 9mm im Durchmesser. Die Chorangiome zeigten folgenden histologischen Typ: 1x endotheliomatös, 1x endotheliomatös/fibrös, 1x ausschließlich kapillär, 2x gemischt kapillär. Als Vergleichskollektiv dienten 10 unselektierte ortholog gereifte Plazenten der 38.- 42 Schwangerschaftswoche (SSW). Chorangiom- und Plazentagewebe wurden in 4%igem gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. H&E- sowie Trichrom-Färbung nach Masson Goldner wurden angefertigt. Die immunhistochemischen Untersuchungen wurden mit der APAAP-Technik an entparaffinisierten 4µm dicken Schnitten durchgeführt. Verwendet wurden: Endothelzellmarker CD 31 (Dako, Verdünnung 1:100), Antikörper: bcl-2 (Dako, Verdünnung 1:80), Proliferationsmarker Ki-67, (Dianova, Verdünnung 1:40).

Wir dokumentierten die Expression der bcl-2 innerhalb der Chorangiome und des regelhaften Plazentaparenchyms halbquantitativ, die Ki-67- positiven Zellen durch Auszählung und Erstellung von Mittelwerten innerhalb der Chorangiome sowie in 20 Blickfeldern der jeweiligen Plazenta bei 250facher Vergrößerung.

Die halbquantitativen Ergebnisse wurde erfaßt mit den Zeichen -, +, ++ oder mit +++ markiert. - bedeutete keine Färbung, + bedeutete 1-2 markierte Zellen, ++ bedeutete 3-5 markierte Zellen und +++ kennzeichnete eine starke Färbeintensität von mehr als 5 markierten [Seite 99↓]Zellen pro Blickfeld. Die Messungen wurden mittels des Leica Mikroskops „Leica DMRB“ durchgeführt.

Ergebnisse:

Kräftige bcl-2 Expression in Trophoblastzellen:

Zyto- und Synzytiotrophoblastzellen zeigten eine starke Expression des Antiapoptose-Proteins bcl-2 (Abb. 27). In Stromazellen der Plazentazotten und in Chorangiomen zeigte sich keine Expression von bcl-2.

	Abbildung 27:
	Zyto- und Synzytiotrophoblastzellen mit Expression von bcl-2. 400x Vergr.

Differierende Proliferationsrate in Chorangiomen und Plazenten:

Zwischen den beurteilten Plazenten und den Chorangiomen zeigte sich ein differierender Proliferationsgrad. Proliferierende Zellen fanden sich nur vereinzelt innerhalb der Vergleichsplazenten (vgl. Seite 64, Abb. 16), hierbei handelte es sich um Endothelzellen. In den Chorangiomen zeigten sich 1-2 positive Zellen/Blickfeld im kapillären und dem gemischt kapillären-kavernösen Chorangiom, 2 positive Zellen/HPF (HPF = High Power Field = 400x Vergr.) im endotheliomatösen/fibrösen Chorangiom und 3-4 markierte Zellen/Blickfeld im Chorangiom vom endotheliomatösen Subtyp (Abb. 19 und 28).

	Abbildung 28:
	Endotheliomatöses Chorangiom mit zahlreichen proliferierenden Fibroblasten und Endothelzellen im Stroma. Angrenzende Plazentazotten mit nahezu ausschließlicher Reaktion im Trophoblastzellsaum. Ki-67, 100x Vergr.

Diskussion:

Während sich die bislang publizierten Arbeiten in Zusammenhang mit Chorangiomen nahezu ausschließlich mit deren Komplikationen beschäftigten, existierten bis zum Zeitpunkt der Verfassung dieser Monographie keine Studien über die Gefäßbildung in Chorangiomen in Zusammenhang mit der Apoptose oder der Proliferationsrate.

Interessant erschien in diesem Zusammenhang überdies, daß, laut Literaturangaben Wachstumsfaktoren, insbesondere VEGF, als ein „survival-factor“ für Endothelzellen gelten kann, indem die Expression des Anti-Apoptose Proteins bcl-2 induziert wird (Kroemer 1997, Gerber et.al. 1998, Reed 1994, Spyridopoulos et.al. 1997, Pösl et.al. 1994, Nör et.al. 1999).

Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren eine kontinuierliche und kräftige Expression des Zyto- und Synzytiotrophoblasten für bcl-2 im dritten Trimester. Im Zottenstroma fanden sich keine positiven Zellen. Diese Ergebnisse decken sich mit denen von Kim 1995 und Mochizuki 1998, die eine Expression von Bcl-2 in allen Trimestern der Gravidität im Zyto- und Synzytiotrophoblast nachweisen konnten. Zudem sahen sie bis zur 32. Schwangerschaftswoche eine bcl-2-Expression auch in Fibroblasten, Hofbauerzellen und in Endothelien. Nach der 32. Schwangerschaftswoche sinkt die Expression im Stroma. Das deutet auf eine hohe proliferative Aktivität der Plazenta mit geringer Apoptose im ersten Trimester hin (Kim et. al. 1995, Mochizuki et.al. 1998).

Bcl-2 übernimmt offenbar auch in der Plazenta, und hier betont im Zyto- und Synzytiotrophoblasten, die Funktion eines Proliferations- und Differenzierungsmarkers. Die abnehmende bcl-2 Expression in der Plazenta mit fortschreitendem Gestationsalter ist korreliert mit der physiologischen Funktion von bcl-2, daß ab einem bestimmten Zeitpunkt das Zellüberleben keine zwingende Notwendigkeit mehr besitzt und der programmierte Zelltod am Geburtstermin oder kurz zuvor einsetzen kann (Kim et. al. 1995). Im Stroma der Chorangiome ließen sich keine bcl-2 positiven Zellen nachweisen. Diese fanden sich einzig innerhalb der Trophoblastzellen, die die Chorangiome umgaben. Das deutet darauf hin, daß die Apoptoseinhibition beim Wachstum des Chorangioms, zumindest zum untersuchten Zeitpunkt, im letzten Schwangerschaftstrimester, keine wesentliche Rolle spielt. Stromazellen verhalten sich in Chorangiomen gleichartig wie innerhalb der regulär verzweigten und regelrecht kapillarisierten Plazentazotten. Auch dies kann als ein Hinweis gelten, daß es sich bei Chorangiomen um eine lokalisierte Verzweigunsstörung der Plazentazotten mit überschießender Kapillarisierung handelt, im Sinne eines Hamartoms.