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2  Kapitel

Material und Methoden


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2.1  Materialien


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2.1.1 Reagentien

Hersteller

Phosphate-buffered saline (PBS)

RPMI 1640 Medium

Fetales Kälber Serum (FCS)

Ovalbumin (OA, Grad V)

ImjectAlum (Aluminium-hydroxid)

Lymphocyte Separation Medium

H3-Thymidin

Gibco, Grand Island, NY

Gibco

HyClone Lab., Logan, UT

Sigma Chemicals, St. Louis, MN

Pierce, Rockford, IL

Organon Teknika, Durham, NC

ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA

2.1.2 Antikörper (AK)

Hersteller

Primäre, unkonjugierte AK für

Immunglobulin- und Zytokin-ELISA

Sekundäre, FITC- PE- AP- oder Biotin-konjugierte AK für ELISA und FACS

Kaninchen-anti-Maus-MBP

Ratte-anti-Maus-IL-5 (TRFK-5)

Ratte-anti-Maus-IgE (1-5)

PharMingen, San Diego, CA

PharMingen

Dr. G. Gleich, Mayo, Rochester, MN

Dr. R. Coffman, Palo Alto, CA

Dr. C. Heuser, Basel, CH

2.1.3 Verbrauchsmaterial

Hersteller

Falcon Röhrchen 15 und 50 ml

Zelkultur-Flaschen 250/ 500 ml

ELISA Platten Immulon II

96-Loch Kulturplatten

Becton Dickinson,

Becton Dickinson

Dynatech, Chantilly, VA

Becton Dickinson

2.1.4 Geräte

Hersteller

Ultraschall-Nebulisator Aerosonic 5000

Elektrischer Feld-Stimulator

Ganzkörper-Plethysmograph

Ventilator Modell 683

Resistenz-Programm

Microplate Manager ELISA reader

Zell-Harvester

Magnetische Zell-Isolierung

Epics Zytofluorograph

DeVilbis, Somerset, PA
Grass SIV5

Buxco, Troy, NY

Harvard Apparatus, S. Natvick, MA

Labview, National Instruments, TX

Bio-Rads, Richmond, VA

Cambridge Techn., Watertown, MA

Miltenyi, Bergisch-Gladbach, D

Coulter Electronics, Hialeah, FL

2.2  In vivo Tierversuche

2.2.1 Versuchstiere

2.2.1 Stamm
BALB/c
BALB/c nu/nu
B10.BR (B10)
C57BL6 (B6)
B-Zell-defiziente B10.BR
IL-4-defiziente C57BL6
IL-5-defiziente C57BL6

Herkunft
Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME

Jackson Laboratories

Jackson Laboratories

Jackson Laboratories

Dr. P. Marrack, Denver, CO

Dr. L. Shultz, Ann Arbor, MN
Dr. R. Lamers, MPI, Freiburg, D

Alle für die Versuche verwandten Tiere unterlagen den Vorschriften und Bestimmungen des Institutional Animal Care and Use Committee of the National Jewish Research Center, Denver. Alle Mäuse wurden in speziellen Käfigen bei OA-freier Diät im Tierhaus des National Jewish Research Center gehalten. Alle Tiere wurden als frei von Infektionen getestet. Für die Versuche wurden nur 8 bis 12 Wochen alte weibliche Tiere mit ähnlichem Gewicht (20-25 g) verwandt. Die unterschiedlichen Gruppen der einzelnen Versuche wurden immer parallel untersucht, meist 3 bis 4 Tiere pro Versuchsgruppe in einem Experiment von 12 bis 16 Tieren.


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2.2.2  Betäubung

Bei einigen Versuchen war die Betäubung der Versuchstiere notwendig. Für intranasale Applikation von Antikörpern oder Allergen reichte die leichte Anästhesie mit Avertin (2.5%, 300 µl ip) aus. Bei Lungenfunktionsmessung an ventilierten Mäusen wurde eine weitreichendere Anästhesie mit Pentobarbital (50 mg/ kg KG, ip) durchgeführt.

2.2.3 Sensibilisierung mit Allergen

Für die Sensibilisierung mit Allergen wurden drei verschiedene Modelle untersucht, die sich grundsätzlich in der Art der Allergen-Zufuhr und in ihren Auswirkungen auf allergen-spezifische Ig Produktion und histologische Veränderungen der Zielorgane unterscheiden.

.1 Atemwegs-Sensibilisierung

Hintergrund:

In dem ersten Modell der Atemwegs-Sensibilisierung werden die Mäuse ausschließlich über die Atemwege mit Allergen in Kontakt gebracht. Auch wird auf den Einsatz von Adjuvantien, d.s. unspezifische, immunstimulierende Wirkstoffe, die zusammen mit Antigen verabreicht werden, verzichtet. Hierdurch wird eine der Sensibilisierung von Patienten mit Hausstaub-Milben- oder Pollenallergen ähnliche Form der Sensibilisierung erreicht.


Durchführung:

Mäuse wurden in eine Plastikbox (≤ 8 gleichzeitig) gesetzt, die auf der einen Seite an einen Nebulisator und auf der anderen an einen Abzug angeschlossen war. Über den Nebulisator wurde aus einer Lösung von 1% OA in PBS ein Aerosol mit Einzelpartikeln in der Größe von 3.9 ± 1.3 µm (gemessen durch einen Laser-Teilchen-Analysator) für 20 min täglich vernebelt. Die Sensibilisierung war nach 10 konsekutiven Tagen abgeschlossen (Tag 1-10 des Protokolls). Kontrollen wurden nach gleichem Protokoll mit PBS schein-sensibilisiert.


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.2  Passive Sensibilisierung

Hintergrund:

Im Normalfall führt die Applikation eines antigen wirkenden Stoffes im Wirt zur Bildung von Antikörpern (aktive Sensibilisierung/ Immunisierung). Antigen-spezifische Antikörper lassen sich jedoch auch durch Transfer aus Serum von vor-sensibilisierten Tieren oder aus Kulturüberständen Antikörperproduzierender Zellen in nicht-sensibilisierte Empfänger übertragen (passive Sensibilisierung).


Herstellung der Antikörper:

Zunächst wurden OA-spezifische Antiköperproduzierende B-Zell-Linien hergestellt: BALB/c Mäuse wurden ip zweimalig mit OA sensibilisiert, 14 Tage nach letzter Sensibilisierung wurden die Milz-MNC isoliert und in Kultur gebracht. Hybridome wurden durch Fusion der B-Zellen mit Maus-Myelomzellen SP 2/0 (ATCC, Rockeville, MD) hergestellt. OA-Spezifität und Klonalität wurden durch wiederholtes Waschen der Zellen und anschließende Anreicherung des Mediums mit OA und durch die Technik des “limiting dilution” sichergestellt. Isotypen der OA-spezifischen Antikörper der einzelnen Linien wurde mittels ELISA bestimmt. Diese wurden nun in großem Umfang in Kultur gehalten, und der Zellüberstand in regelmäßigen Abständen geerntet. Die Ig wurden durch Protein-G-Säulen gereinigt und portioniert bei -70°C aufbewahrt.


Durchführung der Sensibilisierung:

Mäuse wurden passiv mit OA-spezifischen Antikörpern (0.4 µg in 200 µl PBS) der verschiedenen Ig-Klassen (IgE, IgG1, IgG2a) durch iv Injektion in die Schwanzvene an drei aufeinanderfolgenden Tagen (Tag 1-3 des Protokolls) sensibilisiert. Kontrollen erhielten anti-TNP-spezifische Antikörper (ATCC) nach dem gleichen Protokoll.


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.3  Systemische Sensibilisierung

Hintergrund:

Dieses Modell erlaubt, die Phasen der Sensibilisierung von der Phase der Atemwegs-Provokation mit Allergen abzugrenzen. Zudem stellt sie durch die Zufuhr von Adjuvans eine sehr viel stärkere Form der Sensibilisierung dar. Als Adjuvans wurde Aluminium-hydroxid (Al(OH)3) gewählt, welches wahrscheinlich durch die Verlängerung der Eliminierung und durch unspezifische Stimulierung des mononukleären Phagozyten-Systems (MPS) zu einer Verstärkung der Immunogenität des Antigens/ Allergens führt.


Durchführung
:

Mäuse wurden durch ip Injektion von 100 µl einer Emulsion aus Allergen (20 µg OA) in Adjuvans (2 mg Al-OH) an den Tagen 1 und 14 des Protokolls sensibilisiert.

2.2.4 Provokation mit Allergen

Hintergrund:

Bei den Sensibilisierungs-Protokollen 2 und 3 fehlt der direkte Kontakt der Atemwege mit dem Allergen. Eine Zuführung als Aerosol über die Atemwege garantiert, dass zumindest ein Teil die tiefen Atemwegs erreicht.


Durchführung
:

Wie bei der Methode der Atemwegs-Sensibilisierung beschrieben wurden die Mäuse an den Tagen 6, 7 und 8 (passive) bzw. den Tagen 28, 29 und 30 (systemische Sensibilisierung) für jeweils 20 min mit 1% OA-Lösung in PBS provoziert. Kontrollen waren nicht-sensibilisierte Mäuse und sensibilisierte Mäuse mit Scheinprovokation durch PBS.


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Abbildung 2.2.1: Übersicht über Sensibilisierungs- und Provokationsprotokolle


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2.2.5  In vivo Zell-Depletion

Um den Einfluß bestimmter Zellarten auf Sensibilisierung und die Entwicklung von Atemwegs-Entzündung und AHR zu untersuchen, wurden in vivo CD8+ T-Zellen depletiert. Hierzu wurden 3-4 Wochen alte BALB/c Mäuse zunächst thymektomiert und dann 2 Wochen später ip mit 200µl Überstand von Aszites aus der Kultur von YTS 169 Zellen (Ratte-anti-Maus CD8, ATCC) behandelt. Die Spezifität des Antikörpers und optimale Verdünnung des Aszites wurden in vivo und in vitro gemessen und titriert. Die Antikörperbehandlungen wurden insgesamt 3 mal im Abstand von 3 Tagen durchgeführt. Kontrolltiere erhielten Kontroll-IgG (Ratten-IgG, Sigma).

2.2.6  In vivo Zell-Transfer

Nach positiver Selektion (siehe 2.3.6) der Zielzellen aus Milzzellen unbehandelter BALB/c Mäuse wurden 1 x 107 CD8+ T-Zellen (> 95% CD8+) pro Empfängertier iv am Tag 8 des 10-Tage-Sensibilisierungs-Protokolls (siehe 2.2.3.1) übertragen. Kontrollen erhielten die gleiche Anzahl CD8-negativer T-Zellen (< 1% CD8+) zum gleichen Zeitpunkt.

2.2.7 Antikörperbehandlung

Antikörper werden auf die gewünschte Konzentration verdünnt und zu verschiedenen Zeitpunkten (vor oder nach Sensibilisierung oder unmittelbar vor Provokation) in die laterale Schwanzvene intravenös appliziert (1-100 µg/Maus in 100 µl PBS).

2.2.8 Bestimmung der kutanen Hyperreaktivität (ICH)

Hintergrund:

Die ICH auf Allergen stellt eine klassische, durch IgE-vermittelte Mastzell-Aktivierung mit Freisetzung von Histamin ausgelöste Reaktion nach Sensibilisierung dar. Sie kann daher als gute in vivo Technik für die Feststellung und Quantifizierung der allergen-spezifischen Sensibilisierung und IgE-Produktion gewertet werden. Als [Seite 61↓]Besonderheit weisen Mastzellen der Maus neben dem hochaffinen IgE-Rezeptor (FcεRI) auch Rezeptoren für IgG1 auf.


Durchführung
:

Die Bauchhaut der Mäuse wird glattrasiert und die Testlösungen (30 µl) mit Allergen (OVA 500 µg in 1 ml PBS) oder PBS als Negativkontrolle streng intradermal appliziert. Nach 15 bis 20 min wird die Entwicklung der Hautreaktion durch eine über den Status der Versuchstiere nicht informierte Person abgelesen. Die Quaddelgröße wird gemessen und die Hautreaktion wird als positiv gewertet, wenn die Ausdehnung der Quaddel ≥ 3 mm in beliebiger Richtung beträgt.

2.2.9 Bestimmung der Atemwegs-Reaktivität

AHR ist einer der drei kardinalen pathognomonischen Eigenschaften, die bei Patienten mit BA gefunden werden. Eine direkte Bestimmung der Kontraktilität der glatten Muskulatur der tiefen Atemwege in vivo ist nicht möglich. Veränderungen des Muskeltonus können daher nur durch Bestimmungen der Kontraktilität der glatten Muskulatur in vitro (Methode 1, 2..2.6.1) oder mit Lungenfunktionsmessung erfaßt werden, die Veränderungen des Kalibers der Atemwege (Resistenzmessung, 2.2.6.2) oder Veränderungen der Atemlage (Plethysmographie, 2.2.6.3) aufzeigen. In Abhängigkeit von dem gewählten Modell der Sensibilisierung wurden drei verschiedene Methoden zur Bestimmung der Atemwegs-Reaktivität (AR) durchgeführt, wobei Veränderungen der AR nach Atemwegs- oder passiver Sensibilisierung nur mit der ersten Methode, 2.2.6.1, erfaßt werden konnten.

.1 Bestimmung der trachealen Kontraktilität in vitro

Hintergrund:

Als Ursache der AHR gilt eine Erhöhung der Kontraktilität der glatten Muskulatur der Atemwege auf unspezifische Stimuli aufgrund neuronaler, funktionaler oder struktureller Veränderungen an der motorischen Endplatte als Folge z.B. von allergischer Atemwegs-Sensibilisierung. Im Maus-Modell kann die Kontraktilität der glatten Muskulatur der tiefen Atemwege nicht direkt gemessen werden, so dass die tracheale Kontraktilität nach Stimulation mit elektrischer Spannung als unspezifischer Stimulus als Maß für die Veränderungen an der glatten Atemwegs-Muskulatur [Seite 62↓]herangezogen wird. Unberücksichtigt bleiben hierbei Veränderungen der tiefen Atemwege und Einflüsse der Umgebung der Muskulatur, z.B. durch zelluläre Infiltration.


Durchführung
:

Die Bestimmung der Kontraktilität erfolgte grundsätzlich 2 Tage nach Abschluß der Atemwegs-Sensibilisierung (Tag 12 des Protokolls) bzw. 2 Tage nach letzter Provokation von passiv sensibilisierten Mäusen (Tag 11 des Protokolls). Die Mäuse wurden getötet, die Trachea frei präpariert und ca. 0.5 cm lange Segmente isoliert. Diese wurden in Krebs-Henseleit-Medium an beiden Enden an dreieckigen Metallträgern fixiert, die die Kraft der Kontraktion aufnehmen und weiterleiten konnten. Elektrische Feldstimulation (EFS) wurde mit zunehmender Frequenz im Bereich von 0.5 bis 40 Hz auf das Gewebe ausgeübt, und die Kontraktionen mit Hilfe eines Schreibers als lineares Diagramm aufgezeichnet. Aus diesen wurden die Frequenzen ermittelt, die zu 50% der maximal erreichten Kontraktion geführt hatten (ES50) und für die einzelnen Versuchsgruppen verglichen.

.2 Bestimmung der Resistenz in vivo

Hintergrund:

Die viskösen Widerstände, die bei Inspiration und Exspiration zu überwinden sind, setzen sich aus Strömungswiderständen (Atemwegswiderstand) und nicht-elastischen Gewebswiderständen (Widerständen des Lungengewebes aufgrund von Reibung und Gewebedeformation) zusammen. Ca. 90% des viskösen Widerstandes wird durch den Strömungswiderstand hervorgerufen, der daher dem gesamten viskösen Widerstand bei der Bestimmung gleichgesetzt wird.

Der Atemwegswiderstand oder Strömungswiderstand (R) entspricht dabei der Druckdifferenz zwischen dem intraalveolären Druck (Palv) und dem atmosphärischen Druck an der Mundöffnung (Pao), verkürzt als intrapulmonaler Druck (Ppul) bezeichnet,, geteilt durch die Stromstärke (V), die durch die bestehende Druckdifferenz (Ppul) hervorgerufen wird:


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Bei laminaren Strömungen ist R nach dem Hagen-Poiseuilleschen Gesetz vom Querschnitt (r) und der Länge (L) des Rohres sowie der Viskosität (µ) abhängig:

Daraus geht hervor, dass die wesentliche Determinante für R der Radius (r) des Rohres bzw. der Atemwege darstellt.

Die Bestimmung von R erfordert also die fortlaufende Messung des intrapulmonalen Druckes. Bei Patienten erfolgt dies durch einen Ganzkörper-Plethysmographen, bei dem indirekt Änderungen von Ppul durch Messung der proportional auftretenden Druckänderung in der abgeschlossenen Kammer erfaßt werden. Gleichzeitig wird die Atemstromstärke V über einen Pneumotachographen registriert. Bei Versuchstieren gibt es eine Vielzahl von Methoden. Die hier durchgeführten Experimente folgen im wesentlichen der Erstbeschreibung der invasiven Bestimmung der Resistenz in der Maus (206). Diese beruht auf den alten Arbeiten von Neergaard und Wirtz. Hierbei wird der pulmonale Druck direkt durch einen Druckumwandler an einem Tracheostoma als Differenz von Pleura- und Munddruck, von dem eine elastische Komponente abgezogen wird, gemessen, und die Resistenz als der Quotient zu der gemessenen Stromstärke bestimmt. Diese Methode ist invasiv und erfordert daher die Betäubung und kontrollierte Beatmung der Tiere. Von Vorteil ist, dass durch die tracheale Kanülierung der gesamte obere Respirationstrakt umgangen und daher als Störgröße ausgeschaltet wird.


Durchführung
:

Die Bestimmung von RL erfolgte in der Regel 2 Tage nach letzter Atemwegs-Provokation der systemisch sensibilisierten Mäuse mit Allergen (Tag 32 des Protokolls). Mäuse wurden mit Pentobarbital anästhesiert und tracheostomiert. An das Tracheostoma wird ein 4-Wege-Hahn angeschlossen, mit dem die beiden Anschlüsse des Ventilators für In- und Exspiration verbunden werden. Die Ventilation wird eingestellt auf 160 Atemzüge pro min mit einem Atemzugvolumen (AZV) von 150 µl und end-exspiratorischem Druck von 2-4 cm H2O während der Messungen, und auf 60 Atemzüge pro min mit einem AZV von 500 µl während der Stimulation mit Metacholin (MCh). Der transpulmonale Druck, Ppul, wird durch einen Differenzmanometer registriert, der auf der einen Seite mit dem vierten Hahn des 4-Wege-Hahns und auf der anderen Seite mit einem Ausgang im Plethysmographen [Seite 64↓]verbunden ist. Änderungen der Lungenvolumina werden durch Bestimmung von Druckänderungen im Plethysmographen über einen zweiten Differenzmanometer, verbunden mit einer Referenz-Kammer, registriert. Die Stromstärke V wird durch digitale Differenzierung des Volumensignals berechnet. Die Bestimmung von RL wird kontinuierlich durch Verrechnung von Stromstärke, Lungenvolumen und transpulmonalem Druck über ein Computerprogramm durchgeführt.

Als Modifikation zur ursprünglichen Beschreibung der Methode wurde das MCh nicht in die Jugular-Vene injiziert, sondern in Anlehnung an die Situation beim Patienten als Aerosol über den Ultraschall-Vernebler per inhalationem zugeführt. Hierzu wurde MCh für 10 sec je Dosierungsstufe mit ansteigenden Dosierungen bis zum Erreichen eines Plateau-Wertes von RL vernebelt, und im Anschluß nach jeder Stufe wurde von 20 sec bis 3 min kontinuierlich RL bestimmt. Die maximal erzielten Werte für RL wurden verwandt, um die AR der verschiedenen Versuchsgruppen mit einander zu vergleichen.

.3 Barometrische Plethysmographie in vivo

Diese Methode wird ausführlich im Kapitel 3.3.1 “Das Modell der systemischen Sensibilisierung” beschrieben (207).

2.3  In vitro Versuche

2.3.1 Bestimmung der Immunglobuline mittels ELISA

Venöses Blut wurde aus der Schwanzvene gewonnen und bei Raumtemperatur geronnen gelassen. Nach Zentrifugieren (5 min, 5000 rpm) wurden die Serumproben portionsweise bei -20°C eingefroren.

ELISA-Platten wurden frisch mit OA (20 µg/ ml) (für allergen-spezifische Antikörper) oder mit polyklonalem anti-Maus-IgE oder anti-Maus-IgG (3 µg/ ml in NaHCO3-Puffer-Lösung, pH 9.6) (für Gesamt-Ig) beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit Tween 20-Lösung (0.02%) in PBS wurden die Platten mit 0.2% Gelatine-Puffer-Lösung, pH 8.2, für 2 h bei 37°C geblockt. Serum wurde 1:10 in Gelatine-Lösung verdünnt, in Duplikaten auf die [Seite 65↓]Platten gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden Alkalin-Phosphatase-konjugierte Ratte-anti-Maus-IgE, -IgG, -IgG1 oder IgG2a Antikörper zugefügt und für 2 h bei 37°C inkubiert. Nach Entwicklung der Farbreaktion durch Zugabe von Phosphatase-Substrat (Sigma 104) wurden die Platten in einem automatischen Leser bei 410 nm ausgewertet (BioRad Laboratories). Die Antikörper-Titer der Serumproben wurden gegen Standards verglichen. Standards von anti-OA IgE oder IgG1 wurden durch systemische Sensibilisierung von Mäusen mit OA in Alum hergestellt, titriert und portionsweise bei -70°C aufbewahrt. Die Höhe der Standards wurde als 100 ELISA Einheiten pro ml (100 EU/ml) definiert. Für die Standardisierung von Gesamt-IgE und IgG-Titer wurden kommerzielle Antikörper verwandt. Das Limit der Messbarkeit betrug 1 EU/ ml für spezifische Antikörper, 100 pg/ ml für IgE, 1 ng/ ml für IgG.

2.3.2 Präparation von Zellen

Milzen und peribronchiale Lymphknoten (PBLN) wurden präpariert, MNC durch Zerreiben von kleingeschnittenen Gewebestücken durch ein Stahlsieb und anschließende Dichtegradienten-Zentrifugation (5 min, 1500 rpm, 20°C) auf Lymphozyten-Trennmedium gereinigt. Die Zellen wurden dreimalig mit PBS gewaschen und in RPMI Medium mit Zusatz von 10% Hitze-deaktiviertem FCS, 5 mM L-Glutamin, 0.05 mM 2-Mercapto-Ethanol, 15 mM Hepes-Puffer, 100 U/ ml Penicillin und 100 µg/ ml Streptomycin (alles von Gibco) resuspendiert. Die Zellen wurden bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert.

2.3.3 Zell-Proliferation

Um die proliferative Reaktivität von Zellen sensibilisierter Tiere zu untersuchen, wurden MNC mit und ohne Zusatz von spezifischem Antigen kultiviert. 2 x 105 MNC wurden in Triplikaten in 96-Loch-Rundboden-Platten für 3 Tage inkubiert. In den letzten 6 h der Kultur wurden die Zellen durch Zugabe von 1 µCi (3H) Thymidin gepulst und durch einen Zell-harvester geerntet. Die Inkorporation von (3H) Thymidin wurde in einem Szintillations-Messgerät bestimmt.


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2.3.4  CD8+ T-Zell-Isolierung

CD8+ T-Zellen wurden positiv aus Milz-MNC von unbehandelten Mäusen selektioniert. Hierzu wurden die Zellen mit anti-CD8-konjugierten magnetischen beads inkubiert und magnetisch aussortiert. Die selektionierte Fraktion bestand in der FACS-Analyse zu > 95% aus CD8+ T-Lymphozyten, die depletierte Fraktion enthielt weniger als 1% CD8+ Zellen.

2.3.5 T-Zell-Anreicherung, T-Zell-Depletion in vitro

B- und T-Zellen zeigen eine unterschiedliche Affinität zu verschiedenen Trägermedien: Die Passage von MNC über Nylonwolle bedingt durch die höhere Affinität von B-Zellen und Makrophagen eine selektive Anreicherung von T-Zellen. MNC (108/ ml) wurden in RPMI-Medium in einer mit Nylonwolle (ca. 1 g, 2 ml) gefüllten 12 ml Spritze bei 37°C für 60 min inkubiert. Die non-adherente Zellsuspension wurde mit Medium ausgewaschen, und die ersten 15 ml dieser Suspension zentrifugiert (5 min, 1500 rpm, 4°C), in Medium resuspendiert und als angereicherte T-Zellen verwandt. In der FACS-Analyse wurde eine Reinheit von > 85% CD3+ T-Lymphozyten nachgewiesen.

Für die Gewinnung von APC wurden T-Zellen aus MNC durch Inkubation in anti-Thymozyten-Serum und anschließendes Hinzufügen von Kaninchen-Komplement depletiert, und die T-Zell-freien MNC bei 3000 rad bestrahlt.

2.3.6 Durchfluß-Zytometrie

Milz- und PBLN MNC wurden in Färbe-Pufferlösung (PBS, 2% FCS, 0.2% Natrium-Azid) mit entsprechenden Antikörpern (FITC- oder Biotin-konjugierte anti-Maus-mAb, PharMingen) für 2 h bei 4°C inkubiert. Bei Verwendung von Biotin-konjugierten AK wurde die Farbreaktion in einem zweiten Schritt mit Inkubation mit PE-konjugiertem Streptavidin vervollständigt. Die angefärbten Zellen wurden in einem Zytofluorographen analysiert, die Fluoreszenz-Intensität wurde mit negativen Kontrollen verglichen, die lediglich mit PE-konjugiertem Streptavidin inkubiert worden waren.


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2.3.7  Bestimmung von Zytokinen mittels ELISA

MNC werden in 96-Loch-Rundboden-Platten in einer Dichte von 400,000 Zellen/Loch in der Gegenwart oder in Abwesenheit von OA oder Mitogen (10 nM Phorbolester, 0.5 µM Ionomycin) für 48 hrs bei 37°C inkubiert. Zytokin-Konzentrationen in den zellfreien Überständen oder in der BAL Lösung werden mittels ELISA unter Verwendung von Ratte-anti-Maus-Zytokin-Antikörpern (unkonjugiert für Beschichtung der Platte, konjugiert für Detektion des gebundenen Zytokins), wie für Ig ELISA beschrieben, bestimmt.

2.3.8 Bestimmung von zytoplasmatischen Zytokinen mittels FACS

Zytokin-Produktion auf der Einzel-Zellebene wird mittels zytoplasmatischer Anfärbung bestimmt. Milz MNC und PBLN-Zellen werden für 4 hrs mit Phorbolester (10 nM) und Ionomycin (0.5 µM) stimuliert, mit Saponin-Lösung (Sigma, 0.1% in HBSS) permeabilisiert, mit Ziegen- und Esel Ig geblockt und abschließend mit biotinylierten anti-IL-4, anti-IL-5 oder anti-IFN-γ Antikörpern (PharMingen) angefärbt, gefolgt von PE-konjugiertem Streptavidin. In einem zweiten Schritt werden FITC-konjugierte anti-CD4 und anti-CD8 Antikörper (PharMingen) zugesetzt. Die Frequenz positiver Zellen wird mittels eines Zytofluorographen (Coulter Electronics) bestimmt, die Fluoreszenz-Intensität wird mit Isotyp-Kontrollen, die den Isotypen der verwandten anti-Zytokin- Antikörpern gleichen, oder mit nicht stimulierten Zellen verglichen.

2.3.9 Broncho-alveoläre Lavage (BAL)

Lungen werden über einen trachealen Tubus dreimalig mit “Hank's balanced salt solution” (HBSS, 0.5 ml) gespült, die Zellen in der so gewonnenen Lavage in einem automatischen Zellzähler gezählt, und die BAL-Flüssigkeit nach Zentrifugieren (1000 rpm, 7 min, 4°C) von den BAL-Zellen getrennt.


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2.3.10  Lungenzell-Isolierung

Die Lungen Zellen werden isoliert. Hierzu werden die Lungen nach Kollekte der BAL mit erwärmter (37° C) Calcium- und Magnesium-freier HBSS-Lösung mit 10% FCS, 0.6 mM EDTA, 100 U/ml Penicillin and 100 µg/ml Streptomycin über den rechten Herzventrikel mit einer Rate von 4 ml/ min über einen Zeitraum von 4 min gespült. Die Lungen werden entfernt und in ca. 300 µm große Teile zerschnitten. Die Lungenstückchen werden in 4 ml HBSS-Lösung mit 175 U/ ml Kollagenase (Typ IA, Sigma), 10% FCS, 100 U/ml Penicillin and 100 µg/ml Streptomycin gelöst und für 60 min auf einem Rüttler bei 37° C inkubiert. Die angedauten Lungen werden durch eine 20-g Nadel, danach durch ein 45 µm und ein 15 µm Sieb gefiltert und mit HBSS-Lösung mit 2% FCS gewaschen. Lungen- und BAL-Zellen werden in HBSS resuspendiert, gezählt und mit Leukostat (Fisher Diagnostics) für die Differentialzählung angefärbt. Die übrigen Zellen werden in destilliertem Wasser mit 1% NP-40 (Sigma) resuspendiert (2 x 105 Zellen/ ml) und bis zur Bestimmung der EPO-Aktivität bei -20°C aufbewahrt.

2.3.11 Bestimmung der Eosinophilen Peroxidase (EPO) Aktivität

Verwandt wird eine für die EPO der Eosinophilen spezifische Methode. 100 µl des Substrates (0.1 mM o-Phenylen-Diamin-Dihydrochlorid, 0.1% Triton X-100, 1 mM Hydrogen-Peroxid in 0.05 M Tris-HCl; alle Reagentien von Sigma) wird zu 100 µl der aufgelösten BAL- oder Lungenzellen (s.o.) gegeben und bei 37° C für 30 min inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 µl 4 M Schwefliger Säure gestoppt und die optische Dichte in einem ELISA Lesegerät bei einer Wellenlänge von 492 nm bestimmt.

2.3.12 Histologie

Lungengewebe wird für histologische Untersuchungen mit Formaldehyd lavagiert und in Formaldehyd fixiert. Randomisierte Schnitte der unteren, mittleren und oberen Atemwege werden mit Hämatoxylin/ Eosin (HE) für Licht-Mikroskopie angefärbt oder für die Elektron-Mikroskopische Untersuchung weiterverarbeitet.


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2.3.13  Immunohistochemie (IHC)

Das Lungengewebe wird in 10% Formalin fixiert. Major basic protein (MBP) wird durch in situ IHC mit Kaninchen-anti-Maus-MBP Antikörper (Dr. Gleich, Rochester, MN) lokalisiert. Gewebeblöcke der linken Lunge wurden um den Hauptbronchus herum ausgeschnitten und in Paraffin eingebettet. 5 µm dicke Schnitte werden auf einem Objektträger fixiert, deparaffinisiert und in normalem Kaninchenserum bei 37°C für 2 h inkubiert. Die Schnitte werden daraufhin entweder mit anti-MBP oder, zur Kontrolle, mit normalem Kaninchenserum angefärbt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen und 30 min Inkubation in 1% Chromotrop 2R (Harleco, Philadelphia) werden die Schnitte mit FITC-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG für 30 min bei 37°C gegen gefärbt. Die angefärbten Präparate werden durch einen unabhängigen Mitarbeiter in einem Zeiss Fluoreszenz Mikroskop ausgewertet. Die Anzahl von Eosinophilen, die pro mm2 Submukosa um die zentralen Bronchien und Bronchiolen angetroffen werden, wird mittels des IP-Lab2 Software-Programmes (Signal Analytics, Vienna, VA) bestimmt.

2.3.14  In situ Hybridisierung mittels RT-PCR

Die RNA von 10-30 Millionen Zellen (SC, PBLN, Lungenzellen) wird durch die Guanidin-Isozyanat-Methode isoliert. Die RNA wird bei 260 nm spektrophotometrisch gemessen und in Aliquots bei -20° C gelagert. Die RNA der einzelnen Proben wird in RT-Pufferlösung (AMV reverse transcriptase, oligo dT, dNT, BSA, RNAguard, Pharmacia) zu cDNA umgeformt. cDNA wird bei -20°C gelagert. Der Gehalt an cDNA für die einzelnen Zytokine wird durch semi-quantitative RT-PCR bestimmt. Nach initialer Denaturierung werden bis zu 29 PCR Zyklen durchgeführt. Die Proben werden auf Agarose Gel in Glycerin-Puffer mit Ethidium-Bromid angefärbt. Unter UV-Licht werden Fotografien angefertigt und die Dichte von parallel gelaufenen Marker-Fragmenten gegen das Molekulargewicht berechnet, um die Ausbeute an PCR Target-Fragmenten zu bestimmen. Ergebnisse werden in Prozent β-Aktin mRNA Kopien angegeben.


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2.4  Datenanalyse

Für den Vergleich individueller Gruppen wird der t-Test zur Bestimmung von Signifikanz verwendet. Bei multiplen Vergleichen wird ANOVA angewandt. Für den Vergleich von AR in multiplen Gruppen wird der Tukey Kramer HSD benutzt. Die Schwelle für Signifikanz wird bei 5 % angesetzt. Für jedes Experiment ist eine minimale Gruppenstärke von 8-10 Mäusen vorgesehen, diese wird in drei voneinander unabhängigen Experimenten erreicht. Die Ergebnisse werden als Durchschnitt ± SD für ELISA und Histologie und als Durchschnitt ± SEM für AR angegeben.


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HTML-Version erstellt am:
27.08.2004