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3  Kapitel

Ergebnisse


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3.1  Ergebnisse im Modell der Atemwegs-Sensibilisierung

  1. Hamelmann E , Oshiba A, Bradley K, Loader J, Larsen G, Potter T, Gelfand E. Requirement for CD8 T CELLS in THE DEVELOPMENT OF AIRWAY HYPERRESPONSIVENESS IN A MURINE MODEL OF AIRWAY SENSITIZATION. J. Exp. Med. 1996; 183:1719-1730.
  2. Hamelmann E , Oshiba A, Coffman R, Lee J, Larsen K, Gelfand E. ANTI-interleukin-5 antibody prevents airway hyperresponsiveness in a murine model of airway sensitization. Am. J. Crit. Care Resp. Med. 1997; 155: 819-825.
  3. Schwarze J., E Hamelmann , KL Bradley, K Takeda, EW Gelfand. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS INFECTION RESULTS IN AIRWAY HYPERRESPONSIVENESS AND ENHANCED AIRWAY SENSITIZATION TO ALLERGEN. J. Clin. Invest.1997; 100: 226-233.


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3.1.1  Das Modell der Atemwegs-Sensibilisierung

.1 Einführung

Der genaue Mechanismus der Entstehung von AHR ist unbekannt. Um Untersuchungen zum besseren Verständnis von Allergen-induzierten Veränderungen der Atemwegs-Funktion durchzuführen, sind Studien an Tiermodellen unerläßlich. Die Maus bietet sich hierfür wegen ihrer gut definierten Immunologie und dem Vorhandensein genetisch alterierter und gut charakterisierter Stämme besonders an. Die herkömmliche Methode zur experimentellen Sensibilisierung von Mäusen besteht in der systemischen Gabe von Allergen im Kontext mit Adjuvantien. Das Problem hierbei ist, dass Adjuvantien per se bereits zu Veränderungen der T-Zell- und anderer zellulärer Funktionen und zur Induktion von inflammatorischen Immunantworten führen können. Um diesen unspezifischen Effekt auszuschließen und um dem “normalen” Weg der Sensibilisierung mit inhalativen Allergenen, wie z.B. Pollen oder Hausstaubmilbenallergen, möglichst nahe zu kommen, wurde ein Modell der Atemwegs-Sensibilisierung etabliert. Hierbei werden die Mäuse durch repetitive Vernebelung von allergenhaltiger Lösung ohne den Zusatz von Adjuvantien sensibilisiert. Bei der Partikelgröße des Aerosols (>95 % der Partikel 1-2 µm) wurde beachtet, dass die kleinen und mittleren Atemwege der Maus erreicht werden. Bei der Festlegung des Sensibilisierungs-Protokolls wurden als Parameter eine möglichst hohe allergen-spezifische IgE-Produktion bei nur geringer IgG-Produktion und die Entwicklung von AHR gewählt.


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.2  Protokolle

1) Tiere:

Weibliche BALB/c Mäuse (Jackson) von 6 bis 12 Wochen Alter, keimfrei und mit OA-freier Nahrung gehalten.


2) Atemwegs-Sensibilisierung:

Die BALB/c Mäuse werden an 10 aufeinander folgenden Tagen täglich für 20 min in einer abgeschlossenen Plastikbox mit Allergen (OA 1% in PBS) vernebelt. Kontrollen wurden zu gleicher Zeit mit PBS vernebelt. Ein Tag nach Abschluß des Sensibilisierungs-Protokolls, am Tag 11, wurde die kutane Hypersensibilität nach intradermaler Applikation von Allergen getestet. Zwei Tage nach Abschluß des Sensibilisierungs-Protokolls, am Tag 12, wurden die Mäuse getötet und die Atemwegs-Funktion durch EFS von isolierten trachealen Segmenten bestimmt. Serumspiegel für Gesamt-IgE und IgG und allergen-spezifische Antikörper wurden per ELISA bestimmt (Abbildung 3.1.1).

Abbildung 3.1.1: Protokoll der Atemwegs-Sensibilisierung


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.3  Ergebnisse

1) Ig Produktion:

Atemwegs-Sensibilisierung durch das 10-Tage-Verneblungs-Protokoll mit OA-Aerosol führte zu signifikanter Produktion von allergen-spezifischem IgE (293 ± 29 EU) und IgG1 (1250 ± 330 EU), nicht jedoch zu anderen Isotypen. Der Serumspiegel von Gesamt-IgE und IgG wurde durch diese Form der Sensibilisierung nicht signifikant beeinflußt.


2) Kutane Hypersensibilität
:

Intradermale Injektion von OA ein Tag nach Abschluß der Atemwegs-Sensibilisierung führt in der Mehrzahl der Tiere (10/12) zu positiven Hautreaktionen innerhalb von 15 min. Bei den Kontrollen war bei keinem Tier eine positive Reaktion zu beobachten (0/8, p<0.01 vs OA). Dies spricht für das Vorliegen von spezifischer kutaner Hypersensibilität vom Soforttyp (ICH) nach Atemwegs-Sensibilisierung mit OA.


3) AHR:

2 Tage nach Abschluß des Sensibilisierungs-Protokolls wurde in vitro die AR durch EFS von isolierten trachealen Segmenten bestimmt. Verglichen wurden die Frequenzen, die zur halb-maximalen Kontraktion der glatten Muskulatur geführt hatten (ES50). Bei den Kontrolltieren (PBS) lagen die Werte bei 4.0 ± 0.3 Hz, bei den sensibilisierten Tieren (OA) bei 2.2 ± 0.4 Hz (p<0.01 vs PBS). Die signifikante Verminderung der Frequenzen, die zur halb-maximalen Kontraktion der glatten Muskulatur nach Stimulation mit EFS führten, in der Gruppe der Atemwegs-sensibilisierten Mäuse kann als Zeichen für die Entwicklung von AHR gedeutet werden.


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3.1.2  CD8 Depletion vor Atemwegs-Sensibilisierung

.1 Einführung

Die leukozytäre Infiltration der Atemwege wird als maßgebliche Voraussetzung für die Entwicklung von AHR angesehen. Hierbei kommt es besonders zur Akkumulation von Eosinophilen und T-Zellen. Es gibt zunehmende Hinweise für eine zentrale Rolle von T-Zellen bei der Ausbildung von allergischer Atemwegs-Entzündung und AHR. Zum ersten steht die bei allergischen Patienten beobachtete erhöhte IgE-Produktion unter der Kontrolle von T-Zell-Zytokinen, IL-4 und IL-13. Zum zweiten wird die Reifung, Differenzierung, Aktivierung und das Überleben von Eosinophilen, den maßgeblichen Effektorzellen der allergischen Entzündung, durch das T-Zell-Zytokin IL-5 wesentlich unterstützt. Entsprechend weisen CD4+ T-Helferzellen aus bronchialen Biopsaten oder broncho-alveolären Lavagen von asthmatischen Patienten erhöhte Werte von mRNA für die Produktion von Th2-Zytokinen IL-4 und IL-5 auf.

Im Gegensatz zur gut definierten Rolle von CD4+ T-Helferzellen bleibt die Rolle von CD8 T-Zellen in der allergischen Reaktion weniger klar. Ursprüngliche Beobachtungen verbanden eine verminderte T-Suppressorfunktion von CD8 Zellen mit der Entwicklung von allergischer Rhinitis, Dermatitis und Asthma bronchiale. So konnte eine Verminderung von peripheren CD8+ Suppressorzellen als mögliche Ursache bei Patienten mit Asthma und Rhinitis gefunden werden. Auf der anderen Seite wurde bei Patienten mit Asthma bronchiale eine Zunahme an CD8+ T-Zellen im peripheren Blut und der BAL beobachtet, und eine Infiltration von bronchialem Gewebe mit CD8+ Zellen wurde für verschiedene Tiermodelle beschrieben. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass separierte CD8+ Zellen von asthmatischen Patienten in vitro IL-5 produzieren und das Überleben von Eosinophilen verlängern. Jüngere Arbeiten unterstützen die Existenz von Th2-ähnlichen CD8+ Zellen, die IL-4, IL-5 und IL-10, nicht aber IFN oder IL-2 produzieren.

Ziel der vorliegenden Studie war, die Rolle von CD8+ T-Zellen bei der IgE-Produktion, eosinophilen Infiltration der Atemwege und Entwicklung von AHR bei allergisch sensibilisierten BALB/c Mäusen genauer zu definieren. Wir benutzten ein Modell der selektiven Depletion von CD8+ T-Zellen in vivo und in vitro sowie der [Seite 77↓]selektiven Rekonstitution von CD8-depletierten Tieren mit CD8 angereicherten oder depletierten Milzzellen. Wir zeigen hier, dass CD8 Zellen eine wesentliche Rolle für die Entwicklung von eosinophiler Atemwegs-Entzündung und AHR spielen und an der lokalen IL-5 Produktion durch PBLN maßgeblich beteiligt sind.

.2 Protokolle

1) Tiere:

Keimfreie weibliche BALB/c Mäuse im Alter von 3-12 Wochen.


2) CD8-T-Zell-Depletion in vivo:

3-4 Wochen alte Mäuse wurden in voller Narkose durch Absaugen des Thymus nach Eröffnung über medianen Längsschnitt am Hals thymektomiert (Tag - 23). Zwei Wochen später wurden die Mäuse ip mit 200 µl aus Aszites-Überstand des Hybridoms YTS 169 (Ratten IgG anti-Maus-CD8, ATCC) injiziert (Tag -9). Die Spezifität und optimale Verdünnung des Antikörpers wurden in vivo und in vitro bestimmt. Die Injektion wurde nach 3 und nach 6 Tagen wiederholt.

Kontrollen wurden zu den gleichen Zeitpunkten mit 0.2 mg von normalem Ratten IgG (Sigma) behandelt. In Vorversuchen wurde ein Effekt von Schein-Thymektomie ohne Antikörperbehandlung ausgeschlossen.

Die CD8-depletierten (CD8 depl) und die Kontrolltiere (OA ctrl) wurden 3 Tage nach der letzten Injektion über die Atemwege an 10 aufeinander folgenden Tagen (Tag 1-10) sensibilisiert und die Untersuchungen der AR 2 Tage nach Abschluß der Sensibilisierung (Tag 12) durchgeführt (Abbildung 3.2). Negative Kontrollen waren mit PBS schein-sensibilisierte Tiere (PBS ctrl).


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Abbildung 3.1.2: Protokoll der CD8-Depletion.

3) Transferversuche:

Aus Milzen von naiven, nicht-sensibilisierten Spender-Mäusen wurden über magnetische Partikel (Miltenyi) positiv die CD8+ T-Zellen selektioniert. Die selektionierte Fraktion enthielt in der FACS-Analyse > 95% CD8+ Zellen, die depletierte Fraktion < 1% CD8+ Zellen.

CD8-depletierte Mäuse wurden am Tag 8 des Sensibilisierungs-Protokolls mit 1 x 107 selektionierten CD8+ Zellen intravenös behandelt (CD8 trf). Kontrollen erhielten die gleiche Anzahl an CD8-depletierten Milzzellen zum gleichen Zeitpunkt.


4) CD8-T-Zell-Depletion in vitro :

PBLN-Zellen von nicht-CD8-depletierten Mäusen wurden nach Abschluß der Atemwegs-Sensibilisierung am Tag 12 vor in vitro Kultur zur Bestimmung der Zytokin-Produktion von CD8-Zellen in vitro depletiert.


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3.1.3  Anti-IL-5 Antikörper vor Atemwegs-Sensibilisierung

.1 Einführung

AHR ist ein kardinales Charakteristikum von Asthma bronchiale. Der genaue Mechanismus für die Entwicklung von AHR ist unbekannt, und viele Faktoren können daran beteiligt sein. Es gibt zunehmend Hinweise für eine maßgebliche Rolle von Eosinophilen bei der Ausbildung von erhöhter AR. Eosinophile finden sich vermehrt in bronchialen Biopsaten und Broncho-alveolären Lavagen von Patienten mit Asthma bronchiale, und die Anzahl der Eos korreliert mit dem Schweregrad der Erkrankung. Die eosinophile Entzündung wird mit der Produktion von IL-5 in Verbindung gebracht, dem wichtigsten Faktor für die terminale Differenzierung, Reifung und Aktivierung von Eos. Um den direkten Einfluß von IL-5 untersuchen zu können, wurden Tiermodelle eingesetzt. In Modellen von Meerschweinchen und Primaten konnten anti-IL-5 Antikörper die eosinophile Infiltration verhindern und die Entwicklung von AHR blockieren. In Maus-Modellen für AHR ist die Rolle von IL-5 umstritten. In zwei Studien wurden anti-IL-5 Antikörper bei allergensensibilisierten BALB/c Mäusen eingesetzt, aber trotz deutlicher Reduktion der allergischen eosinophilen Entzündung konnte kein Einfluß auf die Entwicklung von AHR gefunden werden, so dass von einem von Eosinophilie unabhängigen Mechanismus ausgegangen werden mußte. Im Gegensatz zeigen C57BL/6 Mäuse, die genetisch für die Produktion von IL-5 defizient sind, im Anschluß an allergische Sensibilisierung und Atemwegs-Provokation weder eosinophile Entzündung noch Entwicklung von AHR. Die Unterschiede der Ergebnisse könnten durch die zwei unterschiedlichen Mausstämme der Studien begründet sein, die einen differenten Mechanismus bei der Entwicklung von AHR nach sich ziehen könnten.

Ziel der folgenden Studie war, die Rolle von IL-5-vermittelter eosinophiler Infiltration der Atemwege bei der Entwicklung von AHR nach Atemwegs-Sensibilisierung von BALB/c Mäusen zu untersuchen. Weiter sollte der Einfluß der anti-IL-5 Antikörperbehandlung auf immunologische Reaktionen von T-Zellen (Proliferation, Zytokin-Produktion), B-Zellen (Ig Produktion) und Mastzellen (kutane Hypersensibilität) nach allergischer Sensibilisierung untersucht werden. Dies ist die Erstbeschreibung der wirksamen Verhinderung von eosinophiler Infiltration der [Seite 80↓]Atemwege und Entwicklung von AHR durch anti-IL-5 Antikörperbehandlung in allergensensibilisierten BALB/c Mäusen.

.2 Protokolle

  1. Tiere:
    Weibliche BALB/c Mäuse, 8 bis 12 Wochen alt, keimfrei und unter OA-freier Diät.

  1. Anti-IL-5-Antikörper-Behandlung:
    Je vier Mäuse pro Gruppe und Experiment wurden über 10 Tage über die Atemweg sensibilisiert. Die negativen Kontrollen erhielten statt OA PBS als Aerosol (PBS). Die Versuchsgruppe erhielt 100 µg anti-IL-5 Antikörper (Ratte-anti-Maus IgG, TRFK-5) in 200 µl PBS intravenös an den Tagen 4, 6 und 8 des 10-Tage-Sensibilisierungs-Protokolls (OA/ TRFK5). Gleichaltrige Mäuse in der positiven Kontrollgruppe erhielt gleiche Dosen von Normalem Ratten-IgG zu gleichen Zeitpunkten (OA/ IgG). AR wurde am Tage 12, 2 Tage nach Abschluß der Sensibilisierung, über EFS in vitro bestimmt (Abbildung 3.1.3).

Abbildung 3.1.3: Protokoll der anti-IL-5 Antikörperbehandlung .


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3.2  Ergebnisse im Modell der passiven Sensibilisierung

  1. Oshiba A, Hamelmann E , Takeda K, Bradley K, Loader J, Larsen G, and Erwin W. Gelfand. Passive Transfer of Immediate Hypersensitivity and Airway Hyperresponsiveness by Allergen-specific Monoclonal IgE and IgG1 but not IgG2a or IgG3 Antibodies in Mice. J. Clin. Invest. 1996; 97 (6): 1398-1408.
  2. Hamelmann E , Oshiba A, Schwarze J, Bradley K, Loader J, Larsen G, Potter T, Gelfand E. allergen-Specific IgE and IL-5 are essential for the development of airway hyper-responsiveness. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol.1997; 16: 674-682.
  3. Hamelmann E , Vella AT, Oshiba A, Marrack P, Gelfand EW. Allergic Airway Sensitization induces t-cell activation but not airway hyperresponsiveness in B-cell deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997;94:1350-1355.


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3.2.1  Passive Sensibilisierung mit IgE und IgG1

.1 Einführung

Es gilt als gesichert, dass die IgE-vermittelte Mastzell-Aktivierung der wesentliche Auslöser bei der Entstehung der allergischen (anaphylaktischen) Sofortreaktion darstellt, die bei weiterem Allergen-Kontakt in chronische Atemwegs-Entzündung und die Entwicklung von AHR übergehen kann. Der genaue Zusammenhang zwischen der IgE-vermittelten Sofortreaktion und der durch die Entzündung hervorgerufenen AHR ist jedoch unklar. Sowohl bei Patienten mit Asthma bronchiale als auch in Tiermodellen der AHR wird parallel zur IgE-Produktion die Entstehung von Asthmasymptomen bzw. AHR beobachtet, ohne dass dies einen kausalen Zusammenhang beweist. Um die Interaktion zwischen allergischen Immunreaktionen, ausgelöst durch allergen-spezifisches IgE (und IgG), mit der Entwicklung von erhöhter AR genauer untersuchen zu können, entwickelten wir B-Zell-Hybridome, die OA-spezifische Ig sezernieren. Durch passive Sensibilisierung mit anti-OA Antikörpern und nachfolgende Allergen-Provokation (intradermal, systemisch, inhalativ) konnte der Einfluß von allergen-spezifischem IgE und IgG-Subklassen auf die Entwicklung von Anaphylaxie und AHR untersucht werden. Die Studie zeigt, dass mehrfache Injektionen von anti-OA IgE oder IgG1, gefolgt von mehrfachen Allergen-Provokationen der Atemwege, zu Atemwegs-Entzündung und AHR führen.


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.2  Protokolle

  1. Tiere:
    Weibliche BALB/c Mäuse, 8 bis 12 Wochen alt, keimfrei und unter OA-freier Diät.

  1. Protokolle:
    Passive Sensibilisierung mit anti-OA IgE, IgG1, IgG2a oder IgG3 (2 µg in 200 µl PBS, iv) an den Tagen 1, 2 und 3 des Protokolls. Kontrollen erhielten gleiche Mengen von entsprechenden anti-TNP Ig-Subklassen zu den gleichen Zeitpunkten. Atemwegs-Provokation mit Allergen (OA 1% in PBS, 20 min tgl.) beginnend drei Tage nach der letzten Injektion, an den Tagen 6, 7 und 8. Messung von in vitro AR nach EFS von trachealen Segmenten 2 Tage nach der letzten Provokation, am Tag 10 des Protokolls (Abb. 3.2.1). Positive Kontrollen waren systemisch sensibilisierte und atemwegsprovozierte Mäuse (Protokoll siehe 3.3.1).

Abbildung 3.2.1: Protokoll der passiven Sensibilisierung mit anti-OA Ig


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3.2.2  Passive Sensibilisierung von Nacktmäusen

.1 Einführung

Es wird angenommen, dass die Produktion von allergen-spezifischem IgE ein zentraler Mechanismus bei der Entwicklung von AHR und Atemwegs-Entzündung darstellt. Erhöhte IgE Serumspiegel werden bei Patienten mit Asthma bronchiale gefunden und korrelieren mit dem Schweregrad der Erkrankung. In Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass die IgE-vermittelte Mastzell-Aktivierung für die Entwicklung von AHR und die Anwesenheit von IgE für die eosinophile Atemwegs-Infiltration Voraussetzungen darstellen. Diese eosinophile Infiltration wird wiederum als wesentliche strukturelle Voraussetzung für die Entstehung von AHR angesehen. Bislang ist es unmöglich, den Einfluß von und die Beziehung zwischen IL-5 und IgE-Produktion bei der Entstehung von AHR zu definieren. Im Rahmen der allergischen Sensibilisierung kommt es zu einer Th2-Antwort, die sowohl mit erhöhter IL-4 und IgE-Produktion als auch mit erhöhter IL-5-Produktion und eosinophiler Atemwegs-Entzündung einhergeht. Ziel der folgenden Studie war, die Notwendigkeit von T-Zellen, T-Zell-Produkte und allergen-spezifischem IgE für die Entstehung von AHR getrennt zu analysieren. Wir bedienten und athymischen, T-Zell-defizienten Nacktmäusen und der passiven Sensibilisierung mit allergen-spezifischem IgE, um die T-Zellantwort von der IgE-Produktion zu trennen. Wir zeigen, dass passive Sensibilisierung von athymischen Mäusen nicht zu AHR führt, obwohl allergische Sofortreaktionen wie die ICH möglich sind. Erst die zusätzliche Behandlung von passiv sensibilisierten athymischen Mäusen mit IL-5 vor den Atemwegs-Provokationen mit Allergen führt zu signifikanter eosinophiler Atemwegs-Entzündung und Entwicklung von AHR.


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.2  Protokolle

  1. Tiere:
    Weibliche BALB/c und T-Zell-defiziente, athymische, “nackte” BALB/c Mäuse (Jackson) im Alter von 8-12 Wochen, keimfrei und unter OA-freier Diät.

  1. Protokolle:
    Normale (BALB/ OA-IgE) und athymische (nu/ OA-IgE) Mäuse (3-4 pro Gruppe und Experiment) wurden passiv durch iv Injektion von anti-OA IgE (0.4 µg in 200 µl PBS) an den Tagen 1, 2 und 3 sensibilisiert. Kontrollen erhielten gleiche Mengen und Konzentrationen von anti-TNP IgE zu gleichen Zeitpunkten (BALB/ TNP-IgE). Gruppen von athymischen Mäusen wurden mit IL-5 (20 ng) zusätzlich zur passiven Sensibilisierung iv an den Tagen 1 bis 3 behandelt (nu/OA-IgE/IL-5) (Abbildung 3.2.2). Die passiv sensibilisierten Mäuse wurden, beginnend am dritten Tag nach der letzten Injektion, an den Tagen 6 und 7 des Protokolls mit OA als Aerosol (1% in PBS) jeweils für 20 min über die Atemwege provoziert. Eine positive Kontrollgruppe wurde über 10 Tage nach dem Protokoll der Atemwegs-Sensibilisierung behandelt. AR wurde zwei Tage nach der letzten Provokation, am Tag 9, durch EFS von trachealen Segmenten in vitro bestimmt.

Abbildung 3.2.2: Protokoll der passiven Sensibilisierung von Nackmäusen


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3.2.3  Passive Sensibilisierung von B-Zell-defizienten-Mäusen

.1 Einführung

Die allergische Reaktion bei atopischen Patienten ist durch die Produktion ungewöhnlich hoher Mengen an allergen-spezifischem IgE als Reaktion auf den Kontakt mit Umwelt-Antigenen gekennzeichnet. IgE Serumspiegel korrelieren mit der Prävalenz und der Schwere der Erkrankung bei Patienten mit Asthma bronchiale. Die IgE-vermittelte Mastzell-Aktivierung setzt einerseits im Rahmen der allergischen Sofortreaktion pro-inflammatorische Mediatoren, wie Histamin, PG und LT, frei; andererseits können Mastzellen aber auch Quelle von Th2-Zytokinene, wie IL-4 und IL-5, sein und so in die Regulation von IgE-Produktion und eosinophiler Entzündung eingreifen. Neben ihrer Rolle bei der IgE-Produktion haben B-Zellen jedoch eine zweite wichtige Funktion in der allergischen Reaktion. Über den niedrig-affinen IgE-Rezeptor, CD23, stellen B-Zellen wichtige Effektorzellen bei der IgE-vermittelten Anregung von T-Zellfunktionen dar. In vitro dienen sie der CD23-vermittelten Antigen-Fokussierung auf T-Zellen; in vivo zeigen CD23-defiziente Mäuse verminderte Anregung der Ig-Produktion nach IgE-Aktivierung, und anti-CD23-behandelte Tiere weisen verminderte IgE-Produktion und eosinophile Entzündung auf.

Um die Rolle von B-Zellen und IgE bei der Entwicklung von allergen-induzierter AHR und Atemwegs-Entzündung zu genauer untersuchen, führten wir aktive und passive Sensibilisierung in B-Zell-defizienten (BCD) Mäusen durch. Dies erlaubt, die Bedeutung von B-Zellen und allergen-spezifischem IgE für die allergische Reaktion getrennt zu definieren. Die folgend beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass Atemwegs-Sensibilisierung von BCD Mäusen zu signifikanter T-Zell-Aktivierung und eosinophiler Infiltration der Atemwege, nicht jedoch zu AHR führt. Passive Sensibilisierung mit allergen-spezifischem IgE stellte die Entwicklung von AHR wieder her, was auf die wesentliche Rolle von IgE für die Entstehung von erhöhter AR in diesem Modell der Sensibilisierung schließen läßt.


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.2  Protokolle

  1. Tiere:
    Weibliche B10.BR Mäuse (Jackson) im Alter von 8 bis 12 Wochen. B-Zell-defiziente (BCD) B10.BR Mäuse (µMt-/-) über fünf Generationen auf B10.BR Wildtyp zurück gekreuzt. Milzen und Lymphknoten der BCD wiesen <3% B220+ Zellen, der Wildtyp 70% B220+ in Milzen, >30% in Lymphknoten. Alle Mäuse keimfrei und unter OA-freier Diät.

  1. Sensibilisierung und Antikörperbehandlung:
    Normale (B10.BR/ OA) und BCD (µMt/ OA) Mäuse (3-4 pro Gruppe und Experiment) wurden über die Atemwege mit OA (1% in PBS) an 10 aufeinander folgenden Tagen sensibilisiert. Kontrollen erhielten PBS Aerosol (B10.BR/ PBS). In einer Gruppe erhielten die BCD anti-OA IgE (0.4 µg in 200 µl PBS) iv an den Tagen 4, 6 und 8 des 10-Tage Protokolls (µMt/ IgE) (Abbildung 3.2.3). Gleichaltrige Kontrollen erhielten gleiche Mengen anti-TNP IgE zu den gleichen Zeitpunkten. (In allen Untersuchungen ergaben sich keine Unterschiede zwischen OA sensibilisierten Mäusen mit oder ohne anti-TNP IgE Behandlung.) AR wurde in vitro nach EFS von trachealen Segmenten bestimmt.

Abbildung 3.2.3: Protokoll der passiven Sensibilisierung von B-Zell-defizienten Mäusen


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3.3  Ergebnisse im Modell der systemischen Sensibilisierung

  1. Hamelmann E. , J. Schwarze, K. Takeda, A. Oshiba, G.L. Larsen, C.G. Irvin, E.W. Gelfand. Noninvasive Measurement of Airway Responsiveness in Allergic Mice using Barometric Plethysmography. Am. J. Crit. Care Resp. Med. 1997;156:766-775.
  2. Hamelmann E , Vella AT, Kappler J, Marrack P, Gelfand EW . Development of eosinophilic airway inflammation and airway hyperresponsiveness requires interleukin-5 but not immunoglobulin E or B lymphocytes [see comments]. Am J Respir Cell Mol Biol 1999 Oct 1;21(4):480-489.
  3. Takeda K, Hamelmann E , Joetham A, Shultz L, Irvin C, Gelfand EW. DEVELOPMENT OF AIRWAY EOSINOPHILIA AND AIRWAY HYPERRESPONSIVENESS IN ALLERGEN-SENSITIZED MAST CELL DEFICIENT MICE. J. Exp. Med. 1997; 186: 449-454.
  4. Hamelmann E , Takeda K, Haczku A, Cieslewicz G, Shultz LD, Hamid QA, Xing Z, Gauldie J, and Gelfand EW. IL-5 but not IgE reconstitutes airway inflammation and hyperresponsiveness in IL-4 deficient mice. Am.J Respir.Cell Mol.Biol. 2000;23:327-334.
  5. Hamelmann E , Cieslewicz G, Schwarze J, Ishizuka T, Joetham A, Heusser C, Gelfand E. Anti-Interleukin 5 but not Anti-Immunoglobulin E Treatment Prevents Airway Inflammation and Hyperresponsiveness in a Mouse Model of Allergic Sensitization. Am. J. Crit. Care Resp. Med. 1999;160: 934-941.


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3.3.1  Das Modell der systemischen Sensibilisierung

.1 Einführung

Zwei generelle unterschiedliche Ansätze sind benutzt worden, um Veränderungen der Atemwegs-Funktion bei Mäusen feststellen zu können: die in vitro Messung der Kontraktilität der glatten trachealen Muskulatur nach EFS und die invasive in vivo Messung des Atemwegswiderstandes nach intravenöser Injektion von bronchokonstriktiven Stimuli. Beide Methoden haben ihre Limitationen. Die in vitro Technik korreliert gut mit allergischer Sensibilisierung und reflektiert wahrscheinlich eine Zunahme der Acetylcholin-Freisetzung aufgrund einer Fehlfunktion der muscarinen M2-Rezeptoren. Einflüsse der tiefen Atemwege, wie z.B. erhöhte Schleimproduktion, Ödematisierung oder Atemwegsumbau nach allergischer Sensibilisierung werden jedoch durch diese Methode nicht erfaßt. Die in vivo Technik setzt die Narkotisierung und Ventilation der Tiere voraus. Der Einfluß von Anästhesie und operativer Tracheostomie auf die Messung ist dabei schwer abzuschätzen. Weiterhin reflektiert die iv Gabe des Bronchokonstriktors kaum die physiologische Stimulation der glatten Atemwegs-Muskulatur. Schließlich ist die Technik sehr zeit- und arbeitsaufwendig und kann nur durch speziell ausgebildetes Personal unter erheblichem Aufwand durchgeführt werden.

Im folgenden werden die Ergebnisse einer Studie dargestellt, bei der Veränderungen der Atemwegs-Funktion erstmalig an nicht anästhesierten, spontan atmenden Mäusen nach allergischer Sensibilisierung und Atemwegs-Provokation mittels barometrischer Plethysmographie (WBP) gemessen werden. WBP weist dabei gegenüber den herkömmlichen Methoden mehrere Vorteile auf: es ist technisch nicht aufwendig, gestattet die Messung von AR nach Stimulation mit inhalativen Bronchokonstriktoren und erlaubt mehrfache und Langzeit-Messungen von AR für die Beurteilung von Kinetik und Behandlungsprotokollen der AHR. Da es sich bei WBP um eine indirekte, nicht invasive Messung handelt, müssen sorgfältige Versuche zur Validierung durchgeführt werden, bevor die Technik zur Bestimmung von AHR allgemein anerkannt werden kann. Der Einfluß der AHR der oberen Luftwege und von Atemfrequenz und AZV auf die Messungen in WBP mußten untersucht werden. Weiter mußte das Verhältnis von WBP zu der invasiven Messung des [Seite 90↓]Lungenwiderstandes bestimmt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass WBP eine valide und reproduzierbare Methode darstellt, erhöhte AR nach allergischer Sensibilisierung und Atemwegs-Provokation zu bestimmen.

.2 Protokolle

  1. Tiere:
    Weibliche BALB/c Mäuse (Jackson) im Alter von 8-12 Wochen, keimfrei und unter OA-freier Diät.

  1. Protokoll:
    Systemische Sensibilisierung (OA 20 µg in 2 mg Alum, ip.) an den Tagen 1 und 14, Atemwegs-Provokation mit Allergen (OA 1% in PBS, 20 min tgl.) an den Tagen 28, 29 und 30 (ipNeb). Kontrollen waren nicht-sensibilisierte, nicht provozierte (N), sensibilisierte, nicht provozierte (ip) und nicht-sensibilisierte, provozierte (Neb) Mäuse. Messung der in vivo AR durch barometrische Plethysmographie (WBP) nach Stimulation mit ansteigenden Dosierungen von MCh (3 - 50 mg/ml in PBS) 2 Tage nach der letzten Provokation, am Tag 32 (Abbildung 3.3.1).

Abbildung 3.3.1: Protokoll der systemischen Sensibilisierung


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3.3.2  Systemische Sensibilisierung von B-Zell-defizienten Mäusen

.1 Einführung

Wie unter 3.2.3.1 ausgeführt fällt den B-Lymphozyten als Produzenten von Ig und besonders IgE bei der allergischen Immunreaktion eine Schlüsselrolle zu. Um die Bedeutung von B-Zellen bei der Ausbildung von allergenstimulierter Atemwegs-Entzündung und in vivo AHR im Modell der systemischen Sensibilisierung zu untersuchen, wurden B-Zell-defiziente Mäuse eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die eosinophile Infiltration der kleinen und mittleren Atemwege und die Ausbildung von erhöhter AR nach Provokation mit MCh in normaler Höhe in vollständiger Abwesenheit von B-Zellen oder Ig entwickeln können.

.2 Protokolle

  1. Tiere:
    Weibliche normale B10.BR Mäuse (Jackson) und B-Zell-defiziente (BCD) B10.BR Mäuse (µMt-/-), im Alter von 8 bis 12 Wochen, keimfrei und unter OA-freier Diät.

  1. Protokoll:
    Systemische Sensibilisierung (OA 20 µg in 2 mg Alum, ip.) an den Tagen 1 und 14, Atemwegs-Provokation mit Allergen (OA 1% in PBS, 20 min tgl.) an den Tagen 28, 29 und 30 (ipNeb). Kontrollen waren nicht provozierte (ip) und nicht-sensibilisierte, provozierte (Neb) Mäuse. Messung der in vivo AR durch barometrische Plethysmographie (WBP) nach Stimulation mit ansteigenden Dosierungen von MCh (3 - 50 mg/ml in PBS) 2 Tage nach der letzten Provokation, am Tag 32.


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3.3.3  Systemische Sensibilisierung von Mastzell-defizienten Mäusen

.1 Einführung

Die Aktivierung von Mastzellen durch die Verknüpfung von mindestens zwei membranständigen hochaffinen IgE-Rezeptoren durch Bindung von spezifischem Allergen und IgE Antikörpern ist wesentlicher Bestandteil der allergischen Immunreaktion vom Typ-1 (Sofortreaktion). Die Freisetzung von Leukotrienen, Prostaglandinen und Histamin bewirkt die pathophysiologischen Veränderungen in der Folge eines Allergenkontaktes: Ödem, Hyperämie, Pruritus. Daneben spielt die Mastzelle aber auch als immunregulatorische Einheit eine Bedeutung. Mastzellen sind in der Lage, eine Vielzahl von Zytokinen de novo zu synthetisieren und dadurch auch auf die Funktion anderer Zellen Einfluss zu nehmen. Unter anderem wird diskutiert, ob und wie weit ortsständige Mastzellen in den Atemwegen als initiale IL-4 Produzenten für die Entwicklung der allergischen Immunreaktion, Atemwegs-Entzündung und AHR in der Lunge von Bedeutung sind. Wir untersuchten daher, ob die Gegenwart von Mastzellen Einfluß auf die Entwicklung von allergischer Sensibilisierung, eosinophiler Entzündung und AHR nehmen kann. Normale und Mastzell-defiziente Mäuse wurden im direkten Vergleich systemisch sensibilisiert und über die Atemwege mit Allergen provoziert. Gezeigt wird, dass alle gemessenen Parameter (IgE-Produktion, Th2-Zytokin-Produktion, eosinophile Infiltration, in vivo AR) bei den beiden Mausstämmen vergleichbare Ergebnisse aufzeigten. Die Gegenwart von Mastzellen ist in dem gewählten Modell für die Entstehung von Atemwegs-Entzündung und AHR also redundant.

.2 Protokolle

  1. Tiere:
    Weibliche normale W/W und Mastzell-defiziente W/Wv Mäuse (Jackson) im Alter von 8-12 Wochen, keimfrei und unter OA-freier Diät.

  1. Protokoll:
    Systemische Sensibilisierung und Atemwegs-Provokation mit OA. Messung der in vivo AR durch invasive Bestimmung von RL und Cdyn.


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3.3.4  Systemische Sensibilisierung von Zytokin-defizienten Mäusen

.1 Einführung

Das Vorhandensein von Mausstämmen, die für die Produktion ganz bestimmter Zytokine durch genetische Manipulation unfähig geworden sind, ermöglicht die genaue Analyse der Rolle einzelner Mediatoren bei pathologischen Mechanismen. Für die allergische Reaktion nehmen die Zytokine IL-4 - für die Induktion von IgE-Produktion, Adhäsionsmolekülen und Th2-Immunreaktion - und IL-5 - für die Differenzierung, Aktivierung und Lebensverlängerung von Eosinophilen - eine Schlüsselfunktion ein. Wir haben daher zunächst genetisch IL-4- und IL-5-defiziente mit normalen Mäusen hinsichtlich der Ausbildung von allergischer Sensibilisierung, Atemwegs-Entzündung und AHR verglichen. In einem zweiten Schritt wurden die defizienten Mäuse entweder mit allergen-spezifischem IgE oder mit cDNA für die Produktion des defizienten Zytokins über ein Vektorsystem (Adenovirus) rekonstituiert. Die Ergebnisse zeigen, dass bei den IL-4-defizienten Mäusen die allergen-spezifische IgE- und IgG1-Produktion fehlt. Zusätzlich bleiben sowohl bei IL-4- als auch bei IL-5-defitienten Mäusen die eosinophile Atemwegs-Entzündung und Entwicklung von in vivo AHR nach Sensibilisierung und Provokation mit Allergen aus. Beide Komponenten können durch die Rekonstitution von IL-5, nicht aber durch anti-OA IgE Gabe, bei IL-4-defizienten Mäusen wiederhergestellt werden. Dies verdeutlicht die herausragende Bedeutung der IL-5-vermittelten eosinophilen Entzündung und die relative Redundanz der IgE-Produktion für die Entstehung von AHR in diesem Modell.


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.2  Protokolle

  1. Tiere:
    Weibliche normale C57BL/6, IL-4-defiziente C57BL/6 (IL-4-/-) und IL-5-defiziente C57BL/6 (IL-5-/-) Mäuse (Jackson) im Alter von 8-12 Wochen, keimfrei und unter OA-freier Diät.

  1. Protokoll:
    Systemische Sensibilisierung (Tag 1 & 14) und Atemwegs-Provokation (Tag 28-30) mit OA. Rekonstitution mit anti-OA IgE (0,4 µg iv, Tag 26-28) oder Adenovirus-gekoppelter cDNA für IL-4 oder IL-5 (einmalig intranasal, Tag 26). Messung der in vivo AR durch invasive Bestimmung von RL und Cdyn (Tag 32).

Abbildung 3.3.2: Protokoll der Zytokin-Rekonstitution


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3.3.5  Anti-IL-5 und anti-IgE Antikörper Behandlung

.1 Einführung

Die Entwicklung von Allergen induziertem Asthma bronchiale ist durch die gleichzeitig erhöhte IgE-Produktion und Eosinophilie gekennzeichnet. In einer Studie an Mäusen wurde gezeigt, dass die Behandlung von sensibilisierten Mäusen mit nicht-anaphylaktogenem anti-IgE Antikörper nicht nur die erhöhten IgE Serumspiegel neutralisieren kann, sondern auch die TH2-T-Zellaktivierung und Zytokin-Produktion vermindert, so dass eine geringere Eosinophilie als bei Kontrolltieren ausgebildet wird. Weiter wurde für IgE eine unterstützende Funktion bei der Antigen-Fokussierung und T-Zell-Aktivierung, möglicherweise vermittelt über CD23, beschrieben. Wir untersuchten daher, ob die Behandlung von sensibilisierten Mäusen mit anti-OA IgE vor Atemwegs-Provokation mit Allergen Einfluß auf die Entwicklung von eosinophiler Entzündung und AHR nehmen kann. Der Effekt von anti-IgE wurde direkt verglichen mit dem einer anti-IL-5 Behandlung, die bei den Atemwegs-sensibilisierten Mäusen zur Reduktion von Atemwegs-Entzündung und Verhinderung von AHR geführt hatte. Hier wurde das Modell der systemischen Sensibilisierung gewählt, welches hohe IgE-Produktion und starke eosinophile Infiltration induziert. Gezeigt wird, dass anti-IgE Behandlung signifikant die IgE Serumspiegel vermindert und anaphylaktische Reaktionen unterdrückt, ohne Einfluß auf Atemwegs-Entzündung und AHR zu nehmen. Im Gegensatz werden durch anti-IL-5 Behandlung erfolgreich die eosinophile Atemwegs-Infiltration und die Entwicklung von erhöhter in vivo AR verhindert.


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.2  Protokolle

  1. Tiere:
    Weibliche BALB/c Mäuse (Jackson) im Alter von 8-12 Wochen, keimfrei und unter OA-freier Diät.

  1. Protokoll:
    Systemische Sensibilisierung und Atemwegs-Provokation mit OA. Messung der in vivo AR durch WBP. Anti-IgE Behandlung (1-5: 200 µg in 200 µl PBS, iv) und anti-IL-5 Behandlung (TRFK-5: 50 µg in 30 µl PBS, intranasal) an den Tagen 27, und 2 hrs vor jeder Atemwegs-Provokation an den Tagen 28 and 29.(Abbildung 3.3.2). Kontrollen erhalten gleiche Mengen an Ratte-anti-Maus Ig zu den gleichen Zeitpunkten.

Abbildung 3.3.3: Protokoll der anti-IgE und anti-IL-5 Behandlung


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27.08.2004