Kapitel 2. Erster Abschnitt: Untersuchungen genregulatorischer Mechanismen, die kardialem Wachstum zugrundeliegen

2.1 Entwicklung eines in vivo-Modells zur Analyse der Genregulation im Myokard

2.1.1 Einleitung

Bis vor kurzem wurde die Regulation der Genexpression in transienten Transfektions-Assays von Zellkulturen (Henderson et al., 1989; Kariya et al., 1991; LaPointe et al., 1988; Rosenzweig et al., 1991; Wu et al.,1989) und/oder durch Verwendung transgener Tiermodelle untersucht (Field, 1988; Rockman et al., 1991). Besonders im Falle terminal differenzierter Zellen wie den Kardiomyozyten war der Gebrauch kultivierter Zellen durch eine niedrige Transfektionseffizienz und durch die Schwierigkeit, eine genügend hohe Quantität primärer Zellen zu erreichen, beeinträchtigt. Letzteres insbesondere, da bisher keine phänotypisch geeignete Zellinie für Kardiomyozyten existiert. Diese Probleme sind besonders offensichtlich in Studien, die die Genexpression im Myokard zum Ziele haben, da die kultivierten Zellen nicht in ihrer natürlichen Umgebung gehalten werden. Aus diesen Gründen besteht eine große Notwendigkeit für alternative Ansätze zur Untersuchung der Regulation der Genexpression im Myokard.

Die Einschleusung exogener DNA in Keimzellen und die Züchtung transgener Tiere hat die Analyse

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Das Potential, nackte Plasmid-DNA, die direkt injiziert wurde, aufzunehmen und zu exprimieren, ist nicht auf den Skelettmuskel begrenzt. Kürzlich haben mehrere Arbeitsgruppen von der Möglichkeit der Expression von Plasmid-DNA, die ins Herz injiziert wurde, berichtet (Acsadi et al., 1991; Buttrick et al., 1992; Kitsis et al., 1991; Lin et al., 1990; Lompre et al., 1981). Hierbei scheint die Expression der injizierten DNA auf den Injektionskanal beschränkt zu sein (Buttrick et al., 1992; Lin et al., 1990) und nur eine geringe Anzahl von Zellen exprimieren das Transgen tatsächlich (Acsadi et al., 1991). Die Transfektionseffizienz scheint mit zirkulärer Plasmid-DNA höher zu sein als mit linearer (Buttrick et al., 1992). Außerdem bleiben die injizierten DNA-Fragmente episomal (Wolff et al., 1990).

Nagetiere unterscheiden sich wesentlich in ihrer kardiovaskulären Physiologie und Pathophysiologie vom Menschen. Dies betrifft die Herzfrequenz, das Muster kardialer kontraktiler Isoformen (Lompre et al., 1981; Lompre et al., 1984) und die Induktion des Isoform-Switches während der Myokardhypertrophie (Izumo et al., 1987; Lompre et al., 1979). Weiterhin sind große Säugetiere - insbesondere Hunde - das Modell der Wahl für physiologische Untersuchungen, obwohl kleine Säugetiere das Modell der Wahl für genetische und molekulare Analysen sind. Dieses und die Tatsache, daß die kardiale Physiologie zwischen Hunden und Menschen ähnlicher ist, macht diese Spezies das Tier der Wahl für die Analyse der Genregulation unter experimentellen Bedingungen, die physiologisch bedeutend sind und die relevante Einblicke in Expressionsmuster vorherrschend in Menschen liefern können.

Aus all diesen Gründen haben wir ein Modell entwickelt, indem wir durch Injektion von Plasmid-DNA in Hundeherzen die Genexpression in großen Säugern untersuchten.

2.1.2 Methoden

Reportergen-Plasmide

MSV-CAT wurde konstruiert durch Fusion der kodierenden Sequenz des Gens der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) (Gorman et al., 1982) an das long terminal repeat des Maus Sarcoma Virus (MSV). Rous Sarcoma Virus (RSV)-Luciferase wurde andernorts beschrieben (DeWet et al., 1987). -

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Präparation der Tiere und Injektion der Plasmid-DNA

Hunde wurden mit Xylazin (10 mg/kg i.m.) prämediziert; Vollnarkose wurde mit Thiamylal (10-20 mg/kg i.v.) erzielt und mit Halothan (0.5-1.5 % (Vol.)) aufrecht erhalten. Unter sterilen Operationsbedingungen wurde eine linkslaterale Thorakotomie im 5. Intercostalraum durchgeführt und das Perikardium freipräpariert. Das Perikard wurde eröffnet und der Apex des Herzens mit einer Naht verankert. Bis zu 30 4mm² große Dacron-Flicken wurden auf die epikardiale Oberfläche genäht und damit die Injektionsstellen markiert. Daraufhin wurde die in 1 x PBS aufgelöste Plasmid-DNA mit einer 30 Gauge Nadel lotrecht ins Epikard injiziert. Das Volumen der DNA-Lösung betrug - wenn nicht anders angegeben - jeweils 200 µl und die Konzentration der DNA 0.3 µg/µl für die CAT-Reporterkonstrukte und 0.075 µg/µl für das Kontrol-Luciferase-Reportergen. Die Konstrukte wurden den markierten Injektionsstellen zufällig zugeordnet, um mögliche regionale Unterschiede auszugleichen. Um für die Injektionseffizienz zu kontrollieren, wurde das Kontrol-Plasmid (RSV-Luciferase) stets mit den CAT-Konstrukten koinjiziert. Nach den Injektionen wurde die Wunde verschlossen. Nach der Operation wurden die Tiere für eine Weile in einem Aufwachraum observiert. Die Tiere vertrugen den Eingriff gut und Blutdruck und Puls wurden täglich bestimmt.

Präparation des Gewebes

Je nach Angabe wurden die Tiere nach einem Zeitraum von 3 bis 21 Tagen nach der Operation mit einer Überdosis Pentobarbital (50 mg/kg i.v.) getötet, das Herz rasch entfernt und in eiskalte Kochsalzlösung gelegt. Die markierten Injektionsstellen wurden als transmurale Blöcke herausgeschnitten und sofort in Flüssigstickstoff gelagert. Anschließend wurden die Gewebsproben bei -80° Celsius bis zur weiteren Präparation aufbewahrt. Direkt vor dem CAT-Assay wurden die Gewebsproben in jeweils 1 ml Homogenisierungspuffer ((25 mM Glycyl-Glycin, pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, pH 8.0, und 1 mM DTT) homogenisiert. Die Suspension wurde mit 6.000 g bei 4° Celsius für 15 Minuten zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der Überstand wurde auf den Proteingehalt durch entsprechende Verdünnung mit Homogenisierungspuffer normalisiert mittels Bradford-Assay (Bio-Rad Laboratories).

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CAT-Assay

Die CAT-Assays wurden durchgeführt wie von Seed und Sheen ursprünglich beschrieben (Seed and Sheen, 1988). Hierbei wurden 10% des für seinen Proteingehalt normalisierten Überstandes, 1 µL ¹⁴C-markiertes Chloramphenicol (0.25 mCi) und 5 µL n-Buturyl Coenzym A (5mg/mL) gemischt und auf ein Gesamtvolumen von 125 µL mit Puffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.0) aufgefüllt. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem Hitzeblock bei 37° Celsius für 2 Stunden inkubiert. Durch Zugabe von 300 µL Xylen wurde das acetylierte Chloramphenicol von der Suspension extrahiert. Aliquots von 200 µL wurden in einem Szintillationszähler (Beckman Instruments, Modell LS 6000IC) ausgezählt.

Luciferase-Assay

Der Luciferase-Assay wurde durchgeführt wie von Brasier et al. beschrieben (Brasier et al., 1989). Hierbei wurden 10% des für seinen Proteingehalt normalisierten Überstandes auf ein Volumen von 100 µL durch Zugabe des Homogenisierungs-Puffers (25 mM Glycyl-Glycin, pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, pH 8.0, und 1 mM DTT) gebracht und mit 360 µL Reaktions-Puffer (25 mM Glycyl-Glycin, pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, pH 8.0, 1 mm DTT, 15mM KPO4, pH 7.8, 2 mM ATP, 0.3% Triton X-100) vermischt. Unmittelbar nach Zugabe von 0.2 mM D-Luciferin zum Reaktionsgemisch wurde die Lichtemission in einem Luminometer bestimmt (1251 Luminometer, LKE Wallac, Turqu, Finnland). Dabei werden die Lichteinheiten dargestellt als Integral der Aktivität über 20 Sekunden. Nur Werte, die sich innerhalb des linearen Bereiches der Reaktion befanden, wurden für die Analyse verwandt.

Datenanalyse

Alle Daten sind dargestellt als Mittelwert + Standardfehler (SEM). Für die statistische Analyse der CAT-Werte über die Zeit und regional über den linken Ventrikel wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) angewandt. ANOVA wurde auch angewandt für den Vergleich zwischen den verschiedenen Promotor-Konstrukten und den verschiedenen Injektionstechniken. Wenn signifikant, so wurden Vergleiche zwischen den Gruppen mittels ungepaartem t-Test mit der Bonferroni-Angleichung durchgeführt. Lineare Regressionsanalyse wurde angewandt, um die Korrelation zwischen den CAT- und Luciferase-Aktivitäten in den Kotransfektionsexperimenten zu analysieren. Hierzu wurde das Programm Statview verwandt und ein p < 0.05 wurde als signifikant erachtet.

2.1.3 Ergebnisse

Die Expression von Genkonstrukten injiziert ins Myokard erfolgt nach einer Dosis-Wirkungs-Kinetik

Um die Effizienz und Kinetik der Expression intrakardial injizierter DNA zu bestimmen, wurde ein

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Abbildung 1: Dosis-Wirkungs Beziehung zwischen der Menge injizierter DNA und der CAT-Aktivität. Scatter-Plot der CAT-Aktivität pro Injektionsstelle versus Gesamtmenge der DNA (MSV-CAT) pro Injektionsstelle ist dargestellt. Verschiedene DNA-Konzentrationen wurden in einem konstanten Volumen von 200 µl injiziert. Die Mittelwerte (+ SEM) sind als schwarze Vierecke dargestellt (n = 4 für jede Dosis)

Das Ausmaß des durch die Injektion gesetzten Gewebstraumas korreliert nicht mit dem Grad der Genexpression

Drei verschiedene Injektionstechniken wurden in einem Experiment verglichen, um den Einfluß der injektions-bedingten Gewebsverletzung auf das Ausmaß der Genexpression zu untersuchen. Da es möglich wäre, daß die Ergebnisse auf der Aufnahme und Expression von Plasmid-DNA in nicht-muskulären Herzzellen beruht und damit keine Bedeutung für die Untersuchung der Biologie des

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Abbildung 2: Balkendiagramm zum Vergleich von drei verschiedenen Injektionstechniken. Eine Gesamtmenge von 50 µg -667-ßMHC-CAT wurde in jeder Gruppe injiziert. Mittelwerte + SEM (n = 10 in jeder Gruppe).

Promisköse und gewebsspezifische Reportergenkonstrukte werden über einen ausgedehnten Zeitraum exprimiert.

Um die Stabilität und den Spitzenwert der Expression injizierter rekombinanter Genkonstrukte im

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Abbildung 3: Balkendiagramm zur Darstellung des Zeitverlaufs der Expression injizierter Genkonstrukte. CAT-Aktivität aufgetragen gegen Zeit (Tage) nach Injektion für promisköse (MSV, schwarze Balken) und muskelspezifische (-667-ßMHC-CAT, schraffierte Balken) Promotoren (verglichen mit Tag 7, *p<0.01 für MSV und *p<0.0001 für -667-ßMHC-CAT nach ungepaartem t-Test). Mittelwerte + SEM (n = 5 für jeden Zeitpunkt).

Injizierte Reportergenkonstrukte werden gleichermaßen über die linksventrikuläre Myokardwand exprimiert.

Da es das Ziel dieser Arbeit war, ein praktisches Modell zu etablieren, das es erlaubt, die Expression verschiedener rekombinanter Genkonstrukte innerhalb desselben Individuums zu untersuchen, wurde nun die Expression eines bestimmten Konstruktes an verschiedenen Lokalisationen der linksventrikulären freien Myokardwand verglichen. Hierzu wurde -667-ßMHC-CAT an 24 verschiedenen Stellen des linken Ventrikels injiziert (Abb. 4). Zwischen diesen Lokalisationen waren

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Abbildung 4: Balkendiagramm zur Darstellung der regionalen Expressionswerte injizierter Genkonstrukte über den linken Ventrikel verteilt. A = anterior, AL = anterolateral, L = lateral, P = posterior. 24 Injektionen von -667-ßMHC-CAT mit 4 Reihen um den linken Ventrikel wurden durchgeführt, mit jeweils 6 Injektionsstellen von der Basis zum Apex (siehe Zeichnung). Mittelwert + SEM (n = 6).

CAT-Aktivität ist im linken Ventrikel etwa dreimal höher als im rechten Ventrikel

Ein weiterer Vorteil des Hunde- versus des Nagermyokards ist die Möglichkeit, auch Injektionen in den rechten Ventrikel vorzunehmen. Wie in der Abbildung 5 dargestellt, so betrug die Expression promisköser als auch gewebsspezifischer Promotorkonstrukte etwa ein Drittel im rechten Ventrikel gegenüber dem linken Ventrikel. Dies könnte auf der unterschiedlichen Wanddicke beruhen mit einer geringeren Anzahl von Zellen entlang dem Injektionskanal in der rechtsventrikulären Wand. Möglicherweise beruht dieser Unterschied aber auch auf der höheren Wahrscheinlichkeit, aufgrund der geringeren Wanddicke Plasmid-Lösung in die freie Herzhöhle zu verlieren.

Das Myokard exprimiert injizierte Reportergenkonstrukte ein bis zwei Größenordnungen höher als der Skelettmuskel

Um das Ausmaß der Expression zwischen dem Myokard und anderen Organen zu vergleichen und dadurch möglicherweise organspezifische Unterschiede der Expression exogener DNA festzustellen, injizierten wir promisköse (MSV-CAT) oder gewebsspezifische (ßMHC-CAT) Promotorkonstrukte in den M. quadriceps, einem Muskel mit gemischten Muskelfasertypen. Die in der Abbildung 5 dargestellten Werte sind dargestellt als Angabe des Prozentes der Expression desselben Konstruktes in der linksventrikulären Wand des Myokards. Beide Promotortypen wurden im Skelettmuskel ein

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Abbildung 5: Balkendiagramm zur Darstellung der Expression promisköser (MSV-CAT) oder muskelspezifischer (-667-rß-MHC-CAT) Promotorkonstrukte im rechten Ventrikel (RV) und im Skelettmuskel (Sk.M.). Die Angaben der Werte zeigen den Prozentwert der Expression im Vergleich zum linken Ventrikel an (100%, schwarze Balken). Weiße Balken für RV (n = 10 für MSV-CAT, n = 8 für -667-ßMHC-CAT), schraffierte Balken für Sk.M. (n = 10 für MSV-CAT, n = 9 für -667-ßMHC-CAT).

Koinjektion eines Kontroll-Reportergenkonstruktes (RSV-Luciferase) erweist sich als sinnvoll, um für die Transfektionseffizienz zu kontrollieren.

Kotransfektion wird bei in vitro-Transfektions-Assays verwandt, um für die Transfektionseffizienz zu kontrollieren. Aber auch bei in vivo-Modellen wird Kotransfektion angewandt (Kitsis et al., 1991; Parmacek et al., 1992). Seine Nützlichkeit hierfür wurde aber noch nie untersucht. Dabei wäre es aber von besonderer Bedeutung, da in in vivo-Modellen im Gegensatz zu Zellkultur-Modellen ein heterogener Zellpool vorliegt und dadurch - je nach Promotorkonstrukt - sehr unterschiedliche Expressionswerte resultieren könnten. Zwei repräsentative Experimente wurden auf die Korrelation zwischen CAT- und Luciferase-Werten in diesem Modell untersucht (Abb. 6). In einem Experiment war das muskelspezifische -667-ßMHC-CAT-Konstrukt mit dem RSV-Luciferase-Konstrukt koinjiziert worden (Abb. 6A). Das LTR (long terminal repeat) des RSV-Promotors funktioniert wie ein promisköser Promotor in allen Geweben mesodermalen Ursprungs (Overbeck et al., 1986; Swain et al., 1987). Hier war die Korrelation zwischen den CAT- und den Luciferase-Werten signifikant (r² = 0.8, slope = 0.8 + 0.2, p < 0.01). Wenn das promisköse MSV-CAT- Konstrukt mit RSV-Luciferase koinjiziert wurde, war die Korrelation zwischen den CAT- und den Luciferase-Werten ebenfalls

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Abbildung 6: Korrelation zwischen CAT- und Luciferase-Aktivität in Koinjektionsexperimenten. Scatter-Plots der CAT-Aktivität versus Luciferase-Aktivität (Lichteinheiten) sind dargestellt. 100 µg eines promiskösen (MSV-CAT, obere Abbildung) oder eines gewebsspezifischen (-667-ßMHC-CAT, untere Abbildung) Promotorkonstruktes wurden mit 20 µg eines Kontrolgenkonstruktes (RSV-Luc) koinjiziert. Die Regressionsfunktionen sind angegeben.

Injektion von Reportergenkonstrukten ins Myokardium des Hundes ist ein nutzvolles Modell zur Identifizierung regulatorischer Gensequenzen in vivo.

Nachdem all die wichtigen prinzipiellen Parameter, die die Expression injizierter Reportergenkonstrukte im Myokard beeinflussen könnten, charakterisiert waren, wurde die

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Abbildung 7: Balkendiagramm mit der Darstellung des Promotor-Mappings der 5´-flankierenden Region des ß-MHC-Promotors. Eine Serie von Deletionen der Promotorregion von -3300 bis -186 wurden als CAT-Konstrukte ins Myokard injiziert. Die CAT-Werte wurden für die Expression des koinjizierten Kontrollreportergens (RSV-Luc) normalisiert. Mittelwerte + SEM (n = 6-10).

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2.1.4 Diskussion

Diese Untersuchung belegt, daß nackte Plasmid-DNA ins Hundemyokard ohne unerwünschte Nebeneffekte injiziert werden kann. Postoperativ über mehrere Tage ununterbrochen durchgeführtes elektrokardiographisches Monitoring und intraarterielle Blutdruckkontrollen in mehreren Hunden zeigten außer transienten Tachyarrhythmien in der ersten 1-2 Stunden postoperativ keine Nebenwirkungen der kardialen Injektionen. Weiterhin ist die Effizienz der Expression der injizierten Reportergene vergleichbar mit anderen in vitro-Transfektionsmodellen.

Die ersten Experimente adressieren wichtige Parameter der Injektionstechnik. Die Resultate belegen, daß die Expression der injizierten Konstrukte dosisabhängig erfolgt und oberhalb einer Konzentration von 200 µg einer Sättigungskinetik unterliegt. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Injektion von Plasmid-DNA in den Skelettmuskel von Mäusen erzielt (Wolff et al., 1990). Die Analyse des Zeitverlaufs der Expression der injizierten Konstrukte ergab, daß sie mit Resultaten anderer Studien übereinstimmen, obwohl diese an kleinen Säugetieren durchgeführt worden waren (Buttrick et al., 1992; Wolff et al., 1990). Der genaue Grund für die Abnahme der CAT-Aktivität nach bereits 7 Tagen ist unklar, aber Acsadi et al. vermuten, daß injizierte Plasmid-DNA aufgrund ihrer episomalen Lokalisation relativ rasch degradiert wird (Acsadi et al., 1991). Alternativ wäre zu bedenken, daß eukaryote Zellen, die in vivo CAT exprimieren, aufgrund immunologischer Prozesse eliminiert werden. Diese Hypothese wird durch Experimente jüngeren Datums gestützt, die an immunsupprimierten Mäusen durchgeführt wurden und eine gegenüber normalen Tieren verlängerte Expression von Luciferase-Reportergenkonstrukten aufweisen (Acsadi et al., 1991). Ergebnisse von transgenen Tieren zeigen ebenfalls die Aktivierung immunologischer Prozesse durch die Expression von Transgenen (Tang et al., 1992). Dennoch, verschiedene Arbeiten konnten eine Expression bis zu 19 Monaten in Nagetieren nach Injektion von Plasmid-DNA in den Skelettmuskel (Wolff et al., 1992), bzw. bis zu 60 Tagen nach Injektion ins Myokard von Ratten (Buttrick et al., 1992) nachweisen.

Die Möglichkeit lokaler Unterschiede in der Expression ins Myokard injizierter Reportergenkonstrukte war bisher nicht untersucht worden, hauptsächlich aufgrund der geringen Größe der verwandten Spezies. In der vorliegenden Arbeit fanden wir keine regionalen Unterschiede in der Expression injizierter Reportergenkonstrukte. Dies bedeutet die Möglichkeit der Injektion mehrerer Konstrukte in ein Herz, was ein Vorteil gegenüber kleineren Versuchstieren bedeutet, bei denen eine große Anzahl von Tieren erforderlich ist, um statistische Signifikanz zu erreichen (Wolff et al., 1991).

Die histologische Zuordnung der Expression injizierter Reportergenkonstrukte wurde entweder

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Sowohl promisköse, als auch gewebsspezifische Promotorkonstrukte wurden im Skelettmuskel deutlich geringer als im Myokard exprimiert. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit einer anderen Arbeit, in der eine etwa 20-fach geringere Expression von RSV-Luciferase im Skelettmuskel der Ratte im Vergleich zum Myokard beobachtet werden konnte (Kitsis et al., 1991). Der Grund hierfür ist unklar und Grundlage für Spekulationen. So könnte beispielsweise die rhythmische Kontraktion des Myokards mit der einhergehenden Veränderung der Wandspannung oder andere neurohumorale regionale Unterschiede als Erklärung für diese organspezifischen Unterschiede dienen. Auch der Unterschied in der Struktur zwischen dem Tubulussystem des Skelettmuskels und dem Myokard könnte unterschiedliche Effizienz der Aufnahme der Plasmid-DNA bedeuten. Bezüglich der Expression des gewebsspezifischen ßMHC-Konstruktes wäre auch der Unterschied des jeweiligen intrazellulären Vorkommens dieses kontraktilen Proteins eine mögliche Erklärung für unterschiedliche Expressionswerte (Izumo et al., 1986). Jedenfalls sind noch weitere Arbeiten in dieser Richtung erforderlich, um diese Frage entgültig zu klären.

Die Ergebnisse des Promotor-"Mappings" durch in vivo-Geninjektion ins Myokard sind in Übereinstimmung mit Transfektions-Assays von Zellkulturen mit Herzmuskel- oder Skelettmuskelzellen (Thompson et al., 1991) und belegen die Nützlichkeit dieses Modells für die Identifizierung regulatorischer Gensequenzen unter physiologischen in vivo-Bedingungen und möglicherweise die Anwendung dieses Modells zur Untersuchung der Regulation der Genexpression unter pathophysiologischen Bedingungen.

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2.2 Identifizierung des cis-regulatorischen Elements, das die Induktion des ANF-Gens bei der Myokardhypertrophie vermittelt

2.2.1 Einleitung

Hypertrophie des Myokards ist der primäre kompensatorische Mechanismus auf verstärkte hämodynamische Belastung, jedoch sind die zugrundeliegenden Mechanismen noch weitgehend unklar. Es ist anzunehmen, daß ein besseres Verständnis dieser Prozesse durch Studien gewonnen werden kann, die sich mit molekularen Mechanismen der initialen Antwort des Myokards auf die Druck- oder Volumenbelastung beschäftigen. Das Gen des atrialen natriuretischen Faktors (ANF) ist in der Vergangenheit extensiv untersucht worden und wird bekannterweise bei Myokardhypertrophie induziert. Während der embryonalen Entwicklung wird das ANF-Gen sowohl in den Vorhöfen, als auch in den Ventrikeln des Herzens exprimiert (Bloch et al., 1986). Kurz nach der Geburt wird die Expression in den Ventrikeln herunterreguliert und die Vorhöfe bleiben der primäre Ort der kardialen ANF-Synthese des differenzierten Myokards (Wu et al., 1988). Induktion einer ventrikulären Hypertrophie ist charakterisiert durch die Reexpression von ANF in ventrikulären Zellen als Merkmal einer Aktivierung eines embryonalen Genexpressionsprogramms im hypertrophierenden Myokard (Arai et al., 1988; Drexler et al., 1989; Edwards et al., 1988; Lee et al., 1988). Die Induktion der ANF-Expression ist ein hoch konserviertes Merkmal der Myokardhypertrophie und kann in einer Vielzahl verschiedener Spezies beobachtet werden wie bei der Maus, der Ratte, Hamstern, Hunden und Menschen (Drexler et al., 1989; Edwards et al., 1988; Hasebe et al., 1995; Izumo et al., 1988; Knowlton et al., 1995; Rascher et al., 1985). Verschiedene Stimuli zeichnen sich dafür verantwortlich einschließlich verschiedener Hormone, genetische Prädisposition, arterielle Hypertonie und Druck- und Volumenbelastung (Arai et al., 1988; Drexler et al., 1989; Edwards et al., 1988; Hasebe et al., 1995; Lee et al., 1988).

Versuche wurden bereits unternommen, die cis-agierenden regulatorischen Elemente, die für die Induktion der Immediate Early Genes und embryonaler Gene - einschließlich des ANF-Gens - bei der Myokardhypertrophie verantwortlich sind. Viele dieser Studien waren auf transiente Transfektions-Assays kultivierter kardialer Zellen beschränkt (Kariya et al., 1993; Kariya et al., 1994; Matsubara et al., 1988; McBride et al., 1993; Sadoshima and Izumo, 1993; Simpson, 1983; von Harsdorf et al., 1988; von Harsdorf et al., 1989; Zhu et al., 1991). Darauf basieren Spekulationen, daß die transiente Aktivierung verschiedener Proto-Onkogene, wie sie bei der Induktion der Myokardhypertrophie beobachtet werden kann, in die Aktivierung von Genen wie dem des ANF´s involviert sein könnte (Izumo et al., 1988; Rosenzweig et al., 1991). Allerdings stellen weder isolierte primäre Kardiomyozytenpräparationen, noch die isolierte working heart-Präparation ein geeignetes Modell zur Untersuchung der molekularen Prozesse, die zur Ausbildung der Myokardhypertrophie führen, dar. Die wiederholte Beobachtung der Induktion der ANF mRNA von normalerweise nicht nachweisbaren Konzentrationen bei normalem Myokard zu deutlich meßbaren Konzentrationen bei der Myokardhypertrophie legt nahe, daß transkriptionelle Prozesse dabei eine entscheidende Rolle

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Im folgenden Abschnitt der Arbeit wurde deshalb das unter 2.1. beschriebene Modell benutzt, bei dem Plasmid-DNA intrakardial injiziert wird, um cis-agierende Elemente im ANF-Gen zu identifizieren, die für die Induktion dieses Genes bei Myokardhypertrophie verantwortlich sind. Ein besonderes Merkmal dieser Arbeit ist die Verwendung eines Tiermodelles mit einer Methode der Induktion akuter Druckhypertrophie bei großen Säugetieren. Dies ist insbesondere von Bedeutung, da sich kleine und große Säuger hinsichtlich der biochemischen und hämodynamischen Eigenschaften des Myokards teils erheblich unterscheiden. Durch Injektion von Plasmid-DNA direkt ins Myokard sollten folgende Fragen geklärt werden:

1. ist die Expression von ANF durch Druckhypertrophie aktivierbar?
2. welches ist das cis-agierende regulatorische Element, das die Induktion des ANF-Gens bei der Druckhypertrophie vermittelt?
3. ist das entsprechende cis-regulatorische Element in der Lage, die Induzierbarkeit auf einen heterologen Promotor zu übertragen?

2.2.2 Methoden

Reportergen-Plasmide

Die neben den unter 2.1.2 beschriebenen Reportergen-Plasmiden in dieser Arbeit verwandten Konstrukte sind in Abbildung 8 dargestellt. -3400-ANF-CAT wurde von Frau Dr. Christine Seidman (Boston, U.S.A.) freundlicherweise zur Verfügung gestellt und enthält die 5´-flankierende Region des ANF-Promotors der Ratte, die von der Nukleotidsequenz -3400 bis zu +61 reicht und in die BamHI-Stelle des pO-CAT Vektors kloniert wurde (Seidman et al., 1988). Hind-ANF-CAT wurde durch eine Deletion eines 556 bp HindIII-Fragmentes (Nukleotidsequenz -693 bis -137) des -3400-ANF-CAT Konstruktes hergestellt. DAP1-ANF-CAT enthält eine AP1-Stelle (Position -496 bis -489), die von 5´-ATGAATCA-3´ zu 5´-AGGTACCT-3´ (Sequenz des sense-Stranges) mutiert wurde, wodurch eine singuläre KpnI Restriktionsstelle in den ANF-Promotor eingeführt wurde. CRE-ANF-CAT wurde hergestellt durch Mutation des cAMP regulatory element (CRE) des ANF-Promotors (Position -602 bis -596) von 5´-TGACTTCA-3´ zu 5´-TGGTACCG-3´ (Sequenz des sense-Stranges), wodurch ebenfalls eine singuläre KpnI-Stelle in den ANF-Promotor eingeführt wurde.

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Abbildung 8: A, Schema der verschiedenen Promotorkonstrukte: Wild-Typ (-3400-ANF-CAT), Deletion (Hind-ANF-CAT) und Mutation (AP1-ANF-CAT und CRE-ANF-CAT) des ANF-Promotors und die heterologen Promotorkonstrukte. H, HindIII-Schnittstelle. Schraffierte Bereiche: deletierte und mutierte Sequenzen. Schwarze Bereiche: ßMHC-Promotorsequenzen. Die angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Nukleotidposition relativ zur Transkriptionsstartstelle. B. Aktuelle Sequenzen des Wildtyps und des mutierten ANF-Promotorkonstruktes (sense-Strang) an den angegebenen Stellen des ANF-Promotors, in die eine singuläre KpnI-Schnittstelle eingeführt wurde, sowie Darstellung der Sequenz der heterologen Promotorkonstrukte (sense-Strang). n = 15, ist eine zufällige Sequenz von 15 Nukleotiden (5´-TTAAATTTGAGAAAG-3´), die die beiden regulatorischen Elemente trennte.

Die heterologen Promotorkonstrukte wurden durch die Insertion synthetisch hergestellter doppelsträngiger Oligonukleotide (Applied Biosystems) konstruiert, die die jeweiligen regulatorischen Elemente in tandem enthielten, inseriert in die Polylinkerregion oberhalb des ßMHC-Fragmentes des -147-ßMHC-CAT Plasmids, das den basalen Promotor (Sequenz -147 bis +34) des Rattengens der ßMHC fusioniert mit dem CAT-Gen des pO-CAT Vektors enthält. AP1-147-ßMHC-CAT enthält die ANF-AP1-Stelle (5´-ATGAATCA-3´) in tandem separiert durch 15 zufällige Nukleotide (die identische zufällige Nukleotidsequenz 5´-TTAAATTTGAGAAAG-3´ wurde in allen heterologen Promotorkonstrukten zwischen den in tandem inserierten Bindungsstellen verwandt) inseriert in eine SphI-Restriktionsstelle des Polylinkers oberhalb des -147-ßMHC-Fragmentes. CRE-147-ßMHC-CAT enthält die CRE-Sequenz des Ratten-ANF-Promotors (5´-TGACTTCA-3´) in tandem separiert durch die genannten 15 zufälligen Nukleotide und inseriert in das -147-ßMHC-Promotorkonstrukt an der gleichen Stelle wie die ANF-AP1-Sequenz. SRE-147-ßMHC-CAT enthält die SRE-Sequenz des c-fos Promotors der Maus (5´-CCATATTAGG-3´) (Grueneberg et al., 1992),

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Gezielte Mutagenese mittels PCR

Die Mutationen relevanter regulatorischer Elemente des ANF-Promotors (AP1-, CRE-Element) wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt. Die Reaktion wurde durchgeführt mit dem herausgeschnittenen 556 bp messenden HindIII-Fragment des -3400-ANF- Promotors als Reaktionsschablone, das sowohl die AP1-, als auch die CRE-Bindungsstelle enthielt. Die PCR wurde durchgeführt in einem Perkin Elmer Gene Amp. 9600 Apparat über 25 Zyklen mit den Reaktionsbedingungen bei 94° Celsius für 1 Minute, 55° Celsius für 1 Minute und 65° Celsius für 30 Sekunden. Die Konstruktion wurde in zwei PCR-Schritten durchgeführt. Zunächst wurde die 5´-flankierende Sequenz neben der AP1-, bzw. CRE-Stelle amplifiziert unter Verwendung eines Vorwärts-Primers, der eine flankierende HindIII-Schnittstelle enthielt, und einem Revers-Primer, der eine flankierende KpnI-Schnittstelle enthielt. Dann wurde die 3´-flankierende Sequenz in direkter Nachbarschaft zu den jeweiligen regulatorischen Sequenzen amplifiziert, wobei ein Vorwärts-Primer mit einer KpnI-Schnittstelle und ein Revers-Primer mit einer HindIII-Schnittstelle verwandt wurde. Nach Verdau der PCR-Produkte mit KpnI wurden beide Produkte ligiert und formten nun ein 556 bp-Fragment, das homolog war zum ANF 556-HindIII-Fragment mit Ausnahme einer singulären KpnI-Schnittstelle anstelle der jeweiligen regulatorischen Elemente. Das Ligationsprodukt wurde mit HindIII verdaut und in die HindIII-Stelle des -3400-ANF-Promotorkonstruktes reinseriert. Die Richtigkeit der Sequenz dieser Konstrukte wurde mittels Sequenz-Analyse bestätigt.

Präparation der Tiere, Erzeugung eines Druckgradienten, Injektion der Plasmid-DNA

Hunde wurden präpariert wie unter 2.1.2 beschrieben. Nach den Injektionen wurde die Wunde verschlossen (Sham-operierter Gruppe). In der Gruppe mit Induktion einer Druckbelastung wurde direkt nach Injektion der Plasmid-DNA ein Druckgradient in der aorta ascendens durch Anschlingen mit einer Teflon-Bandage erzeugt. Proximal und distal der Bandage wurde der Druck über einen an einen Druckaufnehmer (Transducer von Statham Instruments) angeschlossenen Katheter invasiv gemessen. Durch leichtes Anziehen der Bandage wurde ein Druckgradient von 59 + 5.8 mmHg intraoperativ eingestellt (siehe Abb. 9). Nach der Operation wurden die Tiere für eine Weile in einem Aufwachraum observiert. Die Tiere vertrugen den Eingriff gut und Blutdruck, Puls und aortaler Gradient wurden täglich bestimmt.

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Abbildung 9: Darstellung der Technik der intrakardialen Geninjektion mit aortic banding und des ventrikulo-aortalen Gradienten eines chronisch instrumentierten Hundes 1 Woche nach Operation (der Gradient betrug ca. 90mmHg).

Präparation des Gewebes, CAT-Assay, und Luciferase-Assay

Diese Schritte erfolgten wie unter 2.1.2 beschrieben.

Präparation nukleärer Extrakte

Gewebsproben von 8 Hundeherzen (vier sham-operierte und vier mit 7 Tagen Druckbelastung) wurden präpariert wie von Deryckere und Gannon beschrieben (Deryckere and Gannon, 1994).

Proben

Die Sequenz der Proben zur Verwendung in der Gel-Shift-Analyse (GMSA) stammen alle von der 5´-flankierenden Region (-506 bis -483) des ANF-Promotors ab (EMBL/GenBank/DDBJ Zugangs-No. J03267). Die verwandten Proben wurden aus einzelsträngigen Oligonukleotiden hergestellt, die durch Hybridisierung doppelsträngig gemacht wurden und deren Enden mit Klenow-Fragmenten gefüllt wurden. Mittels T4-Polynukleotid-Kinase wurden die Proben radioaktiv markiert. Im Nachfolgenden werden die Wildtyp-ANF-Sequenzen in Großbuchstaben dargestellt. Klein geschriebene fette Buchstaben signalisieren Nukleotidveränderungen innerhalb der mutierten Proben und der AP1-Konversions-Probe. Die AP1-Konsensus-Probe wurde bei Santa Cruz Biotechnology erworben. Die Sense-Sequenzen waren folgendermaßen:

ANF-Probe: 5´-gatctACGAGGCCAATGAATCAGGTGTGActaga-3´;

mutierte Probe: 5´-gatctACGAGGCCAAgGtAcCaGGTGTGActaga-3´;

AP1-Konversions-Probe: 5´-gatctACGAGGCCAATGAcTCAGGTGTGActaga-3´;

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Gel-Shift-Assay (GMSA)

Die Assay-Bedingungen wurden erarbeitet, um optimale Bindung für beide Proben - die ANF-Probe und die AP1-Konsensus-Probe - zu erreichen und lehnen sich an andere Arbeiten an, die GMSA mit AP1-Proben durchgeführt haben (Allegretto et al., 1990; Argentin et al., 1994; Nakabeppu et al., 1988; Rauscher et al., 1988; Rosenzweig et al., 1991). Der Bindungspuffer bestand aus 50 mM Tris-HCl, pH 7.9, 2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA und 5% Glycerol. Die auf Eis aufgetauten Kernextrakte wurden mit den Bindungspuffer gemischt, 200 ng polydIdC zugegeben und in einem Endvolumen von 20 µl bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Nun wurde die radioaktiv markierte Probe zugegeben und das Gemisch für weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Davon wurden nun 15 µl auf ein 4%-Polyacrylamid-Gel geladen (0.5 x TBE). Danach wurden die Gele vakuumgetrocknet und einem Kodak-Film exponiert. Bei den Kompetitionsexperimenten wurde die unmarkierte Kompetitor-Probe direkt vor Zugabe der markierten Proben dem Gemisch zugegeben. Für die Supershift-Experimente wurden Antikörper verwandt, die spezifische konservierte Epitope der jeweiligen Protein-Familie von Jun (SC-44X, Santa Cruz) oder Fos (SC-47X, Santa Cruz) erkennen. 10 Minuten nach Inkubation mit der markierten Probe wurden 4 µg des jeweiligen Antikörpers (oder Präimmun-Serum) zugegeben und das Gemisch wurde nun bei 4° Celsius für weitere 4 Stunden inkubiert, bevor es auf das Gel geladen wurde. In den Experimenten, in denen der Antikörper peptid-neutralisiert wurde, wurde der Antikörper mit dem Peptid (SC-44P, Santa Cruz) über Nacht bei 4° Celsius inkubiert.

Experimentelles Design und Datenanalyse

10 erwachsene Mischlinge mit einem Gewicht von 22-26 kg wurden für die Injektionsexperimente benötigt. Sie wurden 2 Gruppen mit jeweils 5 Hunden zugeordnet, davon erhielt eine Gruppe aortic banding, die andere Gruppe wurde sham-operiert. Die Injektionen wurden jedesmal in einem Paar von Hunden vorgenommen (1 x sham-operiert und 1 x aortic banding) und die Ergebnisse direkt miteinander verglichen. In jedem Experiment wurde das -3400-ANF-CAT Konstrukt als Positivkontrolle injiziert. Die Daten werden angegeben als CAT/Luciferase Verhältnis, um für die Injektionseffizienz zu kontrollieren. Das n bezieht sich auf die Anzahl der Injektionen eines jeweiligen Konstruktes pro Tier. Die Variabilität der Expressionswerte betrug 15% in beiden Gruppen (gemessen an den Werten von -3400-ANF-CAT).

2.2.3 Ergebnisse

Tiermodell der akuten Druckhypertrophie

Die Plasmid-DNA wurde intraoperativ in Hundeherzen injiziert und direkt anschließend ein aortaler

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Tabelle 1: Hämodynamik und Morphologie

Injizierte ANF-Reportergenkonstrukte werden im Myokard mit akuter Druckhypertrophie transaktiviert.

Promotorkonstrukte mit konstitutiv aktiven viralen Promotoren (MSV-CAT oder RSV-Luc) wurden in hohem Maße sowohl in normalem, als auch in hypertrophierendem Myokard exprimiert (siehe Tabelle 2).

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Tabelle 2: Relative Expression von verschiedenen Reportergenkonstrukten in sham-operierten Hunden und Hunden mit aortic banding.. Experimentelles Design ist unter Methoden beschrieben.

Das Ausmaß der Expression wurde durch die Druckhypertrophie nicht beeinflußt (CAT/Luc Verhältnis). Hierbei wurde RSV-Luc mit allen CAT-Reportergenen als interne Kontrolle koinjiziert. Als negative Kontrolle wurde -256ApoAI-CAT injiziert. Dieses Promotorkonstrukt enthält den leberspezifischen basalen Promotor des Apolipoprotein I Gens. Das -667-ßMHC-CAT Konstrukt wurde sowohl in normalen, sham-operierten, als auch in Herzen mit akuter Druckhypertrophie hoch exprimiert. Das ANF-Promotor Konstrukt mit der gesamten Promotorsequenz (-3400-ANF-CAT) wurde im normalen Myokard sehr gering exprimiert. In der Gruppe mit aortic banding kam es allerdings zu einem 6-fachen Anstieg der Expression des ANF-Konstruktes (siehe Abb. 10A).

Die Induktion des ANF-Gens wird vermittelt durch ein regulatorisches Element innerhalb einer 556 Basenpaare umspannenden Region.

In transienten Transfektions-Assays von Zellkulturen mit neonatalen Kardiomyozyten war gezeigt worden, daß ein 556 Basenpaare langes Segment des Promotors für die basale ANF Expression nötig ist (Rosenzweig et al., 1991). Dieses Segment scheint auch für die Induktion des ANF-Gens bei Druckhypertrophie verantwortlich zu sein, da ein Konstrukt, das eine Deletion dieses 556 Basenpaare langen Fragmentes des ANF-Promotors enthält (Hind-ANF), durch aortic banding nicht induzierbar war. Wie bereits in Transfektions-Assays neonataler Rattenkardiomyozyten gezeigt worden war, so kam es durch diese Deletion auch in dem hier angewandten Modell zu einer Reduktion der basalen Expression des ANF-Promotors in sham-operierten Tieren. Da bereits die Deletion dieser 556 Basenpaare zu einer kompletten Aufhebung der Induzierbarkeit durch Druckhypertrophie verursachte, wurde keine weitere detaillierte Analyse des ANF-Promotors durchgeführt. Zusammenfassend scheint diese 556 Basenpaare umfassende Sequenz des ANF-Promotors ein regulatorische Elemente zu enthalten, die sowohl für die basale, als auch für die induzierbare Expression des ANF-Gens von Bedeutung sind.

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Das ANF-AP1 Element ist essentiell für Induktion des ANF-Gens durch Druckhypertrophie.

Das identifizierte 556 Basenpaare-Segment enthält zwei Kandidatenelemente, die für die Induktion des ANF-Gens durch Druckhypertrophie potentiell in Frage kommen. Dies ist eine AP1 ähnliche Bindungsstelle (ATGAATCA: -496 bis -489) und ein cAMP responsive element (CRE) (TGACTTCA: -602 bis -596). Die ANF-AP1 Stelle unterscheidet sich von der AP1 Konsensussequenz lediglich durch ein einziges Nukleotid. Es wurden nun Reportergenkonstrukte hergestellt, die mittels gezielter Mutagenese Punktmutationen entweder der AP1 Stelle, oder des CRE enthielten. Wie der Abb. 10B zu entnehmen ist, führte keiner der Mutationen zu einer Beeinträchtigung der basalen Expression der ANF-Promotorkonstrukte. Nach 7 Tagen Druckhypertrophie zeigte sich allerdings, daß das ANF-Promotorkonstrukt, das eine Mutation des CRE enthielt, 11-fach induziert wurde, während das mit der Mutation der AP1 Stelle nicht induzierbar war. Diese Ergebnisse zeigen, daß die ANF-AP1 Bindungsstelle für die Induzierbarkeit des ANF-Gens bei Druckhypertrophie eine zentrale Rolle zu spielen scheint.

Abbildung 10: Einfluß der Druckbelastung auf die Expression von ANF-Reporterkonstrukten. A, Expression von CAT-Konstrukten mit dem ANF-Promotor-Wildtyp (-3400-ANF) oder einer Deletion eines 556 Basenpaare langen HindIII-Fragmentes (Hind-ANF). B, Effekt gezielter Mutagenese auf die ANF-Reporterexpression unter Druckbelastung. Wildtyp (-3400-ANF), ANF-Promotor mit Mutation der AP1-Stelle (AP1-ANF) oder der CRE-Stelle (CRE-ANF). CAT-Werte wurden für die entsprechenden Luciferase-Werte derselben Injektionsstelle normalisiert (CAT/Luc ratio x 100). Druckbelastung (schwarze Balken), sham-operiert (schraffierte Balken). Mittelwert + SEM (n = 10 für jedes Konstrukt). *, signifikanter Unterschied zur Sham-Gruppe.

Um die Hypothese zu überprüfen, ob das AP1-Element ausreichend ist, das ANF-Gen zu induzieren, wurden heterologe Promotorkonstrukte hergestellt, die den basalen Promotor des ß-MHC Gens enthielten, der genügend Sequenz enthielt, um eine muskelspezifische Expression, aber keine Induktion durch Druckhypertrophie zu vermitteln (147-ßMHC-CAT). Wie der Abbildung 11A zu

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Um jede Form der unspezifischen Induktion der basalen ßMHC-Promotorkonstrukte auszuschließen, wurden auch Konstrukte injiziert, die eine zufällige Nukleotidsequenz vor dem basalen ßMHC-Promotor enthielten (x/h-147-ßMHC-CAT). Weder dieses Konstrukt, noch 147-ßMHC-CAT alleine wurden in den jeweiligen Hundeherzen exprimiert (Abb. 11B)

Innerhalb der 556 Basenpaare des ANF-Promotors befindet sich auch ein serum response element (SRE oder CArG-Box, -423 bis -399). Wie der Abbildung 11B zu entnehmen ist, wurde das heterologe ßMHC-Konstrukt, in das das SRE kloniert wurde, in den sham-operierten Tieren hoch exprimiert. Durch Druckhypertrophie kam es zu keiner Induktion dieses Konstruktes. Demnach scheint das SRE von Bedeutung für die basale, nicht jedoch für die induzierbare Form der Expression des ANF-Gens zu sein.

Abbildung 11: Effekt der Druckbelastung auf die Expression heterologer Promotorkonstrukte. A, Verschiedene regulatorische Elemente (AP1-Stelle: AP1-147-ßMHC; CRE-Stelle: CRE-147-ßMHC) wurden mit dem basalen ßMHC-Promotor (-147-ßMHC) fusioniert. ANF-Wildtyp, -3400-ANF. B, Verschiedene regulatorische Elemente (SRE-Stelle: SRE-147-ßMHC; zufällige Nukleotidsequenz: x/h-147-ßMHC) wurden mit dem basalen ßMHC-Promotor (-147-ßMHC) fusioniert. CAT-Werte wurden für die entsprechenden Luciferase-Werte derselben Injektionsstelle normalisiert (CAT/Luc ratio x 100). Druckbelastung (schwarze Balken), sham-operiert (schraffierte Balken). Mittelwert + SEM (n = 7 für jedes Konstrukt). *, signifikanter Unterschied zur Sham-Gruppe.

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Die ANF-AP1 Bindungsstelle wird von DNA-bindenden Proteinen erkannt.

Nachdem die Bedeutung der AP1-Bindungsstelle für die Induktion des ANF-Gens bei Druckhypertrophie erkannt war, war es nun von Bedeutung, zu ermitteln, ob die Induktion des ANF-Gens auch durch die gut charakterisierten AP1-Proteine vermittelt wurde. Experimente wurden durchgeführt, um die DNA-Protein Interaktion zwischen der AP1-Konsensus Sequenz, als auch der ANF-AP1-Bindungsstelle zu optimieren (Allegretto et al., 1990; Argentin et al., 1994; Kovacic-Milivojevic and Gardner, 1992; Nakabeppu et al., 1988; Rauscher et al., 1988; Rosenzweig et al., 1991; Sprenkle et al., 1995). Kernextrakte von Herzen sham-operierter oder mit aortic banding behandelter Tiere wurden mit der ANF-AP1-Sequenz inkubiert. Hierbei resultierte im GMSA ein singulärer Komplex (Abb. 12). Laserdensitometrische Analyse indizierte, daß sich die DNA-Bindungsaktivität dieses Proteinkomplexes nicht zwischen den beiden Gruppen unterschied. Demnach führten 7 Tage Druckhypertrophie zu keiner qualitativen oder quantitativen Veränderung der transaktivierenden Proteine, die an die ANF-AP1-Stelle binden.

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Abbildung 12: Gel-Mobility-Shift-Assay (GMSA) unter Verwendung von nukleären Extrakten aus Herzen präpariert von sham-operierten Hunden (Spur 1-4) oder von Hunden mit 7 Tagen Druckbelastung (Spur 5-8). Spur 9 zeigt die radioaktive Probe ohne Zugabe von Extrakt. 10 µg Extrakt wurden im Bindungspuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert bevor die ³²P-ANF-AP1 doppelsträngige Probe für weitere 10 Minuten zugegeben wurde.

Um die Spezifität dieser Protein-DNA Interaktion zu ermitteln, wurden Kompetitions-GMSAs durchgeführt. Eine doppelsträngige radioaktiv markierte ANF-AP1-Probe wurde inkubiert mit (a) unmarkierter doppelsträngiger ANF-AP1-Probe (selbst; Abb. 13, Bahnen 2-4), (b) unmarkierter doppelsträngiger mutierter ANF-AP1-Probe (Abb. 13, Bahnen 5-7), oder (c) unmarkierter doppelsträngiger AP1-Konsensus Probe (Abb. 13, Bahnen 8-10). Hierbei betrug der molare Überschuß des unmarkierten Kompetitors die 10- bis 100-fache Konzentration der markierten ANF-AP1-Bindungsstelle. Wie der Abbildung 13 zu entnehmen ist, war die unmarkierte ANF-AP1-Probe in der Lage, sehr gut mit der markierten Probe um die bindenden Proteine zu kompetitieren, was für die Spezifität der Bindung dieser Proteine an die ANF-AP1-Stelle spricht. Die unmarkierte Probe mit der mutierten AP1-Stelle, die dieselbe Mutation wie das injizierte AP1-ANF-Promotorkonstrukt enthielt, konkurrierte kaum mit der markierten ANF-AP1-Probe und nur bei der höchsten Konzentration wurde die Bindung an die markierte Probe beeinträchtigt. Auch die AP1-Konsensus Probe konnte gut mit der markierten ANF-AP1-Sequenz kompetitieren. Allerdings zeigt das Gel beim 50-fachen Überschuß, daß die Kompetition der ANF-AP1-Bindungsstelle effektiver war, als die der AP1-Konsensussequenz. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß die beobachtete Protein-DNA Interaktion sequenzspezifisch zu sein scheint.

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Abbildung 13: Kompetitions-GMSA mit nukleären Extrakten aus Hundeherzen. 10 µg nukleären Extraktes wurden in Bindungspuffer für 10 Minuten inkubiert, bevor die Kompetitor-Probe direkt vor Zugabe von ³²P-ANF-AP1 doppelsträngiger Probe zugegeben wurde. Dargestellt ist die Kompetition unter Verwendung unmarkierter Kompetitor-Probe von dergleichen Sequenz (Self; Spur 2-4), der mutierten ANF-Sequenz (Mut; Spur 5-7) und der AP1-Konversion (AP1/con, Spur 8-10) und Angabe des molaren Verhältnisses (10-100) der unmarkierten Probe. Spur 1 beinhaltet keinen Kompetitor, Spur 11 kein Extrakt.

Rosenzweig et al. haben unter der Verwendung von rekombinantem Fos und Jun (AP1 ist ein Heterodimer aus Fos und Jun) demonstriert, daß AP1-Proteine die ANF-AP1-Stelle erkennen und binden (Rosenzweig et al., 1991). Hinsichtlich der hohen Homologie zwischen der ANF-AP1-Stelle und der AP1-Konsensussequenz ist dies eigentlich nicht sehr überraschend. Um zu überprüfen, ob es sich bei den in vivo an die ANF-AP1-Stelle bindenden Proteine tatsächlich um Mitglieder der AP1-Familie handelt, wurden sogenannte Supershift-Assays durchgeführt. Hierfür fanden Antikörper Anwendung, die entweder konservierte Epitope der Proteine aus der Fos-Familie (c-fos, fosB, fra-1, fra-2), oder der Jun-Familie (c-jun, junB, junD) erkannten. Um die Spezifität der verwandten Antikörper zu ermitteln, wurde auch eine käuflich erwerbliche Probe mit den zentralen 7 Nukleotiden der AP1-Konsensussequenz verwandt. Experimente, in denen Extrakte aus Herzen mit akuter Druckhypertrophie und Präimmunserum verwandt wurden, oder in denen der Jun-Antikörper peptidneutralisiert wurde, zeigen, daß die Antikörper-Protein-Interaktion spezifisch war (Abb. 14). Ähnliche Ergebnisse wurden mit Extrakten aus COS-Zellen erzielt, die für 30 Minuten mit Phorbolester stimuliert worden waren. Keiner der genannten Proben führte zum Supershift in der

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Abbildung 14: A, Supershift-GMSA. Die ³²P-ANF-AP1 doppelsträngige Probe wurde mit nukleärem Extrakt aus Hundeherzen unter der Verwendung eines c-jun Antikörpers inkubiert. Spur 1 = kein Antikörper; Spur 2 = Präimmunserum; Spur 3 = c-jun Antikörper; 4 = Peptid neutralisierter c-jun Antikörper; Spur 5 = kein Extrakt. B, Inkubation mit ³²P-ANF/AP1 oder ³²P-AP1/Con(version) oder Konsensus ³²P-AP1 doppelsträngigen Proben. + in Anwesenheit des c-jun Antikörpers. Pfeil: Position des Komplexes mit Supershift. Spur 3, 6 und 9 enthalten kein Extrakt. Die AP1/Con-Probe ist identisch zur ANF-Probe außer einer einzigen A- zu C-Konversion. Die AP1-Konsensus-Probe enthält das Kernseptamer der AP1-Konsensusstelle.

2.2.4 Diskussion

Mit diesen Daten wird die Möglichkeit der intrakardialen in vivo-Geninjektion zur Untersuchung der Genexpression unter physiologischen und pathophysiologischen Zuständen demonstriert. In dieser Arbeit war das verwandte Modell eine über 7 Tage anhaltende akute Druckhypertrophie. Obwohl der angelegte Druckgradient nach 7 Tagen keinen signifikanten Anstieg des Verhältnisses von linksventrikulärem Myokard/Körpergewicht (LV/KG) bewirkte, so konnte in einer anderen Arbeit gezeigt werden, daß dieses Modell zu einem Anstieg der LV/KG Ratio um 25% nach 6 Wochen führt (Okeefe et al., 1978). 3.4 kb der 5´-Promotorregion des ANF-Promotors reagierten mit einer 6- bis 12-fachen Induktion nach 7 Tagen Druckhypertrophie im Vergleich zu sham-operierten Tieren. Deletionsanalysen ergaben, daß hierfür ein 556 bp umspannendes Fragment des ANF-Promotors verantwortlich ist. Es wird gezeigt, daß das verantwortliche Element, das in diesem Fragment lokalisiert ist, eine AP1-Bindungsstelle darstellt. Das ANF-AP1-Element bindet einen konstitutiv exprimierten Faktor, dessen Konzentration nicht durch die Druckhypertrophie beeinflußt wird, sowie die AP1-Proteine. Das ANF-AP1-Element ist entscheidend für die Vermittlung der Induzierbarkeit des ANF-Gens bei Druckhypertrophie.

Die molekularen und biochemischen Grundlagen der Myokardhypertrophie sind Subjekt zahlreicher Studien. Mehrere verschiedene Stimuli wurden identifziert, einschließlich mechanischer Dehnung, adrenerger Agonisten, Wachstumsfaktoren und zyklischer Nukleotide. Obwohl die myokardiale Adaptation auf mehreren Ebenen abläuft, so stellt die transkriptionelle Regulation einen integrativen Mechanismus für viele verschiedene Stimuli dar. So haben z. B. Kariya et al. gezeigt, daß die adrenerge Stimulation des ß-MHC durch die Protein-Kinase C (PKC)-ß vermittelt wird, wahrscheinlich über eine Modulation des Phosphorylierungsstatus des TEF-1 (Kariya et al., 1993; Kariya et al., 1994). So wird auch C/EBP, ein CCAAT/enhancer bindendes Protein, das auch im Herzen vorkommt, über die PKC modifiziert (Rosenzweig et al., 1991). Die Möglichkeit, daß multiple cis-acting Elemente in Kollaboration agieren, wurde von Sprenkle et al. vorgeschlagen, indem er für die komplette -adrenerge Transaktivierung des ANF-Gens die Notwendigkeit multipler SRE demonstrierte (Sprenkle et al., 1995).

Für die Druckhypertrophie des Myokards ist die transiente Expression der sogenannten Immediate Early Genes charakteristisch, als auch der prolongierte Anstieg der Synthese von ANF und der

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Die Anwendung des ANF-Promotors wurde gewählt, da seine 5´-Region sowohl durch Transfektions-Assays als auch durch transgene Studien extensiv charakterisiert wurde (Argentin et al., 1994; Knowlton et al., 1991; Knowlton et al., 1995; McBride et al., 1993; Rosenzweig et al., 1991; Seidman et al., 1988; Sprenkle et al., 1995). Mehrere verschiedene funktionelle cis-agierende Elemente wurden demonstriert (Knowlton et al., 1991; Sprenkle et al., 1995). Hierbei scheinen die multiplen SREs entscheidend für die basale Expression des ANF-Gens zu sein. So konnte Sprenkle et al. durch eine Mutation des SRE bei -114 die Bedeutung dieser Bindungsstelle für die basale ANF-Expression demonstrieren (Sprenkle et al., 1995). Die in der vorgelegten Arbeit gezeigten Ergebnisse mit der Injektion des SRE-147-ßMHC Konstruktes sind in Übereinstimmung mit der Arbeit von Argentin et al. (Argentin et al., 1994) und legen eine bedeutende Rolle des SRE für die basale Expression des ANF-Gens nahe, da bereits eine deutliche Induktion dieses Konstruktes in der sham-operierten Gruppe zu beobachten war, die durch aortic banding nicht weiter gesteigert werden konnte (Abb. 11B). Obwohl im Rahmen der vorgelegten Arbeit das SRE im Kontext des übrigen ANF-Promotors nicht mutiert wurde, so schließen die mit den heterologen Promotorkonstrukten gewonnenen Ergebnisse eine Bedeutung des SRE als Mediator der Induktion des ANF-Gens nach 7 Tagen Druckbelastung weitgehend aus. Allerdings besteht die Möglichkeit, daß das SRE eine transiente Rolle bei der Induktion des ANF-Gens spielt. Die genaue Bestimmung der Rolle von SREs im Kontext des ANF-Promotors würde sich problematisch gestalten, da Sprenkle et al. demonstrierte, daß z. B. für die -adrenerge Stimulation des ANF-Gens multiple SREs verantwortlich sind (Sprenkle et al., 1995).

Da mehrfach gezeigt wurde, daß CREs in die Transduktion verschiedener Wachstum stimulierender Prozesse involviert sind (Roesler et al., 1988; Sheng et al., 1988; Sheng and Greenberg, 1990), war der

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Aortic banding resultierte in einem 6- bis 12-fachen Anstieg der Expression des ANF-Reporterkonstruktes. Die Ergebnisse mit den heterologen ANF-AP1-Reporterkonstrukten zeigen, daß dieses Element ausreicht, um die durch Druckbelastung induzierte Induktion des ANF-Gens zu vermitteln. Direkter Vergleich der Expression der verschiedenen ANF-Promotorkonstrukte mit den heterologen Promotorkonstrukten ist nicht sinnvoll, da in letzteren das jeweilige cis-agierende Element aus dem Kontext des gesamten Promotors genommen ist. Mutation des ANF-AP1-Elementes zeigt, daß diese Bindungsstelle trans-aktivierenden Faktoren im Kontext des längsten ANF-Promotorkonstruktes (-3400-ANF-CAT) zugänglich ist. Diese Daten zeigen außerdem, daß dieses Element absolut notwendig ist, um die Druckantwort des ANF-Gens zu vermitteln. Allerdings können die hier vorgelegten Ergebnisse eine kooperative Rolle anderer regulatorischer Elemente, oder die Möglichkeit, daß andere Elemente eine temporäre Rolle für die Induzierbarkeit des ANF-Gens bei Druckbelastung spielen, nicht vollends ausschließen. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, daß die AP1-Bindungsstelle des ANF-Promotors für die Vermittlung der Induktion des ANF-Gens unter Druckbelastung verantwortlich ist.

Diese Ergebnisse unterschieden sich von denen von Knowlton et al., der den Effekt von aortic banding in transgenen Mäusen, die ein ANF-Reportergen trugen, und mittels Injektion von ANF-Reportergenkonstrukten in Mäuseherzen untersuchte (Knowlton et al., 1995). Hierbei konnte kein Anstieg der Expression der Reportergenkonstrukte nach 7 Tagen Druckhypertrophie beobachtet werden. Verschiedene Faktoren könnten für diese unterschiedlichen Beobachtungen verantwortlich sein. Zunächst gibt es bedeutende Spezies bezogene Unterschiede zwischen den von Knowlton verwandten Mäuse- und den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Hundeherzen. Dies schließt z. B. ein unterschiedliches Muster von MHC-Isoformen ein, was unterschiedliche Adaptationsprozesse auf Druckbelastung zur Folge haben kann. So beobachteten Knowlton et al. nach 7 Tagen aortic banding einen Anstieg von 27% in der LV/KG Ratio im Gegensatz zu der in unserer Arbeit unveränderten LV/KG Ratio bei Hundeherzen in demselben Zeitraum. In dem hier verwandten Modell entwickelt sich eine vergleichbare Veränderung der LV/KG Ratio erst nach 6 Wochen (Okeefe et al., 1978). Dies zeigt, daß der Zeitverlauf der Adaptation an Druckbelastung unterschiedlich verläuft zwischen den verschiedenen Spezies, was durchaus auch die intrazellulären Regulationsmechanismen unterschiedlich beeinflussen kann. Außerdem gibt es einige methodische

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Die Kompetitionsexperimente unter Verwendung der unmarkierten ANF- und AP1-Konversions-Oligonukleotide ergaben, daß beide in der Lage waren, die markierte ANF-Probe aus der Bindung zu verdrängen. Andere Kompetitionsexperimente, bei denen eine Probe verwandt wurde, die nur das zentrale Septamer der ANF-Sequenz (ATGAATCA) enthielt, zeigten, daß nur höhere Dosen eines AP1-Konsensus-Oligonukleotids in der Lage waren, mit der Bindung zu konkurrieren. Mutierte DNA-Oligonukleotide waren nicht in der Lage, effektiv um die Bindung zu konkurrieren. Daraus wird ersichtlich, daß sogar geringe Veränderungen der zentralen Septamersequenz erheblich die DNA-Protein-Interaktion beeinträchtigen. Veränderungen einzelner Nukleotide innerhalb der AP1-Konsensussequenz führen erwiesenermaßen zu einer Beeinträchtigung der Affinität für AP1-Proteine (Busch and Sassone-Corsi, 1990; Nakabeppu et al., 1988; Rauscher et al., 1988). Busch und Sassone-Corsi fanden ebenfalls ein zur AP1-Konsensussequenz unterschiedliches Bindungsmuster unter Verwendung derselben Sequenz wie die des ANF-Promotors der Ratte (TGAATCA) unserer Arbeit (Busch and Sassone-Corsi, 1990). Nakabeppu et al. zeigten, daß unmarkierte Kompetitorsequenzen, die als zenrales Septamer die Sequenzen TGACTCT oder TGACTCG enthielten, nicht in der Lage waren, mit der AP1-Konsensussequenz um die AP1-Bindung zu konkurrieren (Nakabeppu et al., 1988). Zusammenfassend zeigen diese Daten, daß die DNA-Protein-Interaktion sequenzspezifisch und für die Induktion der Expression der ANF-Promotorkonstrukte essentiell ist.

Die Ergebnisse der Experimente zur Bestimmung der DNA-Protein-Interaktion sind in Übereinstimmung mit anderen Arbeiten (Kovacic-Milivojevic and Gardner, 1992; McBride et al., 1993; Rosenzweig et al., 1991). Kovacic-Milivojecic und Gardner demonstrierten, daß in vitro translatiertes fos und jun an ein humanes ANF-KpnI/PvuII-Fragment binden (Position -337 bis -208), eine Region, die nicht mit der von uns untersuchten übereinstimmt (Kovacic-Milivojevic and Gardner, 1992). Rosenzweig et al. hingegen zeigten, daß rekombinantes fos und jun an dieselbe ANF-Region (-506 bis -483) des Ratten-ANF-Promotors binden, wie die von uns untersuchte Region. In der Anwesenheit von gereinigtem fos/jun konnten die Autoren zeigen, daß ein unmarkiertes AP1-Konsensuselement genauso effektiv um die AP1-Bindung konkurrieren konnte wie ein unmarkiertes zur ANF-AP1-Stelle identisches Oligonukleotid (Rosenzweig et al., 1991). Wenn die Autoren hingegen nukleäre Vorhofextrakte verwandten, konnte die AP1-Konsensussequenz nur noch gering mit der Bindung konkurrieren, was darauf hinweißt, daß zwei unterschiedliche Proteinkomplexe gebunden werden.

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Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, daß die ANF-AP1-Bindungsstelle verantwortlich ist für die Induktion des ANF-Gens bei Druckbelastung. An dieses Element binden sowohl konstitutiv exprimierte Proteine, deren Konzentration von der Druckbelastung nicht beeinflußt wird, und zumindest temporär auch AP1-Proteine. Bis jetzt ist unklar, welche Rolle den jeweiligen Proteinkomplexen bei der Regulation der Expression des ANF-Gens zukommt. Auch ist die Identität des konstitutiv exprimierten Proteinkomplexes offen und muß durch fortführende Studien geklärt werden.

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