Kapitel 3. Zweiter Abschnitt: Die Bedeutung der Zellzyklusregulation für Wachstum und programmierten Zelltod kardialer Zellen evaluiert anhand der Überexpression des Transkriptionsfaktors E2F-1

3.1 Einleitung

Kurz nach der Geburt verlieren Kardiomyozyten ihre Eigenschaft, sich zu teilen und arretieren dauerhaft im Zellzyklusarrest. Dies macht das Herz ganz besonders empfindlich gegenüber ischämischen, toxischen oder inflammatorischen Ereignissen, die mit dem Verlust kontraktilen Gewebes einhergehen, denn es hat aufgrund des Zellzyklusarrestes die Fähigkeit zur Regeneration verloren. Dennoch, im Gegensatz zur Skelettmuskulatur, in der sich Zelldifferenzierung und Zellteilung komplett ausschließen, sind Herzmuskelzellen prinzipiell zur simultanen Ausdifferenzierung und Zellteilung in der Lage, wie dies in der gesamten fötalen myokardialen Ontogenese zu beobachten ist (Goldstein et al., 1974). Deswegen stellt die Vorstellung der Reinduktion der Zellteilung in ausdifferenzierten Herzmuskelzellen einen interessanten Ansatz für zukünftige Formen der Behandlung der Herzinsuffizienz dar. Tatsächlich haben mittlerweile mehrere Untersuchungen gezeigt, daß die Überexpression verschiedener Zellzyklusfaktoren zur Induktion der S-Phase des Zellzyklus in Kardiomyozyten führen kann (Agah et al., 1997; Field, 1988; Kirshenbaum et al., 1996; Kirshenbaum and Schneider, 1995; Liu and Kitsis, 1996; Sen et al., 1988; Soonpaa et al., 1997).

Der Zellzyklus wird durch eine komplexe Interaktion und ein stöchiometrisches Equilibrium von Inhibitoren und Aktivatoren des Zellzyklus reguliert. Besonders gehören die cdks (cell cycle dependent kinases) zu den kritischen Regulatoren der Zellteilung in eukaryoten Zellen. Die sequentielle Aktivierung individueller Mitglieder dieser Kinase-Familie und die anschließende Phosphorylierung spezifischer Substrate steuern die Progression durch den Zellzyklus (Pines, 1995). Cdks formen dabei quaternäre Komplexe, die aus den cdks, Zyklinen, PCNA (proliferating cellular nuclear antigen) und einem Vertreter der Familie der ckd-Inhibitoren bestehen. Hierbei wird die enzymatische Aktivität

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Nur sehr wenig ist bekannt über die Regulation der Zellzyklusmaschinerie während der unterschiedlichen Entwicklungsphasen der Kardiomyozyten. Der postnatale Zellzyklusarrest korreliert mit dem Aktivitätsverlust und dem koordinierten Verschwinden der meisten Zykline und ckds (Brooks et al., 1997; Flink et al., 1998; Kang and Koh, 1997; Liu et al., 1998; Yoshizumi et al., 1995), sowie dem Anstieg einiger cdk-Inhibitoren im Myokard (Flink et al., 1998; Koh et al., 1998). Das offensichtliche therapeutische Potential eines regenerativen myokardialen Wachstums zur Reparatur kardialer Läsionen hat eine intensive Suche nach Strategien ausgelöst, die die Aufhebung des Zellzyklusarrestes von Kardiomyozyten zum Ziel haben. In der Tat konnte kürzlich eine Studie zeigen, daß viral-vermittelte Überexpression von E2F-1 den Zellzyklusarrest in Kardiomyozyten aufheben kann (Kirshenbaum et al., 1996). Wie bereits bei der Überexpression von E1A kam es aber auch hierbei zur massiven Induktion von Apoptose, die ebenfalls durch simultane Überexpression von E1B verhindert werden konnte. E2F-1-induzierte Apoptose wurde auch in vivo beobachtet und wurde p53-unabhängig induziert (Agah et al., 1997).

Um die molekularen Mechanismen zu analysieren, die dem Zellzyklusarrest und der Induktion von Apoptose zugrunde liegen und die letzteres verhindern, wurde E2F-1 in Anwesenheit von IGF-I (insulin-like growth factor I) überexprimiert.

3.2 Methoden

Primärkulturen neonataler Rattenkardiomyozyten

Es wurden ventrikuläre Kardiomyozyten von 1 bis 3 Tage alten Wistar Ratten isoliert und kultiviert wie andernorts beschrieben (Simpson et al., 1982), jedoch mit leichten Modifikationen. Hierbei wurden die Herzen der neonatalen Ratten entfernt und zerkleinert und in PBS aufgenommen. Das Gewebe wurde trypsiniert bei 37° Celsius in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung: 20 mmol/L HEPES-NaOH, pH 7.6, 130 mmol/L NaCl, 3 mmol/L KCl, 1 mmol/L NaH2PO4, 4 mmol/L Glucose, 0.15% Trysin (Biochrom) und 30 Einheiten/mL DNase I. Nach kurzer Zentrifugierung wurden die Zellen

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Rekombinante Adenovirus-Konstrukte und Infektionen

Die adenoviralen Konstrukte Ad-Luc (enthält die cDNA der Luciferase-Gens) und Ad-ß-Gal (enthält die cDNA des LacZ-Gens) wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Michael Strauss, MDC, Berlin, zur Verfügung gestellt. Das rekombinante Ad-E2F-1 Konstrukt wurde unter Verwendung eines adenoviralen Vektors mit einem CMV-Promotor (Gomez Foix et al., 1992) (freundliche Gabe von Dr. Robert Gerard, Leuven, Belgien) und der humanen E2F-1 cDNA (freundliche Gabe von Dr. Martin Lipp, MDC, Berlin) hergestellt. HEK 293 Zellen (ATCC) wurden für die homologe Rekombination und Verpackung verwandt. Die adenoviralen Rekombinanten wurden mittels mehrfachem Gefrieren/Auftauen aus den HEK-Zellen freigesetzt und mittels Cäsium-Chlorid Zentrifugation isoliert. Der Titer des Virus wurde mittels direkter Immunfluoreszenz-Färbung des adenoviralen Hexon-Proteins (DAKO) bestimmt. Die Zellkulturen neonataler Kardiomyozyten wurden mit Ad-E2F-1 oder Ad-Luc mit 20 pfu (plaque forming units) pro Zelle für 1.5 Stunden infiziert. Die infizierten Zellen wurden in der Ab- oder Anwesenheit von IGF-I (50 ng/mL, lot 1484300, Boehringer Mannheim) für weitere 24 Stunden inkubiert. Die Effizienz der Infektion neonataler Kardiomyozyten betrug über 90% (bestimmt mit Ad-ß-Gal mit 10 bis 50 pfu/Zelle und ß-Gal-Assay).

Immunfluoreszenz, in situ Apoptose-Assay und in situ DNA-Synthese-Assay

Alle Prozeduren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt und die Lösungen wurden angesetzt in PBS mit 1.5 mmol/L MgCl2 und 1 mmol/L CaCl2, pH 7.2. Kardiomyozyten, die auf Kollagen-beschichteten Deckgläschen kultiviert worden waren, wurden mit PBS gespült und in 3.7% Formaldehyd für 10 Minuten fixiert. Zur Bestimmung von exogenem E2F-1 wurden die Zellen für 15 Minuten mit Triton X-100 permeabilisiert, mit 5% Ziegenserum und 0.2% Tween 20 geblockt für 15 Minuten und für 1 Stunde mit 10 ug/mL eines polyklonalen anti-E2F-1 Antikörpers (Santa Cruz) inkubiert. Zur Identifizierung von Kardiomyozyten wurden sowohl TUNEL-, als auch E2F-1 gefärbte immobilisierte Zellen für 1 Stunde mit einem anti-sarkomeren Tropomyosin Antikörper inkubiert. Die Proben wurden anschließend gespült und für 30 Minuten mit TRITC-konjugiertem Ziege gegen Maus Sekundär-Antikörper (Dianova, Verdünnung 1:50) und einem FITC-konjugiertem Ziege gegen

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Der durch die terminale Deoxyribonukleotidyl-Transferase vermittelte TUNEL-Assay wurde durchgeführt, um DNA-Fragmentierung in situ festzustellen. Die methodische Prozedur wurde nach Vorgabe durch den Hersteller (Oncor) durchgeführt. Hierbei wurden die Zellen für 5 Minuten mit dem Equilibrierungs-Puffer vorinkubiert und anschließend mit der Deoxyribonukleotidyl-Transferase in Anwesenheit von Digoxigenin-gekoppeltem dUTP für 1 Stunde bei 37° Celsius inkubiert. Die Reaktion wurde beendet durch Zugabe und Inkubation des Stopp-Puffers für 30 Minuten. Danach wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen. Schließlich wurden die Zellen für 8 Minuten mit Propidium Jodid (5 µg/mL in PBS, pH 7.4) und 50 µg/mL RNase A (ohne DNase) gefärbt und anschließend mit PBS gewaschen und auf Objektträger aufgetragen.

Für den Nachweis der DNA-Synthese wurde BrdU-Markierung von Zellen auf Deckgläschen angewandt. 24 Stunden nach Infektion mit Ad-E2F-1 oder Ad-Luc (20 pfu/Zelle) wurden die Zellen mit 30 µmol/L BrdU (Sigma) in der Anwesenheit von IGF-I (50 ng/mL) für 4 Stunden markiert, sodann in 3.7% Formalin fixiert und mit PBS/0.1% Triton X-100 permeabilisiert. Für den Nachweis von inkorporiertem BrdU wurden die Zellen mit 2 N HCl/Triton X-100 für 2 Minuten inkubiert und in 0.1 mol/L Na2B4O7, pH 8.5, für 10 Minuten neutralisiert. Die Zellen wurden mit FITC-konjugiertem anti-BrdU Antikörper (B44, Becton Dickinson) nach den Instruktionen des Herstellers gefärbt.

[³H]-Methyl-Thymidin-Einbau

24 Stunden nach Infektion wurden 2.5 µCi/mL [³H]-Methyl-Thymidin (247.9 GBq/mmol, NEN) zu den Kardiomyozytenkulturen für 6 Stunden zugegeben. Die Zellen wurden dann mit 15% Trichloressigsäure extrahiert. Das Präzipitat wurde dann in 0.5 mL NaOH aufgenommen und mit 0.5 mL HCl neutralisiert. Die Radioaktivität wurde dann in einem Szintillationszähler gemessen.

Durchflußzytometrie zur Analyse von Zellzyklus und Apoptose

24 Stunden nach der Infektion wurden trypsinierte Zellen zweimal mit PBS gewaschen und über Nacht in 70% Äthanol fixiert. Danach wurden die Zellen kurz zentrifugiert und in PBS rehydriert. Nun wurden die Zellen mit 20 µg/mL Propidium Jodid auf ihren DNA-Gehalt gefärbt und die Zellen in einem Durchflußzytometer (Coulter Epics) analysiert, wobei die Zuordnung der Zellen zu den einzelnen Zellzyklusstadien mittels Multicycle-Software (Coulter) erfolgte. Zur Bestimmung apoptotischer Zellen mittels Annexin-V-Fluos-Färbung (Boehringer Mannheim) wurden die Zellen nach den Instruktionen des Herstellers präpariert.

Präparation von Ganzzellextrakten

Trypsinierte Zellen wurden in eiskaltem PBS zweimal gewaschen und auf Eis lysiert in einem Puffer mit 50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.5% (V/V) Triton X-100, 5 mmol/L EDTA, 5

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Immunpräzipitation und Immunoblotting

Folgende Antikörper fanden Verwendung: anti-pRb, anti-E2F-1, anti-DP1, anti-PCNA, anti-p16^INK4, anti-p21^CIP1, anti-p27^KIP1, anti-p57^KIP2, anti-Zyklin A, anti-Zyklin D1, anti-Zyklin E, anti-cdc2, anti-cdk2, anti-cdk4, anti-cdk6 (alle von Santa Cruz), anti-sarkomeres Tropomyosin (Sigma).

Zellextrakte (500 µg Gesamtprotein; 1.0 mg Gesamtprotein für Zyklin E) wurden mit Protein G-Agarose Kügelchen vorgereinigt (Boehringer Mannheim) und mit den entsprechenden Antikörpern (1-2 µg/mL) inkubiert. Koimmunpräzipitationsstudien wurden mit 2.0 mg Protein in 1.0 mL Lyse-Puffer durchgeführt. Dann wurden die Immunkomplexe mit 20 µl Protein G-Agarose für 2 Stunden präzipitiert, in Lyse-Puffer dreimal für 10 Minuten gewaschen, woraufhin 30 µl SDS Puffer (10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA, 1% w/v 1,4-DTT, 2% w/v SDS, 0.01% w/v Bromphenolblau) zugegeben wurde. Die Zellextrakte wurden elektrophoretisch aufgetrennt, auf PVDF-Membranen übertragen, geblockt und mit den Primär-Antikörpern (0.5-5.0 µg/mL) inkubiert. Anschließend wurden sie mit den entsprechenden Sekundärantikörpern inkubiert. Zur Normalisierung gleicher aufgetragener Menge wurde ein kleines Aliquot (50 µg Gesamtprotein) auf SDS-PAGE aufgetragen und mit anti-sarkomerem Tropomyosin Antikörper inkubiert. Der Nachweis der Proteine erfolgte mit verstärkter Chemilumineszenz (Amersham).

Assays zur Bestimmung der Protein-Kinase Aktivität

Immunkomplexe wurden dreimal mit eiskaltem Kinase Puffer (50 mmol/L Tris-HCl, pH 7,5, 10 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L 1,4-DTT) gewaschen und in einer Mischung resuspendiert, die 5 µg lysin-reiches Histon-H1 (Typ IIIS, Sigma), 1 µmol ATP, 3 µmol MgCl2, 10 µmol cAMP-Hemmer (Santa Cruz), 20 µCi (-³²P)ATP (111 MBq/mmol, NEN) und Kinase-Puffer in einem Gesamtvolumen von 50 µl enthielt. Zur Bestimmung der Aktivität von cdk4 und cdk6 wurden 5.0 µg rekombinantes Rb-Protein (Aminosäuren 769-921, Santa Cruz) verwandt. Nach 30-minütigem Schütteln bei 30° Celsius wurde die Reaktion durch Zugabe von 25 µl 2 x SDS-Puffer gestoppt. Die Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und die Menge inkorporierter radioaktiver Markierung wurde mittels Phosporimager (Fuji) und dem TINA Software Programm (Raytest) ermittelt.

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3.3 Ergebnisse

IGF-I verhindert E2F-1-induzierte Apoptose von Kardiomyozyten

Um den protektiven Effekt von IGF-I gegen E2F-1-induzierte Apoptose zu überprüfen, wurden neonatale Rattenkardiomyozyten mit Ad-E2F-1 oder Ad-Luc (20 pfu/Zelle) in der An- oder Abwesenheit von IGF-I (50ng/mL) infiziert. Die Expression und nukleäre Lokalisation exogenen E2F´s in Kardiomyozyten wurde durch Doppelimmunfärbung mit einem anti-E2F-1- und einem anti-sarkomeres Tropomyosin-Antikörper bestätigt. Abbildung 15 illustriert die im Vergleich mit Ad-Luc infizierten oder uninfizierten Kulturen hohen Expressionswerte nukleären E2F-1´s 24 Stunden nach Infektion der Kulturen. Außerdem erkennt man, daß die endogenen E2F-1 Expressionsspiegel unter den gegeben Umständen nicht meßbar waren.

Abbildung 15: Expression und nukleäre Lokalisation von adenoviral übertragenem E2F-1 in Kardiomyozyten neonataler Ratten, die mit 20 pfu/Zelle Ad-E2F-1 oder Ad-Luc oder zum Schein infiziert wurden. Nach Kultivierung für 24 Stunden wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit indirekter Immunfluoreszenz mit polyklonalem Kaninchen anti-E2F-1 Antikörper (grün) und kardial spezifischem monoklonalem Maus anti-sarkomeres Tropomyosin Antikörper (rot) doppelt gefärbt.

In der Abwesenheit von IGF-I waren fast alle Zellen, die E2F-1 überexprimierten, aufgrund von

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Um die Anzahl apoptotischer Zellen quantitativ zu erfassen, wurde ein Annexin-V-Assay in Verbindung mit Durchflußzytometrie angewandt. Die Translokation von Phosphatidylserin von der inneren auf die äußere Seite der Plasmamembran ist ein frühzeitiges Ereignis der Apoptose. Annexin-V bindet Phosphatidylserin mit hoher Affinität und stellt somit einen sehr sensitiven Nachweis apoptotischer Zellen dar. Kardiomyozytenkulturen, die mit Ad-E2F-1 in der Abwesenheit von IGF-I infiziert worden waren, wiesen einen sehr hohen Anteil Annexin-V positiver Zellen auf (95.1%; Abbildung 16B). Im Gegensatz hierzu führte die Zugabe von IGF-I zum Kulturmedium dosisabhängig zu einer Reduktion der apoptotischen Zellen (Abbildung 16C).

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Abbildung 16: E2F-1 vermittelte Apoptose wird durch IGF-I in Kardiomyozyten neonataler Ratten inhibiert. Die Kulturen wurden mit Ad-E2F-1 infiziert und für 24 Stunden in der An-, bzw. Abwesenheit von IGF-I kultiviert. A, Darstellung apoptotischen Zelltods durch TUNEL mit einem FITC-konjugiertem anti-Digoxigenin Antikörper (grün). Kardiomyozyten wurden durch Doppelfärbung mit einem anti-sarkomeren Tropomyosin Antikörper (rot) identifiziert. B, trypsinierte, unfixierte Zellen wurden mit Annexin V FLUOS und Propidiumiodid gefärbt und der Prozentsatz Annexin-positiver Zellen im FACS quantifiziert. Das Ergebnis eines repräsentativen Experimentes ist dargestellt. C, Mittelwerte + SEM von drei unabhängigen Annexin V FLUOS Experimenten sind dargestellt zur Darstellung der Dosis-Wirkungs-Kurve des Effektes von IGF-I auf E2F-1-induzierte Apoptose.

Überexpression von E2F-1 führt zur Induktion der Expression von Zyklinen und Zyklin-abhängigen Kinasen und der Phosphorylierung von pRb

Zur Analyse des Effektes von IGF-I und E2F-1 auf die Phosphorylierung von pRb wurden Lysate von Kardiomyozyten einer Immunpräzipitation unterworfen. In Zellen, die mit Ad-Luc infiziert worden waren, wurde pRb als eine singuläre Bande detektiert, die die hypophosphorylierte und Wachstum inhibierende Form darstellt (Abb. 17). Im Gegensatz hierzu führte die Überexpression von E2F-1 zur Darstellung einer zweiten, weniger mobilen Bande, die das inaktive hyperphosphorylierte pRb repräsentiert (Abb. 17). Interessanterweise war das Auftreten dieser Bande unabhängig von der Anwesenheit von IGF-I im Kulturmedium. Weiterhin wurde die Überexpression von E2F-1 begleitet von der Induktion verschiedener Zellzyklusregulatoren wie cdc2, den Zyklinen D1, E und A, sowie dem Replikations-assoziierten Faktor PCNA (Abb. 17). Auch auf die Induktion dieser Faktoren hatte die Anwesenheit von IGF-I keinen Einfluß. Es wurde bereits andernorts gezeigt, daß die Koexpression von DP1 zusammen mit E2F-1 in ruhenden REF52 Zellen keinen Einfluß auf die E2F-1-vermittelte Aktivierung von E2F-1-Zielgenen hat (DeGregori et al., 1997). Dies zeigt, daß die endogenen Mengen an DP1 ausreichen, um die transkriptionelle Aktivität von E2F-1 zu vermitteln (Abb. 17).

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Abbildung 17: E2F-1 induziert die Expression bedeutender Zellzyklus-Faktoren in Kardiomyozyten. Kardiomyozyten neonataler Ratten wurden behandelt wie in Abb. 16 beschrieben. Aliquote von Ganzzellextrakten (500 µg Gesamtprotein) wurden mit Antikörpern gegen die angegebenen Proteine immunpräzipitiert, aufgetrennt mittels denaturierendem PAGE und mit denselben Antikörpern immun-geblottet. Zur Normalisierung wurde ein kleineres Aliquot (50 µg Gesamtprotein) direkt einer SDS-PAGE unterzogen und mit einem anti-sarkomeren Tropomyosin Antikörper inkubiert. Repräsentative Blots von mindestens drei unabhängigen Experimenten sind dargestellt.

In der Anwesenheit von IGF-I induziert E2F-1 die Herabregulation von p21CIP1 und p27KIP1

Die cdk-Inhibitoren p16^INK4, p21^CIP1, p27^KIP1 und p57^KIP2 werden in neonatalen Kardiomyozyten exprimiert (Abb. 18). Um zu klären, wie E2F-1 in Verbindung mit IGF-I auf diese ckd-Inhibitoren wirkt, wurde die Assoziation von p16^INK4, p21^CIP1, p27^KIP1 und p57^KIP2 mit cdks in Koimmunopräzipitations-Assays untersucht. In unseren Untersuchungen wurde die Menge der cdk-Inhibitoren, die an Kinase-Komplexe gebunden waren, mittels Immunoblotting von anti-cdk-Präzipitaten mit anti-cdk-Inhibitor-Antikörpern bestimmt. Immunoblot-Analyse von Gesamtzell-Lysaten mit anti-p16^INK4- und anti-p57^KIP2-Antikörpern ergaben keine Veränderung der Spiegel dieser cdk-Inhibitoren während der unterschiedlichen Kulturbedingungen (Abb. 18 A-B). Im

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Immunpräzipitate von anti-cdk4 und anti-cdk6, die mit anti-p21^CIP1-Antikörper inkubiert wurden, zeigten ebenfalls einen vergleichbar niedrigen Spiegel von gebundenem p21^CIP1, was darauf hinweist, daß p21^CIP1 in Kardiomyozyten hauptsächlich an cdk2 gebunden ist (Abb. 18C). Diese Präferenz von p21^CIP1 für cdk2 wurde erhärtet durch die Inkubation von anti-Zyklin D1-, anti-Zyklin E- und anti-Zyklin A-Immunpräzipitaten mit anti-p21 Antikörpern (Daten nicht präsentiert). Der gesamte Proteinspiegel von p21^CIP1 fiel deutlich nach Behandlung Ad-E2F-1 infizierter Kardiomyozyten mit IGF-I (Abb. 18C). Außerdem war mit cdk2 assoziiertes p21^CIP1 unter diesen Bedingungen praktisch nicht detektierbar.

Die Ergebnisse der Immunpräzipitation zeigen eine höhere Sättigung von cdk4 und cdk6 mit p27^KIP1 als von cdk2 (Abbildung 18D). Es ist andernorts berichtet worden, daß in vitro p27^KIP1 eine höhere Affinität für cdk4 als für cdk2 aufweist (Toyoshima and Hunter, 1994). Unsere Ergebnisse zeigen, daß es nach Infektion mit Ad-E2F-1 in der Anwesenheit von IGF-I zu einer abrupten Abnahme der gesamten Proteinmenge von p27^KIP1 kam. Dementsprechend kam es zu einer deutlichen Reduktion der p27^KIP1-Menge, die an cdk2, cdk4 oder cdk6 gebunden war (Abb. 18D).

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Abbildung 18: E2F-1 und IGF-I führen zur spezifischen Herunterregulation von p21^CIP1 und p27^KIP1. Der Effekt von E2F-1 und IGF-I auf die Expression der Zellzyklusinhibitoren p16I^NK4, p57^KIP2, p21^CIP1 und p27^KIP1 und ihre Interaktion mit cdk2-, cdk4- und cdk6-Kinasekomplexen wurde bestimmt. Isolierte Kardiomyozyten wurden behandelt wie in Abb. 16 beschrieben. Gesamtprotein-Levels der cdk-Inhibitoren wurden bestimmt durch Auftragen von Ganzzellextrakten (50 µg Gesamtprotein) auf SDS-PAGE und Inkubation mit den entsprechenden Antikörpern. Zur Analyse der Protein-Level der inhibitorischen Faktoren in Assoziation mit den cdks wurden Zellextrakte von den verschiedenen Bedingungen (2 mg Gesamtprotein) mit Antikörpern gegen cdk2, cdk4 oder cdk6 immunopräzipitiert. Nach elektrophoretischer Auftrennung und Transfer auf PVDF-Membranen wurden die Blots mit den entsprechenden cdk-Inhibitor spezifischen Antikörpern inkubiert. Bestimmung der gleichen Beladung von Banden wurden durchgeführt wie in Abbildung 17. Repräsentative Blots von mindestens drei unabhängigen Experimenten sind dargestellt.

Die Herabregulation von p21^CIP1 und p27^KIP1 durch Überexpression von E2F-1 in der Anwesenheit von IGF-I führt zur Freisetzung aktiver Zyklin/cdk-Komplexe

Die Phosphotransferaseaktivität der cdks wurde mittels Immunkomplex-in vitro-Kinase-Assay ermittelt, da die Progression durch G1 und Eintritt in die S-Phase engmaschig durch die enzymatische Aktivität von cdk2, cdk4 und cdk6 reguliert wird. Die Infektion der Kardiomyozyten mit Ad-E2F-1 führte zu keinem Anstieg der Aktivität von cdk4 oder cdk6 (Abb. 19). Der Mangel an signifikanter cdk-Aktivität in Kardiomyozyten, die E2F-1 in der Abwesenheit von IGF-I überexprimieren, war - wie der Abbildung 16 zu entnehmen ist - nicht auf eine limitierte Expression von Zyklinen zurück zuführen. E2F-1-Überexpression führte in der Anwesenheit von IGF-I zur Induktion der Aktivität von cdk4 und cdk6 um das 6.2- und 5.5-Fache im Vergleich zu Kulturen ohne IGF-I (Abb. 19). Das Verschwinden von p27^KIP1 aus den cdk4- und cdk6-Komplexen korrelierte mit der Induktion der entsprechenden Kinaseaktivität. Die cdk2-assoziierte Histon-H1-Kinaseaktivität war in Ad-E2F-1 infizierten Kardiomyozyten in der Anwesenheit von IGF-I 4.7-fach höher als in infizierten Kulturen in der Abwesenheit von IGF-I (Abb. 19). Diese Zunahme der Aktivität von cdk2 ist am ehesten auf die Herabregulation von p21^CIP1 zurückzuführen, da die Expression dieser Kinase unabhängig von der Anwesenheit von IGF-I war (siehe Abb. 18). Das absolute Ausmaß der cdk2-Aktivität war signifikant höher als das der Aktivität von cdk4 und cdk6. In der Anwesenheit von IGF-I führte die Überexpression von E2F-1 zu einem Anstieg der Zyklin E-, Zyklin A- und cdc2-assoziierten Kinaseaktivität (Daten nicht präsentiert).

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Abbildung 19: IGF-I induziert die Kinase-Aktivität von cdk2, cdk4 und cdk6 in Kardiomyozyten, die E2F-1 überexprimieren. Zellextrakte (500 µg Gesamtprotein) wurden mit Antikörpern gegen cdk2, cdk4 oder cdk6 immunpräzipitiert. Die Kinaseaktivität wurde bestimmt unter Verwendung von Histon H1 (für cdk2) oder rekombinantem pRb Protein (für cdk4 oder cdk6) als Substrat. Die Menge inkorporierter Radioaktivität wurde mittels SDS-PAGE ermittelt und in einem Phosphorimager mit TINA Software analyisiert. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments sind dargestellt zusammen mit der quantitativen Bestimmung durch Pooling von drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert + SEM), y-Achse: Werte in cpm x 10^-3, schwarze Balken: ohne IGF-I; weiße Balken: mit IGF-I.

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In der Anwesenheit von IGF-I induziert E2F-1 S-Phase in Kardiomyozyten

In der nächsten Serie von Experimenten wurde untersucht, ob der Effekt von E2F-1 und IGF-I auf Zellzyklus regulierende Faktoren von einem Wiedereintritt in den Zellzyklus begleitet wird, der sich in der Induktion der DNA-Synthese widerspiegelt. [3H]-Methyl-Thymidin-Einbau wurde angewandt, um den Effekt von IGF-I auf E2F-1 überexprimierende Kardiomyozyten zu quantifizieren. Wie in Abbildung 20A dargestellt kam es dabei zu einem dosisabhängigen Anstieg der [3H]-Methyl-Thymidin-Einbaurate, was durch parallele Überexpression von p21^CIP1 antagonisiert werden konnte.

Um festzustellen, ob die DNA-Synthese tatsächlich speziell in Kardiomyozyten induziert wird, wurde eine Doppel-Immunfärbung durchgeführt, um BrdU-Einbau als Zeichen von DNA-Synthese in Kardiomyozyten, die durch anti-sarkomeres Tropomyosin Antikörper identifziert wurden, festzustellen (Abb. 20B). 24 Stunden nach Infektion war die adenoviral vermittelte Überexpression von E2F-1 nicht ausreichend, um DNA-Synthese in Kardiomyozyten zu bewirken. 5% der schein-infizierten, 3% der mit Ad-Luc infizierten und 6% der mit Ad-E2F-1 infizierten Kardiomyozyten waren BrdU-positiv. Im Gegensatz hierzu führte der kombinierte Effekt von E2F-1 und IGF-I zur Induktion der DNA-Synthese, was in 20% BrdU-positiven Kardiomyozyten resultierte (Abb. 20B). Jedoch konnten zu keiner Zeit Kardiomyozyten mit typischen mitotischen Konfigurationen oder anderen Zeichen der Zellteilung identifiziert werden. Überexpression von p21^CIP1 führte zur Hemmung des kombinierten Effektes von IGF-I und E2F-1 auf den Einbau von BrdU.

Um die Verteilung der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen zu bestimmen, wurde FACS-Analyse von Kardiomyozyten, die mit Propidium Jodid und BrdU gefärbt wurden, angewandt. Weder in der Abwesenheit, noch in der Anwesenheit von IGF-I konnte mittels FACS eine Veränderung der Zellzyklusverteilung in mit Propidiumjodid gefärbten Kardiomyozyten, die mit Ad-Luc infiziert worden waren, festgestellt werden (Abb. 20C). Im Gegensatz hierzu kam es zu einem Anstieg der Zellen in der S-Phase auf 23%, wenn E2F-1 in der Anwesenheit von IGF-I überexprimiert wurde. Auch der Peak der apoptotischen Zellpopulation mit weniger als 2n DNA-Gehalt (sub-G1 Fraktion) verschwand. Überexpression von p21^CIP1 führte zur Abnahme der E2F-1-induzierten Apoptose um ein Drittel, was in Übereinstimmung ist mit der Beobachtung, daß p21^CIP1 in der Lage ist, Apoptose in C2C12 Myoblasten zu blockieren (Wang and Walsh, 1996). Außerdem war p21^CIP1 in der Lage, den Effekt von IGF-I auf die Zellzyklusaktivierung zu antagonisieren, was zu einer Abnahme der S-Phase Population von 23% auf 1.9% führte (Abb. 20C).

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Abbildung 20: E2F-1 und IGF-I induzieren den Wiedereintritt in den Zellzyklus in Kardiomyozyten neonataler Ratten. Die Zellkulturen wurden mit Ad-E2F-1 infiziert und behandelt wie in Abbildung 16 beschrieben. A, [³H]-Methyl-Thymidin Inkorporation unter den angegebenen Dosen von IGF-I in E2F-1 überexprimierenden Kardiomyozyten (Mittelwert + SEM von drei unabhängigen Experimenten). B, Zellkulturen wurden für 4 Stunden mit BrdU markiert 24 Stunden nach der Infektion mit Ad-E2F-1. Die auf den Objektträgern befindlichen Zellen wurden dann mit FITC-markiertem anti-BrdU Antikörper (grün) und kardiomyozyten-spezifischem anti-sarkomeren Tropomyosin Antikörper (rot) gefärbt. C, Zellen wurden trypsiniert und in 70%-igem Äthanol fixiert. Zur Bestimmung der Zellzyklusverteilung wurden die Zellen anschließend mit Propidium Jodid gefärbt und mit FACS analysiert. Unter Verwendung von Multicycle Software (Coulter) wurde der Prozentsatz der Zellen in den jeweiligen Zellzyklusphasen bestimmt und in der Abbildung dargestellt. Das Ergebnis eines repräsentativen Experimentes ist dargestellt.

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3.4 Diskussion

Diese Arbeit zeigt, daß E2F-1 in Kombination mit IGF-I den Zellzyklus in postmitotischen primären Kardiomyozyten induzieren kann. Dies geht mit der spezifischen Herabregulation von p21^CIP1 und p27^KIP1 einher und der Freisetzung aktiver cdk-Komplexe, was auf eine bedeutende Rolle dieser beiden Zellzyklusinhibitoren für die Aufrechterhaltung des Zellzyklusarrestes differenzierter Kardiomyozyten hinweist.

Die Fähigkeit, E2F-1- oder E1A-induzierte Apoptose von Kardiomyozyten zu blockieren, wurde bereits durch Überexpression des viralen Proteins E1B demonstriert (Kirshenbaum et al., 1996; Kirshenbaum and Schneider, 1995; Liu and Kitsis, 1996). Dennoch, bis jetzt war es unklar, ob irgendwelche physiologische Faktoren existieren, die den Zellzyklus in postmitotischen Kardiomyozyten veranlassen und als solche als interessante Objekte für zukünftige interventionelle Studien geeignet sind, die die kardiale Regeneration auf molekularer Ebene zum Ziel haben. Deshalb stand im Fokus dieser Arbeit die Funktion von IGF-I, da es als Mediator von Wachstumshormon für den günstigen Effekten von Wachstumshormon bei Patienten mit Herzinsuffizienz verantwortlich zu sein scheint (Osterziel et al., 1998).

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß in postmitotischen Kardiomyozyten IGF-I allein weder einen Effekt auf die Expression und Aktivität von Zellzyklusfaktoren aufweist, noch zur Induktion von DNA-Synthese führt. Diese Beobachtung steht im Gegensatz zu anderen Arbeiten, die IGF-I das Potential zuschreiben, direkt DNA-Synthese in Kardiomyozyten zu induzieren (Kajstura et al., 1994; Reiss et al., 1996). Der Grund für die Diskrepanz zwischen den Daten der hier vorgelegten Arbeit und den erwähnten Studien ist unklar. Es sei in diesem Zusammenhang allerdings erwähnt, daß Kajstura et al. in Kardiomyozyten, die mit IGF-I behandelt wurden, einen Anstieg des Einbaus von BrdU von 1% auf lediglich 6% beobachteten (Kajstura et al., 1994). Diese Rate an BrdU-Einbau konnten wir bereits in unseren unstimulierten Kontroll-Kulturen beobachten. Außerdem präsentieren die Autoren in dieser Arbeit keine quantitativen oder funktionellen Daten bestimmter molekularer Marker des Zellzyklus, die ihre Ergebnisse erhärten. Dies trifft leider auch für die Arbeit von Reiss et al. zu, in der

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Schließlich wäre es von großer Bedeutung zu verstehen, über welche intrazellulären Signalwege IGF-I seinen anti-apoptotischen Effekt auf Kardiomyozyten ausübt. So konnten einige Studien bereits eine wichtige Rolle für die Proteinkinase B/Akt in PC12 Phäochromozytomzellen (Parrizas et al., 1997) und in Rat-1 Fibroblasten (Kulik et al., 1997) nachweisen. Daneben scheint es aber auch andere Proteinkinase B-unabhängige anti-apoptotische Signalwege zu geben, die durch IGF-I aktiviert werden (Kulik and Weber, 1998), einer davon scheint über die Aktivierung von MAP (Mitogen-Aktivierte-Protein)-Kinasen zu laufen (Parrizas et al., 1997). Weiterhin konnte kürzlich in einem Modell der Induktion von Apoptose durch Serumentzug oder Behandlung mit Doxorubicin demonstriert werden, daß IGF-I in fötalen Kardiomyozyten die Induktion des pro-apoptotischen Faktors Bax und die Aktivierung der Kaspase 3 antagonisieren kann (Wang et al., 1998). Allerdings ist nachwievor unklar, wie IGF-I seinen anti-apoptotischen Effekt in post-mitotischen Kardiomyozyten ausübt und es besteht ein großer Bedarf an weiteren Studien, die dieses wichtige Thema zu klären versuchen.

Man könnte argumentieren, daß die Zellzykluskontrolle in neonatalen unterschiedlich ist zu der adulter, voll differenzierter Kardiomyozyten, da die ersteren in vivo immer noch DNA-Synthese und Karyokinese vollziehen können (Kang and Koh, 1997; Soonpaa et al., 1996; Zak, 1974). Obwohl dies für in vivo-Verhältnisse zutreffen mag, so gilt dies sicherlich nicht für in vitro-Bedingungen wie sie in dieser Arbeit angewandt wurden. DNA-Gehalt und der Assay zur Inkorporation von Nukleotiden zeigen eindeutig, daß nur eine sehr geringe Anzahl neonataler Kardiomyozyten unter basalen Bedingungen in die S-Phase gehen (weniger als 5%). Dies ist in Übereinstimmung mit anderen Studien, die ebenfalls belegten, daß neonatale (Sadoshima et al., 1997) und sogar fötale (Kaplan et al., 1998; Liu and Kitsis, 1996) Kardiomyozyten ihre proliferative Kapazität verlieren, in dem Moment, wo sie in Kultur genommen werden.

Die hier vorgelegten Ergebnisse zeigen, daß Überexpression von E2F-1 zur Apoptose in

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Die Induktion von Apoptose kann durch die Aktivität von Zytokinen oder anderen Faktoren wirksam beeinflußt werden. So haben andere Studien zeigen können, daß c-myc induzierte Apoptose durch ein zweites, durch Zytokine vermitteltes Signal blockiert werden kann, was insbesondere für IGF-I zutrifft (Harrington et al., 1994). Weiterhin haben verschiedene Studien unter Verwendung aktivierter T-Lymphozyten gezeigt, daß ein zusätzliches Signal erforderlich ist, um Apoptose zu verhindern und S-Phase Eintritt zu ermöglichen (Firpo et al., 1994; Kaplan et al., 1998). Die hier vorgelegten Ergebnisse und andere Studien haben gezeigt, daß diese Signale in der Herabregulation von cdk-Inhibitoren konvergieren, insbesondere von p27^KIP1 (Coats et al., 1996; Kaplan et al., 1998; Leone et al., 1997; Mann et al., 1997; Reynisdottir and Massague, 1997; Winston et al., 1996). Die Herabregulation von cdk-Inhibitoren führt zur Freisetzung aktiver cdk-Komplexe, was zur Progression des Zellzyklus führt (Abb. 21). Deshalb liefert das hier vorgestellte Modell einen Mechanismus, über den frühere Ergebnisse zur Induktion von S-Phase durch E1A in Kardiomyozyten erklärt werden können (Kirshenbaum and Schneider, 1995; Liu and Kitsis, 1996), da das virale Onkoprotein E1A direkt an p27^KIP1 bindet und seine inhibitorische Aktivität blockiert (Mal et al., 1996).

Schlußfolgernd läßt sich sagen, daß die hier vorgelegten Ergebnisse belegen, daß die cdk-Inhibitoren p21^CIP1 und p27^KIP1 eine Schlüsselrolle für den Zellzyklusarrest postmitotischer Kardiomyozyten zu spielen scheinen und daß ihre Präsenz für die Modulation einer apoptotischen versus mitogenen Antwort von Bedeutung ist.

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Abbildung 21: Modell zur Darstellung des Effektes von E2F-1 in Kardiomyozyten in der Ab-, bzw. Anwesenheit von IGF-I.

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