Kapitel 4. Dritter Abschnitt: Signalwege des programmierten Zelltods in Kardiomyozyten induziert durch freie Sauerstoffradikale

4.1 Einleitung

Die Rolle der Apoptose für die Entwicklung, als auch für die Erkrankung des Myokards wurde in zahlreichen Untersuchungen nahegelegt. Dies basiert hauptsächlich auf Beobachtungen, die einen Gipfel der Apoptoserate in der perinatalen Periode beschreiben (Kajstura et al., 1995) und Apoptose nur in bestimmten Regionen des Myokards entdeckten (James, 1994). Schließlich wurde eine Assoziation zwischen dem Auftreten eines Myokardinfarktes und dem der Apoptose sowohl bei der Ratte (Kajstura et al., 1996), als auch beim Menschen (Itoh et al., 1995) nachgewiesen. Weiterhin wird vermehrte Apoptose bei Patienten mit unterschiedlichen Rhythmusstörungen beobachtet (James, 1994), als auch bei Patienten mit Kardiomyopathien einschließlich des arrhythmogenen rechten Ventrikels (Mallat et al., 1996) und der dilatativen Kardiomyopathie (Narula et al., 1996). Diese Arbeiten sind nicht nur deswegen von Bedeutung, weil durch sie der Nachweis der Apoptose in einem weiteren Organ gelang, sondern weil sie belegen, daß beide, mitotische wie post-mitotische Zellen, zur Induktion von Apoptose fähig sind. Allerdings existiert bislang kaum Information über mögliche Stimuli der myokardialen Apoptose.

Interessanterweise konnte Apoptose nach Reperfusion und Ischämie in mehreren Organen einschließlich dem Myokard nachgewiesen werden (Gottlieb et al., 1994). Jedoch ist bislang unklar, wodurch es hierbei zur Induktion von Apoptose kommt. Experimentelle Studien unter Verwendung isolierter Organpräparationen oder in vivo-Tiermodelle konnten die Generierung von

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Dieser Abschnitt der vorgelegten Arbeit beschreibt unter Verwendung eines Zellkulturmodells kardialer Zellen und verschiedener ROS-generierender Systeme Ergebnisse eigener Experimente, die das Ziel hatten, zu untersuchen, ob ROS Apoptose in kardialen Zellen erzeugen können und über welche Signalkaskade dieser Effekt ausgelöst wird.

4.2 Methoden

Zellkulturen

Die Präparation von Zellkulturen isolierter neonataler Rattenkardiomyozyten erfolgte wie unter 3.2 beschrieben.

Exposition der Zellen mit ROS-generierenden Systemen

Die kultivierten Zellen wurde zweifach mit HBSS (Hank´s buffered salt solution) bei 37° Celsius gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden für eine Stunde bei 37° Celsius in HBSS inkubiert, das die angegebenen Mengen an Xanthin-Oxidase plus Xanthin (XO/X) oder H²O² plus FeSO⁴ enthielten. Wenn Superoxid-Dismutase (SOD), oder Catalase (CAT) oder Tiron benutzt wurden, so wurden diese simultan mit XO/X verabreicht. Weder SOD, noch CAT hatten einen Effekt auf die Zellkulturen in Abwesenheit von XO/X (Daten nicht dargestellt). Der Kaspase-Inhibitor Z-VAD-fmk wurde 2 Stunden vor und direkt nach der Behandlung mit ROS zugegeben.

Bestimmung der Zellvitalität

Die Zellvitalität von Zellen, die mit H²O² behandelt worden waren, wurde mittels MTT-Test evaluiert (MTT = 3-(4,5-Dimethyl-Thiazol-2-yl)2,5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid). Hierzu wurde ein Kit (Boehringer Mannheim) eingesetzt und die Methode wurde nach den Kit-Instruktionen durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen in 96-Lochplatten in einem Endvolumen von 100 µL in Kulturmedium gehalten. Nach der Behandlung mit ROS wurden 10 µL des MTT-Markierungsreagenz zu jedem Loch zugegeben und für 4 Stunden bei 37° Celsius inkubiert.

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Zelltod-ELISA

Dieser ELISA wurde nach den Instruktionen des Herstellers (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Der monoklonale Anti-Histon Antikörper wurde jedem Loch der 96-Lochplatten zugegeben und über Nacht bei 4° Celsius inkubiert. Nach erneutem "Coating" der Platten und dreifachem Waschen wurden die zytoplasmatischen Zellfraktionen in die Löcher gegeben und für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach nochmaligem Waschen wurden die gebundenen Nukleosomen durch Zugabe eines monoklonalen Anti-DNA-Peroxidase Antikörpers präzipitiert, der für weitere 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Nach der Zugabe des Substrates wurde die optische Dichte mittels ELISA-Reader´s bei 405 nm abgelesen.

In situ nick end-Labeling und Färbung mit Propidium Jodid

Der immunzytologische Nachweis von Apoptose durch den TUNEL-Assay erfolgte wie unter 3.2 beschrieben.

Immunoblot-Analyse

Die Zellen wurden für ein Stunde bei 4° Celsius in Lysis-Puffer inkubiert (20 mmol/L Tris, pH 7.5, 2 mmol/L EDTA, 3 mmol/L EGTA, 2 mmol/L DTT, 250 mmol/L Sucrose, 0.1 mmol/L PMSF, 1 % Triton X-100, jeweils 10 µg/mL Leupeptin, Aprotinin, Pepstatin A). 50 µg Protein enthaltende Proben wurden auf ein 12% SDS-PAGE aufgetragen und auf Nitrocellulosemembran übertragen. Gleiche Konzentration an Protein wurde mittels Ponceau-Rot-Färbung der Membranen ermittelt. Nach der Inkubation mit den jeweiligen primären Antikörpern folgte die Zugabe von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG, Kaninchen-anti-Maus-IgG oder Esel-anti-Ziege-IgG (alle Amersham). Antigen-Antikörper-Komplexe wurden sichtbar gemacht durch verstärkte Chemilumineszenz (ECL).

Präparation von subzellulären Fraktionen

Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und das Pellet wurde in 0.5 mL Puffer suspendiert (20 mmol/L HEPES-NaOH, pH 7.5, 250 mmol/L Sucrose, 10 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EGTA, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 0.1 mmol/L Phenylmethylsulfonyl-Fluorid, jeweils 10 µg/mL Leupeptin, Aprotinin, Pepstatin A). Darin wurden die Zellen in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Die subzellulären Fraktionen wurden gewonnen wie andernorts beschrieben (Yang et al., 1997). Hierbei wurde das Homogenisat zweimal bei 4° Celsius für 5 Minuten mit 750 g zentrifugiert, um Nuklei und nicht-aufgebrochene Zellen zu sammeln. Der Überstand wurde bei 4° Celsius für 15 Minuten mit 10.000 g zentrifugiert, um die schwere Membranen

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Immunpräzipitation

HM- oder LM-Fraktionen wurden in Puffer resuspendiert (10 mmol/L HEPES, pH 7.4, 38 mmol/L NaCl, 0.1 mmol/L PMSF, jeweils 10 µg/mL Leupeptin, Aprotinin, Pepstatin A) und in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Um Immunpräzipitationen durchführen zu können, wurde das Zytosol oder die HM- oder LM-Fraktion in 10 % (V/V) Protein A-Agarose auf einer Schaukelplattform für eine Stunde vorgereinigt. Nun wurden die spezifischen Antikörper zugegeben und für eine weitere Stunde auf der Schaukelplattform inkubiert. Anschließend wurden die Immunpräzipitate durch eine weitere Stunde Inkubation mit 10% (V/V) Protein A-Agarose gesammelt. Die Agarose-Kügelchen wurden herunterzentrifugiert und dreimal mit NET-Puffer gewaschen. Durch Zugabe von SDS-Puffer wurden die Antigene freigesetzt und denaturiert. Immunoblot-Analyse wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Statistik

Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwert + Standardfehler von mindestens 3 repräsentativen Experimenten. Gepaarte Daten wurden mittels Student´s t-Test analysiert. ANOVA wurde verwandt für multiple Vergleiche. Ein p-Wert < 0.5 wurde als signifikant erachtet.

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4.3 Ergebnisse

ROS induzieren Tod in kardialen Zellen

Exposition isolierter kardialer Zellen mit H²O² führte zu einer dosis-abhängigen Reduktion der Zellvitalität, die mittels MTT-Assay ermittelt wurde (Abb. 22A). Xanthin-Oxidase plus 0.1 mmol/L Xanthin (XO/X) wurde verwandt, um O2^- zu erzeugen und die entsprechende Zellvitalität wurde mittels Trypanblau-Ausschluß bestimmt, da XO/X selbst mit der MTT-Reaktion interferieren kann. Auch mit XO/X konnte eine dosis-abhängige Reduktion der Zellvitalität beobachtet werden (Abb. 22B). Da XO/X zur Bildung sowohl von O2^-, als auch H²O² führt, wurden SOD, CAT oder Tiron zugegeben, um den Anteil des jeweiligen ROS am XO/X-induzierten Zelltod zu ermitteln (Abbildung 22C). In der Anwesenheit von SOD war der Effekt von XO/X partiell reversibel, was darauf hinwies, daß O2^- zum XO/X-induzierten Zelltod beitrug. Dies wurde erhärtet durch die alternative Zugabe von Tiron, einem zellmembrandurchlässigen Fänger von O2^-. Die Anwesenheit von CAT hatte einen ähnlichen Effekt auf die Zellvitalität wie SOD. Die Kombination von CAT mit SOD oder Tiron führte zur kompletten Aufhebung der toxischen Wirkung von XO/X. Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse, daß H²O² oder O2^- oder beide zur Induktion von Zelltod in kardialen Zellen führen können.

Abbildung 22: Effekt von H²O² oder XO/X auf die Lebensfähigkeit kardialer Zellen. A, die Lebensfähigkeit wurde mittels MTT-Assay bestimmt, nachdem die Zellen für 1 Stunde mit den angegebenen Dosen von H²O² plus 0.1 mmol/L FeSO⁴ behandelt und für weitere 19 Stunden in ROS-freiem Medium kultiviert wurden. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert (+ SEM) von drei unabhängigen Experimenten (n = 16 Slots in jedem individuellen Experiment); *p<0.05, ** p<0.01, verglichen mit unstimulierten Kontrollzellen. B, die Lebensfähigkeit wurde mittels Ausschluß von Trypanblau bestimmt, nachdem die Zellen für 1 Stunde mit den angegebenen Dosen von XO plus 0.1 mmol/L Xanthin behandelt und für weitere 7 Stunden in ROS-freiem Medium kultiviert wurden; *p<0.05, ** p<0.01 verglichen mit unstimulierten Kontrollzellen. C, Zellen wurden mit 0.04 U/ml XO plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von 1000 U/mL Superoxid-Dismutase (SOD), oder 500 U/mL Catalase (CAT), oder 1 mmol/L Tiron exponiert. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM von 4 unabbängigen Experimenten in Duplikat; *p<0.05, ** p<0.02, verglichen mit XO/X.

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ROS induzieren Apoptose in Kardiomyozyten

Die Frage war nun, ob ROS Zelltod über die Induktion von Apoptose in kardialen Zellen erzeugen. Die Anwendung eines Zelltod-ELISA´s, der spezifisch Histon-assoziierte DNA-Fragmente im Zytosol stimulierter Zellen detektiert, zeigte einen dosis-abhängigen Anstieg von Oligonukleosomen im Zytosol von Zellen, die mit H²O² behandelt worden waren (Abb. 23A). Ähnliche Ergebnisse zeigten sich nach Behandlung der Zellen mit XO/X (Abb. 23B). Zugabe von SOD, CAT oder Tiron minderten den Effekt von XO/X und die Kombination von CAT mit SOD oder Tiron konnte den Effekt von XO/X nahezu komplett aufheben (Abb. 23C).

Um festzustellen, ob Apoptose auch in Kardiomyozyten stattfindet, deren Zellkultur immer durch einen gewissen Anteil kardialer Nicht-Kardiomyozyten (vornehmlich kardiale Fibroblasten) kontaminiert ist, wurde in situ nick end-labeling (TUNEL) in Kombination mit Propidium Jodid-Färbung und Immunfluoreszenz angewandt (Abb. 23D). Die Ergebnisse belegen nach einer Behandlung mit 0.1 mmol/L H²O² die Anwesenheit apoptotischer Kardiomyozyten (TUNEL positiv) durch eine simultane Färbung mit -sarkomerem Actin. Vergleichbare Ergebnisse wurden erzielt durch 0.04 U/mL Xanthin-Oxidase in Anwesenheit von 0.1 mmol/L Xanthin und 500 U/ml CAT. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß H²O² oder O2^- oder beide in der Lage sind, Apoptose in Kardiomyozyten zu erzeugen.

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Abbildung 23: Bestimmung von ROS-induzierter Apoptose in kardialen Zellen. DNA-Fragmentierung wurde mittels ELISA bestimmt, wobei die Zellen wie in Abb. 22 beschrieben behandelt wurden unter Verwendung der angegebenen Dosen von A, H²O² or B, XO/X or C, mit 0.04 U/ml XO plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von SOD (1000 U/ml), oder Tiron (1 mmol/L), und/oder CAT (500 U/ml). Die Histon-assoziierten DNA-Fragmente werden als optische Dichte bei 405 nm präsentiert (Mittelwerte + SEM von drei unabhängigen Messungen in Triplikat); *p<0.05, verglichen mit der Kontrolle. D, TUNEL (grün) und Immunfluoreszenz mit anti-sarkomerem Tropomyosin Antikörper (rot) von kardialen Kontrollzellen und stimulierten kardialen Zellen. Die kultivierten Zellen wurden mit 0.1 mmol/L H²O² plus 0.1 mmol/L FeSO⁴ stimuliert wie in Abb. 22 beschrieben. Pfeile deuten auf TUNEL-positive Kardiomyozyten.

Effekt von ROS auf die Expression von apoptose-relevantenFaktoren

Die Induktion von Apoptose ist mit der Expression und/oder Aktivierung spezifischer Proteine assoziiert, die für die Ausführung des apoptotischen Programms verantwortlich sind. Prinzipiell sind eine ungeheuere Vielzahl verschiedener apoptotischer Signalwege möglich, je nach Stimulus und je nach betroffener Zellart. Um nun den Signalweg der ROS-induzierten Apoptose in Kardiomyozyten zu spezifizieren, wurden zunächst die Proteinkonzentrationen von vier verschiedenen bekannten apoptose-relevanten Faktoren mittels Immunoblot-Analyse bestimmt: Bcl-2, Bax, Bad und p53. Kardiomyozyten wurden mit H²O² oder XO/X plus CAT (zur Generierung von O2^-) behandelt. Sowohl H²O², als auch O2^- führten zur Expression von p53, die bereits 1 bis 2 Stunden nach Exposition ersichtlich war (Abb. 24). Allerdings bewirkte nur H²O² und nicht O2^- die Expression von

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Abbildung 24: Western-Blot Analyse der Expression von p53 und Bad in Kardiomyozyten, die mit 0.1 mmol/L H²O² plus 0.1 mmol/L FeSO⁴ oder mit 0.04 U/ml XO plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von 500 U/ml CAT stimuliert wurden. Die Zellen wurden für 1 Stunde stimuliert und anschließend in normalem Kulturmedium für die angegebene Zeit kultiviert. Dargestellt sind repräsentative Blots von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

Differentieller Effekt von H²O² und O2^- auf die Freisetzung von Cytochrom C und Aktivierung von Caspasen

Als nächstes wurde die Verteilung von Cytochrom C in Kardiomyozyten bestimmt, die mit H²O² oder O2^- stimuliert worden waren. Kürzlich wurde eine bedeutende Rolle der Freisetzung von Cytochrom C aus Mitochondrien ins Zytosol von Zellen als Mediator von apoptotische Signalen diagnostiziert (Li et al., 1997; Liu et al., 1996). 1 bis 2 Stunden nach Stimulation mit H²O² wurde die Anwesenheit von Cytochrom C im Zytosol kultivierter Kardiomyozyten sichtbar (Abb. 25A). Um eine signifikante Kontamination der subzellulären Fraktion des Zytosols mit Mitochondrien als Ursache für den Nachweis von Cytochrom C auszuschließen, wurden die Blots mit einem Antikörper gegen die mitochondriale Cytochrom-Oxidase rehypbridisiert (Abb. 25A). Aus der Abbildung ist zu ersehen, daß Cytochrom-Oxidase in der zytosolischen Fraktion über den gesamten untersuchten Zeitraum nahezu nicht nachweisbar war. Die Freisetzung von Cytochrom C führt zur Aktivierung der Caspase CPP32. Diese Aktivierung läßt sich durch die Spaltung der inaktiven Form Pro-CPP32 in die aktive 17 kDa schwere Form nachweisen, wie sie 3 Stunden nach Behandlung mit H²O² sichtbar wurde (Abb. 25A). Auch ließ sich ein 85 kDa-Fragment von PARP 3 Stunden nach Exposition mit H²O² nachweisen, was ebenfalls als ein Indiz für die Aktivierung von CPP32 gewertet wird (Abb. 25A). Diese Daten belegen, daß Freisetzung von Cytochrom C und die nachfolgende Aktivierung von CPP32 Teil der durch H²O²-induzierten Apoptose von Kardiomyozyten darstellt.

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Abbildung 25: Beteiligung der Freisetzung von Cytochrom C und Aktivierung von CPP32 in ROS-induzierter Apoptose von Kardiomyozyten. Dargestellt sind die Expressionswerte von Cytochrom C (cyt c) und Cytochrom Oxidase (cox) in den zytosolischen Extrakten, sowie die Aktivierung von CPP32 und Spaltung von PARP bestimmt durch Immunoblot-Analyse. Die Kardiomyozyten Kulturen wurden stimuliert mit A, 0.1 mmol/L H²O² plus 0.1 mmol/L FeSO^4, oder mit B, 0.04 U/ml XO plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von 500 U/ml CAT. Die Zellen wurden für 1 Stunde stimuliert und anschließend in normalem Kulturmedium für die angegebene Zeit kultiviert. Dargestellt sind repräsentative Blots von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

Interessanterweise war die durch O2^--induzierte Apoptose von Kardiomyozyten weder durch Freisetzung von Cytochrom C, noch durch die Aktivierung von CPP32 und Spaltung von PARP gekennzeichnet (Abb. 25B). Allerdings führte die Anwesenheit eines Pan-Caspase-Inhibitors (Z-VAD-fmk) zur Aufhebung der O2^--induzierten Histon-assoziierten DNA-Fragmentierung (Abb. 26A). Dies belegt, daß O2^- zur Aktivierung anderer Signalkaskaden, als die über Cytochrom C und CPP32, zur Induktion von Apoptose in Kardiomyozyten führt. Unter Verwendung eines Mch2-Antikörpers wurde gezeigt, daß die Caspase Mch2 durch O2^- aktiviert wurde, was sich durch die Bildung der aktiven Form von Mch2, p20, 2 Stunden nach Behandlung mit XO/X plus CAT nachweisen ließ (Abb. 26B). Zum selben Zeitpunkt wurde in diesen Zellen Lamin A, das ein Substrat von Mch2 darstellt (Orth et al., 1996; Takahashi et al., 1996) in sein aktives 46 kDa Protein gespalten (Abb. 26C). Z-VAD-fmk führte zur Inhibierung von Mch2, was sich an der fehlenden Spaltung von Lamin A darstellte. Auch die Anwesenheit von Tiron verhinderte die Aktivierung von Mch2, wodurch auch hier die Spaltung von Lamin A ausblieb. Somit scheint O2^-, anders als H²O², zur Induktion von Apoptose in Kardiomyozyten Mch2 zu aktivieren, was zur Spaltung von Lamin A führt.

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Abbildung 26: Immunoblot Detektion von O2^--induzierter Aktivierung von Mch2 in Kardiomyozyten. Zellen wurden stimuliert mit 0.04 U XO/mL plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von 500 U/mL CAT. A, Bestimmung der DNA-Fragmentierung mittels ELISA. Z-VAD-fmk wurde in den angegebenen Konzentrationen 2 Stunden vor und unmittelbar nach Behandlung mit ROS zugegeben. *p<0.05, verglichen mit XO/X+CAT allein. B, Immunoblot Analyse von Mch2 und der aktiven Form p20, und C, von Lamin A und dem Spaltprodukt p46; Tiron (1 mmol/L), Z-VAD-fmk (50 µmol/L). Dargestellt sind repräsentative Blots von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

H²O² führt zur Translokation von Bax und Bad vom Zytosol zu den Mitochondrien und ihre Interaktion mit Bcl-2.

Um die Faktoren zu identifizieren, die für die Freisetzung von Cytochrom C in der H²O²-induzierten Apoptose von Kardiomyozyten verantwortlich sind, wurden nach der Exposition mit H²O² die Zellen in ihre subzellulären Fraktionen aufgetrennt, in eine zytosolische Fraktion, eine Fraktion mit zellulären Bestandteilen aus schweren Membranen (HM, einschließlich der Mitochondrien) und einer Fraktion mit leichten Membranen (LM). Bad, Bax und Bcl-2, von all denen bekannt ist, daß sie an der Regulation der Freisetzung von Cytochrom C aus Mitochondrien beteiligt sind, wurden durch Zugabe ihrer spezifischen Antikörper immunpräzipitiert und dann über ein SDS-PAGE der Immunoblot-Detektion zugeführt. Vor der Exposition mit H²O² waren Bad und Bax vornehmlich in der zytosolischen Fraktion, und kaum in der HM-Fraktion, bzw. gar nicht in der LM-Fraktion nachweisbar (Abb. 27A). 1 Stunde nach Behandlung mit H²O² translozierten sowohl Bad, als auch Bax vom Zytosol zu den Mitochondrien (und nicht zu der LM-Fraktion). Vor und nach der

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Um nachzuweisen, daß die Translokation von Bad und Bax auch eine Interaktion mit Bcl-2 zur Folge hat, einem Faktor, von dem bekannt ist, daß er Apoptose durch Verhinderung der Freisetzung von Cytochrom C antagonisiert (Kluck et al., 1997; Yang et al., 1997), wurden Immunpräzipitate von Bad oder Bax gegen einen Antikörper von Bcl-2 geblottet. Sowohl Bad, als auch Bax tauchten 1 Stunde nach Behandlung mit H²O² in Bcl-2-Komplexen der Kardiomyozyten auf (Abb. 27B). Hingegen konnten keine entsprechenden Komplexe in Kardiomyozyten nachgewiesen werden, die mit O2^- stimuliert worden waren (Daten nicht dargestellt).

Abbildung 27: Subzelluläre Verteilung von Bad, Bax und Bcl-2 und die Interaktion von Bad oder Bax mit Bcl-2 in Kardiomyozyten, die für 1 Stunde mit 0.1 mmol/L H2O2 plus 0.1 mmol/L FeSO4 behandelt und anschließend für die angegebene Zeitdauer in normalem Kulturmedium kultiviert wurden. A, Anschließend an die Präparation zytosolischer Fraktionen, Fraktionen mit schweren Membranen (HM) und Fraktionen mit leichten Membranen (LM) wurden Bad, Bax und Bcl-2 unter Verwendung ihrer spezifischen Antikörper immunpräzipitiert und dann zur Immunblot-Detektion mittels SDS-PAGE aufgetrennt. B, Die Immunpräzipitation von Bad und Bax wurde in den Fraktionen mit schweren Membranen durchgeführt und die immunpräzipitierten Mengen wurden mittels Immunoblot und einem Anti-Bcl-2 Antikörper analysiert. Dargestellt sind repräsentative Blots von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

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Diese Daten belegen, daß die Freisetzung von Cytochrom C in Kardiomyozyten, die mit H²O² exponiert wurden, parallel zur Translokation von Bad und Bax vom Zytosol an die Mitochondrien verläuft, wo diese Faktoren mit dem anti-apoptotischen Bcl-2 interagieren, was auf eine funktionelle Rolle dieser beiden Faktoren bei der Freisetzung von Cytochrom C in der H²O²-induzierten Apoptose von Kardiomyozyten hinweist. Das Ausbleiben der Translokation dieser beiden Faktoren bei O2^--induzierter Apoptose von Kardiomyozyten könnte den fehlenden Nachweis der Freisetzung von Cytochrom C bei dieser Form der Apoptose erklären.

4.4 Diskussion

ROS spielen eine bedeutende Rolle für die Pathogenese einer Vielzahl verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen. Das haben zahlreiche Studien in den letzten Jahren belegt. Es besteht aber weiterhin weitgehende Unklarheit über die Mechanismen, über die ROS die Struktur und Funktion von Herz und Gefäßen beeinflussen. Die vorgelegte Arbeit belegt erstmals, daß ROS Apoptose in Kardiomyozyten induzieren können und daß sie sich dabei unterschiedlicher intrazellulärer Signalwege bedienen können.

Es gibt mehrere Belege für eine enge Beziehung zwischen p53 einerseits und oxidativem Stress andererseits. So konnte gezeigt werden, daß die Konformation und die DNA-bindende Aktivität von p53 durch das intrazelluläre Redox-Potential reguliert werden können (Hainaut et al., 1995). Ein potenter Transaktivator von p53 ist Ref-1, ein Redox/Reparatur Protein (Jayaraman et al., 1997). Außerdem führt die Überexpression von p53 zur Transaktivierung von Genen, die für Proteine kodieren, die durch oxidativen Stress aktiviert werden (Polyak et al., 1997). Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, daß H²O² und O2^-, obwohl sie unterschiedliche intrazelluläre Signalkaskaden aktivieren, zur Induktion der Expression von p53 führen. p53 kann Apoptose über die Transaktivierung des Bax-Gens induzieren, das mehrere p53-Bindungsstellen besitzt und für einen Apoptose-induzierenden Faktor kodiert (Miyashita and Reed, 1995). Überraschenderweise war in beiden Fällen die Induktion der Expression von p53 nicht von einer Induktion der Expression von Bax gefolgt. Hierfür gibt es zwei plausible Erklärungen: 1. obwohl die Expression von p53 in unserem Modell gesteigert wird, bleibt p53 funktionell inaktiv. Diese Möglichkeit wird gestützt durch die Beobachtung, daß p21^CIP1 in einer p53-unabhängigen Form durch oxidativen Stress aktiviert werden

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Bcl-2, ein bekannter anti-apoptotischer Faktor, kann Apoptose in Kardiomyozyten, die p53 überexprimieren, verhindern (Kirshenbaum and de Moissac, 1997). Weder H²O², noch O2^- führten zu wesentlichen Veränderungen in der Expression von Bcl-2. Um die funktionelle Aktivität von Vertretern der Bcl-2-Familie zu bestimmen, wurde in der vorgelegten Arbeit die Freisetzung von Cytochrom C bestimmt, die engmaschig durch das Gleichgewicht aus anti-apoptotischem Bcl-2 und pro-apoptotischem Bax oder Bad reguliert wird (Kluck et al., 1997; Yang et al., 1997). Die Beteiligung von Cytochrom C in der Exekution der Apoptose wurde erst kürzlich beschrieben (Li et al., 1997; Liu et al., 1996). Die hier vorgelegten Daten belegen, daß Cytochrom C in H²O²-induzierter Apoptose freigesetzt wird, was auf eine prädominante Aktivität der pro-apoptotischen Vertreter der Bcl-2 Familie hinweist. Um dies nachzuweisen, wurde die subzelluläre Lokalisation von Bad und Bax bestimmt und ihre Translokation vom Zytosol an die Mitochondrien nachgewiesen. Diese subzelluläre Translokation veranlaßte zu der Spekulation, daß Bad und Bax Heterodimere mit dem mitochondrien-ständigen Bcl-2 formen, um dessen anti-apoptotische Wirkung zu antagonisieren. Diese Annahme wurde durch den Nachweis von Bad und Bax in Bcl-2-Komplexen in Kardiomyozyten, die mit H²O² stimuliert worden waren, bestätigt. Demnach dürfte die Translokation von Bad und Bax und ihre Interaktion mit Bcl-2 eine wichtige Rolle für die H²O²-induzierte Freisetzung von Cytochrom C und der nachfolgenden Aktivierung der Kaspase CPP32 und Spaltung von PARP spielen. Dies zeigt erstmals die Existenz von Cytochrom C-abhängigen apoptotischen Signalwegen in Kardiomyozyten. Auf der anderen Seite belegt das Fehlen einer Freisetzung von Cytochrom C bei O2^--induzierter Apoptose die Existenz Cytochrom C-unabhängiger apoptotischer Signalwege in Kardiomyozyten. O2^- hingegen benutzt einen apoptotischen Weg, der die Aktivierung einer anderen Kaspase, Mch2, beinhaltet. Wennauch die präzise Substratzuordnung zu den verschiedenen Kaspasen noch nicht vollends geklärt ist, so scheint Mch2 dennoch die bislang einzige Laminase zu sein (Orth et al., 1996; Takahashi et al., 1996). Zwar kann sie in vitro auch PARP spalten, aber diese Aktivität ist vergleichsweise niedrig (Takahashi et al., 1996). Dies könnte auch erklären, warum in der vorgelegten Arbeit keine Spaltung von PARP nach Aktivierung von Mch2 durch O2^- beobachtet werden konnte.

Mittlerweile konnte Apoptose im Herzen bei Prozessen nachgewiesen werden, die bekannterweise mit der Generierung von ROS einhergehen, wie z. B. Ischämie und Reperfusion (Gottlieb et al., 1994). Allerdings konnten bislang nur wenige Faktoren identifiziert werden, die bei diesen und anderen pathophysiologischen Bedingungen Apoptose triggern. Die hier vorgelegten Daten bilden die erste Verbindung zwischen der Generierung von ROS einerseits, und der Induktion von Apoptose im Herzen andererseits.

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Zusammenfassend belegen diese Daten, daß ROS Apoptose in Kardiomyozyten erzeugen können. Hierbei bedienen sich H²O² und O2^- unterschiedlicher Signalwege mit der Freisetzung von Cytochrom C und Aktivierung der Kaspase CPP32 einerseits und der Aktivierung der Kaspase Mch2 und Spaltung von Lamin A andererseits. Weiterführende Studien sind dringend indiziert, um zu klären, ob andere apoptotische Stimuli ebenfalls über den Cytochrom C/CPP32 Pfad laufen und ob sich durch Inhibition dieser Kaskade Apoptose in Kardiomyozyten verhindern läßt.

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