v. Harsdorf, Rüdiger: UNTERSUCHUNGEN ZUR REGULATION VON ZELLWACHSTUM UND ZELLTOD IM HERZEN

Aus der Abteilung Innere Medizin der
Franz-Volhard-Klinik
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Rainer Dietz


Charité
Medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin

UNTERSUCHUNGEN ZUR REGULATION VON ZELLWACHSTUM UND ZELLTOD IM HERZEN
Habilitationsschrift

vorgelegt von:

Dr. med. Rüdiger v. Harsdorf

Berlin, 1999

Zusammenfassung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Mechanismen zu identifizieren, die an der Induktion von Zellwachstum und/oder Zelltod von Kardiomyozyten beteiligt sind.

Zunächst wurde ein Modell entwickelt, das es erlaubt, genregulatorische Elemente in vivo zu identifizieren. Es wurden die verschiedenen Variablen, die die Expression in vivo ins Myokard injizierter Reportergenplasmide regulieren, analysiert. Es stellte sich heraus, daß die Injektion von Reportergenkonstrukten ins Myokard des Hundes ein ausgezeichnetes Modell darstellt zur Analyse der Genregulation im Myokard großer Säugetierspezies.

Mit Hilfe dieses Modells gelang durch Injektion von ANF (atrialer natriuretischer Faktor)-Promotorkonstrukten mit anschließendem aortic banding die Identifizierung einer AP1-Bindungsstelle im Promotor des ANF-Gens als cis-regulatorisches Element, das für die Aktivierung des ANF-Gens bei der Druckhypertrophie verantwortlich ist.

Zur Identifizierung von Faktoren, die für den Zellzyklusarrest von Kardiomyozyten verantwortlich sind, wurde der ubiquitär exprimierte Transkriptionsfaktor E2F-1 in isolierte Kardiomyozyten mittels adenoviralem Gentransfer eingebracht. Die Überexpression von E2F-1 in Kardiomyozyten führte zur Induktion von programmiertem Zelltod (Apoptose). Die Apoptose wurde in Anwesenheit von Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I) supprimiert und es konnte nun gesteigerte DNA-Synthese beobachtet werden. Es zeigte sich weiterhin, daß die Zellzyklusinhibitoren p21CIP1 und p27KIP1 eine besondere Rolle bei der Aufrechterhaltung des Zellzyklusarrestes von Kardiomyozyten spielen, denn in der Anwesenheit von IGF-I verschwanden in Kardiomyozyten, die E2F-1 exprimierten, diese Faktoren aus den Komplexen, die sie mit Zyklinen und zyklin-abhängigen Kinasen (cdks) bilden.

Um zu verstehen, über welche Faktoren Apoptose in Kardiomyozyten induziert und über welche intrazellulären Signalwege sie vermittelt wird, wurden isolierte Kardiomyozyten mit freien Sauerstoffradikalen (ROS) exponiert, von denen bekannt ist, daß sie in bestimmten Zellen in einem bestimmten Dosisbereich Apoptose erzeugen können. Obwohl beides, H2O2 und O2-, zur Induktion von Apoptose in Kardiomyozyten führt, werden jeweils unterschiedliche intrazelluläre Signalwege aktiviert. So führt H2O2 zur Freisetzung von mitochondrialem Cytochrom C, was mit einer Translokation von Bax an die Mitochondrien und seiner Interaktion mit dem anti-apoptotischen Faktor Bcl-2 einhergeht. Dies führt zur Aktivierung der Caspase 3. O2- hingegen führt zur Aktivierung der Caspase 6 und Spaltung von Lamin A.

Abstract

The aim of the study was to elucidate mechanisms controlling death and growth of cardiomyocytes.

First, a model was developed suitable to identify regulatory gene sequences in vivo. Multiple variables controlling expression of reportergene constructs injected into the heart were investigated. The results showed that injection of reportergene constructs into the heart of dogs is an appropriate model to analyse regulation of gene expression in vivo in large mammals. Using this approach reportergene constructs harboring the promoter of the ANF (atrial natriuretic factor)-gene were injected in dog hearts which were subjected to pressure overload by aortic banding. Serial mutations of the promoter region revealed an AP-1 like sequence to be of importance for the induction of this gene in pressure overload hypertrophy.

In order to identify factors responsible for the cell cycle arrest of cardiomyocytes the transcription factor E2F-1 was overexpressed in isolated cardiomyocytes using adenoviral gene transfer. In cardiomyoccytes the overexpression of E2F1- was followed by apoptosis. Apoptosis was suppressed in the presence of insulin-like growth factor-I (IGF-I) and the re-induction of DNA synthesis could be observed. Cyclin dependent inhibitors (cdi) p21CIP1 and p27KIP1 appear to play an important role in the maintenance of the cell cycle arrest in cardiomyocytes, since these factors dissappeared from cyclin complexes in the presence of IGF-I.

In order to understand how apoptosis is induced in cardiomyocytes and which intracellular signalling cascades may be involved, isolated cardiomyocytes were exposed to reactive oxygen species (superoxide anion (O2-) or hydrogen peroxide (H2O2)). Both O2- and H2O2 induced apoptosis in cardiomyocytes dose-dependently. However, different intracellular signalling cascades were activated. Cytochrome C was released by H2O2, but not by O2-. Release of cytochrome c was followed by translocation of Bax from the cytosol to mitochondria where it was interacting with anti-apoptotic Bcl-2 leading to the subsequent activation of caspase-3. O2- lead to an activation of caspase-6 which was followed by the cleavage of lamin A.

Schlagwörter:
Myokard, Hypertrophie, Apoptose, Zellzyklus

Keywords:
myocardium, hypertrophy, apoptosi, cell cyclem


Seiten: [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUNTERSUCHUNGEN ZUR REGULATION VON ZELLWACHSTUM UND ZELLTOD IM HERZEN
1 ZUSAMMENFASSUNG
2 Erster Abschnitt: Untersuchungen genregulatorischer Mechanismen, die kardialem Wachstum zugrundeliegen
2.1 Entwicklung eines in vivo-Modells zur Analyse der Genregulation im Myokard
2.1.1 Einleitung
2.1.2 Methoden
2.1.3 Ergebnisse
2.1.4 Diskussion
2.2 Identifizierung des cis-regulatorischen Elements, das die Induktion des ANF-Gens bei der Myokardhypertrophie vermittelt
2.2.1 Einleitung
2.2.2 Methoden
2.2.3 Ergebnisse
2.2.4 Diskussion
3 Zweiter Abschnitt: Die Bedeutung der Zellzyklusregulation für Wachstum und programmierten Zelltod kardialer Zellen evaluiert anhand der Überexpression des Transkriptionsfaktors E2F-1
3.1 Einleitung
3.2 Methoden
3.3 Ergebnisse
3.4 Diskussion
4 Dritter Abschnitt: Signalwege des programmierten Zelltods in Kardiomyozyten induziert durch freie Sauerstoffradikale
4.1 Einleitung
4.2 Methoden
4.3 Ergebnisse
4.4 Diskussion
Bibliographie Literatur
Abkürzungsverzeichnis ALPHABETISCH GELISTETE ABKÜRZUNGEN
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Hämodynamik und Morphologie
Tabelle 2: Relative Expression von verschiedenen Reportergenkonstrukten in sham-operierten Hunden und Hunden mit aortic banding.. Experimentelles Design ist unter Methoden beschrieben.

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Dosis-Wirkungs Beziehung zwischen der Menge injizierter DNA und der CAT-Aktivität. Scatter-Plot der CAT-Aktivität pro Injektionsstelle versus Gesamtmenge der DNA (MSV-CAT) pro Injektionsstelle ist dargestellt. Verschiedene DNA-Konzentrationen wurden in einem konstanten Volumen von 200 µl injiziert. Die Mittelwerte (+ SEM) sind als schwarze Vierecke dargestellt (n = 4 für jede Dosis)
Abbildung 2: Balkendiagramm zum Vergleich von drei verschiedenen Injektionstechniken. Eine Gesamtmenge von 50 µg -667-ßMHC-CAT wurde in jeder Gruppe injiziert. Mittelwerte + SEM (n = 10 in jeder Gruppe).
Abbildung 3: Balkendiagramm zur Darstellung des Zeitverlaufs der Expression injizierter Genkonstrukte. CAT-Aktivität aufgetragen gegen Zeit (Tage) nach Injektion für promisköse (MSV, schwarze Balken) und muskelspezifische (-667-ßMHC-CAT, schraffierte Balken) Promotoren (verglichen mit Tag 7, *p<0.01 für MSV und *p<0.0001 für -667-ßMHC-CAT nach ungepaartem t-Test). Mittelwerte + SEM (n = 5 für jeden Zeitpunkt).
Abbildung 4: Balkendiagramm zur Darstellung der regionalen Expressionswerte injizierter Genkonstrukte über den linken Ventrikel verteilt. A = anterior, AL = anterolateral, L = lateral, P = posterior. 24 Injektionen von -667-ßMHC-CAT mit 4 Reihen um den linken Ventrikel wurden durchgeführt, mit jeweils 6 Injektionsstellen von der Basis zum Apex (siehe Zeichnung). Mittelwert + SEM (n = 6).
Abbildung 5: Balkendiagramm zur Darstellung der Expression promisköser (MSV-CAT) oder muskelspezifischer (-667-rß-MHC-CAT) Promotorkonstrukte im rechten Ventrikel (RV) und im Skelettmuskel (Sk.M.). Die Angaben der Werte zeigen den Prozentwert der Expression im Vergleich zum linken Ventrikel an (100%, schwarze Balken). Weiße Balken für RV (n = 10 für MSV-CAT, n = 8 für -667-ßMHC-CAT), schraffierte Balken für Sk.M. (n = 10 für MSV-CAT, n = 9 für -667-ßMHC-CAT).
Abbildung 6: Korrelation zwischen CAT- und Luciferase-Aktivität in Koinjektionsexperimenten. Scatter-Plots der CAT-Aktivität versus Luciferase-Aktivität (Lichteinheiten) sind dargestellt. 100 µg eines promiskösen (MSV-CAT, obere Abbildung) oder eines gewebsspezifischen (-667-ßMHC-CAT, untere Abbildung) Promotorkonstruktes wurden mit 20 µg eines Kontrolgenkonstruktes (RSV-Luc) koinjiziert. Die Regressionsfunktionen sind angegeben.
Abbildung 7: Balkendiagramm mit der Darstellung des Promotor-Mappings der 5´-flankierenden Region des ß-MHC-Promotors. Eine Serie von Deletionen der Promotorregion von -3300 bis -186 wurden als CAT-Konstrukte ins Myokard injiziert. Die CAT-Werte wurden für die Expression des koinjizierten Kontrollreportergens (RSV-Luc) normalisiert. Mittelwerte + SEM (n = 6-10).
Abbildung 8: A, Schema der verschiedenen Promotorkonstrukte: Wild-Typ (-3400-ANF-CAT), Deletion (DeltaHind-ANF-CAT) und Mutation (DeltaAP1-ANF-CAT und DeltaCRE-ANF-CAT) des ANF-Promotors und die heterologen Promotorkonstrukte. H, HindIII-Schnittstelle. Schraffierte Bereiche: deletierte und mutierte Sequenzen. Schwarze Bereiche: ßMHC-Promotorsequenzen. Die angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Nukleotidposition relativ zur Transkriptionsstartstelle. B. Aktuelle Sequenzen des Wildtyps und des mutierten ANF-Promotorkonstruktes (sense-Strang) an den angegebenen Stellen des ANF-Promotors, in die eine singuläre KpnI-Schnittstelle eingeführt wurde, sowie Darstellung der Sequenz der heterologen Promotorkonstrukte (sense-Strang). n = 15, ist eine zufällige Sequenz von 15 Nukleotiden (5´-TTAAATTTGAGAAAG-3´), die die beiden regulatorischen Elemente trennte.
Abbildung 9: Darstellung der Technik der intrakardialen Geninjektion mit aortic banding und des ventrikulo-aortalen Gradienten eines chronisch instrumentierten Hundes 1 Woche nach Operation (der Gradient betrug ca. 90mmHg).
Abbildung 10: Einfluß der Druckbelastung auf die Expression von ANF-Reporterkonstrukten. A, Expression von CAT-Konstrukten mit dem ANF-Promotor-Wildtyp (-3400-ANF) oder einer Deletion eines 556 Basenpaare langen HindIII-Fragmentes (DeltaHind-ANF). B, Effekt gezielter Mutagenese auf die ANF-Reporterexpression unter Druckbelastung. Wildtyp (-3400-ANF), ANF-Promotor mit Mutation der AP1-Stelle (DeltaAP1-ANF) oder der CRE-Stelle (DeltaCRE-ANF). CAT-Werte wurden für die entsprechenden Luciferase-Werte derselben Injektionsstelle normalisiert (CAT/Luc ratio x 100). Druckbelastung (schwarze Balken), sham-operiert (schraffierte Balken). Mittelwert + SEM (n = 10 für jedes Konstrukt). *, signifikanter Unterschied zur Sham-Gruppe.
Abbildung 11: Effekt der Druckbelastung auf die Expression heterologer Promotorkonstrukte. A, Verschiedene regulatorische Elemente (AP1-Stelle: AP1-147-ßMHC; CRE-Stelle: CRE-147-ßMHC) wurden mit dem basalen ßMHC-Promotor (-147-ßMHC) fusioniert. ANF-Wildtyp, -3400-ANF. B, Verschiedene regulatorische Elemente (SRE-Stelle: SRE-147-ßMHC; zufällige Nukleotidsequenz: x/h-147-ßMHC) wurden mit dem basalen ßMHC-Promotor (-147-ßMHC) fusioniert. CAT-Werte wurden für die entsprechenden Luciferase-Werte derselben Injektionsstelle normalisiert (CAT/Luc ratio x 100). Druckbelastung (schwarze Balken), sham-operiert (schraffierte Balken). Mittelwert + SEM (n = 7 für jedes Konstrukt). *, signifikanter Unterschied zur Sham-Gruppe.
Abbildung 12: Gel-Mobility-Shift-Assay (GMSA) unter Verwendung von nukleären Extrakten aus Herzen präpariert von sham-operierten Hunden (Spur 1-4) oder von Hunden mit 7 Tagen Druckbelastung (Spur 5-8). Spur 9 zeigt die radioaktive Probe ohne Zugabe von Extrakt. 10 µg Extrakt wurden im Bindungspuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert bevor die 32P-ANF-AP1 doppelsträngige Probe für weitere 10 Minuten zugegeben wurde.
Abbildung 13: Kompetitions-GMSA mit nukleären Extrakten aus Hundeherzen. 10 µg nukleären Extraktes wurden in Bindungspuffer für 10 Minuten inkubiert, bevor die Kompetitor-Probe direkt vor Zugabe von 32P-ANF-AP1 doppelsträngiger Probe zugegeben wurde. Dargestellt ist die Kompetition unter Verwendung unmarkierter Kompetitor-Probe von dergleichen Sequenz (Self; Spur 2-4), der mutierten ANF-Sequenz (Mut; Spur 5-7) und der AP1-Konversion (AP1/con, Spur 8-10) und Angabe des molaren Verhältnisses (10-100) der unmarkierten Probe. Spur 1 beinhaltet keinen Kompetitor, Spur 11 kein Extrakt.
Abbildung 14: A, Supershift-GMSA. Die 32P-ANF-AP1 doppelsträngige Probe wurde mit nukleärem Extrakt aus Hundeherzen unter der Verwendung eines c-jun Antikörpers inkubiert. Spur 1 = kein Antikörper; Spur 2 = Präimmunserum; Spur 3 = c-jun Antikörper; 4 = Peptid neutralisierter c-jun Antikörper; Spur 5 = kein Extrakt. B, Inkubation mit 32P-ANF/AP1 oder 32P-AP1/Con(version) oder Konsensus 32P-AP1 doppelsträngigen Proben. + in Anwesenheit des c-jun Antikörpers. Pfeil: Position des Komplexes mit Supershift. Spur 3, 6 und 9 enthalten kein Extrakt. Die AP1/Con-Probe ist identisch zur ANF-Probe außer einer einzigen A- zu C-Konversion. Die AP1-Konsensus-Probe enthält das Kernseptamer der AP1-Konsensusstelle.
Abbildung 15: Expression und nukleäre Lokalisation von adenoviral übertragenem E2F-1 in Kardiomyozyten neonataler Ratten, die mit 20 pfu/Zelle Ad-E2F-1 oder Ad-Luc oder zum Schein infiziert wurden. Nach Kultivierung für 24 Stunden wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit indirekter Immunfluoreszenz mit polyklonalem Kaninchen anti-E2F-1 Antikörper (grün) und kardial spezifischem monoklonalem Maus anti-sarkomeres Tropomyosin Antikörper (rot) doppelt gefärbt.
Abbildung 16: E2F-1 vermittelte Apoptose wird durch IGF-I in Kardiomyozyten neonataler Ratten inhibiert. Die Kulturen wurden mit Ad-E2F-1 infiziert und für 24 Stunden in der An-, bzw. Abwesenheit von IGF-I kultiviert. A, Darstellung apoptotischen Zelltods durch TUNEL mit einem FITC-konjugiertem anti-Digoxigenin Antikörper (grün). Kardiomyozyten wurden durch Doppelfärbung mit einem anti-sarkomeren Tropomyosin Antikörper (rot) identifiziert. B, trypsinierte, unfixierte Zellen wurden mit Annexin V FLUOS und Propidiumiodid gefärbt und der Prozentsatz Annexin-positiver Zellen im FACS quantifiziert. Das Ergebnis eines repräsentativen Experimentes ist dargestellt. C, Mittelwerte + SEM von drei unabhängigen Annexin V FLUOS Experimenten sind dargestellt zur Darstellung der Dosis-Wirkungs-Kurve des Effektes von IGF-I auf E2F-1-induzierte Apoptose.
Abbildung 17: E2F-1 induziert die Expression bedeutender Zellzyklus-Faktoren in Kardiomyozyten. Kardiomyozyten neonataler Ratten wurden behandelt wie in Abb. 16 beschrieben. Aliquote von Ganzzellextrakten (500 µg Gesamtprotein) wurden mit Antikörpern gegen die angegebenen Proteine immunpräzipitiert, aufgetrennt mittels denaturierendem PAGE und mit denselben Antikörpern immun-geblottet. Zur Normalisierung wurde ein kleineres Aliquot (50 µg Gesamtprotein) direkt einer SDS-PAGE unterzogen und mit einem anti-sarkomeren Tropomyosin Antikörper inkubiert. Repräsentative Blots von mindestens drei unabhängigen Experimenten sind dargestellt.
Abbildung 18: E2F-1 und IGF-I führen zur spezifischen Herunterregulation von p21CIP1 und p27KIP1. Der Effekt von E2F-1 und IGF-I auf die Expression der Zellzyklusinhibitoren p16INK4, p57KIP2, p21CIP1 und p27KIP1 und ihre Interaktion mit cdk2-, cdk4- und cdk6-Kinasekomplexen wurde bestimmt. Isolierte Kardiomyozyten wurden behandelt wie in Abb. 16 beschrieben. Gesamtprotein-Levels der cdk-Inhibitoren wurden bestimmt durch Auftragen von Ganzzellextrakten (50 µg Gesamtprotein) auf SDS-PAGE und Inkubation mit den entsprechenden Antikörpern. Zur Analyse der Protein-Level der inhibitorischen Faktoren in Assoziation mit den cdks wurden Zellextrakte von den verschiedenen Bedingungen (2 mg Gesamtprotein) mit Antikörpern gegen cdk2, cdk4 oder cdk6 immunopräzipitiert. Nach elektrophoretischer Auftrennung und Transfer auf PVDF-Membranen wurden die Blots mit den entsprechenden cdk-Inhibitor spezifischen Antikörpern inkubiert. Bestimmung der gleichen Beladung von Banden wurden durchgeführt wie in Abbildung 17. Repräsentative Blots von mindestens drei unabhängigen Experimenten sind dargestellt.
Abbildung 19: IGF-I induziert die Kinase-Aktivität von cdk2, cdk4 und cdk6 in Kardiomyozyten, die E2F-1 überexprimieren. Zellextrakte (500 µg Gesamtprotein) wurden mit Antikörpern gegen cdk2, cdk4 oder cdk6 immunpräzipitiert. Die Kinaseaktivität wurde bestimmt unter Verwendung von Histon H1 (für cdk2) oder rekombinantem pRb Protein (für cdk4 oder cdk6) als Substrat. Die Menge inkorporierter Radioaktivität wurde mittels SDS-PAGE ermittelt und in einem Phosphorimager mit TINA Software analyisiert. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments sind dargestellt zusammen mit der quantitativen Bestimmung durch Pooling von drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert + SEM), y-Achse: Werte in cpm x 10-3, schwarze Balken: ohne IGF-I; weiße Balken: mit IGF-I.
Abbildung 20: E2F-1 und IGF-I induzieren den Wiedereintritt in den Zellzyklus in Kardiomyozyten neonataler Ratten. Die Zellkulturen wurden mit Ad-E2F-1 infiziert und behandelt wie in Abbildung 16 beschrieben. A, [3H]-Methyl-Thymidin Inkorporation unter den angegebenen Dosen von IGF-I in E2F-1 überexprimierenden Kardiomyozyten (Mittelwert + SEM von drei unabhängigen Experimenten). B, Zellkulturen wurden für 4 Stunden mit BrdU markiert 24 Stunden nach der Infektion mit Ad-E2F-1. Die auf den Objektträgern befindlichen Zellen wurden dann mit FITC-markiertem anti-BrdU Antikörper (grün) und kardiomyozyten-spezifischem anti-sarkomeren Tropomyosin Antikörper (rot) gefärbt. C, Zellen wurden trypsiniert und in 70%-igem Äthanol fixiert. Zur Bestimmung der Zellzyklusverteilung wurden die Zellen anschließend mit Propidium Jodid gefärbt und mit FACS analysiert. Unter Verwendung von Multicycle Software (Coulter) wurde der Prozentsatz der Zellen in den jeweiligen Zellzyklusphasen bestimmt und in der Abbildung dargestellt. Das Ergebnis eines repräsentativen Experimentes ist dargestellt.
Abbildung 21: Modell zur Darstellung des Effektes von E2F-1 in Kardiomyozyten in der Ab-, bzw. Anwesenheit von IGF-I.
Abbildung 22: Effekt von H2O2 oder XO/X auf die Lebensfähigkeit kardialer Zellen. A, die Lebensfähigkeit wurde mittels MTT-Assay bestimmt, nachdem die Zellen für 1 Stunde mit den angegebenen Dosen von H2O2 plus 0.1 mmol/L FeSO4 behandelt und für weitere 19 Stunden in ROS-freiem Medium kultiviert wurden. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert (+ SEM) von drei unabhängigen Experimenten (n = 16 Slots in jedem individuellen Experiment); *p<0.05, ** p<0.01, verglichen mit unstimulierten Kontrollzellen. B, die Lebensfähigkeit wurde mittels Ausschluß von Trypanblau bestimmt, nachdem die Zellen für 1 Stunde mit den angegebenen Dosen von XO plus 0.1 mmol/L Xanthin behandelt und für weitere 7 Stunden in ROS-freiem Medium kultiviert wurden; *p<0.05, ** p<0.01 verglichen mit unstimulierten Kontrollzellen. C, Zellen wurden mit 0.04 U/ml XO plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von 1000 U/mL Superoxid-Dismutase (SOD), oder 500 U/mL Catalase (CAT), oder 1 mmol/L Tiron exponiert. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM von 4 unabbängigen Experimenten in Duplikat; *p<0.05, ** p<0.02, verglichen mit XO/X.
Abbildung 23: Bestimmung von ROS-induzierter Apoptose in kardialen Zellen. DNA-Fragmentierung wurde mittels ELISA bestimmt, wobei die Zellen wie in Abb. 22 beschrieben behandelt wurden unter Verwendung der angegebenen Dosen von A, H2O2 or B, XO/X or C, mit 0.04 U/ml XO plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von SOD (1000 U/ml), oder Tiron (1 mmol/L), und/oder CAT (500 U/ml). Die Histon-assoziierten DNA-Fragmente werden als optische Dichte bei 405 nm präsentiert (Mittelwerte + SEM von drei unabhängigen Messungen in Triplikat); *p<0.05, verglichen mit der Kontrolle. D, TUNEL (grün) und Immunfluoreszenz mit anti-sarkomerem Tropomyosin Antikörper (rot) von kardialen Kontrollzellen und stimulierten kardialen Zellen. Die kultivierten Zellen wurden mit 0.1 mmol/L H2O2 plus 0.1 mmol/L FeSO4 stimuliert wie in Abb. 22 beschrieben. Pfeile deuten auf TUNEL-positive Kardiomyozyten.
Abbildung 24: Western-Blot Analyse der Expression von p53 und Bad in Kardiomyozyten, die mit 0.1 mmol/L H2O2 plus 0.1 mmol/L FeSO4 oder mit 0.04 U/ml XO plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von 500 U/ml CAT stimuliert wurden. Die Zellen wurden für 1 Stunde stimuliert und anschließend in normalem Kulturmedium für die angegebene Zeit kultiviert. Dargestellt sind repräsentative Blots von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.
Abbildung 25: Beteiligung der Freisetzung von Cytochrom C und Aktivierung von CPP32 in ROS-induzierter Apoptose von Kardiomyozyten. Dargestellt sind die Expressionswerte von Cytochrom C (cyt c) und Cytochrom Oxidase (cox) in den zytosolischen Extrakten, sowie die Aktivierung von CPP32 und Spaltung von PARP bestimmt durch Immunoblot-Analyse. Die Kardiomyozyten Kulturen wurden stimuliert mit A, 0.1 mmol/L H2O2 plus 0.1 mmol/L FeSO4, oder mit B, 0.04 U/ml XO plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von 500 U/ml CAT. Die Zellen wurden für 1 Stunde stimuliert und anschließend in normalem Kulturmedium für die angegebene Zeit kultiviert. Dargestellt sind repräsentative Blots von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.
Abbildung 26: Immunoblot Detektion von O2--induzierter Aktivierung von Mch2alpha in Kardiomyozyten. Zellen wurden stimuliert mit 0.04 U XO/mL plus 0.1 mmol/L Xanthin in der Anwesenheit von 500 U/mL CAT. A, Bestimmung der DNA-Fragmentierung mittels ELISA. Z-VAD-fmk wurde in den angegebenen Konzentrationen 2 Stunden vor und unmittelbar nach Behandlung mit ROS zugegeben. *p<0.05, verglichen mit XO/X+CAT allein. B, Immunoblot Analyse von Mch2alpha und der aktiven Form p20, und C, von Lamin A und dem Spaltprodukt p46; Tiron (1 mmol/L), Z-VAD-fmk (50 µmol/L). Dargestellt sind repräsentative Blots von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.
Abbildung 27: Subzelluläre Verteilung von Bad, Bax und Bcl-2 und die Interaktion von Bad oder Bax mit Bcl-2 in Kardiomyozyten, die für 1 Stunde mit 0.1 mmol/L H2O2 plus 0.1 mmol/L FeSO4 behandelt und anschließend für die angegebene Zeitdauer in normalem Kulturmedium kultiviert wurden. A, Anschließend an die Präparation zytosolischer Fraktionen, Fraktionen mit schweren Membranen (HM) und Fraktionen mit leichten Membranen (LM) wurden Bad, Bax und Bcl-2 unter Verwendung ihrer spezifischen Antikörper immunpräzipitiert und dann zur Immunblot-Detektion mittels SDS-PAGE aufgetrennt. B, Die Immunpräzipitation von Bad und Bax wurde in den Fraktionen mit schweren Membranen durchgeführt und die immunpräzipitierten Mengen wurden mittels Immunoblot und einem Anti-Bcl-2 Antikörper analysiert. Dargestellt sind repräsentative Blots von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

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Wed Oct 25 11:10:46 2000