2 Methode

Es wurde im Zeitraum von Januar 2000 bis August 2002 eine prospektive Studie im Deutschen Herzzentrum Berlin, Abteilung für Herz- Thorax- und Gefäßchirurgie und in der Abteilung für Radiologie und Nuklearmedizin, Charite, Campus Virchow-Klinikum, Humboldt-Universität Berlin durchgeführt. Es wurden vor einer Aortokoronaren Venen-Bypassoperation (ACVB) bzw. A.mammaria Implantation in das Koronarsystem präoperativ neben der routinemäßig durchgeführten Koronarangiographie und Elektrokardiographie, eine Echokardiographie, eine Myokardszintigraphie und eine Magnetresonanztomographie durchgeführt. Intraoperativ wurde vor der Revaskularisation eine Myokardbiopsie entnommen. Sechs Monate post operationem erfolgte dann eine Wiederholung der präoperartiv durchgeführten Myokardfunktions- und Vitalitätsdiagnostik.


[Seite 38↓]

2.1  Patienten

Es wurden im Zeitraum Untersuchungszeitraum insgesamt 45 Patienten in die Studie aufgenommen. Nach den präoperativen Untersuchungen wurden vier Patienten wieder ausgeschlossen. Bei einem Patienten fand sich in allen Untersuchungen (PET, MRT, SPECT und Echokardiographie) kein Hinweis auf eine Myokardischämie, so dass kein Revaskularisationsziel vorhanden war. Bei drei Patienten war die LVEF > 30 %, sodass schließlich 41 Patienten in der Studie untersucht werden konnten. Das Alter der Patienten lag zum Zeitpunkt der Operation bei im Mittel 63,8 ± 9,9 Jahren. Der älteste Patient war 82 Jahre alt, der jüngste 36 Jahre. Zwei Patienten waren weiblich, 39 männlich. Bei stationärer Aufnahme der Patienten zur Operation wurden die Patienten hinsichtlich dem Schweregrad ihrer Herzinsuffizienz in die Klassifikation der New York Heart Association (NYHA) (107) eingeteilt (s.Abb.3).

Abbildung 3: Präoperative NYHA-Klassifikation der 41 Studienpatienten:
Klasse I = 0 Patienten; Klasse II = 10 Patienten (24,4%); Klasse III = 28 Patienten (68,3%); Klasse IV = 3 Patienten (7,3%). Die Säulen zeigen die Anzahl der Patienten in %.


[Seite 39↓]

Außerdem wurden die Patienten nach ihrer Angina Pectoris Symptomatik in die Klassifikation der Canadian Cardiovascular Society (CCS) (108) eingruppiert (s.Abb.4).

Abbildung 4: CCS-Klassifikation präoperativ: Klasse I = 15 Patienten (36,6%); Klasse II = 7
Patienten (17,1%); Klasse III = 17 Patienten (41,5%); Klasse IV = 2 Patienten (4,9%).

In der folgenden Tabelle sind die Altersverteilung, die kardialen Risikofaktoren, die anamnestisch festgestellte Anzahl der präoperativen Herzinfarkte und die präoperative Medikation der Studienpatienten aufgelistet.


[Seite 40↓]

Tabelle 2: Insgesamt wurden 41 Patienten in die Studie eingeschlossen.
Die Tabelle gibt einen Überblick über die Altersverteilung, Anzahl der präoperativen
Herzinfarkte, Geschlechtsverteilung, Anzahl der Ballondilatationen und Medikation.

Parameter

Anzahl der Patienten

%

Alter (Jahre)

  

36 - 50

4

9,8

51 - 70

27

65,9

> 70

10

24,4

Geschlecht

  

männlich

39

95,1

weiblich

2

4,9

Kardiale Risikofaktoren

  

Hypertonie

32

78,0

Diabetes mellitus

24

58,5

Nikotin

28

68,3

Hypercholesterinämie

30

73,2

Anzahl der Herzinfarkte

  

0

9

22,0

1

26

63,4

2

4

9,8

3

2

4,9

PTCA präoperativ

8

19,5

Medikation

  

Diuretika

ACE-Hemmer

Nitrate

Ca-Antagonisten

ß-Blocker

30

35

19

14

30

73,2

85,4

46,3

34,1

73,2

Die mittlere Anzahl an kardialen Risikofaktoren der Patienten betrug 2,7±0,9. In der folgenden Tabelle ist die Häufigkeit der vorhandenen kardialen Risikofaktoren in dem Studienkollektiv (41 Patienten) aufgelistet. Die Tabelle zeigt, dass 87% der Patienten mehr als einen Risikofaktor trugen.

Tabelle 3: Häufigkeit von kardialen Risikofaktoren (Nikotin, Hypertonus, Hyperlipidämie,
Diabetes mellitus) bei 41 Patienten.

Anzahl der kardialen Risikofaktoren

Anzahl der Patienten

%

4

12

29,3

3

15

36,6

2

9

22,0

1

3

7,3

0

2

5,4


[Seite 41↓]

In der folgenden Tabelle sind alle Studienpatienten in der Reihenfolge ihrer Aufnahme dargestellt.


[Seite 42↓]

Tabelle 4: Die Tabelle zeigt alle Patienten der Studie. Patient Nr.3 wurde nicht operiert, da mit keiner Methode ein „Myokardischämie-Nachweis“ präoperativ gelang. Die Patienten 4,5 und 9 hatten präoperativ eine zu hohe linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) in den Untersuchungen der Studie („falsch niedrige“ Bestimmung in der Herzkatheteruntersuchung) und mussten daher ausgeschlossen werden. Ihre ursprünglich bei Einweisung angegebene linksventrikuläre Funktion ist in der Tabelle in Klammern gesetzt.

Patienten- Nr.

Alter (Jahre) zum Zeitpunkt der OP

Geschlecht

LVEF (%)

Während der Dauer der Studie verstorben: JA/NEIN

Studienausschluss

1

75

männlich

28

JA

2

36

männlich

30

NEIN

3

72

männlich

13

Von der Studie ausgeschlossen

Nicht operiert/keine Ischämie

4

51

männlich

40(30)

Von der Studie ausgeschlossen:

LVEF über 30%

5

63

männlich

57(30)

Von der Studie ausgeschlossen:

LVEF über 30%

6

68

männlich

20

NEIN

7

66

männlich

20

NEIN

8

72

männlich

24

JA

9

61

männlich

44(30)

Von der Studie ausgeschlossen:

LVEF über 30%

10

68

männlich

30

NEIN

11

59

männlich

30

JA

12

60

männlich

30

NEIN

13

79

männlich

30

NEIN

14

82

männlich

30

NEIN

15

67

männlich

30

NEIN

16

50

männlich

20

NEIN

17

78

männlich

30

NEIN

18

56

männlich

15

NEIN

19

53

männlich

25

NEIN

20

64

männlich

15

NEIN

21

60

männlich

30

NEIN

22

61

männlich

30

NEIN

23

78

weiblich

30

JA

24

63

männlich

30

NEIN

25

70

männlich

30

NEIN

26

63

männlich

30

NEIN

27

62

männlich

20

JA

28

75

männlich

30

NEIN

29

68

männlich

27

NEIN

30

65

männlich

30

NEIN

31

60

männlich

30

NEIN

32

53

männlich

30

NEIN

33

42

männlich

25

NEIN

34

49

männlich

25

NEIN

35

52

männlich

15

NEIN

36

77

weiblich

30

NEIN

37

76

männlich

22

NEIN

38

70

männlich

30

NEIN

39

60

männlich

20

NEIN

40

65

männlich

30

NEIN

41

60

männlich

15

NEIN

42

63

männlich

30

NEIN

43

65

männlich

15

NEIN

44

67

männlich

25

NEIN

45

67

männlich

30

NEIN

Mittelwert

63,8±9,9

 

26,0±4,7

 

2.2 Echokardiographie

Bei allen Studienpatienten wurde präoperativ eine Echokardiographie transthorakal (TTE) und transoesophageal (TEE) durchgeführt. Sechs Monate postoperativ wurden diese Untersuchungen wiederholt. In Anlehnung an die [Seite 43↓]Untersuchungen von Vanoverschelde et al (148) wurde ein Patient als „verbessert“ eingestuft, wenn die LVEF um mindestens 5% postoperativ in Ruhe gesteigert war, andernfalls wurde er als „nicht verbessert“ eingestuft. Die Patienten, die sich postoperativ „verbessert“ zeigten, wurden in die Gruppe I eingeteilt, diejenigen, die als „nicht verbessert“ eingestuft wurden, kamen in die Gruppe II. Anschließend wurden alle präoperativen Untersuchungsergebnisse der Gruppe I und II miteinander verglichen, um Prädiktoren für eine funktionelle kardiale Verbesserung bei Patienten mit KHK und LVEF ≤ 30% nach Koronarrevaskularisation zu ermitteln.

2.2.1 Transthorakale Echokardiographie (TTE)

Die TTE wurde 1-dimensional und 2-dimensional durchgeführt. Das 1-dimensionale M-Mode Verfahren hat ein extrem hohes Auflösungsvermögen entlang des Ultraschallstrahls (1000 Impulse/s) und bietet somit eine präzise Abbildung von Grenzflächen, die senkrecht zum einfallenden Ultrastrahl liegen (88). Das M-Mode Verfahren eignet sich zur Ermittlung von Wanddicken, intrakavitären Dimensionen und ihren Änderungen und zur Bestimmung von Wandbewegungen der Herzkammern. Die Sonde wurde im 3. und 4. Interkostal-Raum (ICR) links parasternal angesetzt. Mit der 2-dimensionalen Darstellung konnte das Herz räumlich korrekter dargestellt werden, durch variable Schallkopfstellung konnten verschiedene Schnittebenen gelegt werden. Das Auflösungsvermögen liegt bei 30-50 Bildern/s. Mit diesem Verfahren wurde z.B. der linksventrikuläre enddiastolische Diameter gemessen.

2.2.2 Transösophageale Echokardiographie (TEE)

Der Patient musste für die Untersuchung nüchtern sein. Die Untersuchung wurde [Seite 44↓]in Rachenanästhesie (Lokalanästhesie) durchgeführt. Die TEE erfolgte mittels eines am distalen Ende eines Endoskops angebrachten verkleinerten Schallwandlers vom unteren Anteil der Speiseröhre bzw. vom Magenfundus aus. Der Durchmesser des Schaftes betrug 9 mm, der Durchmesser des Transducer 13 mm. Mit der TEE gelingt v.a. eine bessere Beurteilung der Hinterwand der linken Herzkammer als mit der TTE. Die Stressechokardiographien (s. unter 2.2.3) wurden als TEE durchgeführt.

2.2.3 Dobutamin Stressechokardiographie

Bei Dobutamin handelt es sich um ein synthetisch hergestelltes Katecholamin, welches dosisabhängig, zuerst positiv inotrop, bei höheren Dosen positiv chronotrop wirkt. Es resultiert ein gesteigerter Sauerstoffbedarf des Myokards, so dass es im Perfusionsgebiet einer stenosierten Herzkranzarterie zu Wandbewegungsstörungen kommt. Wandbewegungs- und Wanddickenanalyse waren die Befunderhebungen des Dobutamin-Streßtestes. Außerdem wurde die LVEF unter maximal erreichter Belastung gemessen. Der unmittelbare Vergleich der Wandbewegung bzw. provozierter Wandbewegungsstörungen wurde durch die digitale Bildspeicherung möglich. EKG-getriggert konnte eine Bildschleife („cineloop“) aus 8 Bildern/Zyklus einer Herzaktion erstellt werden und auf dem Monitor EKG-synchronisierte Bildschleifen unterschiedlicher Belastungsstufen simultan wiedergegeben werden.

Der Nachweis von vitalem Myokard gelingt mit dieser Untersuchung folgendermaßen: In niedriger und hoher Dosierung kann bei Patienten mit chronischer KHK eine biphasische Antwort beim „Hibernating Myocardium“ festgestellt werden. Bei niedriger Dosierung ist eine vorübergehende Wanddickenzunahme Ausdruck vitalen Myokards. Eine Kontraktionsabnahme [Seite 45↓]unter Erhöhung der Dosis ist als Ischämie zu werten (85). Ein solches Segment im Myokard wurde als „Area of Interest“ beschrieben und intraoperativ später biopsiert (86, 87).

Die Dobutamin-Dosis wird Stufenweise erhöht:

Tabelle 5: Belastungsstufen während der Stressechokardiographie

Stufe 0

Startdosis

2,5 μg/kg/min

Stufe 1

Nach 3 min

5 μg/kg/min

Stufe 2

Nach 3 min

10 μg/kg/min

Stufe 3

Nach 3 min

15 μg/kg/min

Stufe 4

Nach 3 min

20 μg/kg/min

Segmentmodel und Ejektionfraktion

Die Einteilung des linken Ventrikels erfolgte in 12 Segmente nach einer Methode von Haas et al, modifiziert nach Hetzer (84). In allen 12 Segmenten wurde die Wandkinetik und im M-Mode die Wanddicken in Systole und Diastole gemessen.

Abbildung 5: Patientenprotokoll der Echokardiographie: Es ist die Einteilung der 12 Segmente dargestellt, sowie deren Fächenanteil am gesamten Ventrikel in %. Der Untersucher bestimmte hier das Segment der „Area of interest“.


[Seite 46↓]

Alle Messungen erfolgten in zwei Schnittebenen. Der erste Schnitt erfolgte als Querschnitt auf der Basisebene des linken Ventrikels, der zweite in der Mitte des linken Ventrikels auf Höhe der Papillarmuskeln. Es wurden die linksventrikulären enddiastolischen und endsystolischen Diameter gemessen. Ferner wurde die linksventrikuläre Ejektionsfraktion nach „Simpson Rule“(83) bestimmt. Dazu wurden für die lange Achse zwei Aufnahmen im 4 und 5 Kammer-Blick erstellt. Die Enddiastole wurde definiert als die größte Fläche mit dem kürzesten Abstand zum Beginn des QRS-Komplexes im EKG und die Endsystole als die darauf folgende kleinste Ventrikelfläche. Die Auswurffraktion wurde aus der Differenz zwischen enddiastolischem und endsystolischem Volumen berechnet, als Prozentsatz des enddiastolischen Volumens. Die Wandbewegungsanalyse erfolgte aus den standardisierten 2-dimensionalen Echogrammen (TEE und 4 Kammerübersicht im TTE).

2.2.4 Wandbewegungsscore

Die regionale Wandbewegung wurde nach einem Wandbewegungsscore in 6 Qualitäten klassifiziert.

Tabelle 6: Wandbewegungsscore für die segmentale Wandbewegungsanalyse

Wandbewegungsscore

Kinetik

0

Dyskinesie

1

Akinesie

2

Schwere Hypokinesie

3

Leichte Hypokinesie

4

Normokinesie

5

Hyperkinesie


[Seite 47↓]

2.2.5  Klassifizierung der Zustandsformen des Myokards

Das Myokard wurde nach dem segmentalen Wandbewegungsscore (WS) und nach der Wanddickenbestimmung in

unterteilt. Als „Area of Interest“ wurde das Ventrikelsegment bestimmt, welches die echokardiographischen Kriterien für die Klassifizierung „Hibernating Myocardium“ aufwies (s.Tabelle 5).

Tabelle 7: Die Zustandsformen des Myokards, bestimmt nach Wanddickenmessung und Wandbewegungsscore (WS), wurden vom Untersucher (Echokardiographie) definiert.

Normales Myokard

Enddiastolische Wanddicke >7mm

Systolische Wanddickenzunahme mind.: Hinterwand 40%; Vorderwand 50%

Normokinesie (WS 4)

Myokardnarbe

Enddiastolische Wanddicke ≤ 7mm

Keine systolische Wanddickenzunahme

Akinesie oder Dyskinesie (WS 0-1)

Hibernating Myocardium

Enddiastolische Wanddicke 7-10mm

Systolische Wanddickenzunahme von unter 20%

Schwere Hypokinesie oder Akinesie (WS 1-2)

Übergangsformen (Ischämien)

Wanddicke ≥ 7mm

Systolische Wanddickenzunahme 10-40%

Schwere oder leichte Hypokinesie (WS 2-3)

2.2.6 Kontrastechokardiographie

Das Kontrastmittel ermöglicht eine bessere Abgrenzung der Herzwände bzw. eine [Seite 48↓]bessere Abgrenzung des Endokards. Es wurde das Kontrastmittel Optison verwendet. Es besteht aus octafluorpropanhaltigen Mikrosphären aus hitzebehandelten Albumin vom Menschen, die in 1%igen Albuminlösungen vom Menschen suspendiert sind. Weitere Bestandteile von Optison sind Natriumchloridlösung N(2)-acetyl DL-Tryptophan, Octansäure, Natriumhydroxid und Wasser. Die empfohlene Dosierung beträgt 0,5-3,0 ml pro Patient. Die Gesamtdosis sollte 8,7ml nicht überschreiten. Das Kontrastmittel wird

über eine periphere Vene injiziert. Die Resonanzfrequenzen der Mikrogasbläschen, aus denen das Ultraschallkontrastmittel besteht, liegen üblicherweise im Bereich der Frequenzen, die zur Ultraschalldiagnostik verwendet werden. Die Bläschen schwingen asymmetrisch und erzeugen dabei Resonanzfrequenzen, so genannte harmonische Oberschwingungen. Die Amplituden der harmonischen Frequenzen addieren sich zu der Amplitude der harmonischen Signale. Diese können mit „Harmonic Imaging“ gemessen werden. Im Vergleich zur herkömmlichen Echokardiographie ist der Unterschied zwischen Gewebesignalen und Kontrastsignalen bei Verwendung der harmonischen Frequenzen deutlich größer. Daher führt „Harmonic Imaging“ zu einer eindrucksvollen Verstärkung der Kontrastmittelsignale (89).

2.2.7 Technische Ausrüstung im Echokardiographielabor

2.2.8 Abbruchkriterien der Stressechokardiographie

2.2.9 Nachbetreuung

Nach der Rachenanästhesie war für ca. 1 Stunde die Nahrungsaufnahme nicht erlaubt, um eine Aspiration zu vermeiden. Die Probanden wurden noch 30 Minuten überwacht.

2.3 Myokardszintigraphie

Präoperativ wurde eine Myokardszintigraphie (201-Thalliumchlorid) durchgeführt, wenn keine solche Untersuchung aus den letzten 6 Monaten vor der Operation vorlag. Es wurde eine intravenöse Applikation von 85 Mbq 201-Tl-Chlorid in Ruhe [Seite 50↓]mit einer SPECT-Acquisition nach 30 Minuten durchgeführt. Nach weiteren 60 Minuten erfolgte eine Injektion von ca. 250 Mbq 99mTc-MIBI nach pharmakologischer Belastung mit Dobutamin in Analogie zur Stressechokardiographie; 30 Minuten später Durchführung der 2.SPECT-Acquisition ebenfalls an einer Dreikopf- Gammakamera (Multi-SPECT, Siemens; PowerMac Workstation mit ICON-Software Version 9.5-Siemens, Erlangen), 270 Grad, 6 Grad Winkelschritte, „Stepp and Schood Mode“. Die Aufnahmen wurden gemäß der Richtlinien der „American College of Cardiology/American Heart Association Task Force“ für die klinische Radionukliddarstellung des Herzens durchgeführt (91).

2.3.1 Gated-Myokard-Single Photon Emission Computer Tomography

Die EKG-getriggerte myokardiale Single Photon Emission Computer Tomography (SPECT) erlaubt die gleichzeitige Erfassung von Perfusion, Pumpfunktion und Kontraktion in dreidimensionaler Technik. Es handelt sich um eine schichtweise Untersuchung. Mittels automatisierter Definition (Siemens GS Quant) des Endokards in den zentralen vertikalen und horizontalen Längsschnitten zum Zeitpunkt der Enddiastole und der Endsystole nach vorangegangener manueller Schnittlegung in den vertikalen und horizontalen Langachsenschnitten und retrospektiver EKG-Triggerung der Rohdaten (Siemens ICON 9.5) können sowohl das enddiastolische als auch das endsystolische Volumen bestimmt werden. Als abgeleitete Funktionsparameter lassen sich dann das Schlagvolumen und die Austreibungsfraktion (LVEF) berechnen. Dazu wurde das computergestützte Programm GS-Quant (Siemens, Erlangen, Germany) verwendet (92). Der prozentuale Nuklid-uptake wurde mit der Emory Cardiac Toolbox, Version 1.0 [Seite 51↓](Siemens and Emory University, Atlanta, Georgia, USA) bestimmt (93). Es wurde das schwach-radioaktive Nuklid intravenös gespritzt, das sich dann entsprechend der Durchblutung im Herzmuskel anreichert. Die verwendete 3-Kopf Gammakamera (Siemens MultiSPECT) rotierte dann in Intervallen von 20 (Ruhe) bis 45 Sekunden (Belastung) um den Patienten herum. Computergestützt wurde die Radioaktivität des Myokards gemessen. Dabei wurde analog zu den echokardiographischen Untersuchungen das 12-Segmentmodel benutzt (s.2.2.4). Der Nuklid-uptake jedes Segmentes wurde mit dem Segment mit dem höchsten uptake verglichen. In einer Modifikation der Studie von Nagueh et al wurde ein maximaler uptake von ≥ 50% unter Belastung und das Fehlen eines Thallium-Speicherdefektes als beweisend für Vitalität erachtet (79). Thallium-Speicherdefekte von mehr als 50% der Fläche eines Segmentes klassifizierten dieses als myokardiale Narbe, genau wie ein Technetium uptake von < 50% in einem Segment (54).


[Seite 52↓]

Abbildung 6: Myokardszintigraphie am gesunden Herzen: Gezeigt sind drei einzelne Schichten. „short axis“ bezeichnet einen Schnitt senkrecht zur Herzlängsachse (Klappenebene-Apex), „long axis“ parallel zur Herzlängsachse. (VW: Vorderwand; SP: Septum; LW: laterale Wand: HW: Hinterwand; AP: Apex=Herzspitze).


[Seite 53↓]

Abbildung 7: Schnittebenen der Myokardszintigraphie.

Abbildung 8: Myokardszintigraphie eines 62 Jahre alten Patienten mit KHK. Aufnahme nach Injektion des Nuklids Tc-99m MIBI in Ruhe (gelbe Pfeile markieren die Herzspitze).


[Seite 54↓]

Abbildung 9: Myokardszintigraphie unter Belastung bei dem gleichen Patienten wie in der Voraufnahme. Deutlich ist der Speichdefekt in der Herzspitze (gelbe Pfeile) zu erkennen.

Nach Messung des Nuklid-uptakes der einzelnen Segmente wurde ein Vitalitätsscore nach Pagley et al berechnet (94).

Tabelle 8: Vitalitätsscore für Thallium-Szintigraphie nach Pagley

Vitalität

uptake

Scorepunkte

Normal

> 75%

2

Milder Defekt

50 - 75%

1

Schwerer Defekt

< 50%

0

2.4 Magnetresonanztomographie (MRT)

Die MRT – Untersuchung wurde im Anschluss an die Myokardszintigraphie,

spätestens im zeitlichen Abstand von 48 Stunden durchgeführt. Sie erfolgte an einem MR-Tomographen mit 1.5 Tesla Feldstärke (Gyroscan ACS-NT, Philipps, Niederlande). An dem zuletzt genannten Gerät ist eine Perfusionsmessung mit einer zeitlichen Auflösung von 1-2 Bildern pro Herzschlag in 3 Schichten a 10mm möglich, so dass im Kurzachsenschnitt die Herzbasis, Papillarmuskelregion und der Apex beurteilt werden konnten (Dauer ca. 20 Sekunden Atemanhalten). Der Patient lag während der gesamten Untersuchung in Rückenlage. Die [Seite 55↓]Untersuchungen erfolgten EKG getriggert unter Verwendung einer Oberflächenspule, die auf den Brustkorb des Patienten gelegt wurde, um das Signal/Rauschverhältnis im Vergleich zur Körperspule zu verbessern.

Zur Überwachung stand im MRT neben einer 1-Kanal Brustwand EKG-Ableitung, die auch zur Triggerung des MR-Impulses verwendet wurde, ein Pulsoxymeter und eine Einheit zur kontinuierlichen Blutdrucküberwachung zur Verfügung. Außerdem erfolgte vor der Untersuchung, nach der Untersuchung sowie beim Auftreten von pektanginösen Beschwerden des Patienten die Ableitung eines 12-Kanal-EKGs. Die EKG-Ableitung war außerhalb des Scanners im Untersuchungsraum auf der Untersuchungsliege jederzeit möglich. Die Kommunikation zwischen Untersucher und Patient wurde über eine Gegensprechanlage hergestellt. Über eine Videoanlage bestand Sichtkontakt zum Probanden während der Untersuchung.

In Analogie zur Beurteilung der Myokardperfusion und Wandkinetik in der Stressechokardiographie und der Myokardszintigraphie, wurden für die dynamische Untersuchung 12 Segmente untersucht. Zur Beurteilung der Wandkinetik konnten während der pharmakologischen Belastung von 4 Minuten drei Schichten zu 10 mm in der kurzen Achse (2-Kammerblick) und eine Schicht in der langen Achse (4-Kammerblick) untersucht werden. In der Ruhephase wurden bis zu 12 Kurzachsenschnitte mit 2-Kammerblick erstellt. Die Perfusionsmessung konnte z.Zt. als „first pass“ Untersuchung mit einer hohen zeitlichen Auflösung von ca. zwei Bildern pro Herzschlag nur in einer Schicht durchgeführt werden, weshalb dies nur am Ort der Minderspeicherung in der Szintigraphie bzw. an der Stelle der Biopsieentnahme durchgeführt wurde. Das hierzu verwendete Kontrastmittel-Gadolinium DTPA (Schering) für MRT ist seit Jahren erprobt und auf dem Markt [Seite 56↓]für jedermann erhältlich und für die Indikation „Darstellung von geschädigtem Myokard“ zugelassen. Es wurde eine Kontrastmittelkonzentration von 0.05mmol/kg angestrebt. Die Aufnahmedauer betrug ca. 100 ms pro Bild. Die Akquisition wurde auf die Enddiastole getriggert. Die MR-Ventrikulometrie und Wandbewegungsanalyse erfolgte in Ruhe mit einer schnellen Gradientenechosequenz in 5 mm Schichtdicke im „multislice multiphase“ Verfahren unter Verwendung von retrospektivem gating, um Bilder über den gesamten Herzzyklus mit einer minimalen zeitlichen Auflösung von 50 ms zu erhalten. Durch manuelles Umfahren des Endokards zum Zeitpunkt der Enddiastole und –systole, Multiplikation mit der Schichtdicke und Summation der Schichtvolumina konnten Ventrikelvolumina, das Schlagvolumen und die Ejektionsfraktion bestimmt werden.

Abbildung 10: MRT-Zweikammerblick


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Abbildung 11: MRT-Vierkammerblick

Abbildung 12: MRT-Kurzachsenschnitt (gelber Pfeil: laterale Myokardnarbe)


[Seite 58↓]

Eine Wandbewegungsanalyse über den gesamten Herzzyklus war in Ruhe möglich und wurde nach derselben Score durchgeführt, der auch in der Echokardiographie benutzt worden war (2.2.5).

Für die Bestimmung des „late enhancement“ erfolgten „inversion recovery“-Sequenzen 20 Minuten nach Gabe von 0,2 mmol/kg/KG GdDTPA intravenös in den gleichen Ebenen wie bei der Stressmagnetresonanztomographie.

Die Quantifizierung des „late enhancement“ erfolgte mit dem Amira System (Version 2.3 Konrad – Zuse –Zentrum, Berlin). Der Untersucher des „late enhancement“ wurde gegenüber den Untersuchern der Wandbewegungsanalyse und Wanddickenmessung „geblindet“. Wenn 20 Minuten nach Gabe des Gadolinium DTPA die Signalintensität in ≥ 50% der Fläche eines Segmentes zunahm („late enhancement“), wurde dieses Segment als Narbe klassifiziert, gemäß der Vorstellung von Lauerma (95), dass hier der extrazelluläre Raum signifikant vergrößert ist. Eine Zunahme der Signalintensität wurde registriert wenn diese 2 Standardabweichungen über der mittleren Signalintensität aller Segmente lagen. Nach Kim et al, ist hier eine Verbesserung der Kontraktilität nach Revaskularisation nicht mehr zu erwarten (61). Dieses galt es auch an unseren Patienten mit einer LVEF ≤ 30 % zu prüfen.


[Seite 59↓]

Abbildung 13: MRT-Vierkammerblick: Achsenschnitte der MRT-Untersuchungen (RV: Rechter Ventrikel, LV: Linker Ventrikel)


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Abbildung 14: Segmenteinteilung in der MRT analog der Einteilung in der Echokardiographie: 1 Vorderwand-Basis, 2 Seitenwand-Basis, 3 Hinterwand-Basis, 4+5 Septum-Basis, 6 Vorderwand-Mitte, 7 Seitenwand-Mitte, 8 Hinterwand-Mitte, 9+10 Septum-Mitte, 11+12 Apex

2.5 Positronenemissionstomographie (PET)

Zur Beurteilung der Vitalität von Myokard ist nicht nur die Durchblutung des Herzmuskels für die genaue Diagnose von Bedeutung, sondern auch seine Versorgung mit Nährstoffen. Um diese sichtbar zu machen, muss man den Zuckerstoffwechsel im Muskelgewebe darstellen. Gegenüber gut durchbluteten, gesundem Myokard ändert sich die Glukose-Aufnahme (Glukose = Traubenzucker) im geschädigten Herzmuskelgewebe deutlich.

Am besten für die Darstellung der Nährstoffversorgung des Herzmuskels geeignet ist die Positronen-Emissions-Tomographie – kurz PET. Bei diesem Verfahren wird dem Patienten eine geringfügig modifizierte, radioaktiv markierte Form des [Seite 61↓]Traubenzuckers injiziert – das sogenannte FDG (Fluordesoxyglucose) –, die sich – abhängig von der Nährstoffaufnahme – in den Herzmuskelzellen anreichert (60).

Abbildung 15: Myokardszintigraphie eines 55jährigen Patienten nach einem Hinterwandinfarkt. Die reduzierte Durchblutung (gelbe Pfeile) ist gut zu sehen.

Abbildung 16: FDG-PET des gleichen Patienten wie in Abb.8, deutlich ist zu sehen (gelber Pfeil), dass gerade in den weniger durchbluteten Anteilen der Stoffwechsel erhöht ist. Hier spricht man von einem sogenannten Mismatch-Verhältnis. Die beiden Befunde scheinen sich zu widersprechen. Eine solche Befundkonstellation spricht für „Hibernating Myocardium“, welches von einer Revaskularisation profitieren könnte.


[Seite 62↓]

Misst man mit der PET-Kamera von außen die Verteilung des FDG im Herzmuskel, sind die gesunden Herzmuskelanteile kräftig „angefärbt“. Geschädigte Herzmuskelanteile weichen dagegen in ihrer FDG-Anreicherung und damit in ihrer Darstellung im PET-Bild deutlich davon ab. Sind einzelne Bereiche des Herzmuskels überhaupt nicht „angefärbt“ zu sehen, liegt hier Narbengewebe vor, das beispielsweise nach einem Herzinfarkt zurückbleiben kann.

Die PET wird zwar heute in der Literatur als „Goldstandard“ der Myokardvitalitätsdiagnostik beschrieben (58, 60, 96, 97, 98), dieses trifft jedoch für den „klinischen Alltag“ nicht zu. Das Verfahren ist zu teuer und in seiner Vorbereitung zeitlich für eine einzelne Untersuchung zu aufwendig, sodass es z.B. bei der Diagnostik bei Notfall-Patienten (mit akutem Koronarsyndrom) keine Bedeutung finden kann. Wir setzten die PET in unserer Studie entsprechend dem Verfahren im klinischen Alltag nur ein, wenn alle anderen Diagnoseverfahren (Echokardiographie, MRT, Szintigraphie -SPECT) einen negativen Befund hinsichtlich Myokardvitalität auswiesen oder ein größeres Areal der linken Herzkammer als Narbe ausgewiesen wurde, wohingegen die vitalen Bezirke eher als klein beschrieben worden waren. Damit konnten einige PET Untersuchungen kasuistisch mit den anderen Ischämie-Diagnoseverfahren verglichen werden.

2.6 Koronarangiographie

Alle Patienten wurden zur Operation mit dem Befund einer Koronarangiographie überwiesen. Aus der Laevokardiographie wurde die linksventrikuläre Ejektionsfraktion bestimmt (99). Patienten mit einer LVEF > 30 % wurden von dieser Studie ausgeschlossen. Aus der Koronarangiographie wurde, neben der Befundung der koronaren Stenosen, ein Koronarscore berechnet, der den Schweregrad der Arteriosklerose der Koronarien, deren Größe und Adaption in [Seite 63↓]Form von Kollateralbildungen beschreibt (16).

Tabelle 9: Koronarscore (1-3) nach Kleikamp (16)

Revaskularisationsmöglichkeit

Durchmesser der Gefäße

Gefäßbeschaffenheit

1 = gut

> 2,0 mm

Proximale Stenosen oder über Kollateralen aufgefüllte periphere Gefäßabschnitte jeweils ohne weitere distale Stenosen

2 = mäßig

> 1,5 mm

Wie 1, jedoch mit unterkritischen distalen Stenosen

3 = schlecht

≤ 1,5 mm

Proximale und distale Stenosen, rekanalisierte und skelettierte Gefäße

Abbildung 17: Nomenklatur der Koronararterien wie sie in dieser Studie bei der Auswertung der
präoperativen Koronarangiographien angewendet worden ist (Abb. aus 115).


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2.7  Elektrokardiogramm (EKG)

Bei allen Probanden wurde bei stationärer Aufnahme zur Operation ein 12 Kanal Ruhe-EKG geschrieben. Dieses wurde von einem erfahrenen Kardiologen, der die Ergebnisse der Untersuchungen der Ischämie-Diagnostik (MRT, Szintigraphie, Echokardiographie, ggf. PET) nicht kannte, befundet. Dabei wurden Herzrhythmusstörungen, Blockbilder, Zeichen eines Infarktes („q“, R-Verlust) oder ST-Streckenveränderungen (Ischämie in der „Area of interest“) in die Bewertung aufgenommen (100).

2.8 Operation

Alle Operationen wurden von mir am Deutschen Herzzentrum Berlin vorgenommen. Die Eingriffe erfolgten elektiv. Voraussetzung für die Akzeptanz zur Revaskularisation war außer der notwendigen Compliance des Patienten (s.1.5), allgemeine Operationsvoraussetzungen (ausreichende Lungenfunktion etc.), die Möglichkeit eines Gefäßanschlusses distal der Hauptstenosen, welche sich in der Angiographie erkennen ließen. Es wurde im Wesentlichen nach dem Verfahren wie es Jamieson und Lytle (101, 102) beschrieben haben operiert. Der Patient lag in Rückenlage und befand sich in Intubationsnarkose (103). Die Operation begann mit dem medianen Hautschnitt über dem Sternum, es folgte die Längssternotomie und die y-förmige Eröffnung des Perikardbeutels. Gleichzeitig wurde von einem zweiten Chirurgen die Vena saphena magna der unteren Extremität entnommen und zur Bypassanastomosierung präpariert (106). Parallel erfolgte die Präparation der A. mammaria, die anschließend mit Papaverin behandelt wurde (104). Nach Heparingabe wurde die Aorta ascendens kanüliert und ein Zweistufenkatheter über den rechten Vorhof in die untere Hohlvene zur venösen Drainage eingeführt. [Seite 65↓]Es erfolgten der Anschluss an die Herzlungenmaschine (HLM) und der Beginn der extrakorporalen Zirkulation. Danach wurde ein „Linksvent-Katheter“ über die rechte obere V. pulmonalis durch den linken Vorhof, transmitral in den linken Ventrikel eingelegt. Über diesen Katheter wurde nun zur Entlastung des linken Herzens kontinuierlich gesaugt. Anschließend wurde die Biopsie in der „Area of interest“, welche zuvor mit der Echokardiographie bestimmt worden war, entnommen. Nach der Entnahme der drei Biopsien (Lichtmikroskopie, Elektronenmikroskopie, Molekularbiologie) wurden die Stanzlöcher mit einer 5.0 Prolene Naht mit Hilfe von Perikardpatches verschlossen. Es wurde auf 32°C Körperkerntemperatur gekühlt, die Aorta ascendens ausgeklemmt und Kardioplegie in die Aortenwurzel gegeben. Außerdem wurde das Herz mit Eiswasser gekühlt. Es wurde eine magnesiumreiche, kristalloide Kardioplegie verwendet. Es folgte die Inspektion der Koronarien und das Aufsuchen von bypassfähigen Gefäßabschnitten. Die Koronararterien wurden durch Längsschnitt eröffnet und End-zu Seit mit dem distalen Ende des Venengrafts anastomosiert. Bei der fortlaufenden Nahttechnik wurde eine 7.0 oder 8.0 Prolene Naht verwendet. Sobald eine distale Anastomose gefertigt war, wurde Kardioplegie über diesen Bypass ins Koronarsystem infundiert. Zuletzt wurde die A.mammaria, zumeist auf den R. interventrikularis anterior (RIVA) anastomosiert und der Blutfluss sofort freigegeben.

Mit der Fertigstellung der Anastomosierung wurde das Herz orthograd entlüftet und die Aortenzirkulation freigegeben. Nachdem das Herz seinen Eigenrhythmus wieder aufgenommen hatte, wurde die Aorta ascendens tangential ausgeklemmt und es wurden kreisrunde Öffnungen entsprechend der Anzahl der Venengrafts in die Aortenwand gestanzt. Hier wurden die proximalen Anastomosen der [Seite 66↓]Venenbrücken mit fortlaufenden 6.0 Prolene in offener Nahttechnik angelegt. Nach Einlegen eines linksatrialen Druckkatheters, Entfernen des „Linksvent“ und ausreichender Wiederaufwärmung konnte dann von der HLM abgegangen werden. Es folgten Dekanülierung, Protamingabe und Blutstillung. Anschließend wurden Wunddrainagen gelegt und das Sternum mit 8 Stahldrähten verschlossen. Die Operation endete mit den Hautnähten an Thorax und unterer Extremität.

2.9 Biopsie

Alle Biopsien wurden im Arbeitsbereich „Herzpathologie“, Leiter: Prof. Dr. R. Meyer, bearbeitet und ausgewertet. Die Biopsie wurde mit einer 20mm langen, „true-cut“-Biopsienadel nach HLM -Anschluss und vor Kardioplegiegabe durchgeführt (79).


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Abbildung 18: Biopsieentnahme an der Vorderwand der linken Herzkammer am schlagenden
Herzen vor Gabe der kardioplegischen Lösung.

Die drei Proben (s.2.8) wurden in 8%iges, neutral-gepuffertes Formalin, in Glutaraldehyd und tiefgefroren in flüssigen Stickstoff gebracht. Für lichtmikroskopische Untersuchungen wurden HE-Färbungen (Hämatoxilin-Eosin) und Domagk-Färbungen angefertigt (130).

2.9.1 Untersuchung der histologischen Schnitte

Die histologischen Schnitte wurden nach gleichem Standard untersucht und in einem Befundbericht dokumentiert.

2.9.1.1. Herzmuskelzellen

Folgende Parameter wurden bewertet:

Tabelle 10: Größenklassen der Herzmuskelzelle

Klasse

Morphologie

Durchmesser

I

Keine Hypertrophie

bis 15 μm

II

Geringe Hypertrophie

15,1-17 μm

III

mittelgrosse Hypertrophie

17,1-19 μm

IV

Starke Hypertrophie

≥19,1 µm

Die Festlegung auf eine dieser Kategorien bedeutet, dass die große Mehrzahl der Herzmuskelzellen sich in einer Richtung verändert. Sollte eine solche Festlegung nicht möglich gewesen sein, so wurde zwischen den hauptsächlich vorkommenden Grössenklassen unterschieden. Für die Beurteilung und Beschreibung wurde immer die größere Klasse der Hypertrophie verwandt. War auch eine solche Entscheidung nicht möglich, wurden die Extreme der vorkommenden Größenklassen dokumentiert. Es bestand dann eine Störung der Myokardzellarchitektur.

2.9.1.2. Fibrose

Die Fibrose wurde nach folgenden Gesichtspunkten unterschieden:

Bei der Art der Fibrose wird unterschieden:

Bei der Ausprägung wurde zwischen örtlich und diffus unterschieden. Diese Unterscheidung betraf den Befall der Probe, d.h. ob die Fibrose in der gesamten Probe oder nur in Teilen nachweisbar war. Weiterhin wurde ausgewiesen, ob sich aus einer Fibrose eine Narbe entwickelte oder ob unabhängig von der Fibrose Narben bestanden. Ausserdem wurde das Vorkommen von Pseudoseptierung geprüft, d.h. ob durch die Fibrose eine Separierung der Herzmuskelzellen bzw. von Gruppen von Herzmuskelzellen erfolgt war. Bei der immunhistologischen Charakterisierung wurden die Subtypen der Kollagene bestimmt und ggf. ihr Anteil ausgemessen. Gegenwärtig werden die Subtypen III und V bestimmt. Bei der morphometrischen Bestimmung erfolgte mittels einer automatisierten Mikroskopbildauswertung, entwickelt von Dipl. Ing. T. Betz, Karl Zeiss und von Prof. Dr. R. Meyer (Deutsches Herzzentrum Berlin), die Bestimmung des Anteils des Bindegewebes aber auch anderer Strukturelemente am gesamten Material . Das Ausmaß der Fibrose und die Relation zwischen Fibrose und Narben wurden durch Einsatz der automatisierten Mikroskopbildauswertung reproduzierbar vermessen und als File abgelegt.


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2.9.1.3.  Endokard

Es wurden folgende Veränderungen unterschieden:

2.9.1.4. Terminale Strombahn

2.9.1.5. Vitalitätskriterien


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Aus diesen vier Parametern wurde dann über einen Score die Vitalität des Myokards abgeschätzt (105). Zum Abschluss erfolgte in Form der Diagnose und des Kommentars eine Bewertung aller Befunde.

2.9.2 Ermittlung des Messumfanges der Zellflächen

Um einen statistisch aussagekräftigen Messumfang zu ermitteln, wurde die folgende „Versuchspolitik der kleinen Schritte“ angewendet:

Von jeweils drei Messungen wurde Mittelwert (X) und Standardabweichung (S) berechnet. Dann wurde diese Population um jeweils drei weitere Messwerte erweitert, erneut X und S errechnet, und dieser Vorgang der Messung und der statistischen Berechnung so lange erweitert, bis sich X und S nicht mehr entscheidend änderten. Dieses Ziel wurde erreicht, indem der Quotient aus Standardfehler des Mittelwertes und Standardabweichung den Wert 0,10 erreichte. Dieser Rechenwert wurde nach 69 Messungen erreicht.

Abbildung 19: Ermittlung des Messumfanges für die Bestimmung der Zellflächen.


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2.9.3  Mikroskopie

Die Ermittlung der Herzmuskelzellen erfolgte an runden oder ovalen Querschnitten mit Kern. Dazu wurde ein halbautomatisiertes Bildverarbeitungssystem der Firma Zeiss verwendet, wobei ein Gerätesystem benutzt wurde, bestehend aus Mikroskop (Zeiss, Axioskop) und Videokamera (Sony Color Video, Typ 3CCD). Die ausgewählten Objekte wurden mit der Computermaus markiert. Mittels eines in der Meßsoftware KS 400 Release 3,1 eingeschlossenen Touls (KPR; entwickelt von Dipl. Ing. T.Betz und Prof. Dr. R. Meyer, Deutsches Herzzentrum Berlin) erfolgte die Messung. Dazu wurde eine 200fache Gesamtvergrößerung gewählt.

Innerhalb dieser definierten Objekte können die gezählten Pixel über eine Kalibrierung automatisch in Flächen, d. h. µm² umgerechnet werden. Die so gewonnenen Daten konnten dann in das Tabellenkalkulationsprogramm Excel (Microsoft) überführt und dort verarbeitet werden.

Dieses halbautomatische Verfahren erfordert allerdings zwei Bedingungen:

1. dürfen nur runde bis ovale Querschnitte erfasst werden und 2. muss sich innerhalb jedes Herzmuskelzellanschnittes eine Herzmuskelkernstruktur darstellen lassen.

Insgesamt wurden 2507 Herzmuskelzellen nach ihrer Größe vermessen. Retrospektiv wurden dann die Werte der Patientengruppe I (mit postoperativer Verbesserung der linksventrikulären Funktion) oder der Gruppe II (ohne postoperative linksventrikuläre Verbesserung) zugeteilt. Anschließend wurden für jede Gruppe Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten berechnet, um sie statistisch vergleichen zu können.


[Seite 73↓]

2.10  Elektronenmikroskopie

Biopsieproben für elektronenmikroskopische Untersuchungen wurden ab der Patientennummer 29 abgenommen. Diese Proben wurden in 2%igem Glutaraldehyd fixiert und zur weiteren Beurteilung und Untersuchung dem Institut für Neuropathologie im Klinikum Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin (Fr. Prof. Dr. Stoltenburg) übergeben.

An mit Toluidin-Blau gefärbten Semidünnschnitten (Schnittdicke 1 µm) wurde zunächst lichtmikroskopisch orientierend eine Beurteilung vorgenommen, anschließend ultra-dünne Schnitte mit Uranyl-Acetat und Lead-Citrat angefärbt und in einem Elektronenmikroskop Typ „Zeiss EM 10“ (Zeiss, Oberkochem, Deutschland) beurteilt und photographisch dokumentiert. Die Photodokumentation erfolgte auf einem speziellen „Electron Image Film-SO 163 Estar Thick Base“ (Eastman-Kodak, Rochester, NY, USA) (113). Die elektronenmikroskopische Beurteilung konzentrierte sich auf folgende Strukturen:

  1. Aufbau der Myofibrillen
  2. Anzahl, Größe und Verteilung der Mitochondrien
  3. Menge und Verteilung von Glycogen

2.11 Molekularbiologie

Als Vergleichsgruppen zu den Studienpatienten wurden gleichartige Untersuchungen an Myokardproben von abgelehnten Spendern zur Herztransplantation (sogenannte „Normalgruppe“) und Myokardproben [Seite 74↓]explantierter Herzen (sogenannte „Domino-Herzen“) im Endstadium der Koronaren Herzkrankheit herangezogen.

Aus der eigentlichen Ischämiestudie wurden von 20 Patienten Proben verwendet. Alle Proben wurden unmittelbar nach Entnahme in flüssigem Stickstoff eingefroren und darin bis zur Aufarbeitung aufbewahrt.

Die molekularbiologischen Untersuchungen wurden von Herrn Dr. med. Reinhard Pregla am Deutschen Herzzentrum Berlin durchgeführt.

2.11.1 Isolation von Ribonukleinsäuren mit Mini-Prep-Kit

Die Gesamt-RNA wurde aus den Gewebeproben mittels Qiagen Mini-Prep Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend dem Protokoll des Herstellers isoliert. Die tiefgekühlten Proben wurden dazu vorher in Lysepuffer mittels Ultraturrax homogenisiert.

2.11.2 RNA Qualitäts- und Quantitätskontrolle kleinster Mengen mit Bioanalyzer und Biophotometer

Eine herkömmliche Kontrolle der RNA-Güte mittels Agarose-Gelelektrophorese ist bei Präparationen aus Herzmuskelbiopsien aufgrund der zu geringen Ausbeute nicht möglich. Diese erfolgte daher mittels Kapillarelektrophorese in einem Bioanalyzer der Firma AGILENT (Agilent Technologies Inc., Böblingen, Deutschland). Durch die Messung mit einem Biophotometer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland, OD 260/280 nm) wurde die Ausbeute bestimmt.


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Abbildung 20: Agarosegelelektrophorese (1,2% Agarose, Färbung mit Ethidium-Bromid)-UV-Fluoreszens-Photographie): RNS hoher Qualität, die 28S Bande ist ca. doppelt so stark wie die 18S-RNS-Bande

Abbildung 21: Agarosegelelektrophorese (1,2% Agarose, Färbung mit Ethidium-Bromid)-UV-Fluoreszens-Photographie): RNS-Abbau in den ersten 7 Proben, die charakteristische Doppelbande ist einem Schmier gewichen.

2.11.3 Reverse Transkription

Zur Erst-Strang-cDNA-Synthese wurde die RNA der Einzelproben mittels Superskript 2 (RT-Kit, GIBCO-BRL, Großbritannien) entsprechend den Herstellerangaben unter Verwendung eines Biometra Thermocyklers (T-Gradient, Biometra, Deutschland) umgeschrieben. Dazu wurden Random-Hexamer-Primer [Seite 76↓]der Firma Roche (Mannheim, Deutschland) verwendet.

2.11.4 Quantitative Real-Time-Syber-Green-RT-PCR

Die Messungen wurden mit dem PCR-System (Polymerase-Kettenreaktion/Polymerase-Chainreaction) Gene-Amp-5700 (PE Applied Biosystems) durchgeführt. Unter Verwendung des vom Hersteller für das Gerät empfohlenen SYBR-Green Core Reagent Kits (Perkin Elmer) wurde das PE-Standard-PCR Protokoll (50°C 2 min [AmpEraseUNG-Reaktion], 95°C 10 min ["hot start-PCR" mit Ampl Taq Gold Polymerase, Perkin Elmer], dann 40 Zyklen 95°C 15 sec gefolgt von 1 min 60°C) angewendet. Für jede Probe wurden Vierfachbestimmungen gefahren. Als Kontaminationschutz vor vorangegangenen PCR-Reaktionen wurde ein dUTP-haltiger dNTP-Mix verwendet und eine Amp-Erase-UNG Reaktion eingeschlossen. Die Reaktionsspezifität wurde mit einer Schmelzkurve verifiziert.

Um eine quantitative Auswertung einer RT-PCR durchführen zu können, wird ein Treshholdwert der SYBR-Green Leuchtstärke gewählt, bei dem alle vermessenen Proben in einem linearen PCR-Bereich liegen. Dies ist durch die Onlinedokumentation des Cyclers problemlos möglich und stellt den eigentlichen Vorteil der „Real Time PCR“ gegenüber der althergebrachten „Endpunkt PCR“ dar.

Die Zielgenergebnisse wurden auf die Expression des Haushaltsgens Glycerolaldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase (GapDh) unter Anwendung der delta-delta-ct–Methode normalisiert, nachdem zuvor in einem Effizienzexperiment eine 100%ige Amplifikation für alle Gene nachgewiesen wurde.


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2.11.5  DNA-Sequenzierung

Um die Richtigkeit der Amplifikate aus der RT-PCR zweifelsfrei festzustellen, wurde neben der Schmelzkurvenanalyse zusätzlich eine Sequenzierung des PCR-Produktes durchgeführt.

Am automatischen DNS-Sequenzierer (Perkin Elmer, Langen, Germany) wurde die DNS-Sequenz nichtradioaktiv analysiert. Die Reaktion wurde nach Angabe des API-PRISM™ DYE TERMINATOR CYCLE SEQUENCING READY REACTION KIT mit einer Ampli-Taq-DNS-Polymerse unter Einbau fluoreszenzmarkierter Didesoxynucleotide durchgeführt.

Abbildung 22: Ausschnitt aus dem Sequenzierungsergebnis eines HSP70 PCR Amplifikates

2.11.6 Verwendete Primer


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Tabelle 11: Verwendete Primer dieser Studie.

Primer

Sequenz

BAX forward primer

5`-CAGACTCCCCCCGAGAGG-3`

BAX reverse primer

5`-TCAGTTCCGGCACCTTGG-3`

BAK forward primer

5`-CCACCAGCCTGTTTGAGAGTG-3’

BAX reverse primer

5’-GGCCATGCTGGTAGACGTG-3’

BCL-XL forward primer

5’-AACGCTTCAACCGCTGGTT-3’

BCL-XL reverse primer

5’-GAGTGGATGGTCAGTGTCTGGTC-3’

MMP2 forward primer

5’-TGGACAACTATCCCATGAAA-3’

MMP2 reverse primer

5’-TCCAGGTTCGCTTCTCGAAA-3’

MMP12 forward primer

5’-GTCCCCGATCTCCATCATTTC-3’

MMP12 reverse primer

5’-TCCTCACGGTTCATGTTCAGG-3’

MMP13 forward primer

5’-ACTACCATCCTACAAATCTCGCG-3’

MMP13 reverse primer

5’-TTTGCCAGTCACCTCTAAGCC-3’

TIMP2 forward primer

5’-GCAATGCAGATGTATGGATCAGG-3’

TIMP2 reverse primer

5’CTCATACTGGATCCTCTTGATAGGG-3’

CnA alpha forward primer

5’-TGTTCATACTTCTACAGTTACCCGGC-3’

CnA alpha reverse primer

5’-CCTGTACATGCGGTACCCTGC-3’

CnA beta forward primer

5’CAAAGTGCCACAGTTGAGGC-3’

CnA beta reverse primer

5’ATCCATATCCAAACCCTTTGCC-3’

CnB forward primer

5’-AGAAATTGAGGTTTGCTTTCCG-3’

CnB reverse primer

5’-TCCCACCATCTTTTTGTGGATAT-3’

HSP70-1 forward primer

5’-GCGTGTATTTCCGCGTGAA-3’

HSP70-1 reverse primer

5’-TGTGATGACACCCTTTCTTCCA-3’

HSP70-2 forward primer

5’-TTTGTAGTGTTTTCGCCAAGCA-3’

HSP70-2 reverse primer

5’-ACTGCCACCTTCTGTACGAGTTT-3’

HSP27 forward primer

5’-TCCCTGGATGTCAACCACTTC-3’

HSP27 reverse primer

5’-GCGTGTATTTCCGCGTGAA-3’

HSP70HOM forward primer

5’-GCCAAGATGGATAAGGCTAAAATC-3’

HSP70HOM reverse primer

5’-CCCATATGCTACGGCCTCAT-3’

IL1 forward primer

5’-GGTGGTAGTAGCAACCAACGG-3’

IL1 reverse primer

5’-TCTGAGTCATTGGGCGATGGC-3’

2.12 Statistik

Alle Untersuchungsdaten wurden in der Studienzentrale des Deutschen Herzzentrum Berlin (DHZB) in eine für diese Studie eingerichtete Datenbank von Frau Elke Wenzel eingegeben. Für die Auswertung wurden die statistischen [Seite 79↓]Programmpakete SAS und SPSS angewendet (116). Von quantitativen Merkmalen wurden Median und Quartale bzw. Mittelwert und Standardfehler angegeben. Qualitative Größen wurden durch Häufigkeiten und Prozentangaben beschrieben.

Der Vergleich der qualitativen Parameter vor und nach der Behandlung erfolgte mittels Wilcoxon-Test. Zum Vergleich der „verbesserten“ (Patienten der Gruppe I) mit den „nicht verbesserten“ (Patienten der Gruppe II) Patienten wurde der Mann- Whitney- U-Test herangezogen (Snedecor&Cochran, 117).

Für den Vergleich von Proportionen wurde der Chi-Quadrat-Test bzw. Fisher-Exact-Test angewendet. Im Fall von abhängigen Proportionen erfolgte die Analyse mittels McNemar-Test (Agresti, 118). Alle statistischen Berechnungen wurden von der Dipl. Mathematikerin Frau Julia Stein am DHZB vorgenommen.

Das Signifikanzniveau wurde bei allen Tests bei 0,05 angesetzt.


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30.09.2004