Aus der Medizinischen Klinik
mit Schwerpunkt Onkologie und Hämatologie
Campus Virchow-Klinikum der Charité,
Humboldt-Universität zu Berlin

Evaluation von Granulozyten Kolonie-Stimulierendem Faktor (G-CSF) und einem monoklonalen Antikörper gegen Kapselpolysaccharid zur Therapie der experimentellen Klebsiella pneumoniae-Pneumonie:
Direkte Interaktion des
hämatopoetischen Wachstumsfaktors mit dem Bakterium steigert dessen Virulenz

Der Medizinischen Fakultät
Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
als

Habilitationsschrift

zur Erlangung der venia legendi

vorgelegt von

Dr. med. Thomas Held

Berlin, 2000

Inhaltsverzeichnis

• 1. Einleitung
  • 1.1. Allgemeine Betrachtungen
  • 1.2.  Klebsiella pneumoniae
    • 1.2.1. Bakterielle Virulenzfaktoren
      • 1.2.1.1. Kapselpolysaccharid (KPS)
      • 1.2.1.2. Lipopolysaccharid (LPS)
    • 1.2.2. Situation bei einer Pneumonie durch K. pneumoniae
  • 1.3. Auf Antikörper basierende antibakterielle Therapieansätze
  • 1.4. Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)
    • 1.4.1. In vitro-Produktion von G-CSF
    • 1.4.2. Wirkungen von G-CSF auf bei einer bakteriellen Infektion wichtige Zellar- ten
    • 1.4.3. G-CSF in der Behandlung experimenteller Infektionen
• 2. Problemstellung
• 3. Material und Methoden
  • 3.1. Tiere
  • 3.2. Bakterien
  • 3.3. Zytokine, Antikörper und Reagenzien
  • 3.4. Tierversuche
    • 3.4.1. Wirksamkeit des verwendeten G-CSF
    • 3.4.2. Experimentelle Pneumonie und Versuchsprotokolle
  • 3.5. Immunoblotting
  • 3.6. Bindung von ¹²⁵J-G-CSF an K. pneumoniae
  • 3.7. In vitro-Produktion von KPS in der Gegenwart von G-CSF
  • 3.8. Mikrophagozytose-Assay
    • 3.8.1. Präparation der Granulozyten und des Serums
    • 3.8.2. Mikrophagozytose-Assay
  • 3.9. Statistische Analyse
• 4. Ergebnisse
  • 4.1. Effekt des rekombinanten humanen G-CSF im verwendeten Mausstamm
  • 4.2. Einfluß von G-CSF auf die experimentelle K. pneumoniae-Pneumonie
    • 4.2.1. Überleben
    • 4.2.2. Klinischer Verlauf
    • 4.2.3. Quantitative Bestimmung der Keimzahlen
    • 4.2.4. Histologische Befunde
  • 4.3. Einfluß des gegen K2-Kapselpolysaccharid gerichteten monoklonalen An- tikörpers mAb III/5-1 auf die experimentelle K. pneumoniae-Pneumonie
    • 4.3.1. Überleben
    • 4.3.2. Klinischer Verlauf
    • 4.3.3. Quantitative Bestimmung der Keimzahlen
    • 4.3.4. Histologische Befunde
  • 4.4. Einfluß von Pentoxifyllin auf die experimentelle K. pneumoniae-Pneumonie
    • 4.4.1. Überleben
    • 4.4.2. Klinischer Verlauf
    • 4.4.3. Quantitative Bestimmung der Keimzahlen
    • 4.4.4. Histologische Befunde
  • 4.5. Interaktion von G-CSF mit K. pneumoniae in vitro
    • 4.5.1. Wachstumsverhalten von K. pneumoniae unter dem Einfluß von G-CSF
    • 4.5.2. Einfluß von G-CSF auf die Produktion von zellgebundenem KPS
  • 4.6. Funktionelle Bedeutung der Erhöhung der zellgebundenen KPS-Produktion durch G-CSF
  • 4.7. Bindung von G-CSF an K. pneumoniae
    • 4.7.1. Bindung von ¹²⁵J-G-CSF an K. pneumoniae
    • 4.7.2. Immunoblotting
• 5. Diskussion
  • 5.1. Wirkung des G-CSF im verwendeten Mausstamm
  • 5.2. G-CSF verschlechtert das Überleben bei einer experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie
    • 5.2.1. G-CSF fördert die bakterielle Dissemination bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie
    • 5.2.2. Einfluß des Zeitpunktes der G-CSF-Therapie auf den Verlauf der experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie
  • 5.3. Einfluß des monoklonalen Antikörpers gegen KPS auf den Verlauf der experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie und Synergismus mit G-CSF
  • 5.4. Die mögliche Beteiligung von TNF—α an den Leberzellnekrosen bei prophylaktischer Behandlung einer experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie durch G-CSF
    • 5.4.1. Effekte von Pentoxifyllin auf TNF—α
    • 5.4.2. Einfluß von Pentoxifyllin auf die experimentelle K. pneumoniae-Pneumonie und den Effekt einer prophylaktischen G-CSF-Gabe
  • 5.5. Ist eine pulmonale Schädigung durch G-CSF für die erhöhte Letalität verantwortlich?
  • 5.6. Gibt es eine andere Erklärung für die Beobachtungen?
    • 5.6.1. Direkte Effekte von G-CSF auf K. pneumoniae
    • 5.6.2. G-CSF bindet spezifisch an K. pneumoniae
    • 5.6.3. Vergleich der Befunde mit anderen tierexperimentellen Untersuchungen unter dem Gesichtspunkt einer direkten Wachstumsfaktor-Bakterien-Interaktion
• 6. Zusammenfassung
• Literatur
• Danksagung
• Anhang
  • Farbabbildungen
  • Verwendete Abkürzungen

Tabellen

• Tabelle 1. Versuchsaufbau
• Tabelle 2. Indices der Keimzahlen aus Leber/Milz und Lunge als Parameter für die bakterielle Disseminierung.

Bilder

• Abbildung 1. Dosisabhängige Erhöhung der Gesamtleukozytenzahl durch G-CSF, gegeben ab Tag 0, in BALB/c-Mäusen (n = 3 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Der für diesen Mausstamm ermittelte Normalbereich für Gesamtleukozyten (Mittelwert ± 1 x SD) ist schraffiert unterlegt.
• Abbildung 2. Dosisabhängige Erhöhung der neutrophilen Granulozyten durch G-CSF, gegeben ab Tag 0, in BALB/c-Mäusen (n = 3 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Der für diesen Mausstamm ermittelte Normalbereich für neutrophile Granulozyten ist schraffiert unterlegt.
• Abbildung 3. Überlebenskurven bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF; G-CSF/t: therapeutische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,011 im Vergleich zur Kontrollgruppe und zur Gruppe, die G-CSF therapeutisch erhielt (G-CSF/t).
• Abbildung 4. Gewichtsverlauf bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF; G-CSF/t: therapeutische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16).
• Abbildung 5. Keimgehalt in Lunge, Leber und Milz bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von G-CSF. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Innerhalb der Säulen ist die Anzahl der untersuchten Tiere angegeben. G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF; G-CSF/t: therapeutische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,005 und **: P = 0,014 im Vergleich zur Kontrollgruppe.
• Abbildung 7. Überlebenskurven bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß des spezifisch gegen K2-KPS von K. pneumoniae gerichteten mAb III/5-1 und Synergismus dieser Therapie mit der Gabe von G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). mAb III/5-1/p: prophylaktische Gabe des mAb; mAb III/5-1/t: therapeutische Gabe des mAb; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,011 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,0094 zur Gruppe, die sowohl G-CSF prophylaktisch als auch den mAb III/5-1 prophylaktisch erhielt.
• Abbildung 8. Gewichtsverlauf bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß des spezifisch gegen K2-KPS von K. pneumoniae gerichteten mAb III/5-1 und Synergismus dieser Therapie mit der Gabe von G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. mAb III/5-1/p: prophylaktische Gabe des mAb; mAb III/5-1/t: therapeutische Gabe des mAb; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,014 und **: P = 0,007 im Vergleich zur Kontrollgruppe. §: P = 0,003 und §§: P = 0,0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. #: P = 0,0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,00001 im Vergleich zur Gruppe, die G-CSF prophylaktisch erhielt (G-CSF/p). ##: P = 0,0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,00001 im Vergleich zur Gruppe, die G-CSF prophylaktisch erhielt (G-CSF/p).
• Abbildung 9. Keimgehalt in Lunge, Leber und Milz bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß des spezifisch gegen K2-KPS von K. pneumoniae gerichteten mAb III/5-1 und Synergismus dieser Therapie mit der Gabe von G-CSF. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Innerhalb der Säulen ist die Anzahl der untersuchten Tiere angegeben. mAb III/5-1/p: prophylaktische Gabe des mAb; mAb III/5-1/t: therapeutische Gabe des mAb; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,016 im Vergleich zur Kontrollgruppe. §: P = 0,011; §§: P = 0,0003 und §§§: P = 0,0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. #: P = 0,005 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,0007 im Vergleich zur Gruppe, die G-CSF prophylaktisch erhielt (G-CSF/p). ##: P = 0,004 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,008 im Vergleich zur Gruppe, die G-CSF prophylaktisch erhielt (G-CSF/p).
• Abbildung 11. Überlebenskurven bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von Pentoxifyllin (POF) und G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). POF/t, therapeutische Gabe von Pentoxifyllin; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,011 im Vergleich zur Kontrollgruppe; §: P = 0,023 im Vergleich zur Kontrollgruppe.
• Abbildung 12. Gewichtsverlauf bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von Pentoxifyllin und G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16).
• Abbildung 13. Keimgehalt in Lunge, Leber und Milz bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von G-CSF und/oder Pentoxifyllin. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Innerhalb der Säulen ist die Anzahl der untersuchten Tiere angegeben. Pentoxifyllin/t, therapeutische Gabe von Pentoxifyllin; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,036 und **: P = 0,028 im Vergleich zur Kontrollgruppe.
• Abbildung 15. Wachstumsverhalten von K. pneumoniae B5055 in vitro unter dem Einfluß von G-CSF (10 ng/ml) oder IL-1α (2 ng/ml). Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz.
• Abbildung 16. Produktion von K2-KPS durch K. pneumoniae B5055 oder F201 (Einsatz) in vitro unter dem Einfluß von G-CSF (10 ng/ml) oder IL-1α (2 ng/ml). Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz. *: P = 0,02 im Vergleich zu Bakterien, die nur in Medium angezüchtet wurden.
• Abbildung 17. Inhibierung der Phagozytose und des bakteriellen Abtötens von K. pneumoniae B5055 durch neutrophile Granulozyten in vitro, wenn die Bakterien für 6 Stunden ohne oder mit G-CSF (10 ng/ml) angezüchtet wurden. Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz. *: P = 0,014 im Vergleich zu Bakterien, die nur in Medium angezüchtet wurden.
• Abbildung 18. Bindung von ¹²⁵J-G-CSF an K. pneumoniae B5055 oder F201 nach 40 Minuten Inkubation bei 4°C.
• Abbildung 19. Inhibition der Bindung von ¹²⁵J-G-CSF an K. pneumoniae B5055 durch nicht markiertes G-CSF. ¹²⁵J-G-CSF (50 ng) wurde für 40 Minuten bei 4°C mit K. pneumoniae B5055 und den angegebenen Mengen an nicht markiertem G-CSF inkubiert. Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz, als spezifische Bindung relativ zu einem Experiment ohne Kompetitor.
• Abbildung 20. Fehlende Inhibition der Bindung von ¹²⁵J-G-CSF an K. pneumoniae B5055 durch nicht markiertes IL-1α. ¹²⁵J-G-CSF (50 ng) wurde für 40 Minuten bei 4°C mit K. pneumoniae B5055 und den angegebenen Mengen an nicht markiertem IL-1α inkubiert. Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz.
• Abbildung 21. Immunoblot von K. pneumoniae B5055-Lysaten mit G-CSF. Bahn 1: Marker für Molekulargewicht in kDa; Bahn 2: bakterielles Lysat; Bahn 3: bakterielles Lysat, das vor der Elektrophorese mit Proteinase K verdaut wurde; Bahn 4: Inkubation mit G-CSF, das mit anti-humanem G-CSF-IgG präabsorbiert wurde; Bahn 5: Elektrophorese von G-CSF alleine als Positivkontrolle; Bahnen 6 bis 8: Silberfärbung eines identischen Zweitgeles, wobei Bahn 6 der Bahn 2 entspricht, Bahn 7 der Bahn 3 und Bahn 8 der Bahn 5. Die Pfeile in Bahn 2 markieren die spezifischen Bindungsstellen von G-CSF an Proteine im bakteriellen Lysat. Die Pfeilspitze in Bahn 5 markiert die Positivkontrolle mit G-CSF.
• Abbildung 6 (Seite 90 und 91): Histologische Befunde von Kontrolltieren nach experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie und von Tieren, die als Therapie G-CSF vor oder nach Induktion der Pneumonie erhielten (vgl. auch Tabelle 2).
• Abbildung 10 (Seite 93 und 94): Histologische Befunde bei Behandlung einer experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie mit einem gegen KPS gerichteten monoklonalen Antikörper (mAb III/5-1) alleine oder in Kombination mit G-CSF (vgl. auch Tabelle 1).
• Abbildung 14 (Seite 96): Histologische Veränderungen bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie nach Blockierung von TNF-α durch Pentoxifyllin alleine und bei Gabe von Pentoxifyllin zusammen mit G-CSF (vgl. Tabelle 1).