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1. Einleitung

1.1. Allgemeine Betrachtungen

Die zytostatische Therapie bösartiger Erkrankungen führt häufig zur Granulozytopenie. In Abhängigkeit von Ausmaß und Dauer der Granulozytopenie nimmt das Risiko von Infektionen zu. Diese nehmen oft einen raschen progredienten Verlauf; Fieber ist als klinisches Symptom häufig das einzige Zeichen einer Infektion. Die Entwicklung zum septischen Schock bei Bakteriämien tritt in etwa 40% aller Fälle auf, mit einer hohen Letalität zwischen 40 und 90%. Komplizierend kommt hinzu, daß sich Resistenzen und Mehrfachresistenzen bei klinisch bedeutsamen Bakterien immer mehr ausbreiten und somit die antibiotische Therapie von Infektionen erheblich erschweren. Deshalb ist es von großer Wichtigkeit, anti-infektiöse Therapiestrategien zu evaluieren, die ergänzend zu Antibiotika eingesetzt werden können. In dieser Hinsicht sind unter anderem zwei Ansätze von Interesse, die zum einen den Einsatz von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren [1], zum anderen das Konzept einer passiven Immunisierung gegen spezifische bakterielle Virulenzfaktoren untersuchen [2,3,4].

In der hier vorgelegten Arbeit wird anhand des tierexperimentellen Modells einer Pneumonie mit nachfolgender Sepsis durch Klebsiella pneumoniae der Einsatz von granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) und einem monoklonalen Antikörper gegen den wichtigsten Virulenzfaktor von K. pneumoniae untersucht.

1.2.  Klebsiella pneumoniae

K. pneumoniae ist eines der bei schweren nosokomialen Infektionen am häufigsten isolierten Bakterien [5,6,7,8,9,10]. In erster Linie werden durch diesen Keim Pneumonien, Bakteriämien und Harnwegsinfektionen hervorgerufen [9,11,12]. Pulmonale Infektionen zeigen häufig besonders schwere Verläufe durch multilobulären Befall, rasch progredienten klinischen Verlauf und durch die Ausbildung von Abszessen [13,14]. Auffallend ist die hohe Letalität von 40 – 60% und mehr trotz adäquater Antibiotikatherapie [8,15,12].

Erschwerend kommt hinzu, daß die Anzahl gegenüber häufig verwendeten Antibiotika resistenter Isolate zunimmt. Die neuen Resistenzenzyme mit erweitertem Spektrum [Seite 5↓](extended-spectrum β-Laktamasen, ESBL) werden ungewöhnlich häufig bei Klebsiellen beschrieben, die Ursache hierfür ist unbekannt. Es handelt sich gewöhnlich um Isolate aus nosokomialen Infektionen [16,17,18,19,20]. Teilweise findet sich eine deutliche Korrelation zwischen der zunehmenden Anwendung bestimmter Antibiotika und einer steigenden Frequenz ESBL-bildender Isolate von K. pneumoniae[19,21].

1.2.1. Bakterielle Virulenzfaktoren

1.2.1.1. Kapselpolysaccharid (KPS)

Der wahrscheinlich wichtigste Virulenzfaktor von K. pneumoniae ist das Kapselpolysaccharid (KPS) [22,23]. Zum einen verhindert KPS die Phagozytose der Bakterien durch neutrophile Granulozyten [24], zum anderen wird KPS während des bakteriellen Wachstums und durch den Einfluß antimikrobieller Substanzen freigesetzt [25,26]. Im Rahmen einer schweren Infektion ließen sich bei einem Patienten hohe Mengen an KPS im Serum nachweisen, die bei erfolgreicher Behandlung wieder verschwanden [25]. Während der Wachstumsphase der Keime verbindet sich dieses KPS mit Lipopolysaccharid (LPS, Endotoxin) und Proteinen und formt einen toxischen Komplex, der für die durch Klebsiella typischerweise verursachten Nekrosen bei Pneumonien verantwortlich gemacht wird [27,28]. Erschwerend kommt hinzu, daß bei nur subinhibitorischen Konzentrationen von Antibiotika, wie sie z.B. in Abszessen beobachtet werden können, die Bakterien vermehrt KPS produzieren [26].

Siebenundsiebzig verschiedene KPS-Serotypen sind bei der Species Klebsiella bekannt [29]. Zwar konnten einige Studien ein Vorherrschen bestimmter Serotypen in klinischen Isolaten nicht nachweisen [30,23], andere Untersuchungen erbrachten jedoch eine vermehrte Isolation der Serotypen K2, K21 und K7 bei Infektionen des Respirations- und des Urogenitaltraktes [31,32,33,34].


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1.2.1.2. Lipopolysaccharid (LPS)

Ein weiterer Virulenzfaktor ist LPS, ein wichtiger Mediator des septischen Schocks. Neben diesen zytokin-vermittelten Effekten ist das LPS von K. pneumoniae für die Resistenz des Bakteriums gegenüber der Serumbakterizidie verantwortlich, KPS dagegen scheint in dieser Hinsicht keine Rolle zu spielen [35]. LPS alleine jedoch ist nicht hinreichend, um eine experimentelle pulmonale Infektion mit virulenten Klebsiellen auch letal enden zu lassen. In einer Versuchsreihe mit verschiedenen Klebsiellenstämmen, die sich in der Produktion von KPS (bzw. der fehlenden Produktion von KPS) verschiedener Serotypen unterschieden, konnte nachgewiesen werden, daß die Gabe selbst sehr hoher Keimzahlen nicht letal ist, wenn kein KPS oder KPS eines anderen Serotyps als K2 und K1 produziert wird [36]. Die Keimzahlen (lethal dose50, LD50) lagen über 5 x 106 koloniebildende Einheiten (KBE) für K. pneumoniae 7380 (Serotyp O2ab:K–), über 1,33 x 107 KBE für K. pneumoniae F201 (Serotyp O1:K–) und über 8,25 x 107 KBE für K. pneumoniae 390 (Serotyp O3:K11) [36]. Hingegen waren sehr geringe Keimzahlen der Klebsiellenstämme B5055 und A5054 letal, wobei sich der Stamm B5055, der KPS des Serotyps K2 produziert, als virulenter erwies als der Stamm A5054 mit KPS des Serotyps K1. Es spielte dabei keine Rolle, ob die infizierte Maus gegenüber LPS empfindlich oder unempfindlich war [36]. So betrug die LD50 bei LPS-sensiblen Mäusen (Stämme ICR und C3H/HeN) für K. pneumoniae B5055 (Serotyp O1:K2) 5 x 102 KBE und bei LPS-unempfindlichen Mäusen (Stamm C3H/HeJ) 2,27 x 102 KBE [36].

1.2.2. Situation bei einer Pneumonie durch K. pneumoniae

Wie bereits erwähnt, zeichnet sich die durch K. pneumoniae verursachte Pneumonie durch einen raschen Verlauf mit hoher Letalität aus. Die wichtigsten Virulenzfaktoren von Seiten der Bakterien sind KPS und LPS; auf Seiten des Wirtes sind als wichtigste Abwehrfaktoren von zellulärer Seite her neutrophile Granulozyten und, im Fall einer pulmonalen Infektion, Alveolarmakrophagen zu nennen [37]. Die entscheidenden humoralen Faktoren und Zytokine sind TNF—α, Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-2, IFN—γ, ICAM-1 und Nitric Oxide (NO). Die Inhibierung von TNF—α erhöht die Letalität und die Keimzahl in der Lunge [38], die Behandlung mit einem TNF—α-Agonisten hingegen hat genau die entgegengesetzten Effekte [39]. Die Be[Seite 7↓]deutung von TNF—α bei der Abwehr bakterieller Infektionen über z.B. Aktivierung neutrophiler Granulozyten konnte auch bei der experimentellen Legionellenpneumonie [40], der experimentellen Pneumocystis carinii-Pneumonie [41] und bei der experimentellen S. typhimurium-Peritonitis nachgewiesen werden [42]. Die Gabe von IFN—γ vor experimenteller Wundinfektion durch K. pneumoniae erhöht das Überleben, ohne additive oder synergistische Wirkung mit TNF—α zu zeigen [43]. Bei anderen Infektionsmodellen jedoch war ein Synergismus von IFN—γ mit TNF—α hinsichtlich der protektiven Wirkung dieser Zytokine nachweisbar [42, 44]. Das MIP-2 ist bei der experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie erhöht nachweisbar, seine Inhibierung verschlechtert das Überleben und erhöht das bakterielle Wachstum [45]. Bei K. pneumoniae-Pneumonie wird ICAM-1 vermehrt auf Alveolarmakrophagen exprimiert, das Fehlen dieser Expression geht mit erhöhter Letalität, verminderter bakterieller clearance und verminderter Phagozytose und Abtötung der Keime durch Alveolarmakrophagen einher [46]. Schließlich wurde auch eine vermehrte Bildung von NO bei der experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie nachgewiesen; die Blockierung der NO-Produktion hatte ebenfalls ein gesteigertes bakterielles Wachstum sowie die Abnahme der Phagozytose und Abtötung der Bakterien durch Alveolarmakrophagen zur Folge [47]. Der Verlauf einer K. pneumoniae-Pneumonie wird also nicht nur durch Virulenzfaktoren der Bakterien, sondern auch durch ein komplexes Zusammenspiel pro- und anti-inflammatorischer Faktoren auf der Seite des infizierten Wirtes bestimmt.

1.3. Auf Antikörper basierende antibakterielle Therapieansätze

Die zunehmende Resistenz pathogener Bakterien gegenüber herkömmlichen Antibiotika veranlaßte die Entwicklung verschiedener, von Antibiotika unabhängigen therapeutischen Ansätze, wovon einige auf dem Einsatz von Antikörpern gegen bakterielle Virulenzfaktoren beruhen. So waren monoklonale Antikörper gegen KPS und LPS von E. coli oder K. pneumoniae im Tierexperiment protektiv, einhergehend mit einer Reduktion von zirkulierendem TNF-α und förderten die Phagozytose von E. coli durch humane neutrophile Granulozyten und Mausmakrophagen in vitro [4,3]. Antikörper gegen die Polysaccharidketten des LPS von E. coli waren in Zusammenwirken mit Komplement protektiv, dies jedoch nur gegen den E. coli – Stamm, gegen den sie gerichtet waren, nicht aber gegen serologisch unterschiedliche E. coli – Stämme [48]. [Seite 8↓]Die antibakterielle Wirkung monoklonaler Antikörper ist dosisabhängig [49]. Die passive Immunisierung mit Hyperimmunserum gegen K. pneumoniae, das von geimpften Freiwilligen gewonnen wurde, war im klinischen Einsatz jedoch nicht erfolgreich [2].

Der ideale Angriffsort für eine Antikörpertherapie ist noch nicht endgültig geklärt. Zwar konnte gezeigt werden, daß spezifische Antikörper gegen LPS die Kapsel von K. pneumoniae durchdringen können [50]. Diese Antikörper sind in vitro auch opsonierend und phagozytosefördernd, jedoch schwächt das Vorhandensein einer Kapsel diese Wirkung ab [51]. Dies wird tierexperimentell bestätigt durch die etwa 100-fach höhere Menge von anti-LPS-Antikörpern im Vergleich zu einem gegen KPS gerichteten monoklonalen Antikörper, die für einen 50 %-igen Schutz notwendig ist [52]. Ein gegen KPS gerichteter Antikörper jedoch war in einem Mausmodell der Sepsis, bei dem die Keime intravenös gegeben wurden, protektiv [53]. Auch in einem die klinische Situation besser reflektierenden Pneumoniemodell bei der Ratte, bei dem K. pneumoniae intrabronchial gegeben wurde, konnte dieser Antikörper die Schwere der Infektion mindern und die septische Streuung der Bakterien reduzieren [54].

1.4. Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)

Verschiedene Zytokine und Wachstumsfaktoren beeinflussen Überleben, Proliferation, Differenzierung und funktionelle Kapazitäten hämatopoietischer Zellen. Unter diesen sind Interleukin (IL)-3, -5, -6, -11, macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) und granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) am besten untersucht [1]. Von diesen wiederum sind nur GM-CSF und G-CSF für die klinische Anwendung am Patienten zugelassen; M-CSF wurde in klinischen Studien bereits geprüft [55,56,57].

Das Risiko einer Infektion ist nicht nur mit dem Schweregrad, sondern auch mit der Dauer einer Neutropenie eng korreliert [58]. Obwohl G-CSF die Dauer einer Neutropenie durch Beschleunigung der Differenzierung und Proliferation hämatopoetischer Stammzellen abkürzt [59,60,61], konnte bislang eine Reduktion der durch schwere Infektionen bedingten Letalität durch G-CSF nicht überzeugend nachgewiesen werden, wenn die Neutropenie Folge einer Chemotherapie war [62,63,64,65]. [Seite 9↓]Unbestritten jedoch ist der Einsatz von G-CSF bei angeborenen Defekten wie der schweren kongenitalen Neutropenie [66,59,67,68] oder bei Neutropenien anderer Ursachen [69,70].

1.4.1. In vitro-Produktion von G-CSF

Bereits 1971 konnte nachgewiesen werden, daß LPS die Produktion von G-CSF erhöht [71]. G-CSF wird von verschiedenen hämatopoetischen und nicht hämatopoetischen Zellen wie Monozyten, Makrophagen, Fibroblasten und Endothelzellen synthetisiert [72,73,74,75,76]. Durch Stimulation mit IL-1, LPS oder TNF—α kann eine dosisabhängige Steigerung der Produktion von G-CSF durch humane Endothelzellen induziert werden [73], vermutlich über den Signaltransduktionsfaktor NF-IL6 [77]. Interferon (IFN)—γ hingegen kann die stimulatorische Wirkung von IL-1, LPS und TNF—α herunterregulieren [73]. LPS und die Bindung von Fibronectin und Vitronectin an Makrophagen sind ebenfalls potente Stimuli für die Expression von G-CSF in den Makrophagen [78]. Auch die direkte Koinkubation von Makrophagen mit einer von G-CSF abhängigen Promyelozyten-Leukämie-Zelllinie führt zur erhöhten Produktion von G-CSF, so daß nicht nur Zytokine, sondern auch Adhäsion und direkter Zell-Zell-Kontakt die Produktion von G-CSF regulieren [78].

1.4.2. Wirkungen von G-CSF auf bei einer bakteriellen Infektion wichtige Zellar-
ten

Im Vergleich zu Lymphozyten und Monozyten haben neutrophile Granulozyten in vitro und in vivo nur eine sehr kurze Lebensdauer [79,80,81]. G-CSF, aber auch LPS verlängern diese durch Inhibierung der Apoptose [82,83]. IL-10 hingegen verhindert in vitro die Inhibierung der Apoptose durch G-CSF [83]. G-CSF verstärkt ebenfalls die funktionelle Aktivität ausgereifter Leukozyten in Konzentrationen, die für eine Proliferation zu gering sind. Die physiologische Bedeutung dieser Befunde in der Abwehr bakterieller Infektionen ist jedoch noch weitgehend ungeklärt [84].

Über weitere Wirkungen von G-CSF gibt es zum Teil widersprüchliche Ergebnisse. So berichten Untersuchungen, daß G-CSF keine direkte Stimulation des „oxidative burst“ und der Produktion von Sauerstoffradikalen in neutrophilen Granulozyten bewirkt [85,86,87]. [Seite 10↓]Andere Untersuchungen hingegen zeigen, daß dies unter bestimmten Bedingungen durchaus der Fall sein kann. So konnte der oxidative burst bei adhärenten Neutrophilen durch G-CSF gesteigert werden [88], und die mit G-CSF vorbehandelten Neutrophilen antworteten mit einem gesteigerten oxidative burst auf eine Stimulation mit fMLP [88,89,90,91,92]. Dies war in einer vergleichenden Untersuchungen jedoch nur bei im Blut zirkulierenden, jedoch nicht bei im Gewebe befindlichen neutrophilen Granulozyten der Fall [90]. Zusätzlich zeigt G-CSF noch eine Vielzahl anderer Wirkungen auf neutrophile Granulozyten (Übersicht in [93]).

G-CSF wirkt aber nicht nur auf neutrophile Granulozyten. Bei peritonealen Makrophagen wurde eine Erhöhung der Pinozytose beobachtet [94]. Die Größe von Alveolarmakrophagen nahm unter dem Einfluß von G-CSF zu [95]; Alveolarmakrophagen wurden in vitro durch G-CSF zu vermehrtem Abtöten phagozytierter Bakterien stimuliert [96]. Auch die Produktion von TNF—α durch Alveolarmakrophagen auf Stimulation durch LPS oder Bakterien wurde durch Vorbehandlung der Zellen mit G-CSF gesteigert [96]. Proliferation und Migration von Endothelzellen wurde durch G-CSF ebenfalls erhöht [97]; die Differenzierung unreifer Monozyten wurde durch G-CSF ebenfalls induziert [98]. Die pleiotrope Wirkung dieses Wachstumsfaktors wird auch dadurch deutlich, daß er die durch LPS und IFN—γ induzierte Mehrexpression der iNOS-mRNA und die Produktion von NO in glatten Muskelzellen der Gefäße inhibiert [99]. In Hepatozyten vermag G-CSF die Expression von iNOS, cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC) und ICAM-1 zu induzieren [100].

1.4.3. G-CSF in der Behandlung experimenteller Infektionen

Frühe Therapiestudien mit G-CSF bei experimentellen Infektionen zeigten unabhängig vom infektiösen Agens und vom verwendeten Tiermodell durchweg Verbesserung des Überlebens und Verstärkung antibakterieller Mechanismen. In einem Pneumoniemodell, bei dem Ratten intratracheal mit K. pneumoniae infiziert wurden, konnte die Behandlung mit G-CSF nicht nur den Einstrom neutrophiler Granulozyten in die Lunge, sondern auch das Überleben der behandelten Tiere verbessern [101]. Eine pulmonale Infektion mit Streptococcus pneumoniae bei splenektomierten Mäusen konnte ebenfalls [Seite 11↓]erfolgreich mit G-CSF therapiert werden, wobei Überleben und die Verminderung der Keime in der Lunge signifikant gegenüber Kontrollgruppen verbessert wurde [102]. Der gleiche Befund (signifikante Verbesserung des Überlebens) wurde durch G-CSF in einem Peritonitis-Modell erreicht [103]. Neutropenische Mäuse, die entweder intraperitoneal mit Pseudomonas aeruginosa oder systemisch intravenös mit Serratia marcescens, Escherichia coli, Staphylococcus aureus oder Candida albicans infiziert wurden, zeigten mit G-CSF ein signifikant besseres Überleben und eine schnellere Elimination der Mikroorganismen als Kontrolltiere [104]. Auch bei Infektionen in neutropenischen Mäusen, die auf Antibiotika schlecht ansprachen, half die therapeutische Gabe von G-CSF, Letalität und Keimzahlen in der Leber zu senken [105]. Synergistische Wirkung von G-CSF und Antibiotika auf das Überleben wurden ebenfalls bei polymikrobieller intraabdomineller Infektion und bei intramuskulärer Infektion beobachtet [106,107]. Die Inaktivierung des G-CSF-Genes durch homologe Rekombination (“knockout”-Mäuse) führt zu einer chronischen Neutropenie, und die Infektion dieser Tiere mit Listeria monozytogenes resultiert nicht nur in einer schweren Infektion mit erhöhter Letalität gegenüber Kontrolltieren, sondern auch im Ausbleiben einer Neutrophilie nach Infektion [108]. Dies zeigt, daß G-CSF nicht nur für die Aufrechterhaltung einer genügenden Anzahl zirkulierender neutrophiler Granulozyten, sondern auch für die Induktion einer Neutrophilie bei bakterieller Infektion wichtig ist. Die durch G-CSF vermittelten protektiven Effekte bei bakteriellen Infektionen scheinen darüberhinaus auf einer Verstärkung der Phagozytose-Aktivität und des respiratory burst sowie auf der vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen auf neutrophilen Granulozyten zu beruhen [109,110].


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18.01.2005