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3. Material und Methoden

3.1. Tiere

Pathogenfreie weibliche BALB/c-Mäuse wurden von der Tierzuchtabteilung des Institutes für Mikrobiologie und Infektionsimmunologie der Freien Universität Berlin bezogen. Bei Verwendung wogen sie zwischen 20 und 25 Gramm. Der freie Zugang zu Wasser und Standardfutter war jederzeit gewährleistet. Die Tiere wurden unter einem 12-stündigen Tag/Nacht-Rhythmus gehalten. Die Tierversuche wurden von der Senatsverwaltung für Gesundheit des Senates von Berlin genehmigt.

3.2. Bakterien

Klebsiella pneumoniae B5055 vom Serotyp O1:K2 [26] und K. pneumoniae F201 vom Serotyp O1:K– [111] wurden für die Untersuchungen verwendet. Zu tierexperimentellen Studien wurden die Keime von einer auf Trypticase-Soja-Agar (Difco, Detroit, USA) ausplatierten Einzelkolonie auf Trypticase-Soja-Bouillon (TSB, Difco, Detroit, USA) überimpft und bei 37°C und end-über-end-Rotation für 4 Stunden bebrütet. Anschließend wurden sie zentrifugiert (1560 x g, 15 Minuten, 4°C), einmal mit steriler Kochsalzlösung (0,9%) gewaschen und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wurde mit steriler Kochsalzlösung aufgenommen und die bakterielle Konzentration mittels einer Standardkurve, die in Vorversuchen erstellt wurde, spektrophotometrisch ermittelt. Danach wurde die gewünschte Konzentration an koloniebildenden Einheiten (KBE) durch Verdünnung mit Kochsalzlösung hergestellt. Bis zur Verwendung im Tierexperiment wurden die Bakterien auf Eis gekühlt. Alle spektrophotometrisch ermittelten KBE wurden mit zehnfacher Verdünnungsreihe und anschließendem Ausplattieren im Doppelansatz auf Trypticase-Soya-Agar überprüft. Die Bebrütung der Agarplatten zur Ermittlung der KBE erfolgte über Nacht bei 37°C.

3.3. Zytokine, Antikörper und Reagenzien

Rekombinantes humanes G-CSF (Filgrastim) wurde steril und pyrogenfrei von AMGEN (München) bezogen und subkutan verabreicht. Der monoklonale Antikörper III/5-1 (mAb III/5-1) ist ein für Kapselpolysaccharid des Serotyps K2 von K. pneumoniae spezifisches IgM von der Maus, dessen Herstellung und Aufreinigung bereits beschrieben wurde [53,54]. Er wurde intravenös gegeben. Pentoxifyllin wurde ebenfalls ste[Seite 14↓]ril und pyrogenfrei von Albert-Roussel (Wiesbaden) bezogen und intraperitoneal verabreicht. Die entsprechenden Verdünnungen wurden mit steriler phosphatgepufferter Saline (PBS) hergestellt. Alle Reagenzien und das PBS wurden auf ihren LPS-Gehalt mit einem limulus amebocyte lysate-Assay (Chromogenix, Mölndal, Schweden) überprüft. Der Assay weist LPS (E. coli O111:B4) ab einer Konzentration von >1 pg/ml nach. In keiner der bei einem Tierversuch verwendeten Reagenzien konnte mit diesem Assay LPS nachgewiesen werden.

3.4. Tierversuche

3.4.1. Wirksamkeit des verwendeten G-CSF

Alle Tierversuche wurden im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsimmunologie der Freien Universität Berlin durchgeführt (Leiter: Prof. Dr. med. H. Hahn). Um die Wirkung des G-CSF im verwendeten Mausstamm sicherzustellen, wurde den Tieren an vier aufeinanderfolgenden Tagen jeweils zweimal täglich in 12-stündigem Abstand G-CSF in drei verschiedenen Dosierungen (15 μg/kg, 50 μg/kg und 250 μg/kg) subkutan gespritzt. Täglich vor der ersten G-CSF-Gabe wurde den Tieren aus einer Schwanzvene 20 μl Blut abgenommen. Um einen Effekt der Blutabnahme auf die Leukozytenzahl und das Differentialblutbild zu erkennen, wurde mit der Blutabnahme 4 Tage vor der ersten G-CSF-Gabe begonnen. Die Leukozytenzahl wurde mit einem Coulter Counter (Modell DN, Coulter Electronics LTD, Harpenten Herts, Großbritannien) ermittelt, und ein korrespondierender Blutausstrich wurde nach Pappenheim gefärbt. Die absolute Anzahl der Leukozytensubpopulationen wurde durch Multiplikation der aus dem Differentialblutbild erhaltenen Prozentzahl mit der Gesamtleukozytenzahl ermittelt. Zur Beurteilung der Blutausstriche wurden diese kodiert; somit war dem Beurteiler die verwendete Dosis des G-CSF unbekannt.

3.4.2. Experimentelle Pneumonie und Versuchsprotokolle

Die einzelnen Versuchsreihen sind in ihrem zeitlichen Ablauf in Tabelle 1 (siehe Seite 16) dargestellt. Die Erzeugung einer bakteriellen Pneumonie wurde wie beschrieben durchgeführt [112,113]. Dafür wurden die Tiere mit intraperitoneal verabreichtem Xylacin (8 mg/kg; Bayer, Leverkusen) und Ketamin (80 mg/kg; Parke, Davis & Co., München) anästhesiert. Das bakterielle Inokulum wurde in einem Volumen von 50 μl [Seite 15↓]verabreicht und enthielt 1 x 103 KBE. Dies geschah mittels einer Pipette in das linke Nasenloch der Tiere, die dabei mit dem Kopf nach oben gehalten wurden. Innerhalb von etwa 10 Minuten erwachten die Tiere nach kurzer Hyperventilation aus der Narkose. Das Überleben der Tiere wurde alle 12 Stunden für drei Tage registriert, das Gewicht einmal täglich. Falls ein Tier verstarb, wurde es obduziert. Nach 72 Stunden wurde der Versuch beendet und alle noch überlebenden Tiere mit CO2 euthanasiert. Anschließend wurden Lunge, Leber und Milz entnommen und auf ihren Keimgehalt hin wie beschrieben untersucht [54]. Da die Teilung eines Organes zur simultanen Untersuchung auf Keimgehalt und histologische Veränderungen zu einem „sampling error“ führen kann, wurden die Tiere vor Versuchsbeginn für entweder eine histologische Aufarbeitung oder für die Untersuchung auf den Keimgehalt hin randomisiert. Starben vor Versuchsende mehr als 50% der Tiere einer Gruppe (und wurden damit obduziert und histologisch untersucht), so wurden alle überlebenden Tiere für die Ermittlung des Keimgehaltes verwendet. Als Parameter für die systemische bakterielle Disseminierung aus dem Primärorgan (Lunge) wurde für jedes auf den Keimgehalt hin untersuchte Tier ein Index aus dem Keimgehalt der Leber oder der Milz und dem der Lunge gebildet:

Während der gesamten Dauer der Aufarbeitung wurden die Organhomogenate auf Eis gelagert. Von allen bis 72 Stunden nach Induktion der Pneumonie überlebenden Tieren wurden Blutausstriche für Differentialblutbilder angefertigt. Eine Zählung der Leukozytenzahl war aus technischen Gründen nicht möglich. Zur Beurteilung der Blutausstriche und der histologischen Präparate wurden diese kodiert; somit war dem Beurteiler die Behandlung nicht bekannt. Die histologischen Untersuchungen wurden in der Abteilung für Paidopathologie des Institutes für Pathologie der Humboldt-Universität durchgeführt (Leiter: Prof. Dr. M. Vogel).


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Tabelle 1. Versuchsaufbau

Gruppen a

Zeit (h) b

            
 

-48

-36

-24

-12

0

6

12

24

36

48

60

Kontrolltiere

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

G-CSF/p, 15 μg/kg/Gabe

G

G

G

G

       

G-CSF/p, 50 μg/kg/Gabe

G

G

G

G

       

G-CSF/p, 250 μg/kg/Gabe

G

G

G

G

       

G-CSF/t, 50 μg/kg/Gabe

       

G

G

G

G

            

mAb III/5-1 /p, 10 mg/kg einmalig

    

mAb

      

mAb III/5-1 /t, 10 mg/kg einmalig

       

mAb

   

G-CSF/p, 50 μg/kg/Gabe + mAb III/5-1 /p, 10 mg/kg einmalig

G

G

G

G

mAb

      
            

Pentoxifyllin/t, 50 mg/kg/Gabe

    

P

P

P

    

G-CSF/p, 50 μg/kg/Gabe + Pentoxifyllin/t, 50 mg/kg/Gabe

G

G

G

G

P

P

P

    

a p = Behandlung vor Induktion der Pneumonie (prophylaktisch); t = Behandlung nach Induktion der Pneumonie (therapeutisch). Die Kontrolltiere erhielten jeweils PBS zu den angegebenen Zeitpunkten entsprechend der Verabreichung der jeweiligen Reagenzien (s.c., i.v. oder i.p.).
b Angegeben ist der Zeitpunkt vor beziehungsweise nach Induktion der Pneumonie (Stunde 0).


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3.5. Immunoblotting

K. pneumoniae B5055 wurde in TSB bei 37°C und langsamer end-über-end-Rotation über Nacht angezüchtet. Nach Zentrifugation (1560 x g, 15 Minuten, 4°C) wurde das bakterielle Sediment in TRIS/EDTA-Puffer lysiert (50 mmol/l TRIS, 1 mmol/l EDTA, 1 mmol/l Phenylmethylsulfonylfluorid, 100 μg/ml Aprotinin, 0,1 mmol/l Leupeptin; pH 8,0). Dies geschah durch drei Zyklen Einfrieren/Auftauen. Anschließend wurde das Lysat für 10 Minuten mit 0,5% SDS und 1,25% Mercaptoethanol inkubiert und mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Das aufgetrennte Material wurde auf eine PVDF-Membran (Millipore, Bedford, USA) mittels Elektrotransfer semi-trocken geblottet (15 V, 40 Minuten; BioRad, Hercules, USA). Nach dem Blocken unspezifischer Bindungsstellen mit Füllpuffer [25] wurden die einzelnen Bahnen mittels eines Hoefer Decafold-Apparates (Pharmacia Biotech, Piscataway, USA) separat mit G-CSF bei 4°C über Nacht inkubiert. Nach gründlichem Waschen in PBS wurde gebundenes G-CSF mit einem murinen monoklonalen Antikörper gegen humanes G-CSF markiert (4°C, 4 Stunden). Um unspezifische Bindungen des Antikörpers abzusättigen, wurde er vor der Inkubation mit bakteriellem Lysat präabsorbiert (37°C, 1 Stunde). Gebundener Antikörper wurde anschließend mit einem mit horseradish Peroxidase-markiertem anti-Maus-IgG detektiert (4°C, 4 Stunden) und der Blot anschließend mit enhanced chemiluminescence entwickelt. Identische Zweitgele wurden für eine Silberfärbung herangezogen [114]. Als Positivkontrolle wurde G-CSF ebenfalls der Elektrophorese unterworfen. Als Negativkontrollen dienten eine Inkubation mit IL-1α (Genzyme, Cambridge, MA, USA) anstelle von G-CSF sowie die Präabsorption des G-CSF mit einem polyklonalen, gegen G-CSF gerichteten Kaninchenserum vor Inkubation des Blots. Der monoklonale Antikörper gegen G-CSF sowie das polyklonale Kaninchenserum wurden freundlicherweise von Dr. P. Stevens und Ed Shatzen, AMGEN, Thousand Oaks, USA, zur Verfügung gestellt. Zur genaueren Untersuchung von Bindungsstellen wurde ein Teil des bakteriellen Lysates vor Elektrophorese mit Proteinase K verdaut (Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA). Diese und die nachfolgenden Untersuchungen erfolgten im Labor von Dr. A.S. Cross, Greenebaum Cancer Center, University of Maryland, Baltimore, USA.


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3.6. Bindung von 125J-G-CSF an K. pneumoniae

G-CSF wurde nach der Chloramin-T-Methode mit radioaktivem Jod (125J) markiert [115,116]. Einzelkolonie-Isolate von K. pneumoniae B5055 oder F201 wurden in TSB bei 37°C über 4 Stunden angezüchtet. 1 x 108 KBE wurden in 0,5 ml PBS zusammen mit 1% hitzeinaktiviertem Rinderserum und verschiedenen Konzentrationen von 125J-G-CSF inkubiert. Vorversuche ergaben keine Änderung des Bindungsverhaltens bei 37°C gegenüber der Inkubation bei 4°C oder bei Hinzufügen beziehungsweise Weglassen von Natriumazid. Daher wurden die Experimente bei 4°C ohne Natriumazid unter langsamer end-über-end-Rotation durchgeführt. Nach 40 Minuten wurden die Proben zentrifugiert (5 Minuten bei 14250 x g) und der Überstand sofort abgetrennt. Die Radioaktivität in Überstand und Sediment wurde in einem Gamma-Counter gemessen. Um die Spezifität der Bindung von G-CSF an die Bakterien zu ermitteln, wurden einige Proben zusätzlich mit unmarkiertem G-CSF oder mit unmarkiertem IL-1α inkubiert. Die gebundene Menge an 125J-G-CSF wurde in molare Konzentrationen wie vorbeschrieben umgewandelt [117].

3.7. In vitro-Produktion von KPS in der Gegenwart von G-CSF

Nach Inkubation einer Starterkultur von K. pneumoniae B5055 oder F201 in Trypticase-Soja-Bouillon (TSB) (37°C, über Nacht) wurden 2 x 105 KBE in 250 ml frische TSB überführt und in der Gegenwart von G-CSF (10 ng/ml), IL-1α (2 ng/ml) oder Diluent (PBS) erneut bei 37°C und langsamer Rotation (120 rpm) inkubiert. Nach 2, 4, 6, 8 und 10 Stunden wurden jeweils 50 ml abgenommen und sofort auf Eis gestellt. Die Proben wurden hinsichtlich der Keimzahl und des zellgebundenen KPS wie vorbeschrieben untersucht [26,25,54].

3.8. Mikrophagozytose-Assay

3.8.1. Präparation der Granulozyten und des Serums

50 ml venöses Blut wurde einem gesunden Spender entnommen und heparinisiert (50 U/ml). Um Variationen zwischen den einzelnen Ansätzen so gering wie möglich zu halten, wurde nur ein einziger Spender für alle Versuche herangezogen. Die Isolierung der Granulozyten wurde wie beschrieben durchgeführt; eventuell vorhandene Antikör[Seite 19↓]per gegen K. pneumoniae wurden durch die Waschprozesse entfernt [118]. Als Komplementquelle diente das Serum eines anderen gesunden Spenders, das keine Antikörper gegen K. pneumoniae enthielt [118]. Es wurde in Aliquots bei -80°C gelagert und in allen Experimenten in einer Endkonzentration von 60 Vol.% eingesetzt.

3.8.2. Mikrophagozytose-Assay

Granulozyten wurden in einer Rundboden-Mikrotiterplatte (Costar, Cambridge, MA, USA) in einer Endkonzentration von 2,5 x 105 Zellen pro Vertiefung mit Serum, Hank´s Balanced Salt Solution mit Ca2+ und Mg2+ und Bakterien in einer Endkonzentration von 2,5 x 104 KBE pro well in einem Gesamtvolumen von 150 μl inkubiert. Die Bakterien wurden vorher wie unter 3.2. beschrieben in der Gegenwart oder Abwesenheit von G-CSF für 6 Stunden angezüchtet. Um einen Effekt des im Anzuchtmedium vorhandenen G-CSF auf den nachfolgenden Mikrophagozytose-Assay auszuschließen, wurden die Bakterien vor dem Einsatz im Assay gründlich mehrmals gewaschen (siehe 3.2). Die Inkubation im eigentlichen Mikrophagozytose-Assay erfolgte bei 37°C und einer Rotation von 1000 rpm, um einen möglichst engen Kontakt zwischen Granulozyten und Bakterien zu gewährleisten. Zum Zeitpunkt 0 und nach 60 und 90 Minuten wurden 10 μl von jeder Vertiefung entnommen, in steriles Wasser mit 0,1% BSA überführt und auf Eis gestellt, um die Granulozyten ohne Abtöten der Bakterien zu lysieren. Die Bakterienzahl wurde anschließend durch Ausplattieren 10-facher Verdünnungen auf TSA ermittelt. Der Prozentsatz überlebender Bakterien wurde wie folgt ermittelt:

[(1 - KBE bei 60 oder 90 Minuten) ÷ KBE bei 0 Minuten] x 100

Jedes Experiment wurde im Doppelansatz durchgeführt. Als Kontrollen dienten die Inkubation von Bakterien und Granulozyten ohne Serum, von Bakterien und Serum ohne Granulozyten sowie von Bakterien, Granulozyten und hitzeinaktiviertem Serum (56°C, 30 Minuten), um unspezifische antibakterielle Aktivität des Serums oder gegen KPS gerichtete Antikörper auszuschließen.

Um zu ermitteln, ob die antibakterielle Aktivität der Granulozyten auf Phagozytose beruht, wurde der Assay erneut angesetzt. Nach 60 Minuten wurden Proben (10 μl) ent[Seite 20↓]nommen und die Mikrotiterplatten wurden sofort danach zentrifugiert (250 x g, 5 Minuten, Raumtemperatur), um Granulozyten von nicht phagozytierten Bakterien abzutrennen. Anschließend wurden aus dem Überstand erneut Proben (10 μl) entnommen und wie oben beschrieben die KBE bestimmt.

3.9. Statistische Analyse

Die Signifikanz der Letalität wurde mittels des Cox-Mantel-Testes untersucht; für alle anderen Parameter wurde der zweiseitige Mann-Whitney U-Test verwendet. Alle Berechnungen wurden mittels der Software „Statistica for Windows, Version 4.5“ (Statsoft, Tulsa, USA) durchgeführt. Als statistisch signifikant wurden P-Werte < 0,05 angesehen.


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18.01.2005