[Seite 21↓]

4. Ergebnisse

4.1. Effekt des rekombinanten humanen G-CSF im verwendeten Mausstamm

Um eine Beeinflussung der Leukozytenzahlen durch häufige Blutabnahme auszu-schließen, wurde bei den Tieren vier Tage vor erster G-CSF-Gabe mit einmal täglicher Blutabnahme begonnen. Dabei zeigte sich, daß dadurch Zahl und Zusammensetzung der Leukozyten im peripheren Blut unverändert blieben (Abbildungen 1 und 2). Dosisabhängig konnte nach Gabe von G-CSF sowohl ein Anstieg der Gesamtleukozyten (Abb. 1) als auch ein Anstieg der absoluten Anzahl neutrophiler Granulozyten beobachtet werden (Abb. 2). Dabei wiesen die Veränderungen bei den Dosierungen von 2 x 15 μg/kg G-CSF/die und 2 x 50 μg/kg G-CSF/die ihr Maximum am zweiten Tag nach Beginn der Gabe auf. Bei einer Dosierung von 2 x 250 μg/kg G-CSF/die wurde das Maximum der Veränderungen am dritten Tag nach Start der Verabreichung beobachtet. Da die Angaben über Normalwerte von Leukozyten zwischen verschiedenen Mausstämmen und – innerhalb eines Stammes – bei verschiedenen Untersuchern stark schwanken [119,120], wurden die für die hier verwendeten BALB/c-Mäuse ermittelten Normalwerte für Gesamtleukozyten und für neutrophile Granulozyten aus den von Tag –4 bis einschließlich Tag 0 (vor der ersten G-CSF-Gabe) gemessenen Werten ermittelt.


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Abbildung 1. Dosisabhängige Erhöhung der Gesamtleukozytenzahl durch G-CSF, gegeben ab Tag 0, in BALB/c-Mäusen (n = 3 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Der für diesen Mausstamm ermittelte Normalbereich für Gesamtleukozyten (Mittelwert ± 1 x SD) ist schraffiert unterlegt.


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Abbildung 2. Dosisabhängige Erhöhung der neutrophilen Granulozyten durch G-CSF, gegeben ab Tag 0, in BALB/c-Mäusen (n = 3 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Der für diesen Mausstamm ermittelte Normalbereich für neutrophile Granulozyten ist schraffiert unterlegt.

4.2. Einfluß von G-CSF auf die experimentelle K. pneumoniae-Pneumonie

4.2.1. Überleben

Um die Auswirkungen einer Behandlung mit G-CSF auf die experimentelle K. pneumoniae-Pneumonie zu untersuchen, wurde den Tieren entweder vor oder nach Induktion der Pneumonie zweimal täglich G-CSF in verschiedenen Dosierungen subkutan verabreicht (Tabelle 1, Seite 16). Während der ersten 36 Stunden nach Induktion der Pneumonie überlebten alle untersuchten Tiere. Danach hingegen war eine Letalität vor allem der mit G-CSF behandelten Tiere zu verzeichnen. Diese war am stärksten in der Gruppe ausgeprägt, die mit 2 x 50 μg/kg ab Tag –2 behandelt wurde (Abb. 3). Die beiden anderen Dosierungen von G-CSF bei prophylaktischer Gabe (2 x 15 μg/kg und 2 x 250 μg/kg ab Tag –2) sowie die Verabreichung von 2 x 50 μg/kg G-CSF ab Tag +1 nach Induktion der Pneumonie führten zwar auch zu einer höheren Letalität im Vergleich zur [Seite 24↓]unbehandelten Kontrollgruppe, jedoch war dies nicht statistisch signifikant. Durch G-CSF von Tag –2 bis Tag 0 verstarb kein Tier.

Abbildung 3. Überlebenskurven bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF; G-CSF/t: therapeutische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,011 im Vergleich zur Kontrollgruppe und zur Gruppe, die G-CSF therapeutisch erhielt (G-CSF/t).

4.2.2. Klinischer Verlauf

Um Informationen nicht nur über Letalität, sondern auch über den klinischen Verlauf bis zum Ende des Versuchs 72 Stunden nach Induktion der Pneumonie bei den Tieren zu erhalten, die nicht verstarben, wurde täglich das Gewicht gemessen, da dieser Parameter eng mit dem Schweregrad einer experimentell induzierten bakteriellen Pneumonie korreliert [54,113]. Es konnten keine signifikanten Unterschiede im Gewichtsverhalten durch die prophylaktische oder therapeutische Gabe von G-CSF beobachtet werden. Dies war von der Dosierung des Wachstumsfaktors unabhängig (Abb. 4).


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Abbildung 4. Gewichtsverlauf bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF; G-CSF/t: therapeutische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16).

4.2.3. Quantitative Bestimmung der Keimzahlen

Bei einer prophylaktischen Gabe von 2 x 15 μg/kg hatte G-CSF eine im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikante Erhöhung der Keimzahlen in Leber und Milz zur Folge (Abb. 5). Bei höherer Dosierung war hingegen eine Abnahme der Keimzahlen in der Lunge zu beobachten, die jedoch keine statistische Signifikanz erreichte (Abb. 5). Überraschend jedoch fand sich eine Umkehrung des quantitativen Keimverhältnisses zwischen dem primär infizierten Organ (Lunge) und den sekundär besiedelten Organen Leber und Milz im Vergleich zur Kontrollgruppe. War dort die Reihenfolge Lunge → Leber → Milz zu beobachten (absteigend nach KBE geordnet), so kehrte sich dies bei den mit 2 x 50 μg/kg und 2 x 250 μg/kg G-CSF prophylaktisch behandelten Tieren um. Nun fand sich die höchste Anzahl an KBE in der Leber, und der Gehalt an Bakterien in der Milz war ebenso hoch (bei 2 x 50 μg/kg G-CSF) oder höher (bei 2 x 250 μg/kg G-CSF) als der der Lunge (Abb. 5). Die therapeutische Gabe von G-CSF zeigte keinen signifikanten Einfluß auf den Keimgehalt in Lunge, Leber oder Milz (Abb. 5).


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Abbildung 5. Keimgehalt in Lunge, Leber und Milz bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von G-CSF. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Innerhalb der Säulen ist die Anzahl der untersuchten Tiere angegeben. G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF; G-CSF/t: therapeutische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,005 und **: P = 0,014 im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Um dieses Verhalten statistisch näher zu charakterisieren, wurde ein Index aus dem Keimgehalt in Leber oder Milz, dividiert durch den Keimgehalt in der Lunge, gebildet. Diese Indices waren dosisabhängig umso höher, je mehr G-CSF prophylaktisch verabreicht wurde (Tabelle 2).


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Tabelle 2. Indices der Keimzahlen aus Leber/Milz und Lunge als Parameter für die bakterielle Disseminierung.

Behandlung a

Signifikanzniveau c

Kontrolltiere

0,931 ± 0,072 b

0,751 ± 0,037

 

G-CSF/p, 15 μg/kg/Gabe

1,001 ± 0,008

0,847 ± 0,035

0,043 (L)*

G-CSF/p, 50 μg/kg/Gabe

1,405 ± 0,232

1,029 ± 0,086

0,012 (L)*
0,006 (M)*

G-CSF/p, 250 μg/kg/Gabe

1,686 ± 0,265

1,163 ± 0,116

0,008 (L)*
0,006 (M)*

G-CSF/t, 50 μg/kg/Gabe

0,945 ± 0,105

1,001 ± 0,098

0,015 (M)*

MAb III/5-1 /p, 10 mg/kg einmalig

0,636 ± 0,084

0,525 ± 0,071

0,02 (L)*
0,01 (M)*

MAb III/5-1 /t, 10 mg/kg einmalig

0,439 ± 0,037

0,407 ± 0,021

0,0002 (L)*
0,0001 (M)*

G-CSF/p, 50 μg/kg/Gabe +
MAb III/5-1 /p, 10 mg/kg einmalig

0,690 ± 0,120

0,502 ± 0,062

0,013 (M)*
0,007 (L)**
0,002 (M)**

Pentoxifyllin/t, 50 mg/kg/Gabe

0,988 ± 0,096

0,870 ± 0,023

 

G-CSF/p, 50 μg/kg/Gabe +
Pentoxifyllin/t, 50 mg/kg/Gabe

0,943 ± 0,031

0,752 ± 0,044

 

a p = Behandlung vor Induktion der Pneumonie (prophylaktisch); t = Behandlung nach Induktion der Pneumonie (therapeutisch). Die Kontrolltiere erhielten jeweils PBS entsprechend der Verabreichung der jeweiligen Reagenzien (s.c., i.v. oder i.p.). Der genaue Behandlungsplan ist in Tabelle 1 (Seite 16) angegeben.
b Angegeben sind Mittelwert ± SEM.
c(L): Signifikanzniveau für den Index KBE Leber ÷ KBE Lunge; (M): Signifikanzniveau für den Index KBE Milz ÷ KBE Lunge; *: P im Vergleich zu den Kontrolltieren; **: P im Vergleich zu den Tieren, die nur G-CSF prophylaktisch mit 50 μg/kg/Gabe erhielten.


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4.2.4. Histologische Befunde

In der Lunge war bei den Kontrolltieren eine eitrig abszedierende Pneumonie zu finden (Abb. 6 A, Seite 90). In der Leber hingegen zeigten sich nur wenige Gruppenzellnekrosen mit histiozytärer Abräumreaktion (Abb. 6 B, Seite 90). Die mit G-CSF behandelten Tiere wiesen in der Lunge gering ausgeprägte Herdpneumonien, zum Teil eitrig abszedierend und nekrotisierend auf (Abb. 6 C, Seite 90). In der Leber fanden sich im Gegensatz zu den Kontrolltieren ausgedehnte, zum Teil landkartenartig konfigurierte Gruppenzellnekrosen und Abszesse, die mit dichten Bakterienrasen beladen waren (Abb. 6 D, Seite 90). Zum Teil fanden sich granulozytäre Abräumreaktionen am Rand dieser Abszesse. Die pulmonalen Veränderungen bei G-CSF-Gabe waren von der Dosierung unabhängig. Bei Gabe von G-CSF nach Induktion der Pneumonie waren die pulmonalen Veränderungen nicht so stark ausgeprägt wie bei den Kontrolltieren (Abb. 6 E, Seite 91). Im Vergleich zu den Kontrolltieren kam es zwar zu ausgedehnten Abszessen in der Leber und der Milz mit massiven Bakterienrasen (Abbildungen 6 F, G und H, Seite 91). Jedoch waren im Gegensatz zu den Tieren, die G-CSF vor Induktion der Pneumonie erhielten, keine Gruppenzellnekrosen in der Leber zu beobachten (Abbildungen 6 F und D, Seite 90 f.).

4.3. Einfluß des gegen K2-Kapselpolysaccharid gerichteten monoklonalen An-
tikörpers mAb III/5-1 auf die experimentelle K. pneumoniae-Pneumonie

4.3.1. Überleben

In den Gruppen, die den monoklonalen Antikörper III/5-1 erhielten, überlebten alle Tiere bis zum Ende der Experimente (Abb. 7), unabhängig davon, ob der mAb III/5-1 prophylaktisch (d.h., eine Stunde vor Infektion) oder therapeutisch (24 Stunden nach Infektion) gegeben wurde. Bei der prophylaktischen Kombinationsbehandlung der Infektion mit mAb III/5-1 und G-CSF (2 x 50 μg/kg) konnte die signifikante Erhöhung der Letalität durch G-CSF alleine verhindert werden (Abbildungen 3 und 7).


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Abbildung 7. Überlebenskurven bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß des spezifisch gegen K2-KPS von K. pneumoniae gerichteten mAb III/5-1 und Synergismus dieser Therapie mit der Gabe von G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). mAb III/5-1/p: prophylaktische Gabe des mAb; mAb III/5-1/t: therapeutische Gabe des mAb; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,011 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,0094 zur Gruppe, die sowohl G-CSF prophylaktisch als auch den mAb III/5-1 prophylaktisch erhielt.

4.3.2. Klinischer Verlauf

Im Gegensatz zu der Behandlung mit G-CSF konnte die Therapie mit dem mAb III/5-1 den klinischen Verlauf nachhaltig zum besseren beeinflussen. Es zeigte sich, korrespondierend zur Letalität unabhängig von prophylaktischer oder therapeutischer Gabe des Antikörpers, ein signifikant geringerer Gewichtsverlust im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren (Abb. 8). Ebenfalls korrespondierend zur Letalität ließ sich eine signifikante Verbesserung des klinischen Verlaufes durch die Kombinationsbehandlung mit mAb III/5-1 und G-CSF (2 x 50 mg/kg/die) im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren und zu den Tieren, die nur G-CSF erhielten, beobachten (Abbildungen 4 und 8).


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Abbildung 8. Gewichtsverlauf bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß des spezifisch gegen K2-KPS von K. pneumoniae gerichteten mAb III/5-1 und Synergismus dieser Therapie mit der Gabe von G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. mAb III/5-1/p: prophylaktische Gabe des mAb; mAb III/5-1/t: therapeutische Gabe des mAb; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,014 und **: P = 0,007 im Vergleich zur Kontrollgruppe. §: P = 0,003 und §§: P = 0,0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. #: P = 0,0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,00001 im Vergleich zur Gruppe, die G-CSF prophylaktisch erhielt (G-CSF/p). ##: P = 0,0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,00001 im Vergleich zur Gruppe, die G-CSF prophylaktisch erhielt (G-CSF/p).

4.3.3. Quantitative Bestimmung der Keimzahlen

Im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren konnte durch die Behandlung mit mAb III/5-1 in den primär infizierten Organen, den Lungen, keine statistisch signifikante Abnahme der Keimzahlen erreicht werden. Dies war jedoch der Fall bei den septisch besiedelten Organen Leber und Milz (Abb. 9). Dabei zeigte sich, daß die therapeutische [Seite 31↓]Gabe des mAb der prophylaktischen überlegen war (Abb. 9). Im Vergleich zur Kontrollgruppe und zu den allein mit G-CSF prophylaktisch behandelten Tieren (2 x 50 μg/kg/die) hatte die gleichzeitige Behandlung der experimentellen Pneumonie mit mAb III/5-1 und G-CSF eine signifikante Verringerung des Keimgehaltes in Leber und Milz zur Folge. Die mit alleiniger G-CSF-Gabe entschieden geförderte septische Ausbreitung der Infektion in Leber und Milz (vgl. Abb. 5) konnte durch simultane Gabe des mAb III/5-1 verhindert werden (Abb. 9). Dies schlug sich auch in den Indices aus KBE in Leber oder Milz/KBE in der Lunge nieder (Tabelle 2).

Abbildung 9. Keimgehalt in Lunge, Leber und Milz bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß des spezifisch gegen K2-KPS von K. pneumoniae gerichteten mAb III/5-1 und Synergismus dieser Therapie mit der Gabe von G-CSF. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Innerhalb der Säulen ist die Anzahl der untersuchten Tiere angegeben. mAb III/5-1/p: prophylaktische Gabe des mAb; mAb III/5-1/t: therapeutische Gabe des mAb; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,016 im Vergleich zur Kontrollgruppe. §: P = 0,011; §§: P = 0,0003 und §§§: P = 0,0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. #: P = 0,005 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,0007 im Vergleich zur Gruppe, die G-CSF pro[Seite 32↓]phylaktisch erhielt (G-CSF/p). ##: P = 0,004 im Vergleich zur Kontrollgruppe und P = 0,008 im Vergleich zur Gruppe, die G-CSF prophylaktisch erhielt (G-CSF/p).

4.3.4. Histologische Befunde

Die allein mit dem mAb III/5-1 behandelten Tiere wiesen eine im Vergleich zu den Kontrolltieren geringer ausgeprägte pneumonische Alteration der Lunge auf (Abb. 10 A, Seite 93). In der Leber fanden sich diskrete, einzelne Gruppenzellnekrosen mit Abräumreaktion und eine gering ausgeprägte Leberzellverfettung (Abb. 10 B, Seite 93). In Lunge und Leber waren die Veränderungen unabhängig von prophylaktischer oder therapeutischer Gabe des mAb III/5-1 gleich (Abbildungen 10 A und E sowie 10 B und F, Seite 93 f.). Die sowohl mit G-CSF als auch mit dem mAb III/5-1 behandelten Tiere hatten im Vergleich zur Kontrollgruppe und zu den allein mit G-CSF behandelten Tieren die am geringsten ausgebildeten entzündlichen Veränderungen in Lunge und Leber (Abbildungen 10 C und 10 D, Seite 93).

4.4. Einfluß von Pentoxifyllin auf die experimentelle K. pneumoniae-Pneumonie

Die bisher mit G-CSF erhobenen Befunde standen im Widerspruch zu den aus der Literatur bekannten. Die histologischen Befunde mit ausgedehnten Nekrosen in der Leber sowie mit Infiltration von neutrophilen Granulozyten in deren Randbereich ähnelten den in einer Arbeit von Suzuki et al. beschriebenen, die bei Patienten beobachtet wurden, deren Tumoren G-CSF produzierten [121]. Zusätzlich bestand die Möglichkeit, daß diese Nekrosen durch eine Überproduktion von TNF—α hervorgerufen wurden [122,123]. Da eine überschießende Produktion von TNF—α auch die erhöhte Letalität erklären könnte, wurden Experimente durchgeführt, in denen die Produktion von TNF—α blockiert wurde. Eine komplette Blockade von TNF—α aber, wie sie z.B. durch monoklonale Antikörper erreicht wird, hätte unter Umständen eine Erhöhung der Letalität zur Folge haben können, da bekannt ist, daß TNF—α für eine geordnete Infektabwehr notwendig ist [39,38,42,41,43,124,125]. Daher wurde Pentoxifyllin eingesetzt, da diese Substanz ein selektiver Inhibitor der Transkription von TNF—α mRNA ist [126,127] und da weiterhin nachgewiesen wurde, daß Pentoxifyllin die Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch GM-CSF nicht hemmt [128]. Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß Pentoxifyllin die endogene TNF—α-Antwort nicht komplett blockiert, sondern lediglich deren Ausmaß reduziert [129]. [Seite 33↓]Um die durch alleinige prophylaktische Gabe von G-CSF (2 x 50 μg/kg/die) erhöhte Letalität (vgl. 4.2.1.) nicht weiter zu erhöhen, sondern zu senken, wurde deshalb Pentoxifyllin ausgewählt.

4.4.1. Überleben

Bei der Verabreichung von Pentoxifyllin konnte beobachtet werden, daß die Gruppe, die Pentoxifyllin allein erhielt, zwar ebenfalls eine erhöhte Letalität im Vergleich zur Kontrollgruppe aufwies, dies jedoch erst verzögert nach 60 Stunden (Abbildung 11). Die gleichzeitige Gabe von G-CSF (2 x 50 μg/kg ab Tag –2) und Pentoxifyllin ergab keinen Unterschied im Vergleich zur alleinigen Gabe von Pentoxifyllin hinsichtlich der Anzahl überlebender Tiere. Jedoch wurde durch den Zusatz von G-CSF die Kinetik der Letalität verändert; die Tiere begannen bereits ab 36 Stunden nach Induktion der Pneumonie zu versterben (Abbildung 11).

Abbildung 11. Überlebenskurven bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von Pentoxifyllin (POF) und G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). POF/t, therapeutische Gabe von Pentoxifyllin; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,011 im Vergleich zur Kontrollgruppe; §: P = 0,023 im Vergleich zur Kontrollgruppe.


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4.4.2. Klinischer Verlauf

Korrespondierend zur Letalität wies Pentoxifyllin keinen signifikanten Einfluß auf den klinischen Verlauf im Vergleich zur Kontrollgruppe auf, ebenso wie die gleichzeitige Gabe von G-CSF und Pentoxifyllin (Abb. 12).

Abbildung 12. Gewichtsverlauf bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von Pentoxifyllin und G-CSF (n = 11 Tiere/Gruppe). Angegeben sind Mittelwert ± SEM. G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16).

4.4.3. Quantitative Bestimmung der Keimzahlen

Durch die Verabreichung von Pentoxifyllin alleine wurde der Keimgehalt in allen untersuchten Organen erhöht, in Leber und Milz auch statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 13). Die gleichzeitige prophylaktische Gabe von G-CSF (2 x 50 μg/kg/die) und Pentoxifyllin veränderte den Keimgehalt von Lunge, Leber und Milz nicht signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe. Im Vergleich zur allein mit G-CSF (2 x 50 μg/kg/die) prophylaktisch behandelten Tieren konnte ein Keimgehalt der Leber, der den der Lunge übersteigt, bei beiden mit Pentoxifyllin behandelten Gruppen nicht nachgewiesen werden (Abb. 13).


[Seite 35↓]

Abbildung 13. Keimgehalt in Lunge, Leber und Milz bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie unter dem Einfluß von G-CSF und/oder Pentoxifyllin. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. Innerhalb der Säulen ist die Anzahl der untersuchten Tiere angegeben. Pentoxifyllin/t, therapeutische Gabe von Pentoxifyllin; G-CSF/p: prophylaktische Gabe von G-CSF (vergleiche Tabelle 1, Seite 16). *: P = 0,036 und **: P = 0,028 im Vergleich zur Kontrollgruppe.

4.4.4. Histologische Befunde

Die histologischen Veränderungen in der Lunge unter alleiniger Behandlung mit Pentoxifyllin waren mit massiven Nekrosen und Abszessen deutlich stärker ausgeprägt als die der Kontrolltiere (Abb. 14 A, Seite 96; vgl. Abb. 6 A, Seite 90). Die Abszesse in der Leber dieser Tiere waren mit Bakterien beladen; große konfluierende Gruppenzellnekrosen wurden nicht beobachtet (Abb. 14 B, Seite 96). Die gleichzeitige Verabreichung von G-CSF und Pentoxifyllin hatte keinen Einfluß auf die histologischen Veränderungen in der Lunge im Vergleich zu alleiniger Gabe von Pentoxifyllin (Abb. 14 C, Seite 96) oder von G-CSF. In der Leber kamen zu den Abszessen die unter alleiniger G-CSF-Therapie beobachteten großen konfluierenden Gruppenzellnekrosen hinzu (Abb. 14 D, Seite 96).


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4.5. Interaktion von G-CSF mit K. pneumoniae in vitro

Eine durch die Vorbehandlung mit G-CSF verursachte überschießende Produktion von TNF—α ist nach den klinischen und histologischen Ergebnissen unwahrscheinlich, da die Blockierung der Produktion von TNF—α keinen Einfluß auf Letalität, klinischen Verlauf oder Histologie hatte (vgl. 4.4.). Daher lag es nahe, nach einem anderen Mechanismus zu suchen, der den deletären Einfluß von G-CSF auf die Pneumonie erklären könnte. Bereits 1991 konnte die Bindung eines Zytokins (Interleukin-1) an ein gram-negatives Bakterium (E. coli) und daraus resultierend ein beschleunigtes bakterielles Wachstum nachgewiesen werden [130]. Daher wurde untersucht, ob G-CSF das Verhalten von K. pneumoniae in vitro beeinflußt.

4.5.1. Wachstumsverhalten von K. pneumoniae unter dem Einfluß von G-CSF

Ein wichtiger bakterieller Virulenzfaktor ist die Wachstumsgeschwindigkeit. Daher wurde K. pneumoniae in der Gegenwart von G-CSF in einer Konzentration von 10 ng/ml angezüchtet. Diese Konzentration von G-CSF wurde gewählt, da sie bei pharmakologischen Studien als Konzentration im Serum bei klinisch verwendeter Dosierung von subkutan verabreichtem G-CSF gefunden wurde [131,132] und ebenfalls endogen bei Patienten mit neutropenischem Fieber produziert wird [133]. Als Kontrolle wurde das Wachstum in der Gegenwart von IL-1α und von Diluens (PBS) untersucht. In allen beobachteten Kulturen konnte keine Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit durch G-CSF im Vergleich zu IL-1α oder zur Kontrolle beobachtet werden (Abb. 15).


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Abbildung 15. Wachstumsverhalten von K. pneumoniae B5055 in vitro unter dem Einfluß von G-CSF (10 ng/ml) oder IL-1α (2 ng/ml). Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz.


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4.5.2. Einfluß von G-CSF auf die Produktion von zellgebundenem KPS

Der entscheidende Virulenzfaktor von K. pneumoniae ist deren dicke Kapsel, die das Bakterium vor Phagozytose durch neutrophile Granulozyten schützt [24]. Daher wurde untersucht, ob G-CSF die Produktion von zellgebundenem KPS erhöht und es somit den Keimen ermöglichen könnte, dem entscheidenden Abwehrmechanismus, der Phagozytose durch neutrophile Granulozyten, vermehrt zu entgehen. Es konnte gezeigt werden, daß dies tatsächlich der Fall ist. Im Gegensatz zu den Kontrollkulturen mit Diluens alleine oder mit IL-1α nahm die Menge an zellgebundenem KPS signifikant zu, wenn G-CSF dem Medium zugesetzt wurde (Abb. 16). Ein Stamm, der eine nur sehr geringe Produktion von KPS aufweist (K. pneumoniae F201), zeigte hingegen keine Erhöhung des zellgebundenen KPS durch G-CSF (Abb. 16, Inset).


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Abbildung 16. Produktion von K2-KPS durch K. pneumoniae B5055 oder F201 (Einsatz) in vitro unter dem Einfluß von G-CSF (10 ng/ml) oder IL-1α (2 ng/ml). Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz. *: P = 0,02 im Vergleich zu Bakterien, die nur in Medium angezüchtet wurden.


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4.6. Funktionelle Bedeutung der Erhöhung der zellgebundenen KPS-Produktion durch G-CSF

Um die funktionelle Wertigkeit der Steigerung der Produktion von zellgebundenem KPS durch G-CSF in vitro zu überprüfen, wurde ein Mikrophagozytose-Assay eingesetzt, der den Prozentsatz abgetöteter Bakterien bestimmt. Dies ist bedeutend, da phagozytierte Bakterien nicht notwendigerweise abgetötet werden, sondern sich sogar in den Phagolysosomen vermehren können [134]. Es ließ sich nachweisen, daß in der Gegenwart von G-CSF gewachsene Bakterien signifikant weniger abgetötet werden als unbehandelte Kontrollkeime (Abb. 17). Bei keiner der Negativkontrollen konnte ein Absterben der Bakterien beobachtet werden. Um zu untersuchen, ob die Phagozytose von K. pneumoniae durch neutrophile Granulozyten ebenfalls inhibiert ist, wurden nach 60-minütiger Ko-Inkubation Bakterien und Granulozyten voneinander getrennt und die Menge der im Überstand verbliebenen Bakterien bestimmt. 84% der eingesetzten Keimmenge (Median, Quartile: 82,7% und 85,5%) wurden nach 60 Minuten wiedergewonnen, wenn die Bakterien in der Gegenwart von G-CSF angezüchtet wurden. Im Gegensatz dazu wurden nur 53,9% der eingesetzten Keimmenge (Median, Quartile: 52,9% und 59,2%) wiedergewonnen, wenn K. pneumoniae nur im Nährmedium angezüchtet wurde (P = 0,014). Damit konnte nachgewiesen werden, daß G-CSF die Produktion des entscheidenden Virulenzfaktors, von zellgebundenem Kapselpolysaccharid, signifikant vermehrt und somit die Phagozytose der Keime durch neutrophile Granulozyten als wichtigen Abwehrmechanismus gegen K. pneumoniae signifikant schwächt. Dies könnte die in vivo beobachteten Phänomene einer vermehrten septischen Ausbreitung von K. pneumoniae in mit G-CSF vorbehandelten Tieren und die dadurch erhöhte Letalität erklären.


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Abbildung 17. Inhibierung der Phagozytose und des bakteriellen Abtötens von K. pneumoniae B5055 durch neutrophile Granulozyten in vitro, wenn die Bakterien für 6 Stunden ohne oder mit G-CSF (10 ng/ml) angezüchtet wurden. Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz. *: P = 0,014 im Vergleich zu Bakterien, die nur in Medium angezüchtet wurden.

4.7. Bindung von G-CSF an K. pneumoniae

Hat G-CSF in vitro direkte und signifikante Wirkungen auf K. pneumoniae, so wäre der Nachweis einer Bindung dieses hämatopoetischen Wachstumsfaktors an den gram-negativen Organismus eine logische Konsequenz. Dieser Nachweis wurde mit zwei voneinander unabhängigen Methoden geführt.

4.7.1. Bindung von 125J-G-CSF an K. pneumoniae

Zunächst wurden die Kriterien der Spezifität und Sättigbarkeit einer Bindung mittels radioaktiv markiertem G-CSF überprüft. Dabei konnte nachgewiesen werden, daß 125J-G-CSF sowohl an K. pneumoniae B5055 als auch an den avirulenten, nicht signifikant zellgebundenes KPS produzierenden Stamm F201 bindet; diese Bindung war sättigbar (Abb. 18). Um die Spezifität zu zeigen, wurden die Experimente wiederholt und un[Seite 42↓]markiertes G-CSF in steigenden Konzentrationen beigesetzt. Dadurch war es möglich, 125J-G-CSF dosisabhängig aus der Bindung an K. pneumoniae B5055 zu verdrängen (Abb. 19). Mit einem unverwandten Zytokin, IL-1α, hingegen gelang dies nicht (Abb. 20). Somit konnte gezeigt werden, daß G-CSF an K. pneumoniae bindet und daß dies eine spezifische Bindung an das Bakterium war.

Abbildung 18. Bindung von 125J-G-CSF an K. pneumoniae B5055 oder F201 nach 40 Minuten Inkubation bei 4°C.


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Abbildung 19. Inhibition der Bindung von 125J-G-CSF an K. pneumoniae B5055 durch nicht markiertes G-CSF. 125J-G-CSF (50 ng) wurde für 40 Minuten bei 4°C mit K. pneumoniae B5055 und den angegebenen Mengen an nicht markiertem G-CSF inkubiert. Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz, als spezifische Bindung relativ zu einem Experiment ohne Kompetitor.


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Abbildung 20. Fehlende Inhibition der Bindung von 125J-G-CSF an K. pneumoniae B5055 durch nicht markiertes IL-1α. 125J-G-CSF (50 ng) wurde für 40 Minuten bei 4°C mit K. pneumoniae B5055 und den angegebenen Mengen an nicht markiertem IL-1α inkubiert. Angegeben sind Mittelwert ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten, jeweils im Doppelansatz.

4.7.2. Immunoblotting

Die Bindung von G-CSF an K. pneumoniae wurde mittels immunologischer Verfahren näher charakterisiert. Dazu wurden aus unbehandelten Bakterien Lysate hergestellt und diese elektrophoretisch aufgetrennt und auf Membranen geblottet. Anschließend wurden die aufgetrennten bakteriellen Bestandteile mit G-CSF, anti-G-CSF und mit peroxidase-markiertem anti-Maus-IgG inkubiert und mittels Chemilumineszenz entwickelt. Dabei ließen sich drei spezifische Bindungsstellen von G-CSF darstellen, die eine Größe von 41, 25 und 21 kD aufwiesen (Abb. 21). Die Vorbehandlung des bakteriellen Lysates durch Proteinase K führte zum Verschwinden der Bindungsstellen, so daß diese zumindest proteinhaltig sein müssen (Abb. 21). Umfangreiche Kontrollen, von denen hier nur einige gezeigt sind, demonstrierten, daß dieser Bindungsnachweis spezifisch war.


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Abbildung 21. Immunoblot von K. pneumoniae B5055-Lysaten mit G-CSF. Bahn 1: Marker für Molekulargewicht in kDa; Bahn 2: bakterielles Lysat; Bahn 3: bakterielles Lysat, das vor der Elektrophorese mit Proteinase K verdaut wurde; Bahn 4: Inkubation mit G-CSF, das mit anti-humanem G-CSF-IgG präabsorbiert wurde; Bahn 5: Elektrophorese von G-CSF alleine als Positivkontrolle; Bahnen 6 bis 8: Silberfärbung eines identischen Zweitgeles, wobei Bahn 6 der Bahn 2 entspricht, Bahn 7 der Bahn 3 und Bahn 8 der Bahn 5. Die Pfeile in Bahn 2 markieren die spezifischen Bindungsstellen von G-CSF an Proteine im bakteriellen Lysat. Die Pfeilspitze in Bahn 5 markiert die Positivkontrolle mit G-CSF.

 

 


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18.01.2005