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5. Diskussion

5.1. Wirkung des G-CSF im verwendeten Mausstamm

Humanes und murines G-CSF sind zu etwa 70% homolog in ihren Aminosäurensequenzen [135], und auch die entsprechenden Rezeptoren zeigen zu 62,5% Homologie [136]. Die quantitative, nicht aber die qualitative Wirkung humanen G-CSFs in der Maus ist jedoch von der im Menschen verschieden [137]. Um die Wirksamkeit des verwendeten humanen rekombinanten G-CSF im Stamm der BALB/c-Mäuse zu untersuchen, wurden daher den Tieren vor und während der subkutanen Gabe von G-CSF täglich Blut entnommen und die Gesamtleukozytenzahl sowie das Differentialblutbild bestimmt. Um einen Effekt der Blutabnahme allein auf die Anzahl und Zusammensetzung der Leukozyten im peripheren Blut erkennen zu können, wurde mit der Blutabnahme 4 Tage vor der ersten G-CSF-Dosis begonnen.

Die Ergebnisse zeigen, daß das verwendete rekombinante humane G-CSF im verwendeten Mausstamm aktiv war und dosisabhängig zu einem deutlichen Anstieg der Leukozyten im peripheren Blut führte. Dieser Anstieg war nicht artifiziell durch die Blutabnahme selbst bedingt (Abb. 1). Die Ergebnisse standen im Einklang mit bereits publizierten Studien der Leukozytenkinetik in der Maus nach G-CSF-Gabe [138,139], auch wenn die Mausstämme sich unterschieden. Somit kann davon ausgegangen werden, daß die hier beobachteten Ergebnisse nicht auf einer verminderten oder gar fehlenden Wirksamkeit des verwendeten G-CSF beruhen. Da die meisten Arbeiten mit experimentellen bakteriellen Infektionen eine Dosierung von 2 x 50 μg/kg/die verwendeten, wurde diese Dosierung ausgewählt.

5.2. G-CSF verschlechtert das Überleben bei einer experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie

Die Mehrzahl tierexperimenteller Untersuchungen zur Wirkung von G-CSF bei Infektionen zeigt einen günstigen Effekt auf das Überleben. So überlebten signifikant mehr Tiere bei einer experimentellen Infektion mit K. pneumoniae [101], S. pneumoniae [140,102], E. coli [141,142,143], P. aeruginosa [107,143], L. monozytogenes [144] oder bei intraabdomineller Infektion durch Ligatur und Punktion des Zökums [145,146,147,106]. Im Gegensatz hierzu verstarben bei der vorlieg[Seite 47↓]enden Untersuchung signifikant mehr Tiere, wenn G-CSF vor Induktion der Pneumonie gegeben wurde (Abb. 3). Dies war am ausgeprägtesten bei der mittleren hier verwendeten Dosierung, wohingegen die Gabe von G-CSF ab 24 Stunden nach Infektion das Überleben im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe nicht veränderte (Abb. 3). Auch der klinische Verlauf bis zum Ende der Experimente wurde durch G-CSF nicht positiv beeinflußt (Abb. 4). Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch zu zwei vergleichbaren Arbeiten. In der ersten wurde ebenfalls mit K. pneumoniae bei Ratten eine Pneumonie induziert, und die prophylaktische Gabe von G-CSF in identischer Dosierung (50 μg/kg/die) von Tag –2 bis Tag 0 erhöhte das Überleben signifikant [101]. Leider wurden in dieser Arbeit die Keimzahlen nur in der Lunge untersucht und dies auch nur zum Zeitpunkt 4 Stunden nach Infektion. Damit können weitere Vergleiche nicht direkt gezogen werden, da zum einen Angaben über septische Streuung der Bakterien in z.B. Leber oder Milz fehlen und zum anderen eine Aussage über den zeitlichen Verlauf einer bakteriellen Dissemination über mehr als 4 Stunden nach Infektion fehlen [101]. Die Tatsache eines signifikant besseren Überlebens der Tiere durch vorausgegangene Behandlung mit G-CSF läßt jedoch auf einen günstigen Einfluß des Wachstumsfaktors auf die bakterielle Streuung in diesem Modell schließen. Die zweite vergleichbare Arbeit verwendete zwar ein anderes Bakterium (E. coli), ein anderes Infektionsmodell (das der bakteriellen Peritonitis), und eine andere Dosierung von G-CSF (1 x 50 μg/kg/die von Tag –5 bis Tag +2, also eine Behandlung über den Zeitpunkt der Infektion hinaus) [148]. Aber sie untersuchte das Zusammenwirken von G-CSF und einem monoklonalen, gegen die Kapsel von E. coli gerichteten IgM-Antikörper [148]. Hier wurde kein Vorteil hinsichtlich des Überlebens gesehen, wenn G-CSF allein verabreicht wurde. Hingegen verbesserte sich das Überleben signifikant, wenn beide anti-infektiösen Therapieprinzipien zusammen eingesetzt wurden. Leider wurden auch hier wieder die Keimzahlen in Blut und peritonealer Lavage lediglich zu einem sehr frühen Zeitpunkt (90 Minuten nach Infektion) untersucht [148]. Das synergistische Prinzip einer Therapie mit einem hämatopoetischen Wachstumsfaktor und einer immunologischen, gegen einen bakteriellen Virulenzfaktor gerichteten Therapie hinsichtlich der positiven Beeinflussung einer Infektion konnte also sowohl in der hier vorliegenden Arbeit als auch in der Literatur bestätigt werden.


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Daneben gibt es aber auch andere Ergebnisse hinsichtlich der Beeinflussung einer experimentellen Infektion durch G-CSF. So wurde das Überleben einer intravenösen Infektion mit P. aeruginosa verschlechtert, wenn G-CSF nach Infektion gegeben wurde [149]. Dieser Effekt konnte auch bei der Behandlung einer E. coli-Peritonitis und -Sepsis [150] sowie bei Therapie einer E. coli-Pneumonie [151] beobachtet werden.

5.2.1. G-CSF fördert die bakterielle Dissemination bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie

Bei den hier durchgeführten Experimenten fiel auf, daß sich bei den allein mit G-CSF behandelten Tieren die Keimzahl im primär infizierten Organ, der Lunge, nicht durch den Wachstumsfaktor senken ließ (Abb. 5). Darüberhinaus wurde eine dosisabhängige Steigerung der bakteriellen Disseminierung bei prophylaktischer Gabe von G-CSF, erkennbar an den KBE-Indices, beobachtet (Tabelle 2). Auch die histologischen Befunde stützen diese Beobachtung, da in der Leber von mit G-CSF vorbehandelten Tieren nicht nur Nekrosen, sondern auch Abszesse mit hoher Bakterienzahl nachgewiesen werden konnten (Abb. 6). Diese bakterielle Disseminierung trat nicht in signifikantem Ausmaß auf, wenn mit der Gabe von G-CSF erst 24 Stunden nach Infektion begonnen wurde (Abb. 5, Tabelle 2). Auffällig war auch, daß bei der niedrigsten prophylaktisch verwendeten Dosierung, 2 x 15 μg/kg/die, ein höherer Keimgehalt in allen untersuchten Organen zu finden war (Abb. 5). Diese Ergebnisse können das verschlechterte Überleben bei einer prophylaktischen Behandlung mit G-CSF erklären. Auch diese Befunde stehen im Widerspruch zu anderen Arbeiten mit verschiedenen Infektionsmodellen, bei denen eine Abnahme der bakteriellen Besiedlung von Organen und der Bakteriämie unabhängig von den untersuchten Bakterien nachgewiesen wurde [101,145,142,144,146,152]. Zusätzlich ist bekannt, daß G-CSF die Phagozytose von Bakterien durch neutrophile Granulozyten fördert [153]. Jedoch zeigt die Literatur in dieser Hinsicht auch entgegengesetzte Befunde. So konnte durch G-CSF die Anzahl der Bakterien im Liquor bei Pneumokokken-Meningitis nicht gesenkt werden [154]. In neutropenischen Mäusen wurde ein Anstieg der Bakterienzahl in der Leber beobachtet, wenn G-CSF nach intravenöser Infektion mit P. aeruginosa, S. aureus oder K. pneumoniae verabreicht wurde [105]. Somit sind in der Literatur auch Präzedenzfälle für die hier vorgestellten Beobachtungen zu finden.


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5.2.2. Einfluß des Zeitpunktes der G-CSF-Therapie auf den Verlauf der experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie

Die Erhöhung der Letalität durch G-CSF wurde nur beobachtet, wenn der Wachstumsfaktor vor Infektion verabreicht wurde, jedoch nicht, wenn mit der Gabe 24 Stunden nach Infektion begonnen wurde (Abb. 3). Die Keimzahlen in Lunge, Milz und Leber hingegen waren nicht von denen der Kontrollgruppe verschieden (Abb. 5). Auch der klinische Verlauf war mit dem der Kontrollgruppe identisch (Abb. 4). Die Beobachtung, daß der Zeitpunkt der Therapie entscheidend für den Verlauf der Infektion ist, findet sich in der Literatur wieder. Bei einer Infektion durch C. albicans wurde eine Erhöhung des Überlebens nur beobachtet, wenn G-CSF 24 Stunden vor Infektion gegeben wurde, eine Gabe 24 Stunden nach Infektion hatte keinen Einfluß [155]. Der gleiche Effekt (verbessertes Überleben bei prophylaktischer, nicht aber bei therapeutischer Gabe) wurde in experimentellen Modellen einer i.v.-Infektion mit P. aeruginosa, S. aureus, K. pneumoniae [105] oder einer abdominellen Mischinfektion [145] nachgewiesen. Bei Gabe von LPS in Mäusen, die durch eine Retrovirus-induzierte murine Immundefizienz dafür sensibilisiert waren, war der zeitliche Spielraum für einen günstigen Effekt von G-CSF noch enger: die Gabe 12 oder 6 Stunden vor Injektion des LPS erhöhte das Überleben signifikant, aber die Gabe simultan mit oder 6 Stunden nach LPS hatte keinen Einfluß auf das Überleben [156]. Erklärbar werden diese für einen günstigen Effekt von G-CSF engen zeitlichen Grenzen durch die Tatsache, daß das Netzwerk von Zytokinen und Wachstumsfaktoren eng miteinander verflochten ist [73,157]. Schon geringe Änderungen von Dosierung oder Zeitpunkt können aber ein Zytokin entweder pro- oder anti-inflammatorisch wirken lassen [158]. Zusätzlich wird die Situation durch die Wichtigkeit der lokalen, parakrinen Produktion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren verkompliziert [159,160,39,161,162,163]. Zusammen mit den Unterschieden in den einzelnen Tiermodellen [164] wird somit erklärbar, daß G-CSF bei unterschiedlichen Infektionsarten auch verschiedene optimale Zeitpunkte für den Einsatz besitzt.


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5.3. Einfluß des monoklonalen Antikörpers gegen KPS auf den Verlauf der experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie und Synergismus mit G-CSF

Alleine verabreicht, hatte der gegen bakterielles KPS gerichtete mAb III/5-1 einen günstigen Einfluß auf Überleben und klinischen Verlauf (Abbildungen 7 und 8). Auch die Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz der Tiere konnten im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant gesenkt werden (Abb. 9). Dies bestätigte vorangegangene Untersuchungen, die in verschiedenen Tiermodellen einen positiven Einfluß der Antikörpertherapie auf den Verlauf experimenteller K. pneumoniae-Infektionen zeigten [53,54]. Der negative Effekt einer prophylaktischen G-CSF-Gabe auf das Überleben der Tiere wurde durch den gleichzeitigen Einsatz des mAb III/5-1 aufgehoben (Abb. 7). Dies schlug sich auch im klinischen Verlauf nieder, der mit einer signifikant geringeren Gewichtsabnahme im Vergleich zur Kontrollgruppe und zur allein mit G-CSF behandelten Gruppe einherging (Abb. 8). Korrespondierend dazu konnte die vermehrte bakterielle Dissemination, die unter prophylaktischer G-CSF-Gabe beobachtet wurde, durch den simultanen Einsatz des mAb verhindert werden (Abb. 9). Dieser hier beobachtete Synergismus zwischen anti-infektiöser Therapie und Gabe des hämatopoetischen Wachstumsfaktors wird auch von anderen Autoren nachgewiesen. So hatte G-CSF allein keinen Einfluß auf das Überleben einer E. coli-Peritonitis bei nicht immunsupprimierten Mäusen, aber verbesserte dieses in synergistischer Weise zusammen mit einem gegen KPS von E. coli gerichteten mAb der Klasse IgM [148]. Bei neutropenischen Ratten mit P. aeruginosa-Sepsis verdoppelte G-CSF zusammen mit IL-11 das Überleben auf 80%, das durch IL-11 alleine lediglich auf 40% erhöht wurde [165]. Auch die durch G-CSF allein nicht signifikant beeinflußten Keimzahlen und LPS-Mengen im Blut wurden synergistisch durch den simultanen Einsatz beider Zytokine signifikant gesenkt [165]. In verschiedenen Tiermodellen schließlich, bei dem die Tiere mit sowohl gram-positiven als auch gram–negativen Keimen infiziert wurden, wurde ein synergistischer Effekt von G-CSF und Antibiotika nachgewiesen [105,143,107,145].


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5.4. Die mögliche Beteiligung von TNF—α an den Leberzellnekrosen bei prophylaktischer Behandlung einer experimentellen K. pneumoniae-Pneumonie durch G-CSF

Bei den histologischen Befunden der Tiere, die G-CSF prophylaktisch vor Induktion einer K. pneumoniae-Pneumonie erhielten, fielen zunächst in der Leber großflächige Nekrosen auf, die von Infiltraten durch neutrophile Granulozyten begleitet waren (Abb. 6). Es ist bekannt, daß bei transgenen, G-CSF überexprimierenden Mäusen vermutlich durch Infiltration neutrophiler Granulozyten bedingte Leberzellnekrosen auftreten [166]. Auch bei Tumoren, die G-CSF paraneoplastisch produzieren, konnten ähnliche histologische Veränderungen beobachtet werden [121]. Daher könnten die jetzt beobachteten Veränderungen direkt durch G-CSF verursacht worden sein. Allerdings wurde gezeigt, daß die Gabe von G-CSF nicht zu einer erhöhten Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 in der Leber führt und auch nicht zu einer vermehrten lokalen Produktion chemotaktischer Faktoren wie CINC [100]. Die Vorbehandlung mit G-CSF vor einer LPS-Stimulation führte sogar zu einer Reduktion von CINC und ICAM-1 in der Leber [100]. Somit ist ein direkter Effekt von G-CSF, der diese Nekrosen erklären könnte, hier eher unwahrscheinlich.

In der oben erwähnten Arbeit von Suzuki et al. wurde auch gezeigt, daß mit den histologischen Veränderungen eine erhöhte Produktion proinflammatorischer Zytokine (IL-1, IL-6) einherging [121]. Da aber die Produktion von IL-1 und IL-6 sich gleichsinnig mit der von TNF—α verändern [157,158], darf angenommen werden, daß auch TNF—α in erhöhter Konzentration vorlag, obgleich dies nicht direkt gemessen wurde [121]. Die Gabe von G-CSF alleine oder vor LPS-Stimulation erhöhte die Konzentration von TNF—α und von löslichen TNF—α-Rezeptoren im Serum [167,168,169]. Die ortsständigen Makrophagen in der Leber (Kupffer-Zellen) aber produzieren sowohl einen Rezeptor für TNF—α als auch TNF—α selbst auf eine Stimulation mit LPS hin [123,122]. Auf der anderen Seite jedoch schwächt G-CSF die Produktion von TNF—α und IL-6 durch Kupffer-Zellen nach LPS-Stimulation ab [170]. Daher sollte untersucht werden, ob die bei prophylaktischer G-CSF-Gabe beobachteten histologischen Veränderungen auch bei einer Blockade von TNF—α auftreten.


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5.4.1. Effekte von Pentoxifyllin auf TNF—α

TNF—α besitzt eine wichtige Funktion bei der koordinierten Abwehr der K. pneumoniae-Infektion und ist damit nicht als rein pro-inflammatorisches Zytokin anzusehen [39,38,43]. Daher wurde Pentoxifyllin anstelle blockierender monoklonaler Antikörper eingesetzt. Von Pentoxifyllin ist bekannt, daß es die Transskription des TNF—α-Genortes in TNF—α-mRNA in Makrophagen hemmt und die Akkumulation von TNF—α-mRNA inhibiert [127,126], aber nicht die Translation von TNF—α-mRNA in das Zytokin [127]. Dies erklärt die Tatsache, daß Pentoxifyllin die Antwort auf einen LPS-Reiz im Menschen nicht komplett verhindert [129] und auch selektiv nur auf TNF—α wirkt [129]. Zusätzlich bietet Pentoxifyllin den Vorteil, daß es keinen Effekt auf Wirkungen von G-CSF oder GM-CSF in vitro aufweist [128,171]. Über eine Reduktion der durch TNF—α erhöhten Adhärenz von neutrophilen Granulozyten verhindert Pentoxifyllin den Leukozytenabfall nach LPS-Stimulation und erhöht den Pool zirkulierender Granulozyten [129].

5.4.2. Einfluß von Pentoxifyllin auf die experimentelle K. pneumoniae-Pneumonie und den Effekt einer prophylaktischen G-CSF-Gabe

Wurden die Tiere mit Pentoxifyllin behandelt, so konnte eine Verzögerung der Letalität der K. pneumoniae-Pneumonie beobachtet werden (Abb. 11). Jedoch war Pentoxifyllin nicht in der Lage, die durch prophylaktische G-CSF-Gabe hervorgerufene erhöhte Letalität zu verhindern (Abb. 11). Auch der klinische Verlauf bis zum Ende der Experimente wurde weder durch Pentoxifyllin alleine noch durch die gleichzeitige Gabe von G-CSF und Pentoxifyllin beeinflußt (Abb. 12). Bei der Untersuchung der Keimzahlen fiel auf, daß die nur mit Pentoxifyllin behandelten Tiere eine etwa 100-fach höhere Anzahl von Bakterien in allen untersuchten Organen aufwiesen (Abb. 13). Dies änderte sich nicht signifikant, wenn die Tiere G-CSF prophylaktisch erhielten (Abb. 13). Insbesondere die histologischen Befunde in den Lebern der Tiere, die nur G-CSF (2 x 50 μg/kg/die) prophylaktisch erhielten und denen, die zusätzlich mit Pentoxifyllin behandelt wurden, unterschieden sich nicht wesentlich (Abb. 14). Daraus kann geschlossen werden, daß eine eventuelle überschießende TNF—α-Produktion vermutlich nicht für die beobachteten hepatischen Nekrosen verantwortlich ist. Vielmehr ist zu vermuten, [Seite 53↓]daß andere Mechanismen für die Veränderungen in Frage kommen. Zum einen wurde durch Pentoxifyllin die TNF—α-Produktion effektiv gehemmt, zum anderen ist bekannt, daß eine Behandlung mit G-CSF bei experimentellen Infektionen den lokalen und systemischen TNF—α-Gehalt signifikant senkt [145,141,155,154,148,103,142,146]. Der Befund einer deutlich erhöhten Keimzahl nach Blockierung von TNF—α und damit einer Verschlechterung der antibakteriellen Abwehr steht in Einklang mit anderen Berichten, die die Bedeutung von TNF—α für eine Abwehr bakterieller Infektionen zeigen [39,38,172,125,43]. Da Histologie, Überleben und Keimzahl in den Organen gut korrelieren [155], auf der anderen Seite aber die Messung von Zytokinen im Serum methodisch schwierig ist [173] und die Befunde in ihrer Wertigkeit nicht unumstritten [174,175,176] sind, wurde in der vorliegenden Arbeit auf die Bestimmung von Zytokinen verzichtet.

5.5. Ist eine pulmonale Schädigung durch G-CSF für die erhöhte Letalität verantwortlich?

Es wurde vermutet, daß G-CSF durch den erhöhten Influx aktivierter neutrophiler Granulozyten in die Lunge schädigend während einer Infektion sein könnte. Hierholzer et al. konnten zeigen, daß eine direkte intratracheale Instillation von G-CSF zu einem Einstrom neutrophiler Granulozyten in die Lunge und zu einem alveolären capillary leakage führt [177], vermutlich auch dadurch mitbedingt, daß G-CSF auf neutrophile Granulozyten und Monozyten chemotaktisch wirkt [178]. Die gleiche Arbeitsgruppe beobachtete in ähnlichen Experimenten bei Ratten Lungenödem, Hypoxie, Alkalose und einer Zunahme des Zellgehaltes in der bronchoalveolären Lavage nach intratrachealer G-CSF-Gabe [179]. Ratten, die einem hämorrhagischen Schock unterworfen wurden, wiesen einen bis zu siebenfach erhöhten Gehalt an G-CSF-mRNA in der Lunge auf, wobei bronchoepitheliale Zellen der Hauptproduktionsort waren [180]. Dies war mit einer akuten Lungenschädigung, einer pulmonalen Infiltration durch neutrophile Granulozyten, Lungenödem und Hypoxie assoziiert [180]. G-CSF alleine führte zu Lungenschaden und einem Anstieg der pulmonalen neutrophilen Granulozyten und erhöhte signifikant die Letalität eines chemisch-toxisch induzierten Lungenschadens durch HCl [181]. Die Zunahme eines pulmonalen Schadens bei E. coli-Pneumonie durch Gabe von G-CSF wurde ebenfalls beschrieben [151]. TNF—α und LPS stimu[Seite 54↓]lieren die Produktion von G-CSF durch humane Endothelzellen [73,76], was auch bei humanen Synovial- und Lungen-Fibroblasten nachgewiesen wurde [182,75], in letzterem Fall auch durch IL-1 [75]. Somit könnte eine bei einer gram-negativen Infektion auftretende LPS-Stimulation und die erhöhte Produktion von TNF—α und IL-1 [35,151] die lokale Produktion von G-CSF verstärken und über den vermehrten pulmonalen Einstrom neutrophiler Granulozyten, die durch parakrin gebildetes G-CSF aktiviert werden, zu vermehrtem Gewebeschaden in der Lunge führen. Auch beim Menschen sind negative pulmonale Effekte von G-CSF beschrieben worden. So trat bei zwanzig Patienten, die nach einer Chemotherapie mit potentiell lungentoxischen Zytostatika G-CSF erhielten, eine interstitielle Pneumonie ohne Erregernachweis auf [183]. Allerdings wurde nicht die Gesamtzahl der mit G-CSF behandelten Patienten angegeben, so daß die Inzidenz dieser bei 3 von 20 Patienten tödlich verlaufenen Komplikation nicht errechnet werden kann [183]. Die Gabe von G-CSF bei Neutropenie nach Chemotherapie war in einer weiteren retrospektiven Studie signifikant mit einer aufgrund pulmonaler Infektionen erhöhten Inzidenz des ARDS assoziiert [184].

Die Histologien der Lungen der mit G-CSF vorbehandelten Tiere (Abb. 6) sprechen hier gegen die Annahme einer durch G-CSF aggravierten Lungenschädigung. Im Vergleich zu den pulmonalen Befunden bei Kontrolltieren ist sogar ein geringeres Ausmaß der inflammatorischen Veränderungen zu sehen: Abszesse sind nicht vorhanden (Abb. 6). Die Literatur stützt die Annahme, daß G-CSF nur in bestimmten Situationen (direkte pulmonale Applikation) zur vermehrten Lungenschädigung führt. So konnte keine Zunahme der durch LPS verursachten pulmonalen Veränderungen durch systemische G-CSF-Gabe bei Schafen beobachtet werden [185,186]. Bei gesunden Probanden verhinderte subkutan appliziertes G-CSF die durch LPS verursachte Akkumulation von neutrophilen Granulozyten in der Lunge [169]. Bei transgenen, G-CSF überexprimierenden Mäusen konnten über einen Zeitraum von einem Jahr nur sehr selten pulmonale Läsionen beobachtet werden [166]. Die prophylaktische Gabe von G-CSF vor experimenteller E. coli-Pneumonie bei Hunden verschlechterte die pulmonale Funktion nicht [141]. In einem Modell für intraabdominelle Infektion und Sepsis bei hämorrhagischem Schock konnten Davis et al. keinen Anhalt für einen durch neutrophile Granulozyten verursachten Lungenschaden nach G-CSF-Therapie finden [187]. Eine mögli[Seite 55↓]che Erklärung dieser widersprüchlichen Befunde könnte darin liegen, daß in allen Studien, die keine Erhöhung der pulmonalen Läsionen durch G-CSF nachweisen konnten, der Wachstumsfaktor systemisch gegeben wurde, wohingegen die oben angeführten Arbeiten die lokale intrapulmonale Applikation von G-CSF untersuchten [177,179,181]. In vitro jedoch inhibiert G-CSF die durch IFN—γ und TNF—α hervorgerufene Überproduktion von NO und die Expression von iNOS [188]. Eine Überexpression von iNOS und Überproduktion von NO hingegen ist nicht nur günstig [47], sondern kann unter bestimmten Umständen bei Infektionen schädlich sein [189]. Daher ist es möglich, daß systemisch gegebenes G-CSF über die Inhibierung einer erhöhten NO-Produktion bei Infektionen einen günstigen Effekt hat, während lokal verabreichtes und somit in wesentlich höherer Konzentration pulmonal vorhandenes G-CSF durch überschießende Aktivierung von neutrophilen Granulozyten zur pulmonalen Schädigung führt. Bei den hier vorliegenden Experimenten ist vermutlich die erste Annahme der Fall, da histologisch geringer ausgeprägte entzündliche Infiltrate nachgewiesen werden konnten.

5.6. Gibt es eine andere Erklärung für die Beobachtungen?

Mit den bisher untersuchten Hypothesen ist es nicht möglich, die komplexen Befunde der G-CSF-Therapie bei experimenteller K. pneumoniae-Pneumonie einheitlich zu erklären. Das Konzept einer direkten Wirkung von G-CSF auf K. pneumoniae mit konsekutiver Steigerung der bakteriellen Virulenz hingegen wäre dazu in der Lage. Würde G-CSF die Virulenz von K. pneumoniae steigern, so wäre die erhöhte Letalität bei prophylaktischer Gabe von G-CSF plausibel, da zum Zeitpunkt der Infektion hohe Mengen an G-CSF bereits vorhanden sind. Auch die Tatsache, daß der therapeutische Einsatz von G-CSF nicht zu einer Erhöhung der Letalität führte, ließe sich damit in Einklang bringen. Eine gesteigerte Virulenz der Bakterien wäre auch mit der bei alleiniger G-CSF-Gabe beobachteten vermehrten bakteriellen Disseminierung in zunächst nicht infizierte Organe kompatibel. Wäre die gesteigerte Virulenz durch eine gesteigerte Produktion von KPS bedingt, so würde dies erklären, warum der mAb III/5-1 in der Lage war, nicht nur die nachteiligen Effekte einer prophylaktischen G-CSF-Gabe aufzuheben, sondern auch synergistisch mit G-CSF die besten Ergebnisse in der Behandlung der experimentellen Infektion zu zeigen, da dann die durch G-CSF gesteigerte Virulenz [Seite 56↓]inhibiert wäre, und die aus der Literatur bekannten günstigen Wirkungen des Wachstumsfaktors überwiegen könnten.

5.6.1. Direkte Effekte von G-CSF auf K. pneumoniae

Die Beeinflussung von Bakterien durch Proteine eukaryoter Zellen und Wachstumsfaktoren wurde bereits beschrieben. So konnte gezeigt werden, daß die spezifische Bindung von IL-1 an E. coli zu einer Steigerung des bakteriellen Wachstums führt [130]. Auch IL-2 und GM-CSF haben wachstumsfördernde Eigenschaften bei E. coli [190]. IL-6 bindet spezifisch an M. avium und fördert dessen Wachstum [191,192]. Auch Insulin zeigt spezifische Wirkungen auf den Stoffwechsel von E. coli und erhöht dessen Wachstumsrate [193]. Daher wurde hier zuerst untersucht, ob G-CSF einen Einfluß auf das Wachstum von K. pneumoniae hat. Dies konnte nicht nachgewiesen werden (Abb. 15). Bei zwei anderen Pathogenen, C. albicans und P. aeruginosa, wurde ebenfalls kein direkter wachstumsfördernder Effekt von G-CSF gefunden, allerdings wurde nur dieser Einzelaspekt untersucht [155,104]. Der Einfluß von G-CSF auf die Produktion des wichtigsten Virulenzfaktors von K. pneumoniae, dem KPS, war jedoch signifikant. Eine geringe Menge an G-CSF (10 ng/ml), wie sie nach subkutaner Gabe von hier verwendeten Dosierungen über lange Zeit erreicht wird [194,131,132], erhöhte signifikant die Produktion von zellgebundenem KPS (Abb. 16). Dies war jedoch nur beim virulenten Stamm K. pneumoniae B5055 der Fall, nicht aber beim avirulenten Stamm K. pneumoniae F201, der nicht zu einer klinisch bedeutenden Produktion von KPS fähig ist (Abb. 16). Auch diese Befunde werden durch andere Arbeiten bestätigt, in denen die Wirkung von Zytokinen nur bei virulenten, nicht aber bei avirulenten Keimen gesehen wird [190,130,192]. Die funktionelle Bedeutung der gesteigerten Produktion von zellgebundenem KPS ließ sich in zwei Assays nachweisen, die zeigten, daß der erhöhte Gehalt an zellgebundenem KPS die Phagozytose der Bakterien durch neutrophile Granulozyten inhibiert (vgl. 4.6.) und zu einer signifikant geringeren Abtötung der Keime führt (Abb. 17).

5.6.2. G-CSF bindet spezifisch an K. pneumoniae


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Da G-CSF somit die Virulenz von K. pneumoniae steigert, wurde untersucht, ob dieser Wachstumsfaktor an das Bakterium bindet. Dies erfolgte mittels mit 125J markiertem G-CSF. Die Bindung von 125J-G-CSF an K. pneumoniae war spezifisch, da sie zum einen eine typische Sättigungskurve aufwies (Abb. 18), zum zweiten durch unmarkiertes, im Überschuß vorhandenes G-CSF dosisabhängig aus der Bindung verdrängt wurde (Abb. 19) und zum dritten nicht von einem anderen Zytokin, IL-1, beeinflußt wurde (Abb. 20). Damit im Einklang steht der fehlende Effekt von IL-1 auf die Produktion von zellgebundenem KPS (Abb. 16).

Um die Bindung von G-CSF an K. pneumoniae näher zu charakterisieren, wurde mittels Immunoblotting versucht, mögliche Bindungsstellen zu finden. Im Lysat ganzer, unbehandelter Bakterien konnten nach elektrophoretischer Auftrennung, Blotting auf eine Membran und Inkubation mit G-CSF drei zur Bindung fähige Proteinmoleküle identifiziert werden, die ein Molekulargewicht von 41, 25 und 21 kDa aufwiesen (Abb. 21). Da diese Bindungsstellen nach Verdauung des Lysates mit Proteinase K nicht mehr nachweisbar waren, darf auf eine zumindest teilweise Proteinnatur dieser Moleküle geschlossen werden (Abb. 21).

Die Charakterisierung der Bindungsstellen für G-CSF an K. pneumoniae zeigt zumindest vom Molekulargewicht, daß sie von den bisher beschriebenen Rezeptoren unterschiedlich sein müssen. So weist der G-CSF-Rezeptor der Maus ein Molekulargewicht von 91 kDa auf [195], der humane G-CSF-Rezeptor auf Thrombozyten eines von 150 kDa [196] sowie der humane G-CSF-Rezeptor auf verschiedenen Zellarten der myeloischen und lymphatischen Zellreihen und auf der Plazenta eines von 150 kDa [93]. Es scheint aber zumindest zwei Arten von humanen G-CSF-Rezeptoren mit einem Molekulargewicht von 150 kDa und 120 kDa auf Plazenta- und Trophoblastenzellen [197] bzw. von 142 kDa und 92 kDa auf neutrophilen Granulozyten [198] zu geben, wobei eine unterschiedliche Glykosylierung die Differenzen im Molekulargewicht erklären könnte, da Larsen et al. den Prozentsatz an Kohlenhydraten auf etwa 35% des Molekulargewichtes schätzen [93]. Die Analyse der Dissoziationskonstanten zeigt eine weite Variation der K d, die von 240 pM bis 700 pM reicht [93,197,198,196]. Dies läßt den Schluß zu, daß zumindest zwei verschiedene [Seite 58↓]humane G-CSF-Rezeptoren existieren, die extrazellulär sowohl eine Immunglobulin-ähnliche als auch eine Fibronektin Typ III-ähnliche Domäne besitzen [199].

High-affinity-Rezeptoren auf Bakterien für Zytokine wurden ebenfalls bei Shigella flexneri und TNF—α beschrieben [200]. Für Kollagen und Fibrinogen existieren auf E. coli ebenfalls spezifische Rezeptoren [201]. Plasminogen bindet an eine ganze Reihe gram-negativer Bakterien mittels spezifischer Rezeptoren (Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, Proteus mirabilis, P. aeruginosa) und einer biphasischen Interaktion zwischen Plasminogen und dem Rezeptor auf H. influenzae und B. catarrhalis [202]. Spezifische Bindungen wurden ebenfalls für IL-6 an M. avium [192] und für TNF—α an S. typhimurium, E. coli, Streptococcus mitis, S. aureus und L. monozytogenes beschrieben [200]. Ein direkter Vergleich mit anderen Arbeiten ist aber schwierig, da die Konsequenzen einer Interaktion zwischen Zytokinen und anderen eukaryoten Proteinen und pathogenen Keimen nur in Ansätzen untersucht wurden. So zeigten Porat et al. zwar, daß sich das Wachstum von E. coli durch den Einfluß von IL-1 verzehnfacht. Jedoch wird dies relativiert, wenn man die Absolutwerte betrachtet, da nach 2 Stunden die Keimzahlen von 1 x 106/ml auf 1 x 107/ml erhöht waren [130]. Eine Auswirkung dieses Effektes in vivo wurde jedoch nicht untersucht. Zusätzlich ist anzumerken, daß andere Arbeitsgruppen mit identischen Materialien und Untersuchungsbedingungen die Ergebnisse von Porat et al. nicht reproduzieren konnten [203]. Auch die anderen Arbeiten zeigten lediglich in vitro eine Stimulation des Wachstums, ohne die in vivo-Relevanz der Beobachtungen weiter zu untersuchen [191,201,202,204,190,192]. Lediglich eine Arbeit geht zumindest in vivo auf die Auswirkungen der Bindung von TNF—α auf S. flexneri ein und weist nach, daß in Gegenwart von TNF—α gewachsene Keime in vitro eine erhöhte Invasivität für HeLa-Zellen, einer humanen Zervixkarzinom-Zelllinie, aufweisen, was für eine Virulenzsteigerung von S. flexneri durch TNF—α spricht [200].

Einige Arbeiten sprechen dafür, daß Bakterien sich einen Vorteil durch die Verwendung von Proteinen eukaryoter Zellen verschaffen. So produziert E. coli Proteine, die IL-1-ähnliche Eigenschaften aufweisen und kolonie-stimulierende Aktivität bei humanen peripheren Blutstammzellen und Knochenmarkstammzellen zeigen [205,206]. Da das Wachstum von E. coli durch IL-1 stimuliert wird [130], ist ein positiver Regelk[Seite 59↓]reis möglich. E. coli produziert aber auch ein Protein, das Homologie zu humanem CD5 aufweist und sich wie ein Immunglobulin faltet [207]. Die Autoren vermuten, daß diese Eigenschaft durch horizontalen Gentransfer erworben wurde und daß Gene, die eukaryote Zell-Zell-Interaktionen regulieren, von Bakterien rekrutiert worden sind, um die Adhärenz von Bakterien an eukaryote Zellen zu erleichtern [207].

5.6.3. Vergleich der Befunde mit anderen tierexperimentellen Untersuchungen unter dem Gesichtspunkt einer direkten Wachstumsfaktor-Bakterien-Interaktion

Die hier erhobenen Befunde der Verschlechterung einer K. pneumoniae-Pneumonie durch G-CSF stehen auf den ersten Blick in Kontrast zu anderen Arbeiten, die einen günstigen Effekt von G-CSF auf eine K. pneumoniae-Pneumonie zeigen [101]. Bei näherer Betrachtung jedoch zeigen sich große Unterschiede. Der Bakterienstamm, den Nelson et al. verwendeten, scheint eher avirulent zu sein, da eine Keimmenge von 5 x 107 KBE benötigt wurde, um einen letalen Ausgang der Pneumonie hervorzurufen [101]. Daher könnten diese Ergebnisse auch eher durch eine Intoxikation mit LPS denn durch eine Replikation und Disseminierung der Bakterien hervorgerufen sein. Im Gegensatz dazu ist der Bakterienstamm, der hier verwendet wurde, noch virulenter (basierend auf der KPS-Produktion [53]) als ein in früheren Arbeiten benutzter Stamm (K. pneumoniae Caroli), bei dem bereits 3 x 104 KBE genügten, um eine fulminante Pneumonie bei Ratten hervorzurufen [54]. Daher könnte es sein, daß die direkte Wirkung von G-CSF auf K. pneumoniae nicht ausreichte, um im Modell der anderen Arbeitsgruppe die günstigen Wirkungen von G-CSF (Aktivierung und Vermehrung der neutrophilen Granulozyten) aufzuheben [101]. Um diese Hypothese zu testen, wurde der Stamm K. pneumoniae F201 untersucht, der nicht letal ist (Seite 6). An diesen band G-CSF ebenfalls (Abb. 18). Trotz dieser Bindung von G-CSF, deren Verhalten der an den virulenten Stamm K. pneumoniae B5055 ähnlich war, war G-CSF nicht in der Lage, die minimale Produktion von KPS bei Stamm K. pneumoniae F201 zu steigern (Abb. 16). Dies steht in Einklang mit den oben aufgeführten Arbeiten, die eine Beeinflussung nur virulenter Stämme durch Bindung von Zytokinen zeigen. In der Tat wurden in allen vergleichbaren Arbeiten mit G-CSF (Untersuchung nur eines Bakteriums und Infektionsmodelles, nicht immunsupprimierte Tiere), die einen günstigen Einfluß von G-CSF [Seite 60↓]auf das Überleben zeigen, Keimdosen zwischen 5 x 106 und 1,5 x 1010 KBE verwendet, um Letalität hervorzurufen [151,141,208,144,142,107,140].


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18.01.2005