Hermes, Barbara: Pathogenetische Untersuchungen zur Ausbildung unterschiedlicher Phänotypen und zur Vermehrung humaner Mastzellen bei Wundheilung und Urtikaria

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Kapitel 4. Untersuchungsmethoden

4.1 Gewebe

Für die immunhistochemischen Untersuchungen zur Wundheilung und Narbenbildung wurde Narbengewebe von Patienten verwendet, bei denen Nachexzisionen im Rahmen einer Melanombehandlung oder zu diagnostischen Zwecken durchgeführt wurden (N = 20). Das Narbenalter lag zwischen 5 und 369 Tagen. 7 Narben wiesen ein Alter von le 35 Tagen auf und wurden als frische Narben eingeordnet gegenüber 13 alten Narben mit einer Bestandsdauer von > 35 bis 369 Tagen. Die Hautexzisate wurden in Lokalanaesthesie von Stamm oder Extremitäten entnommen. Als Kontrolle diente normale Haut, die im Rahmen kosmetischer Operationen gewonnen wurde (N = 10).

Die Bestimmung der Proteaseaktivitäten sowie die PT-PCR erfolgte an Narbengewebe sowie normaler Haut (mindestens 8 cm von der Narbe entfernt) von 7 weiteren Patienten. Hier lag das Narbenalter zwischen 23 und 56 Tagen.

Für die immunhistochemischen Studien von läsionalem und nicht-läsionalem Urtikariagewebe wurden Biopsien von 9 Patienten mit akuter Urtikaria, von 10 Patienten mit chronisch-rezidivierender Urtikaria, von 6 Patienten mit verzögerter Druckurtikaria, von 1 Patienten mit Kälteurtikaria (sequentielle Biopsien 5, 15 und 30 Minuten nach Quaddelprovokation durch einen Eiswürfel) sowie von 7 nicht-atopischen Personen mit positiver Reaktion auf Hausstaubmilbenantigen im Pricktest entnommen (15 Minuten nach Allergenapplikation). Antihistaminika waren mindestens während der 3 vorausgegangenen Tage, systemische Steroide mindestens während der 3 vorausgegangenen Wochen nicht verwendet worden. Als Kontrolle diente wiederum normale, bei kosmetischen Operationen gewonnene Haut (N = 10).

Die Biopsien wurden unmittelbar nach Entnahme in flüssigen Stickstoff gegeben und anschließend tiefgefroren bei - 80o C gelagert. Alle Patienten hatten den Biopsien nach entsprechender Aufklärung zugestimmt.


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4.2 Immunhistochemie

Die immunhistochemischen Färbungen erfolgten an Gefrierschnitten mittels der in der Arbeitsgruppe etablierten APAAP-Technik (Schadendorf et al., 1991). In Tabelle 1 sind die verwendeten Antikörper aufgelistet.

Tabelle 1: Monoklonale Antikörper für die APAAP-Färbungen

monoklonaler AK

Subklasse

Spezifität

Quelle

anti-SCF

IgG1

SCF

Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA

YB5.B8

IgG1

c-Kit

(CD 117)

L.K.Ashman, Adelaide, Australien

anti-NGF

IgG1

NGF

Santa Cruz Biotechnology

anti-NGF-R-TrkA

IgG1

NGF-R TrkA

Santa Cruz Biotechnology

anti-NGF-R, human

IgG1

humaner NGF-R p75

Boehringer, Mannheim

anti-GM-CSF

IgG1

GM-CSF

Santa Cruz Biotechnology

Moonoclonal mouse anti-human GM-CSF-R (CDw116)

IgG2a

alpha-Kette des humanen GM-CSF-R

Genzyme Diagnostics, Cambridge, USA

anti-TGF-beta 1

IgG1

TGF-beta 1

Santa Cruz Biotechnology

anti-TGF-beta-R I

IgG1

TGF-beta-R Typ I

Santa Cruz Biotechnology

anti-TGF-beta-R II

IgG1

TGF-beta-R Typ II

Santa Cruz Biotechnology

TA 99

 

Melanosomen

L.J.Olds, New York, USA

Anti-human desmin

IgG1

Desmin

DAKO, Dänemark

Anti-human IL-3 monoclonal antibody

IgG1

IL-3

Genzyme

Anti-human TNF-alpha rabbit polyclonal antibody

IgG and IgM

TNF-alpha

Genzyme

Anti-human IL-8 monoclonal antibody 52E8

IgG1

IL-8

M. Sticherling, Kiel

AA1

IgG1

Tryptase

A. Walls, Southampton, Großbritannien

UCHL1

IgG2a

T-Zellen

DAKO

IgG2a (mouse) isotypic control

IgG2a

 

Immunotech, Marseille, Frankreich


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4.3 Enzymhistochemische sequentielle Doppelfärbung

Die Tryptase- und Chymasefärbungen erfolgten an Gefrierschnitten mittels enzymspezifischer chromogener Substrate (Algermissen et al., 1994; Harvima et al., 1990). Als Substrat für Tryptase wurde Z-Gly-Pro-Arg-MNA (40mM) (Bachem, Bubendorf, Schweiz) verwendet unter Zusatz von alpha1-Antitrypsin (Sigma, St. Louis, USA) zur Inhibition von Chymase und als Substrat für Chymase Suc-Val-Pro-Phe-MNA (Bachem) mit Zugabe von Aprotinin (Sigma) zur Blockierung der Chymase-ähnlichen Aktivität von Cathepsin G. MCTC wurden orangebraun, MCT dunkelblau angefärbt. Dieselben Schnitte wurden sequentiell angefärbt und hinsichtlich der Zahl von MCT und MCTC quantitativ ausgewertet (Algermissen et al., 1994).

4.4 Immunfluoreszenzdoppelfärbung

Zur Identifizierung von Mastzellrezeptoren wurden Doppelfärbungen mit Fluoreszein (DTFA)-konjugiertem Eiweißavidin (Jackson Immuno Research Laboratories, West Baltimore, USA) und mit den jeweiligen primären Antikörpern (s. Tab. 2) für den ersten Schritt der APAAP-Reaktion durchgeführt (Haas et al., 1995a). Anschließend wurde ein Fluorochrom-konjugierter Antikörper (Cy3TM-conjugated AffiniPureF(ab)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Jackson Immuno Research Laboratories, West Baltimore, USA) als Sekundärantikörper eingesetzt.

Tabelle 2: Monoklonale Antikörper für die Immunfluoreszenzdoppelfärbung

Monoklonale Antikörper

Titer

YB5.B8

1 : 5000

Anti-human GM-CSF-Receptor (CD w 116)

1 : 300

Anti-Nerve Growth-Factor-Receptor, human (anti-p75)

1 : 500

Cy3TM-conjugated AffiniPureF(ab)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG

1 : 700


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4.5 Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Mastzellproteasen

Die Enzymaktivität der Mastzellproteasen wurde in homogenisierten Hautbiopsien gemessen. Tryptase wurde durch Spaltung des Peptids Z-Gly-Pro-Arg-pNA (4mM) unter Zusatz von Heparin (5 mg pro ml) und alpha-1-Antitrypsin (2 mg pro ml) zur Hemmung anderer Enzyme mit trypsinähnlicher Aktivität bestimmt, Chymase durch Spaltung von Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (2mM) in Gegenwart von Aprotinin (0,5 mg pro ml) als Inhibitor unspezifischer chymotrypsinähnlicher Aktivität durch Cathepsin G (alle verwendeten Substrate und Substanzen von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) (Harvima et al., 1988; Schwartz et al., 1987). Die enzymatische Aktivität wurde als mU pro mg Protein ausgedrückt nach Anpassung der Werte an den spektrometrisch (280 - 260 nm) ermittelten Proteingehalt der Homogenate.

4.6 Bestimmung der mitogenen Wirkung von Mastzellproteasen auf Fibroblasten und Keratinozyten

Murine 3T3 Swiss Albino-Fibroblasten (Passagen 98-113; ICN, Meckenheim, Schweiz), bovine Thymozyten (Becton Dickinson, Basel, Schweiz) und HaCaT Keratinozyten (interne Passagen 15-32; dankenswerterweise zur Verfügung gestellt von N. Fusenig, Heidelberg, Deutschland) wurden in DMEM (GIBCO, Basel, Schweiz) mit 5 % FCS und Antibiotika supplementiert und bei 37°C, 5% CO2 und 95% relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert mit wöchentlichen Passagen.

Nach Trypsinisierung mit EDTA wurden die Zellen geerntet und bei einer Dichte von 10 000 Keratinozyten oder 5000 Fibroblasten / ml supplementiertes Kulturmedium über 3 Tage in Lochplatten inkubiert. Anschließend wurden die Zellen über 3 Tage in serumfreiem Medium bei einer Konfluenz von 40 - 60 % kultiviert, um sie in ein Ruhestadium zu versetzen. 23 Stunden nach Zugabe der Testsubstanzen [humane Lungentryptase, EGF, TGF-alpha (alle von ICN), alpha-Thrombin, Trypsin und Chymotrypsin (alle von Sigma, Deisenhofen, Deutschland), Chymase aus Haut von Moro-Mäusen (Algermissen, 1994) ] wurden die Zellen mit 300 µl Trypsin-EDTA (Keratinozyten) oder 250 µl EDTA mit 1% Glukose und 50 µl Trypsin-EDTA (Fibroblasten) in Suspension gebracht. Als Inkubationsperiode wurden 23 Stunden gewählt, da nach diesem Intervall eine optimale Verteilung der rekrutierten Zellen in der S+G2M-Phase vorlag.


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Für die anschließende FACS-Analyse wurden 50 µl einer 1% RNAse-Lösung, 1% Trypsininhibitorlösung, 150 µl Propidiumjodid und 20 µl 0.1% Triton x (alle von Sigma) in jedes Kulturloch gegeben. Den Keratinozyten wurden 40 µl bovine Thymocyten (1000 Zellen / ml) als interne Kontrolle beigefügt. Die Zellen wurden durch Nylonfilter mit einer Porengröße von 45 µm passiert, hinsichtlich der Anfärbung ihrer Kerne mit Propidiumjodid überprüft und der DNA-Gehalt mit einem FACS-STARPLUS-Gerät (Becton Dickinson) analysiert. Die mitogene Wirkung wurde aus dem Verhältnis des Prozentsatzes von Zellen in der G0/G1-Phase zu dem von Zellen in der S+G2M-Phase mit einem Computerprogramm berechnet.

4.7 Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion

Die Biopsien wurden in flüssigem Stickstoff homogenisiert und lysiert. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNeasy-total-RNA-kit (Quiagen, Hilden) präpariert. Mit einem cDNA-Synthese-Kit (InVitrogen, Stade) wurde über reverse Transkription von 5 µg Gesamt-RNA cDNA synthetisiert. Die Amplifikation von cDNA erfolgte mit den folgenden Primern [Wo nicht anders angegeben, mögen Détails zur Herkunft der Primer den folgenden Arbeiten entnommen werden: (Hermes et al., 2000; Welker et al., 1999; Welker et al., 2000a) ]:

GAPDH: 5'GAT GAC ATC AAG AAG GTG GTG und 5'GCT GTA GCC AAA TTC GTT GTC (197 bp),

Tryptase: 5'GGA GCT GGA GGA GCC CGT GA und 5'ACC TGG GTA AGG AAG CAG TGG TG (531 bp),

Chymase: 5´AAG GAG AAA GCC AGC CTG ACC und 5´TCC GAC CGT CCA TAG GAT ACG (321 bp),

SCF: 5‘GGG CTG GAT CGC AGC GC und 5 ’CTC CAC AAG GTC ATC CAC (Longley et al., 1993),

c-Kit: 5'CGT TGA CTA TCA GTT CAG CGA G und 5'CTA GGA ATG TGT AAG TGC CTC C (369 bp),

NGF: 5‘ TCA TCA TCC CAT CCC ATC TTC CAC und 5‘ CAC AGC CTT CCT GCT GAG CAC ACA (348 bp) (Tam et al., 1997),

NGFR-p75: 5'TGA GTG CTG CAA AGC CTG CAA und 5'TCT CAT CCT GGT AGT AGC CGT (230 bp),

NGFR-TrkA: 5'GGC TCC TCG GGA CTG CGA TG und 5'CAG GAG AGA GAC TCC AGA GCG (260 bp),


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GM-CSF: 5‘ACA CTG CTG AGA TGA ATG AAA CAG TAG und 5‘ TGG ACT GGC TCC CAG CAG TCA AAG GGG ATG (285 bp; Stratagene, Heidelberg);

GM-CSFR: CTT CTC TCT GAC CAG CA und 5‘ ACA TGG GTT CCT GAG TC (530 bp) (Guillaume et al., 1993),

TGFß1: 5‘ CGG GGC GAC GAC CTG GGC ACC ATG CAT GAC und 5‘ CTG CTC CAC CTT CCC CTT GCG ACC CAC (187 bp) (Stratagene),

TGFßRI: 5‘ TAG CTG AAA TTG ACC TAA TTC CTC G und 5‘ TGC GGT TAT GGC AGA TAT AGA CC (310 bp) (Suzuki et al., 1994),

TGFßRII: 5‘ AGA CTG ACT TGC GAC AAC CAG und 5‘ GAC TGC TGG TGG TGT ATT CTT CCG (250 bp) (Lawler et al., 1994),

Mittels taq-Polymerase (GIBCO) wurde die Amplifikation mit einem automatischen Temperaturzyklusgerät (Perkin Elmer, Weiterstadt) über 24 - 40 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus folgenden Teilschritten: Denaturation bei 94°C, Abkühlung und Hybridisierung bei 56°C sowie Extension bei 72 °C, jeweils über eine Minute. Für die semiquantitative PCR wurde die cDNA aus den verschiedenen Geweben durch serielle Verdünnungsschritte auf die gleiche Menge justiert. Das konstitutiv exprimierte GAPDH-Gen diente als Kontrolle (Grabbe et al., 1996; Hermes et al., 2000). Die Analyse der PCR-Produkte erfolgte mittels Agarosegel-Elektrophorese nach enzymatischer Verdauung mittels Standardtechniken. Die Banden wurden mit Ethidiumbromid angefärbt, und die Färbeintensität der Banden wurde densitometrisch mit Hilfe eines Videoscanners und der Software ScanPack 3.0 (Biometra, Göttingen) bestimmt.

4.8 FACS-Analyse von Mastzellen

Mastzellen wurden aus Hautexzisaten (normale Haut) mittels enzymatischem Abbau in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten isoliert und anschließend mit einem magnetischen Zellsortierer unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers YB5.B8 (L.K.Ashman, Adelaide, Australien) weiter aufgereinigt. Durch die Toluidinblaufärbung konnte ein Reinheitsgrad von 95 % bestätigt werden. Für die FACS-Analyse wurden die Zellen mit Maus-IgG inhibiert und bei 4°C über 30 Minuten mit dem Antikörper in 100 µl PBS (mit/ohne Ca2+, Mg2+, 2% FCS) inkubiert, anschließend mit einem Fluoreszein-konjugierten Sekundärantikörper markiert und mittels Durchflußzytometrie analysiert (Lippert et al., 1998).


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4.9 Mikroskopische Auswertung

Die Schnittpräparate der immunhistochemischen Studien von Narbengewebe versus normale Haut wurden bei 400facher Vergrößerung ausgewertet unter Verwendung eines Netzmikrometers (0,0625 mm2 pro Gitterfeld). Zellen in der Epidermis wurden jeweils über 0,0625 mm ausgezählt. Hinsichtlich der Dermis wurden obere Dermis (bis 0,0625 mm unterhalb der Basalmembran = 1 Gitterfeld), mittlere Dermis (basal angrenzende 0,1250 mm = 2 Gitterfelder) und untere Dermis (basal angrenzende Dermis bis Subcutis) unterschieden. In allen Präparaten war der Tiefendurchmesser der Dermis ausreichend für diese Unterteilung. Die angegebenen Zellzahlen beziehen sich jeweils auf 0,0625 mm2.

Bei der enzymhistochemischen sequentiellen Doppelfärbung wurden zunächst die mit der Chymasefärbung identifizierten MCTC jeweils ausgezählt und fotografiert, danach in denselben Schnitten und Gesichtsfeldern die durch die Tryptasefärbung dargestellten MCT.

Die Avidin-APAAP-doppelgefärbten Schnitte wurden bei 1000facher Vergrößerung in Ölimmersion mit einem Fluoreszenzmikroskop (Axioskop HB050, Zeiss, Oberkochem, Deutschland) ausgewertet und fotografiert (Zeiss-Mikroskop-Kamera MC80). Das Filterset 09 (Exzitation 450-490 nm) diente zur Darstellung der avidingefärbten Mastzellen, die grün erschienen, das Filterset 15 (Exzitation 546/12) zur Identifikation der rot angefärbten Zytokinrezeptoren in jeweils denselben Gesichtsfeldern.

Auch die Urtikariabiopsien im Vergleich zu normaler Haut wurden für die immunhistochemischen Untersuchungen bei 400facher Vergrößerung ausgewertet für folgende Kompartimente der Haut: Epidermis, dermale perivaskuläre Zellen, dermale Endothelzellen, letztere beide jeweils unterteilt nach oberer und unterer Dermis. Die angegebenen Zahlen bedeuten jeweils angefärbte Zellen pro Mikroskopausschnitt bei 400facher Vergrößerung (HPF).

Für die Identifizierung von Zytokinrezeptoren auf Mastzellen wurden Serienschnitte mit Tryptase und dem jeweiligen Zytokin angefärbt. Jeweils 50 - 100 Mastzellen wurden pro Biopsie hinsichtlich einer Zytokinexpression ausgewertet.


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4.10 Statistische Auswertung

Hinsichtlich der immunhistochemischen Untersuchungsergebnisse erfolgt die Angabe der Zellzahlen jeweils als Mittelwert mit Standardabweichung (MW ± SD). Statistische Signifikanz der immunhistochemischen Untersuchungen von Narbengewebe im Vergleich zu normaler Haut wurde mit dem Mann-Whitney U-Test ermittelt. Für die mRNA-Bestimmung wurde statistische Signifikanz mit dem ungepaarten zweiseitigen Student t-Test untersucht. Der Wilcoxon-Rank-Test diente zur Korrelation von immunhistochemischen Ergebnissen und Narbenalter. Die statistische Auswertung erfolgte zum Teil mit der Unterstützung des Instituts für Medizinische Statistik und Informationsverarbeitung der Freien Universität.

Für die immunhistochemischen Untersuchungen der Urtikariagewebe im Vergleich zu normaler Haut wurde statistische Signifikanz mit dem Student t-Test bei ungepaarten Proben ermittelt, mit dem gepaarten Student t-Test beim Vergleich zwischen läsionaler und nichtläsionaler Haut jeweils derselben Urtikariapatienten. Der Wilcoxon-Rank-Test diente der Ermittlung einer möglichen Korrelation zwischen Mastzellzahlen und Zytokinreaktivität in den Biopsien.


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Mon Sep 2 13:07:45 2002