Hermes, Barbara: Pathogenetische Untersuchungen zur Ausbildung unterschiedlicher Phänotypen und zur Vermehrung humaner Mastzellen bei Wundheilung und Urtikaria

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Kapitel 5. Ergebnisse und Diskussion

5.1 Mastzellen in Narbengewebe

5.1.1 MCTC und MCT

In der normalen Haut fanden sich MCTC und MCT im gesamten Korium mit bevorzugter Gruppierung um Gefäße und um Hautanhangsgebilde (Abb. 1, S. 45). MCT zeigten eine kontinuierliche Abnahme vom oberen zum unteren Korium (Tab.3).

In Narbengewebe waren zum Teil (N = 6) keine, in den übrigen Narben nur vereinzelt MCTC sichtbar, die kleiner und schwächer angefärbt als MCTC in normaler Haut wirkten (Abb. 2, S. 46). Unauffällige MCTC fanden sich in an das Narbengewebe angrenzender normaler Haut, so daß ein technischer Fehler bei der Färbung ausgeschlossen werden konnte. Die Verminderung der Anzahl von MCTC in Narben gegenüber normaler Haut war in allen drei Koriumetagen hochsignifikant (p < 0,0001, siehe Tab. 3). Das Narbenalter (< oder > 35 Tage) hatte keinen Einfluß auf die Anzahl von MCTC (Abb. 3, S. 47).

Tabelle 3: Chymase- und tryptasehaltige Mastzellen sowie c-Kit-positive Zellen in normaler Haut und Narbengewebe. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 0,0625 mm2 ± SD dar.

 

MCTC

MCT

c-Kit-positive Zellen

Normale Haut (N = 10)

 

 

 

obere Dermis

2,77 ± 0,62

5,22 ± 1,03

5,14 ± 0,96

mittlere Dermis

3,04 ± 0,78

3,30 ± 0,98

2,55 ± 0,89

untere Dermis

2,13 ± 0,63

2,06 ± 0,86

1,45 ± 0,58

Narben (N = 20)

 

 

 

obere Dermis

0,26 ± 0,16***

5,85 ± 1,03

6,99 ± 1,08

mittlere Dermis

0,39 ± 0,22***

4,33 ± 1,21

5,74 ± 1,09*

untere Dermis

0,28 ± 0,17***

2,14 ± 0,63

2,94 ± 0,64**

*** p < 0,0001, ** p < 0,026, * p < 0,041 im Vergleich zu normaler Haut.


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Abb. 1: Darstellung der MCT (A) und MCTC (B) in normaler Haut mittels enzymhistochemischer sequentieller Doppelfärbung (jeweils x 100).


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Abb. 2: Narbengewebe mit weitgehendem Fehlen von MCTC in der enzymhistochemischen Färbung (x 200)

Auch MCT waren in Narben im Vergleich zur gesunden Haut kleiner mit jeweils aufgehelltem Zentrum. Jedoch fand sich kein Unterschied hinsichtlich der Anzahl der MCT zwischen Narben und normaler Haut (Tab. 3, S. 44). Wie in normaler Haut nahmen die MCT in Narbengewebe von der oberen zur unteren Dermis ab, unabhängig vom Narbenalter. In alten Narben fanden sich mehr MCT als in frischen Narben (Abb. 3, S. 47). Der Unterschied zwischen den Zellzahlen war im unteren Korium signifikant bei p < 0,032.

Alle Hautmastzellen enthalten Tryptase, und unter normalen Bedingungen enthalten ca 88 % der Hautmastzellen zusätzlich auch Chymase, wie sich durch unsere Untersuchungen mit einem Verhältnis von 89 % MCTC zu 11 % MCT bestätigen ließ (siehe 1.4.1.3 und Tab. 4, S. 47). In Narbengewebe zeigte sich bei signifikanter Abnahme von MCTC eine Umkehrung dieses Verhältnisses mit 9 % MCTC zu 91 % MCT, und zwar sowohl in frischen als auch in alten Narben (Tab. 4, S.47).


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Abb. 3: Chymase- und tryptasehaltige Mastzellen sowie c-Kit-positive Zellen in der Dermis von normaler Haut im Vergleich zu frischen und alten Narben. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW ± SD pro 0,0625 mm2 dar.

** p < 0,001, * p < 0,05 im Vergleich zu normaler Haut.

Tabelle 4: Anzahl der jeweils unterschiedlich gefärbten Mastzellen in normaler Haut (gesamte Dermis) im Vergleich zu Narbengewebe und Verhältnis von MCTC und MCT in Prozent. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW ± SD pro 0,0625 mm2 dar.

Mastzellen

normale Haut (Dermis)

Narben (Dermis)

MCTC

2,41 ± 0,67

0,28 ± 0,17

MCT

2,71 ± 0,96

3,14 ± 0,97

SCF-R-positive Zellen

2,36 ± 0,86

4,28 ± 0,93

MCTC : MCT

89% : 11%

9% : 91%


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5.1.2 c-Kit-positive Mastzellen

Physiologischerweise wird c-Kit in der Haut nur von Mastzellen und Melanozyten exprimiert. Da Melanozyten normalerweise epidermal lokalisiert sind, handelt es sich bei den dermalen c-Kit-positiven Zellen ausschließlich um Mastzellen, so daß sich c-Kit als ein idealer membranständiger Mastzellmarker erweist, der auch nach Degranulation der Zelle diese als Mastzelle identifizieren kann im Gegensatz zu den Mastzellfärbungen, die auf Bindung der Farbstoffe an Bestandteile der Granula beruhen (Toluidinblau, Avidin). Die in anderen Untersuchungen gewählte Identifizierung von Mastzellen mittels Markierung des hochaffinen IgE-Rezeptors FcepsilonRI muß als weniger spezifisch betrachtet werden, da auch weitere dermale Zellen, z.B. Monozyten, Makrophagen und dermale dendritische Zellen, diesen Rezeptor exprimieren können (Haas et al., 1992; Maurer et al., 1994).

Im Korium normaler Haut fanden sich c-Kit-positive Zellen gleichmäßig disseminiert und perivaskulär sowie perifollikulär gehäuft mit abnehmender Tendenz von der oberen zur unteren Dermis. Narbengewebe zeigte in der Dermis eine relativ gleichmäßige Verteilung c-Kit-positiver Zellen, deren Zahl sich ebenfalls nach unten hin verringerte (Abb. 4, S. 49). Im Vergleich zur normalen Haut war die Zahl c-Kit-exprimierender Zellen in allen Koriumetagen höher. Der Unterschied erreichte Signifikanz in der mittleren (p < 0,041) und in der unteren Dermis (p < 0,026; siehe Tab. 3, S. 44). In den älteren Narben fanden sich im tiefen Korium signifikant mehr SCF-R-positive Zellen als in den frischen Narben (p < 0,024). Zum Ausschluß von dermalen Melanozyten erfolgte eine Färbung mit dem Melanosomenmarker TA99, der keinerlei dermale Zelle in normaler Haut oder in Narben markierte.

Erwartungsgemäß markierte der monoklonale Antikörper YB5.B8 gegen c-Kit in der normalen Haut Zellen innerhalb der Basalzellschicht der Epidermis, die den Melanozyten entsprechen (Dippel et al., 1995). In jüngeren und alten Narben gleichermaßen fehlte eine epidermale c-Kit-Expression weitgehend mit hochsignifikantem Unterschied zur normalen Haut (p < 0,0001). Der Melanosomenmarker TA99 färbte eine ähnliche Anzahl von Zellen in der epidermalen Basalzellschicht normaler Haut wie der c-Kit-Antikörper YB5.B8. Im Gegensatz zu den c-Kit-positiven epidermalen Zellen zeigten TA99-markierte Zellen jedoch keine Abnahme in der Epidermis von Narbengewebe (Tab. 5, S. 49). Hierbei könnte eine selektive Herunterregulation der melanozytären c-Kit-Expression in Narbengewebe eine Rolle spielen.


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Abb. 4: Narbengewebe mit zahlreichen c-Kit-positiven Mastzellen (APAAP-Färbung mit dem c-Kit-Antikörper YB5.B8; x 100)

Tabelle 5: Immunreaktivität basaler Epidermiszellen mit den Antikörpern YB5.B8 gegen c-Kit und TA99 gegen Melanosomen. Zahlen entsprechen MW der markierten Zellen pro 0,0625 mm Epidermislänge ± SD.

 

YB5.B8

TA99

Normale Haut

15,45 ± 2,29

19,38 ± 9,77

Narben

2,39 ± 0,63*

20,17 ± 5,46

* p < 0,0001 im Vergleich zu normaler Haut.

5.1.3 Pathophysiologische Bedeutung von Mastzellsubtypen in Narbengewebe

Unter mehreren Möglichkeiten der Anfärbung von Mastzellen haben wir die enzymhistochemische sequentielle Doppelfärbung der Proteasen Chymase und Tryptase gewählt, mit deren Hilfe eine Subtypisierung in MCT und MCTC möglich ist. In gesunder humaner Haut finden


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sich weitaus überwiegend MCTC, nämlich 88 % (Galli, 1990; Irani et al., 1986; Irani & Schwartz, 1989). In Narben kehrt sich dieses Verhältnis um mit nur noch 9 % MCTC bei insgesamt etwa gleicher Menge von MCT. Dieses Ergebnis korrespondiert zu Publikationen, in denen eine relative Vermehrung von MCT auch bei anderen entzündlichen Prozessen der Haut beschrieben wurde (Algermissen et al., 1994; Harvima et al., 1990; Jarvikallio et al., 1997).

Hinsichtlich fibrosierender Prozesse und Mastzellsubtypen liegen unterschiedliche Ergebnisse vor. Bei der Sklerodermie wurde eine weitgehende Abnahme der MCTC beobachtet (Irani et al., 1992). Bei der rheumatoiden Arthritis ebenso wie bei der fibrosierenden Glomerulonephritis fanden sich bei insgesamt erhöhter Mastzellzahl in Bereichen aktiver fibrosierender Entzündung vermehrt MCTC (Gotis-Graham & McNeil, 1997; Toth et al., 1999). Ca 80 bis 95 % der in arteriosklerotischen Karotiden insgesamt vermehrten Mastzellen waren MCTC (Jeziorska et al., 1997). Wie zu erwarten, zeigte sich im Rahmen einer Mastzellvermehrung im späten fibrosierenden Stadium des respiratorischen Distress-Syndroms der Lunge keinerlei Änderung des MCT/MCTC-Verhältnisses bei Dominanz von MCT in Lungengewebe (s.o. 1.4.1.3) (Liebler et al., 1998). Beim Gewebeumbau im Rahmen von Wundheilung und Fibrosierung werden proentzündliche Zytokine von ortsständigen und einwandernden Zellen freigesetzt, die zu Veränderungen des Mikromilieus führen. Diese Prozesse können in den verschiedenen Organen wie Haut, Lunge, Arterien, Synovia oder Niere unterschiedlich ausgeprägt sein. In Abhängigkeit von Situation und Umgebung sind Konversion von Mastzellsubtypen sowie Änderungen der von Mastzellen exprimierten Zytokine gut möglich (Bradding et al., 1995b; Irani & Schwartz, 1989; Lorentz et al., 2000).

Das auffällige Verschwinden chymasehaltiger Mastzellen in Narbengewebe scheint dem in der Literatur beschriebenen „Verschwinden“ von mit Avidin und Toluidin anfärbbaren Mastzellen bei der Sklerodermie, der GVHD der Maus sowie bei der Wundheilung zu entsprechen. Da mit anderen Darstellungsmethoden, die nicht auf Anfärbung der Granula beruhen, nämlich elektronenmikroskopisch oder durch Markierung von membranständigen IgE-Rezeptoren, scheinbar verschwundene Mastzellen doch sichtbar gemacht werden konnten, wurden sie als Phantommastzellen bezeichnet (Choi & Claman, 1987; Choi et al., 1987; Claman, 1990; Claman et al., 1986; Wichmann, 1955). Dieses Phänomen wird durch De- und Transgranulation von Mastzellen in akut und chronisch traumatisierter Haut erklärt (Claman, 1989; Irani et al., 1992; Pearson et al., 1988; Seibold et al., 1990). Auch die bei unseren Ar


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beiten aufgefallene kleinere Zellgröße und geringere Anfärbbarkeit sowohl von chymase- als auch von tryptasehaltigen Mastzellen in Narben paßt zum Konzept der Degranulation (Abb. 5).

Abb. 5: Schwach angefärbte, blasse MCT in Narbengewebe (rechts im Bild) neben normalen MCT in der angrenzenden normalen Haut (links im Bild); enzymhistochemische Färbung, x 400.

Bemerkenswert ist jedoch die in frischen und älteren Narben gleichermaßen geringe Anzahl von MCTC. Zum einen kann eine kontinuierliche Aktivierung von Mastzellen mit ständiger langsamer Degranulation eine Rolle spielen. Hiermit wären die Funktionen der Proteasen im Bindegewebsmetabolismus gut zu vereinbaren (Akers et al., 2000; Atkins & Clark, 1987; Fang et al., 1997; Fang et al., 1996; Gruber & Schwartz, 1990; Hartmann et al., 1992; Kofford et al., 1997; Lees et al., 1994; Trautmann et al., 1998). Möglicherweise ist auch das Mikromilieu von Narbengewebe der Entwicklung von MCTC abträglich, die sich nicht in allen Organen und nur unter speziellen Kulturbedingungen entwickeln (Li et al., 1995; Schwartz et al., 1987). Außerdem wurde beobachtet, daß die nach vorübergehendem Verschwinden wieder in Erscheinung tretenden und durch Granulafärbung identifizierbaren Mastzellen Charakteristika unreifer Mastzellen aufweisen (Choi et al., 1987). Unreife Mastzellen enthalten Tryptase, jedoch keine Chymase (Czarnetzki et al., 1995). Als Erklärung liegt nahe, daß nach


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Degranulation, gegebenenfalls auch Destruktion der ortsständigen Mastzellen, unreife Mastzellen oder Mastzellvorläufer durch Mediatoren angelockt werden und in das Granulations- bzw. Narbengewebe einwandern und hier persistieren. Solche chemotaktischen Mediatoren, z.B. SCF, TGF-beta, Komplementfaktoren oder IL-8, können einerseits aus den degranulierten Mastzellen selbst stammen, zum anderen aus aktivierten Endothelzellen, Fibroblasten oder eingewanderten Entzündungszellen (Hartmann et al., 1997; Lippert et al., 1998).

Für die Präsenz unreifer Mastzellen in Narben spricht unsere Beobachtung, daß sich bei Mastzellmarkierung mit einem Antikörper gegen den membranständigen SCF-R c-Kit in der Dermis von Narben mehr Zellen anfärben ließen als in gesunder Haut. Der Unterschied der jeweils markierten Zellen erreichte Signifikanz für die mittlere und tiefe Dermis. c-Kit ist als membranständiger Rezeptor auch auf degranulierten Mastzellen vorhanden und wird sowohl von unreifen als auch von reifen Mastzellen exprimiert, so daß davon ausgegangen werden kann, daß mit der Markierung SCF-R-positiver Zellen in der Dermis die meisten Mastzellen dargestellt werden im Vergleich zu den anderen in unseren Untersuchungen verwendeten Mastzellfärbemethoden (Valent, 1995). Dermale, möglicherweise c-Kit-exprimierende Melanozyten wurden durch die negativ verlaufene Färbung mit dem Melanosomenmarker TA99 ausgeschlossen. Die bei Verwendung von Mastzellgranulafärbungen beschriebene Dynamik der Mastzellzahlen bei fibrosierenden Prozessen mit anfänglichem Rückgang und späterem Überschießen läßt sich bei Markierung des C -Kit auf Mastzellen nur für die zweite Phase mit Zunahme der Mastzellen nachvollziehen.

5.2 MC-Proteasen in Narbengewebe

Die Messung der Proteaseaktivitäten in homogenisierten Gewebsextrakten von Narben versus gesunde Haut zeigte einen signifikanten Anstieg der Tryptaseaktivität (p < 0,001) und im Gegensatz dazu eine signifikante Verminderung der Chymaseaktivität (p < 0,05) in Narben im Vergleich zu normaler Haut (Abb. 6, S. 53).


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Abb. 6: Proteaseaktivitäten in Gewebsextrakten aus normaler Haut und Narben jeweils derselben Patienten (mU/mg Protein). MW + SD; N = 7.

In Übereinstimmung damit ließen sich mittels semiquantitativer RT-PCR ebenfalls in homogenisierten Gewebsextrakten eine erhöhte Expression von Tryptase-mRNA sowie eine herabgesetzte Expression von Chymase-mRNA in Narben nachweisen (Tab. 6, S. 54; Abb. 7).

Abb. 7: Durch semiquantitative RT-PCR ermittelte mRNA-Expression von Chymase, Tryptase und c-Kit in Gewebsextrakten aus Narben und normaler Haut. Repräsentatives Beispiel von N = 5 Experimenten. 1 = Kontrolle ohne cDNA; 2 = normale Haut; 3 = Narbe.


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Tabelle 6: : Densitometrische Analyse der Signalintensität von Banden einer RT-PCR mit DNA-Primern für Chymase, Tryptase und c-Kit. MW ± SD von N = 5, * p < 0,05 im Vergleich zu normaler Haut.

DNA-Primer für

Narben

Normale Haut

Chymase

0,2 ± 0,1*

0,4 ± 0,1

Tryptase

2,9 ± 1,0*

0,8 ± 0,4

c-Kit

1,0 ± 0,4*

1,7 ± 0,6

Die Verminderung der Chymaseaktivität und der Chymase-mRNA-Expression in Narbengewebsextrakten steht in Einklang mit der immunhistochemisch nachgewiesenen starken Abnahme von MCTC in Narben (s. 4.1.1). Die Narben, die zur Herstellung der Gewebsextrakte dienten, waren zwischen 23 und 56 Tage alt. Die nach Gewebetraumatisierung einsetzende Degranulierung der Mastzellen mit Freisetzung von Chymase und Tryptase scheint in diesem Zeitintervall keine entscheidende Rolle mehr zu spielen. Der Anstieg der Tryptaseaktivität und der Tryptase-mRNA-Expression in Narbengewebsextrakten desselben Narbenalters paßt sowohl zu der in Narben immunhistochemisch nachgewiesenen kontinuierlichen Präsenz von MCT, die in älteren Narben (> 35 Tage) an Zahl noch zunehmen, als auch zu der veränderten Morphe der MCT mit auffällig kleinerer Zellgröße und geringerer Anfärbbarkeit als in normaler Haut, die fortgesetzte Degranulation nahelegt (s. 4.1.1). Auch die in Narbengewebe vermehrten c-Kit-positiven, möglicherweise unreifen Mastzellen können durch andauernde Degranulation zur Erhöhung der Tryptaseaktivität beitragen (s. 4.1.2 und 4.1.3).

5.2.1 Mitogene Wirkung der Mastzellproteasen auf Fibroblasten und Keratinozyten

Um die potentielle Bedeutung der Proteasen aus Mastzellen für die Wundheilung zu klären, wurden Untersuchungen zu ihrer mitogenen Wirkung auf Fibroblasten durchgeführt. Zunächst wurde der Effekt des Kulturzusatzes FCS ermittelt. Subkonfluente 3T3-Fibroblastenkulturen zeigten bei einem FCS-Gehalt von 0,05 - 10 % eine konzentrationsabhängige Erhöhung der Proliferation, die bei 5 - 10 % FCS am ausgeprägtesten war. Zusatz von Chymase und Tryptase zu in 5 % FCS inkubierten 3T3-Fibroblasten bewirkte jeweils eine dosisabhängige Zunahme der Mitogenität, die für Chymase ausgeprägter als für Tryptase war. Zugabe von EGF führte zu einer weiteren Zunahme der Mitogenität der 3T3-Fibroblasten mit parallelem Kurvenverlauf (Abb. 8).


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Abb. 8: Dosisabhängiger Effekt von Chymase (a) und Tryptase (b) auf die Mitogenität von in 5 % FCS inkubierten 3T3-Fibroblasten allein oder nach Zugabe von EGF (5 ng/ml). MW ± SD; N = 3.


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Im Vergleich mit anderen mitogenen Stimuli entsprach der proliferationsfördernde Effekt von Chymase dem von TGF alpha und EGF; geringere Effekte wurden mit Trypsin, alpha-Thrombin und Tryptase in absteigender Reihenfolge erzielt (Abb. 9).

Abb. 9: : Maximale mitogene Antwort von subkonfluenten 3T3-Fibroblasten auf verschiedene Wachstumsfaktoren und Serinproteasen. Der durch 5% FCS erzielte mitogene Effekt wurde als 100 % definiert. MW ± SD; N = 3.

Abb. 10: Maximale mitogene Antwort von subkonfluenten HaCaT-Keratinozyten auf verschiedene Wachstumsfaktoren und Serinproteasen. Der durch 5% FCS erzielte mitogene Effekt wurde als 100 % definiert. MW ± SD; N = 3.


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Da Keratinozyten für den Wundverschluß wesentlich sind, wurden entsprechende Untersuchungen an HaCaT-Keratinozyten durchgeführt. Dabei war FCS konzentrationsabhängig der stärkste proliferationsfördernde Faktor. Chymase und Tryptase zeigten in unterschiedlichen Konzentrationen keinerlei mitogenen Effekt auf HaCaT-Keratinozyten und inhibierten sogar die durch EGF und alpha-Thrombin stimulierte Proliferation (Abb. 10, S. 56; Tab. 7).

Tabelle 7: Durch Chymase und Tryptase erzielte maximale Hemmung der mitogenen Antwort von HaCaT-Keratinozyten auf Stimulation mit EGF und alpha-Thrombin. Die Werte für EGF und alpha-Thrombin wurden jeweils auf 100 gesetzt. Optimale Konzentrationen der Mastzellproteasen stehen in Klammern. Mittelwert von N = 3.

 

% Inhibition durch

Mastzellprotease

EGF (0,5 ng/ml)

alpha-Thrombin, 1 nM

Chymase

32,8 (300 mU)

45,8 (100 mU)

Tryptase

30,5 (2,2 nM)

55,8 (2,2 nM)

Diese Ergebnisse bestätigen die proliferationsfördernde Wirkung von Tryptase auf Fibroblasten und zeigen denselben Effekt in noch ausgeprägterer Form auch für Chymase (Akers et al., 2000; Hartmann et al., 1992; Levi-Schaffer & Kupietzky, 1990; Levi-Schaffer & Rubinchik, 1995; Ohtsuka, 2000; Ruoss et al., 1991; Trautmann et al., 1998). Die im initialen Stadium nach Gewebetraumatisierung freigesetzte Chymase kann so zur Reparatur des Bindegewebes beitragen, wohingegen eine Epithelisierung zu diesem frühen Zeitpunkt noch nicht sinnvoll erscheint, was mit dem fehlenden mitogenen Effekt der Chymase auf Keratinozyten vereinbar ist. Der Anstieg der Tryptaseaktivität und der Tryptase-mRNA-Expression in Extrakten von 23 bis 56 Tage altem Narbengewebe spricht dafür, daß Tryptase anhaltend eine fibroproliferative Wirkung ausübt.

In anderen bisher publizierten Studien zeigte Chymase aus Hundemastzellen keinerlei Effekt auf Lungenfibroblasten von Hamstern oder Rattenfibroblasten, im Gegensatz zu Tryptase (Ruoss et al., 1991). Rattenmastzellprotease I, die der Chymase entspricht, ist in der Lage, den Zellstoffwechsel zu beeinflussen und inhibiert in vitro das Wachstum von Fibrosarkomzellen (Chan & Tharp, 1994). Welche pathogenetischen Mechanismen für stimulierende oder inhibierende Effekte der Mastzellproteasen auf die Proliferation unterschiedlicher Zellen verantwortlich zu machen sind, ist bisher ungeklärt. Die Aktivierung eines speziellen Signal


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transduktionsweges in Hamsterfibroblasten durch Tryptase wird vermutet (Ruoss et al., 1991). Der o. g. Effekt der Rattenmastzellprotease I auf Fibrosarkomzellen ist rezeptormediiert (Chan & Tharp, 1994). Insgesamt scheinen die Proteasen somit fähig zu sein, selektiv auf spezifische Zelltypen Einfluß nehmen zu können. Diese Eigenschaft kann gerade für die Wundheilung und den Gewebeumbau bei der Narbenbildung wichtig sein und differenzierte Interaktion mit anderen Wachstumsfaktoren ermöglichen.


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5.3 Mastzellwachstums- sowie chemotaktische Faktoren und Rezeptoren in humanem Narbengewebe

5.3.1 SCF und SCF-Rezeptor

Dem SCF sowie seinem Rezeptor galt wegen seiner wichtigen Rolle als humaner Mastzellwachstumsfaktor zunächst das Interesse. In der Immunhistochemie normaler Haut exprimierten diejenigen Zellen SCF, deren Fähigkeit zur Produktion von SCF bekannt ist, und zwar Keratinozyten und Endothelzellen, weniger ausgeprägt Fibroblasten und nicht näher definierte perivaskuläre Zellen, darunter Mastzellen (Grabbe et al., 1994b; Welker et al., 1999). Dasselbe Muster ergab sich auch in Narbengewebe, allerdings bei insgesamt kräftigerer Färbeintensität. Überdies ließen sich in der Dermis deutlich mehr SCF-positive Zellen nachweisen (Abb. 11; Abb. 12, S. 60). Dementsprechend war auch die SCF-mRNA in Narbengewebe im Vergleich zu normaler Haut signifikant erhöht und sprach somit für eine gesteigerte Produktion des Moleküls und nicht für einen erniedrigten Abbau (Tab. 9, S. 66; Abb. 15, S. 66).

Abb. 11: Immunhistochemische Expression von SCF in normaler Haut (n.Haut) versus Narbengewebe. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF in der Epidermis sowie in der oberen (ob.), mittleren (m.) und unteren (u.) Dermis ± SD dar. Die Werte unterscheiden sich jeweils signifikant voneinander (Epidermis: p = 0,0007, obere Dermis: p = 0,001, mittlere Dermis: p = 0,0007, untere Dermis: p = 0,002).


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Abb. 12: SCF-Reaktivität in normaler Haut (A) und in Narbengewebe (B). APAAP-Färbung mit anti-SCF, jeweils x 100.

Im Vergleich zur normalen Haut fand sich in der Dermis von Narbengewebe auch eine größere Zahl SCF-R-positiver Zellen in allen Koriumetagen (siehe Tab. 3, S. 44). Wie in 4.1.2 erörtert, stellen diese Zellen ausschließlich Mastzellen dar, so daß davon ausgegangen werden kann, daß Effekte von SCF bei der Wundheilung über Mastzellen vermittelt werden. In Narbengewebe stellen verschiedene, durch proinflammatorische Stimuli aktivierte Zellen wie Fibroblasten, Endothelzellen, auch Mastzellen potentielle Quellen für die SCF-Sekretion dar. Überdies spielt die Differenzierung einzelner Zelltypen bei der SCF-Produktion eine Rolle (Grabbe et al., 1996; Welker et al., 1999). Die Zunahme von SCF in Narbengewebe dürfte wiederum zur vermehrten Rekrutierung von c-Kit- und tryptasepositiven Mastzellvorläufern in Narbengewebe beitragen. PDGF, das nach Traumatisierung von Thrombozyten, Neutrophilen und Mastzellen freigesetzt wird, führt in vitro via Erhöhung von membrangebundenem SCF auf Fibroblasten indirekt ebenfalls zur Mastzellproliferation (Artuc et al., 1999; Hiragun et al., 1998). Die Zell-Zell-Interaktion von Fibroblasten und Mastzellen via SCF / c-Kit führt bei der Maus zur vermehrten Stimulation von Mastzellen mit Histamin- und Zytokinfreiset


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zung (Hogaboam et al., 1998). Bei der Narbenbildung könnte die Interaktion SCF / c-Kit bei Zell-Zell-Kontakt von Fibroblasten und Mastzellen Bedeutung für die Kontraktion von Kollagenfasern im Verlauf der Gewebewiederherstellung haben (Yamamoto et al., 2000). Unsere Befunde korrespondieren zu der in der frühen Phase der systemischen Sklerodermie immunhistochemisch festgestellten vermehrten dermalen SCF-Expression (Kihira et al., 1998; Yamamoto et al., 1998).

Ergänzend untersuchten wir mittels Immunfluoreszenzdoppelfärbung, wieviele avidingefärbte Mastzellen jeweils in normaler Haut und in Narbengewebe SCF-R-positiv sind (Abb. 13). In normaler Haut exprimierten 87 % der durch die Avidinfärbung markierten Mastzellen c-Kit, 13 % waren SCF-R-negativ.

Abb. 13: Immunfluoreszenzdoppelfärbung desselben Ausschnitts mit Avidin (A) und dem c-Kit-Antikörper YB5.B8 (B), normale Haut, x 1000.


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Dagegen fanden sich in neun Gewebeschnitten von Narben unabhängig vom Narbenalter keine avidinpositiven Mastzellen, in den übrigen Schnitten nur schwach fluoreszierende, einzelne avidingefärbte Mastzellen, die in 56 % c-Kit-positiv, in 44 % c-Kit-negativ waren, wiederum unabhängig vom Narbenalter. Da mittels Avidinfärbung vermutlich nur MCTC, nicht aber MCT erfaßt werden, paßt die Darstellung nur einzelner Mastzellen mit dieser Methode in Narbengewebe zu den mit der Chymasefärbung erhaltenen Ergebnissen, da unreife Mastzellen, die vermutlich vermehrt in Narben rekrutiert werden, keine Chymase enthalten (s. auch 4.1.1 und 4.1.3) (Irani et al., 1992). Allerdings exprimieren unreife Mastzellen bereits den c-Kit, so daß bei den mit der Avidinfärbung identifizierten reifen Mastzellen eigentlich die Expression des c-Kit zu erwarten gewesen wäre. c-Kit-negative Mastzellen wurden auch von Mayrhofer et al. beschrieben (Mayrhofer et al., 1987). Im folgenden aufgeführte Ursachen könnten für die Herabregulierung der c-Kit-Expression maßgebend sein. Nach Bindung von SCF, der - wie wir zeigen konnten (s.o.) - im Rahmen der Narbenbildung vermehrt vorhanden ist, an seinen Rezeptor c-Kit kann eine Rezeptor-Ligand-Internalisierung und damit Abnahme der Anzahl der SCF-Rezeptoren eintreten. Auch durch De- und Transgranulationsprozesse ist ein Rezeptorverlust denkbar. Anschließend ist eine Neusynthese des c-Kit erforderlich (Shimizu et al., 1996). An humanen Lungenmastzellen und an HMC-1-Zellen wurde dosis- und zeitabhängig eine Herabregulation des c-Kit durch SCF nachgewiesen (Baghestanian et al., 1996). Außerdem ist eine Herunterregulierung des c-Kit auf Mastzellen durch IL-4 bekannt (Nilsson et al., 1994b; Sillaber et al., 1991). Bei der Wundheilung ist eine Freisetzung von IL-4 sowohl durch Mastzellen selbst, als auch durch Lymphozyten möglich. Ein T-lymphozytäres Infiltrat wird noch über ein Jahr nach Traumatisierung in Narbengewebe beschrieben (Borgognoni et al., 1995).

Gegenüber normaler Haut war die c-Kit-mRNA in Narbengewebe trotz der erhöhten Zahl c-Kit-positiver dermaler Zellen in Narben vermindert (siehe 4.1.2 und Abb. 7, S. 53; Tab. 6, S. 54). Die oben diskutierte Herabregulation von c-Kit auf avidinpositiven Mastzellen dürfte bei der c-Kit-mRNA-Abnahme in Narben wegen der insgesamt sehr geringen Zahl dieser Zellen nur eine unbedeutende Rolle spielen. Leichter läßt sich dieses Ergebnis durch die stark erniedrigte Expression des c-Kit auf epidermalen Melanozyten in Narbengewebe (s.4.1.2) erklären, da jedenfalls in normaler Haut Melanozyten deutlich zahlreicher als Mastzellen vorhanden sind und damit unter normalen Umständen wesentlich zur Gesamtmenge des c-Kit beitragen.


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5.3.2 NGF und NGF-Rezeptoren

Im Gegensatz zu SCF wird NGF immunhistochemisch nur von wenigen epidermalen und dermalen Zellen und schwach exprimiert ohne erkennbaren Unterschied zwischen normaler Haut und Narbengewebe (nicht gezeigt). Auch die NGF-mRNA war in beiden Geweben in gleicher Menge vorhanden (nicht gezeigt).

Dagegen wiesen die Daten für die NGF-R deutliche Unterschiede auf. In der Immunhistochemie zeigte sich das Epithel von Schweißdrüsen besonders stark mit dem Antikörper gegen den NGF-R TrkA angefärbt. Die Reaktivität beschränkte sich in der Epidermis auf die mittleren Epidermislagen. Der NGF-R TrkA war in der Dermis von Narbengewebe signifikant vermehrt exprimiert im Vergleich zu normaler Haut (Tab. 8, S. 64).

Im Gegensatz zu diesen Befunden mit dem NGF-R TrkA fand sich eine Expression des NGF-R p75 immunhistochemisch in normaler Haut in der basalen Epidermis jeweils suprapapillär und in der Dermis im Bereich der äußeren Haarwurzelscheiden sowie von Nerven- und Muskelzellen und von Gefäßen, Schweiß- und Talgdrüsen (Abb. 14, S. 65). Im oberen Korium waren mehr p75-positive Zellen vorhanden als in der tiefen Dermis. In Narben zeigten sich in der Epidermis nur vereinzelte basale Zellen angefärbt mit signifikantem Unterschied (p < 0,0001) zur normalen Haut. In der Dermis fiel eine markante Anfärbung der Gefäße und des entzündlichen Zellinfiltrates auf, wobei im mittleren und tiefen Korium mehr reaktive Zellen waren als im oberen Korium, und im tiefen Korium signifikant mehr reaktive Zellen als in gesunder Haut (p < 0,0007) (Tab. 8, S. 64; Abb. 14, S. 65). Die mRNA beider NGF-Rezeptoren war in Narben signifikant vermehrt, besonders ausgeprägt für den TrkA (Tab. 9, S. 66; Abb. 15, S. 66).


64

Tabelle 8: Immunhistochemische epidermale und dermale Expression der NGF-, GM-CSF- und TGF-beta-Rezeptoren in normaler Haut und Narbengewebe. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 6,25 nm Länge (Epidermis) bzw. pro 0,0625 mm2 (Dermis) ± SD dar. (- = nicht signifikant bei p > 0,05)

 

Normale Haut

Narben

stat. sign. (p =)

NGFR-TrkA

 

 

 

Epidermis

62.17 ± 72.13

102.96 ± 82.27

-

Obere Dermis

5.50 ± 6.02

22.04 ± 17.79

0,000066

Mittlere und tiefe Dermis

0.81 ± 2.30

18.69 ± 18.99

0,000024

NGFR-p75

 

 

 

Epidermis

11.76 ± 2.36

0.34 ± 0.17

0,0001

Obere Dermis

8.84 ± 2.08

8.05 ± 2.09

-

Mittlere und tiefe Dermis

3.67 ± 2.37

10.27 ± 1.90

0,0007

GM-CSFR

 

 

 

Epidermis

1.33 ± 0.44

1,67 ± 0.72

-

Obere Dermis

2.08 ± 0.68

5.21 ± 1.62

-

Mittlere und tiefe Dermis

0.37 ± 0.28

3.52 ± 1.77

0,0013

TGF-beta-R I

 

 

 

Epidermis

29.74 ± 33.97

114.21 ± 54.19

0,000003

Obere Dermis

7.94 ± 7.09

62.35 ± 35.45

0,000009

Mittlere und tiefe Dermis

1.20 ± 2.69

65.71 ± 35.89

0,000014

TGF-beta-R II

 

 

 

Epidermis

90.63 ± 33.76

156.47 ± 61.74

0,00078

Obere Dermis

79.65 ± 53.26

119.72 ± 68.29

-

Mittlere und tiefe Dermis

18.5 ± 15.58

89.41 ± 11.29

0,000051


65

Abb. 14: : Immunhistochemische Expression des NGF-R-p75 in normaler Haut [(A), x 200] und in Narbengewebe [(B), x 100]. APAAP-Färbung mit anti-NGF-R-p75.

Tabelle 9: Densitometrische Analyse der RT-PCR-Signalintensität mit DNA-Primern für verschiedene Wachstumsfaktoren und ihre Rezeptoren. MW ± SD von N = 5 (# N = 6), * p < 0,01,


66

DNA-Primer für

Narben

Normale Haut

GAPDH

100 ± 30

80 ± 25

SCF #

265 ± 90 **

130 ± 70

NGF-R-TrkA

950 ± 250 *

220 ± 80

NGF-R-p75

350 ± 90 *

110 ± 50

GM-CSF-R

120 ± 40

110 ± 60

TGF-ß

480 ± 200 *

30 ± 10

TGF-beta-R Typ I

750 ± 180 *

60 ± 30

TGF-beta-R Typ II

220 ± 100 *

40 ± 20

** p < 0,02 im Vergleich zu normaler Haut.

Abb. 15: Durch semiquantitative RT-PCR ermittelte mRNA-Expression verschiedener Wachstumsfaktoren und ihrer Rezeptoren im Vergleich zu GAPDH in Gewebsextrakten aus Narben und normaler Haut. Repräsentatives Beispiel von N = 5 Narben mit einem Narbenalter von 23 - 56 Tagen. 1 = Kontrolle ohne cDNA; 2 = Narbe; 3 = normale Haut.


67

Da NGF als wundheilungsfördernder Faktor bekannt ist, ist die geringe Expression ohne Unterschied zwischen normalem und Narbengewebe überraschend (Hutson et al., 1979; Li et al., 1980; Matsuda et al., 1998). Technische Gründe könnten bei der fehlenden Identifikation von NGF eine Rolle spielen oder aber NGF könnte sehr schnell abgebaut werden. Überdies ist die Fähigkeit verschiedener Zellen, NGF zu produzieren, äußerst variabel und hängt von zusätzlichen Stimuli ab wie zum Beispiel TNF-alpha, PDGF und IL-1 bei Keratinozyten (Cartwright et al., 1994; Di Marco et al., 1991). Jedoch sind Effekte auch kleinerer Mengen von NGF über seine Rezeptoren, die in Narben beide auf mRNA- und Proteinebene vermehrt sind, bei der Wundheilung möglich.

Für Keratinozyten, Monozyten und Mastzellen wurde die TrkA-Expression beschrieben, so daß seine Hochregulierung in Narbengewebe mit Vermehrung beziehungsweise Aktivierung dieser Zellen gut in Einklang zu bringen ist (Ehrhard et al., 1993; Nilsson et al., 1997; Pincelli et al., 1994; Tam et al., 1997; Welker et al., 2000a; Welker et al., 1998). Die epidermalen p75-positiven Zellen dürften in Übereinstimmung mit anderen Arbeiten Keratinozyten und Melanozyten darstellen (Di Marco et al., 1993; Yaar et al., 1994). Nach Abschluß der Epithelisierungsphase im Rahmen der Wundheilung sinkt die von anderen Autoren als anfänglich erhöht beschriebene p75-Expression der Keratinozyten, wie sich in unserer Arbeit bestätigen ließ (Di Marco et al., 1991; Di Marco et al., 1993). Die Verminderung der p75-positiven Zellen in der Epidermis mag zusätzlich wie bei c-Kit durch eine Reduktion dieses Rezeptors auf Melanozyten in der Epidermis von Narbengewebe bedingt sein (siehe auch 4.1.2).

Sowohl die erniedrigte epidermale als auch die erhöhte p75-Expression in der tieferen Dermis von Narben könnten Folge der bei Traumatisierung auftretenden Denervation sein. Nach Durchtrennung von sensorischen Nervenfasern wurde einerseits herabgesetzte NGF-R-Expression an epithelialen und im oberen Korium verlaufenden Nervenfasern, andererseits erhöhte NGF-R-Expression von Schwann-Zellen und von in der unteren Dermis befindlichen Nervenfasern beobachtet. NGF ist in dieser Situation unentbehrlich für die Neubildung von neuronalem Gewebe (Bothwell, 1997; Marshall et al., 1990; Ribeiro-da-Silva et al., 1991). Die innerhalb der perivaskulären Zellinfiltrate erhöhte p75-Expression könnte durch aktivierte Lymphozyten bedingt sein, die in Narben bis zu einem Jahr persistieren und durch NGF zur Sekretion koloniestimulierender Faktoren angeregt werden können (Borgognoni et al., 1995; Bothwell, 1997; Yaar et al., 1991). Soweit im Rahmen der immunhistochemischen Färbungen


68

erkennbar, scheinen auch Endothelzellen den NGF-R p75 zu exprimieren, so daß NGF via p75 Einfluß auf die Gefäßneubildung nehmen könnte. Weitere Untersuchungen wären zur Klärung dieses Fragenkomplexes angezeigt.

Mittels Immunfluoreszenzdoppelfärbung wurde untersucht, ob avidingefärbte Mastzellen jeweils in normaler Haut und in Narbengewebe den NGF-R p75 exprimieren. In normaler Haut exprimierten 70 % der durch die Avidinfärbung markierten Mastzellen den p75-NGF-R (Abb. 16). Vereinzelte im Narbengewebe identifizierte avidinpositive Mastzellen zeigten sämtlich keine Expression des p75-NGF-R (Tab. 10, S. 69).

Abb. 16: Immunfluoreszenzdoppelfärbung desselben Ausschnitts mit Avidin (A) und anti-NGF-R-p75 (B), normale Haut, x 1000.


69

Die Expression des NGF-R Trk durch humane Mastzellen wurde mehrfach nachgewiesen (Henz et al., 2000; Nilsson et al., 1997; Tam et al., 1997; Welker et al., 1998). Hingegen konnte eine Expression des p75-NGF-R auf humanen Mastzellen bisher nicht gezeigt werden (Nilsson et al., 1997). In unserem Labor konnte eine sehr schwache Bande der p75-mRNA in HMC-1-Zellen nachgewiesen werden, jedoch kein Rezeptorprotein (Welker et al., 1998). Die durch die Immunfluoreszenzdoppelfärbung in der vorliegenden Untersuchung erfolgte Darstellung des p75-NGF-R auf avidinpositiven Mastzellen in normaler Haut, nicht jedoch in Narben, könnte für eine ausgeprägte Beeinflußbarkeit der Expression durch Veränderungen des umgebenden Mikromilieus sprechen und die Schwierigkeit des Nachweises erklären.

Tabelle 10: Nachweis des p75-NGF-R und des GM-CSF-R auf avidinpositiven Mastzellen in normaler Haut und Narbengewebe. Die Anzahl (N) der jeweils ausgezählten avidinpositiven Mastzellen steht in Klammern.

 

Normale Haut (N)

Narben (N)

 

 

 

NGF-R-p75

70% (153)

0% (einzelne)

GM-CSF-R

73% (125)

49% (39)

5.3.3 GM-SCF und GM-CSF-Rezeptor

Wie NGF wurde auch GM-CSF immunhistochemisch nur von wenigen epidermalen und dermalen Zellen mit geringer Färbeintensität exprimiert ohne Unterschied zwischen normaler Haut und Narbengewebe (nicht gezeigt). GM-CSF-mRNA war ebenso jeweils in gleicher Menge vorhanden (nicht gezeigt).

Die Anzahl GM-CSF-R-exprimierender Zellen in Epidermis und Dermis normaler Haut war insgesamt spärlich (Tab. 8, S. 64). In Narben fand sich eine Vermehrung GM-CSF-R-positiver Zellen, die in der mittleren und tiefen Dermis Signifikanz erreichte und die in frischen Narben (le 35 Tage) insbesondere im mittleren und tiefen Korium erheblich ausgeprägter als in älteren Narben (> 35 - 369 Tage) war (Tab 11, S. 70; Abb. 17, S. 70). Hinsichtlich der mRNA für den GM-CSF-R ergab sich kein Unterschied zwischen Narbengewebe und normaler Haut (Tab. 9, S. 66; Abb. 15, S. 66).


70

Tabelle 11: : Anzahl GM-CSF-R-positiver Zellen in frischen (le 35 Tage) und älteren Narben (> 35 - 369 Tage). Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 6,25 nm Länge (Epidermis) bzw. pro 0,0625 mm2 (Dermis) ± SD dar. * p < 0,026.

Kompartment

Frische Narben

Alte Narben

Epidermis

1,39 ± 0,62

1,79 ± 1,03

Obere Dermis

8,21 ± 3,74

3,86 ± 1,45

Mittlere Dermis

6,30 ± 3,39

3,82 ± 2,41

Untere Dermis

7,28 ± 4,63

0,70 ± 0,46*

Gesamte Dermis

7,13 ± 4,16

1,88 ± 1,41

Abb. 17: Immunhistochemische Expression des GM-CSF-R in normaler Haut (A) und in Narbengewebe (B). APAAP-Färbung mit anti-GM-CSF-R, x 400.


71

GM-CSF wird nach Traumatisierung unter anderem von Makrophagen, T-Lymphozyten, Fibroblasten, Monozyten, Mastzellen und Keratinozyten vermehrt freigesetzt. Außerdem wird die GM-CSF-Synthese von Keratinozyten und Fibroblasten durch bei Gewebstrauma freigesetztes IL-1 stimuliert (Braunstein et al., 1994; Kaushansky et al., 1988; Kupper et al., 1988). Daher ist erstaunlich, daß in dem hier untersuchten Narbengewebe GM-CSF nur von wenigen Zellen exprimiert wurde. Möglicherweise erstreckt sich die vermehrte GM-CSF-Sekretion nur über einen kürzeren Zeitraum nach Trauma, als hier erfaßt wurde. Die relativ geringe Präsenz von GM-CSF als Inhibitor der Mastzellentwicklung würde also eine ungestörte Mastzellreifung und -differenzierung im Narbengewebe begünstigen. Die vermehrte Expression des GM-CSF-R insbesondere in frischeren Narben läßt sich durch das in früheren Phasen der Wundheilung beziehungsweise Narbenbildung dichtere Entzündungsinfiltrat erklären. Darunter finden sich dendritische Zellen, Monozyten, Eosinophile, Neutrophile, und auch Mastzellen, die den GM-CSF-R exprimieren können (Borgognoni et al., 1995). Sowohl in Narben, als auch in normaler Haut waren die Endothelzellen GM-CSF-R-positiv. Die migrations- und proliferationsfördernde Wirkung von GM-CSF auf Endothelien könnte bei Wundheilung und Vernarbung eine Rolle spielen, die sich jedoch zumindest aus den immunhistochemischen Befunden nicht ableiten läßt (Bussolino et al., 1989; Bussolino et al., 1991). Möglicherweise sind andere, z. T. von Mastzellen sezernierte Faktoren wie VEGF, TNF-alpha, Histamin, Heparin und Tryptase bedeutendere angiogenetische Faktoren nach Gewebstrauma (Artuc et al., 1999; Grützkau et al., 1998).

Mittels Immunfluoreszenzdoppelfärbung wurde untersucht, ob avidingefärbte Mastzellen jeweils in normaler Haut und in Narbengewebe den GM-CSF-R exprimieren. In der normalen Haut waren 73 % der avidingefärbten Mastzellen auch positiv für den GM-CSF-R, wohingegen von den im Narbengewebe insgesamt spärlich vorhandenen avidinmarkierten Mastzellen nur 49 % den GM-CSF-R exprimierten, unabhängig vom Narbenalter (Tab. 10, S. 69; Abb. 18, S. 72). Unsere Ergebnisse, die eine GM-CSF-R-Expression auf reifen avidinpositiven Mastzellen zeigen, stehen im Gegensatz zu bisherigen Erkenntnissen, nach denen Mastzellen im Verlauf des Reifungsprozesses den GM-CSF-R verlieren sollen (Valent, 1995). Die Herabregulation der GM-CSF-R-Expression auf avidingefärbten Mastzellen in Narben entspricht unseren Beobachtungen hinsichtlich c-Kit und p75-NGF-R, deren Expression auf avidinpositiven Mastzellen in Narben gleichfalls herabgesetzt war. Bindung von GM-CSF an seinen Rezeptor bewirkt eine Abnahme der Expression (Cannistra et al., 1990; Kurata et al., 1995). Hierdurch könnte eine Herunterregulation des GM-CSF-R erklärt werden.


72

Abb. 18: Immunfluoreszenzdoppelfärbung desselben Ausschnitts mit Avidin (A) und anti-GM-CSF-R (B), Narbengewebe, x 1000.

5.3.4 TGF-beta und TGF-beta-Rezeptoren

Der für die Wundheilung als sehr wichtig betrachtete, ebenfalls von Mastzellen sezernierte Wachstumsfaktor TGF-beta1 war immunhistochemisch insbesondere auf Keratinozyten, Fibroblasten, perivaskulären und Endothelzellen nachweisbar. Im Vergleich zu normaler Haut ließen sich sowohl in der Epidermis als auch in der Dermis von Narben immunhistochemisch signifikant mehr Zellen mit dem TGF-beta1-Antikörper anfärben bei insgesamt ausgeprägterer Färbeintensität (Tab. 12, S. 73). Ebenso war die mRNA-Expression von TGF-beta1 in Narbengewebe signifikant hochreguliert gegenüber normaler Haut (Tab. 9, S. 66; Abb. 15, S. 66).


73

Tabelle 12: Immunhistochemische Expression von TGFbeta1 in normaler Haut versus Narbengewebe. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF ± SD dar.

 

Normale Haut

Narben

stat. sign. (p=)

Epidermis

72.64 ± 29.10

141.00 ± 68.48

0,0026

Obere Dermis

30.35 ± 14.80

120.48 ± 48.81

0,003

Mittlere und tiefe Dermis

4.81 ± 6.80

130.71 ± 79.66

0,00005

Auch für die beiden untersuchten TGF-Rezeptoren TGF-beta-R Typ I und II zeigte sich in Epidermis und Dermis von Narbengewebe eine im Vergleich zu normaler Haut vermehrte Expression in der Immunhistochemie. Hinsichtlich des TGF-beta-R Typ II war der Unterschied geringer als für den TGF-beta-R Typ I und nur in der mittleren und tiefen Dermis sowie in der Epidermis signifikant (Tab. 8, S. 64). Parallel dazu erwies sich die mRNA für beide Rezeptorproteine in Narben gegenüber normaler Haut signifikant erhöht (Tab. 9 und Abb. 15, S. 66). Wiederum war die Heraufregulation weniger ausgeprägt für den TGF-beta-R Typ II als für den TGF-beta-R Typ I.

Die vermehrte Präsenz von TGF-beta sowie seiner Rezeptoren in Narbengewebe entspricht der Erwartung, da dieses Molekül als fibroseinduzierendes Zytokin eine prominente Rolle im Bindegewebsmetabolismus einnimmt. In Haut von Patienten mit Morphea oder Sklerodermie im entzündlichen Stadium sowie in Fibroblasten von Keloiden fand sich gleichfalls eine erhöhte Expression von TGF-beta 1 und 2 (Lee et al., 1999; Querfeld et al., 1999). Humane dermale Fibroblasten zeigten im Rahmen der Wundheilung eine Heraufregulation der TGF-beta-R Typ I und II mit Verringerung bei fortschreitendem Heilungsprozess, nicht jedoch im Fall der hypertrophen Narbenbildung (Schmid et al., 1998).

Wir konnten auf humanen dermalen Mastzellen mittels FACS-Analyse die Expression beider TGF-beta-Rezeptoren zeigen in Übereinstimmung mit kürzlich publizierten, an HMC-1-Zellen erhobenen Befunden (Tab. 13, S. 74) (Olsson et al., 2000). TGF-beta könnte somit zum einen mittels seiner Rezeptoren auf Mastzellen und zum anderen aufgrund seiner potenten chemotaktischen Wirkung auf Mastzellen zu ihrer Rekrutierung und Proliferation bei der Wundheilung beitragen (Gruber et al., 1994).


74

Tabelle 13: FACS-Analyse von isolierten Mastzellen aus normaler Haut hinsichtlich der Expression der TGF-beta-Rezeptoren Typ I und Typ II. Angabe des Prozentsatzes der rezeptorpositiven Zellen in bezug auf die untersuchten Zellen.

Isolierte Mastzellen aus normaler Haut

TGF-beta-R Typ I

TGF-beta-R Typ II

Probe 1

16 %

31 %

Probe 2

90 %

83 %

5.4 Kutane Expression von Mastzellwachstums- sowie chemotaktischen Faktoren und Rezeptoren bei der Urtikaria

Ebenso wie bei Wundheilung und Narbenbildung zeigt sich auch bei der Urtikaria eine dermale Mastzellvermehrung, die sowohl in läsionaler, als auch in nicht-läsionaler Haut ca das 2,4 fache gegenüber normaler Haut beträgt und damit ausgeprägter als im Narbengewebe ist (s. 4.1.1 und 4.1.2) (Haas et al., 1998b). Zahlreiche Untersuchungen wurden bei der Urtikaria hinsichtlich der inflammatorischen Mediatoren der Mastzellen durchgeführt, die die lokale und systemische Symptomatik auslösen. Über die Zytokine, die Proliferation, Differenzierung und Chemotaxis der Mastzelle selbst beeinflussen, liegen hinsichtlich der Urtikaria oder allergischer Reaktionen insgesamt praktisch keine Erkenntnisse vor.

Wir haben einerseits proentzündliche Zytokine der Mastzelle (IL-3, IL-8, TNFalpha), andererseits auch Mastzellwachstumsfaktoren und / oder ihre Rezeptoren (SCF, SCF-R, NGF-R-TrkA, NGF-R-p75, GM-CSF, GM-CSF-R) immunhistochemisch in läsionaler und nicht-läsionaler Haut von Patienten mit verschiedenen Urtikariaformen untersucht im Vergleich mit normaler Haut (s. unter 3.).


75

5.4.1 SCF und SCF-Rezeptor

Im Vergleich zu ausgeprägter SCF-Expression der Epidermis normaler Haut zeigte die Epidermis läsionaler und nicht-läsionaler Haut von Urtikariapatienten immunhistochemisch eine deutlich geringere Anfärbung mit dem SCF-Antikörper. Im Bereich des Follikelepithels war die Reaktivität bei den Urtikariapatienten ebenfalls geringer. In der Dermis exprimierten insbesondere Endothel- und perivaskuläre Zellen SCF. Auch hier ergab sich für läsionale und nicht-läsionale Urtikariahaut eine zum Teil signifikant erniedrigte Expression (Abb. 19; Abb. 20, S. 76; Tab. 14, S. 77).

Abb. 19: Immunhistochemische Expression von SCF in normaler Haut. APAAP-Färbung mit anti-SCF, x 400.


76

Abb. 20: SCF-Reaktivität bei der AU (A) und bei der DU (B), jeweils läsionale Haut. APAAP-Färbung mit anti-SCF, x 400.


77

Tabelle 14: Immunhistochemische epidermale und dermale Expression von SCF in normaler Haut und Urtikariabiopsien. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 6,25 nm Länge (Epidermis) bzw. pro 0,0625 mm2 (Dermis) ± SD dar (N = 5).

 

Urtikaria

Normale Haut

 

läsional

nicht-läsional

 

Epidermis

1,07 ± 0,73 x

1,43 ± 0,53 o

2,11 ± 0,23

Endothel

2,37 ± 0,49 +

2,29 ± 0,49 §

3,02 ± 0,08

Perivaskuläre und interstitielle Zellen

2,40 ± 0,51 *

2,43 ± 0,53 #

3,12 ± 0,53

p = x 0,0001, + 0,0005, § 0,004, * 0,0021, o 0,01, # 0,06 im Vergleich zu normaler Haut.

C-Kit wurde in der Epidermis lediglich in der Basalzellschicht exprimiert. Bei den c-Kit-positiven epidermalen Zellen dürfte es sich um Melanozyten handeln, wie Dippel et al. anhand von Doppelfärbungen mit dem Melanosomenmarker TA99 und dem monoklonalen Antikörper YB5.B8 gegen c-Kit gezeigt haben (Dippel et al., 1995). In der Dermis fanden sich c-Kit-positive Zellen perivaskulär und in der Umgebung der Hautanhangsgebilde, entsprechend der Lokalisation von Mastzellen. Signifikante Unterschiede der Zellzahlen zwischen normaler Haut und läsionaler sowie nicht-läsionaler Urtikariahaut ergaben sich nicht (nicht gezeigt).

SCF wurde sowohl in der Epidermis, als auch in der Dermis von läsionaler und nicht-läsionaler Urtikariahaut vermindert gegenüber normaler Haut angetroffen trotz Zunahme der Mastzellzahl. Nach IgE-mediierter Stimulation zeigen humane Lungenmastzellen in vitro eine innerhalb einer Minute komplette Histaminfreisetzung mit anschließendem Plateau über 60 bis 120 Minuten. Ebenfalls sezernierter SCF erreicht nach 3 - 15 Minuten ein Maximum und fällt allmählich über 30 bis 120 Minuten wieder ab (de Paulis et al., 1999a). Möglicherweise ist hierfür eine rasche Spaltung des SCF durch auch bei der Mastzelldegranulation freigesetzte Proteasen wie Chymase verantwortlich (de Paulis et al., 1999b). Hierdurch könnte die verminderte SCF-Expression bei der Urtikaria erklärbar sein. Weniger wahrscheinlich ist eine Rezeptor-Ligand-Internalisierung nach Bindung des SCF an seinen Rezeptor c-Kit (Shimizu et al., 1996).

Ebenso wie die IgE-mediierte Mastzellaktivierung führt auch Stimulierung der Mastzelle


78

durch SCF zu Produktion und Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen (IL-8, MIP-1alpha, MCP-1, RANTES), die sowohl bei der Soforttypreaktion wie der Urtikaria, als auch bei der Spätphasenreaktion und der chronischen allergischen Entzündung eine entscheidende Rolle spielen, wie am Beispiel des Bronchialsystems gezeigt wurde. Unterschiedliche Wege der Signaltransduktion werden bei diesen Formen der Mastzellaktivierung beschrieben mit möglicher therapeutischer Implikation (Lukasc et al., 2000).

Im Gegensatz zum Urtikariagewebe ist SCF in Narben vermehrt vorhanden. Das mag einerseits durch die zahlreichen im Rahmen der Wundheilung und Narbenbildung aktivierten Zelltypen bedingt sein, die als Quelle für den SCF infrage kommen, wie Fibroblasten, Endothelzellen, Mastzellen und Keratinozyten, andererseits durch die unterschiedliche Kinetik der beiden Prozesse mit konstanter, anhaltender Mastzellaktivierung bei der Narbenbildung und meist eher schubweiser, intensiver Stimulation bei der Urtikaria.

Wider Erwarten spiegelt sich die Erhöhung der Mastzellzahl bei der Urtikaria nicht in einem Anstieg der c-Kit-positiven Zellen, möglicherweise aufgrund einer Herabregulation der Rezeptorexpression. C-Kit-negative, avidinpositive Mastzellen haben wir in humanem Narbengewebe identifiziert. Auch in der Literatur werden C-Kit-negative Mastzellen beschrieben (Mayrhofer et al., 1987). Mastzelldegranulation kann Rezeptorverlust bedingen. Zusätzlich führt Aktivierung der Mastzellen bei der Urtikaria zur Sekretion von IL-4, das die Herabregulation des c-Kit auf Mastzellen bewirken kann (Nilsson et al., 1994b; Sillaber et al., 1991). Vermutlich ist IL-4 als Komponente einer Immunantwort vom Th2-Typ in Urtikariagewebe im Vergleich zu Narben vermehrt vorhanden, so daß die Herabregulation des c-Kit auf Mastzellen entsprechend unseren Ergebnissen bei der Urtikaria deutlicher ausgeprägt ist als im Narbengewebe (Bischoff et al., 1999; Bradding et al., 1994; Lorentz et al., 2000).

5.4.2 NGF-Rezeptoren

NGF-R-p75 wurde in der Immunhistochemie von einigen basalen epidermalen Zellen exprimiert, und zwar gleichermaßen in Urtikariagewebe und normaler Haut. Unterschiede ergaben sich hier bei der endothelialen und perivaskulären p75-Expression in der Dermis, die jeweils


79

in läsionalem Urtikariagewebe signifikant vermindert war im Vergleich zu nicht-läsionaler Haut von Urtikariapatienten und zu normaler Haut (Abb. 21; Tab. 15, S. 80).

Abb. 21: Immunhistochemische Expression des NGF-R-p75 in normaler Haut (A) und in läsionaler Haut bei der DU. APAAP-Färbung mit anti-NGF-R-p75, x 400.


80

Tabelle 15: Immunhistochemische dermale Expression des NGF-R-p75 in normaler Haut und Urtikariabiopsien. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 0,0625 mm2 ± SD dar (N = 5).

 

Endothelzellen

Perivaskuläre Zellen

AU

1,61 ± 0,55

0,22 ± 0,44 *

CRU

1,42 ± 0,53

0,21 ± 0,45 o

DU

1,61 ± 0,56

1,23 ± 0,44

Alle Urtikariaformen

1,47 ± 0,52 *

0,53 ± 0,64 +

Normale Haut

2,02 ± 0,14

1,22 ± 0,64

p = * 0,002, o 0,008, + 0,03 im Vergleich zu normaler Haut.

Der NGF-R-TrkA zeigte sich immunhistochemisch in der gesamten Epidermis exprimiert ohne Unterschiede zwischen läsionaler und nicht-läsionaler Haut von Urtikariapatienten und normaler Haut. Auch die dermale Expression insbesondere auf Endothel- und perivaskulären Zellen zeigte keine deutlichen Unterschiede zwischen den untersuchten Gruppen (nicht gezeigt).

Ebenso wie SCF stellt NGF einen multifunktionalen Wachstumsfaktor dar mit Auswirkungen sowohl auf das neuronale Gewebe, als auch auf die Mastzelle sowie die Wundheilung ( s. 1.4.2.2). Außerdem gibt es Hinweise für eine Beteiligung des NGF bei allergischen Krankheiten, möglicherweise durch neuroimmunologischen Stress bei Störung der biologischen Homoeostase ausgelöst. Bei Patienten mit allergischem Asthma, Rhinokonjunktivitis sowie Urtikaria und Angioödem fand sich im Serum eine signifikante Erhöhung der NGF-Werte, die mit den Gesamt-IgE-Werten im Serum korrelierten (Aloe et al., 1997; Bonini et al., 1996). NGF wird nicht nur von Mastzellen, sondern auch von Eosinophilen, weiteren Effektorzellen allergischer Immunantworten, produziert und führt zu deren Mediatorfreisetzung (Solomon et al., 1998). Nach spezifischer IgE-mediierter Aktivierung, nicht jedoch nach Stimulation durch SCF und Lipopolysaccharide, sezernierten kultivierte humane und murine Mastzellen NGF (Xiang & Nilsson, 2000).


81

Auffällig hinsichtlich der NGF-R-Expression bei der Urtikaria ist eine immunhistochemisch erkennbare Herabregulation des NGF-R-p75 auf Endothel- und perivaskulären Zellen in läsionaler Urtikariahaut. Vor dem Hintergrund oben beschriebener, z. T. relativ neuer Erkenntnisse über eine Involvierung des NGF in immunologische Prozesse ist denkbar, daß ein bei der Urtikaria erhöhter Serumspiegel des NGF zu einer Herabregulation seines p75-Rezeptors in Endothel- und perivaskulären Zellen führen könnte. Über die Fragen, warum die Herabregulation nur in läsionaler Urtikariahaut geschieht und ob die unveränderte Expression des NGF-R-TrkA Ausdruck einer differentiellen Regulierung der NGF-Rezeptoren bei der Urtikaria ist, kann nur spekuliert werden. Ergänzende immunhistochemische und molekularbiologische Untersuchungen müssen die vorliegenden Daten ergänzen.

5.4.3 GM-SCF und GM-CSF-Rezeptor

GM-CSF und sein Rezeptor wurden immunhistochemisch weder bei der Urtikaria noch in normaler Haut von epidermalen Zellen exprimiert. Auch in der Dermis zeigte sich kein Unterschied zwischen den untersuchten Biopsien bei insgesamt geringer Expression dieses Wachstumsfaktors und seines Rezeptors auf perivaskulären Zellen (nicht gezeigt).

Obwohl der GM-CSF zahlreiche Auswirkungen auf Migration und Mediatorsekretion inflammatorischer Zellen wie Eosinophile und Neutrophile hat (Griffin et al., 1990; Jones, 1993; Jyung et al., 1994), haben wir in den Urtikariabiopsien weder Änderungen seiner Expression noch der seines Rezeptors feststellen können. Möglicherweise spielt hierfür die fehlende GM-CSF-Rezeptorexpression der reifen Mastzelle als Effektorzelle der Urtikaria eine Rolle (Valent, 1995). Bei unreifen Mastzellen wirkt GM-SCF inhibitorisch auf die Differenzierung (Welker et al., 1997).

Die Literatur weist relativ wenige Untersuchungen zu GM-CSF und allergischen Entzündungen auf. Nach Bindung des IgE-Rezeptors produzierten humane Mastzellen in vitro GM-CSF. Humane Lungenmastzellen produzierten nach IgE-mediierter Stimulation vermehrt GM-CSF, der zur Sekretion von ECP aus Eosinophilen führte, so daß GM-CSF ein Bindeglied zwischen Lungenmastzellen und chronischer allergischer Entzündung darstellen könnte (Bressler et al., 1997; Okayama et al., 1998). In der Nasenschleimhaut von Patienten mit allergischer Rhinokonjunktivitis findet sich nach Allergenexposition ein Anstieg von Zellen, die mRNA für IL-


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3, IL-4, IL-5 und GM-CSF exprimieren und bei positiver Korrelation zu der Anzahl Eosinophiler eine Rolle bei der Gewebseosinophilie zu spielen scheinen. Eine weitere Charakterisierung dieser Zellen erfolgte nicht. Nach oben dargelegten Beobachtungen ist gut vorstellbar, daß Mastzellen darunter sind (Durham et al., 1992).

In Gegenwart von GM-CSF, IL-3 oder IL-5 kann PAF eine Histaminfreisetzung und eine Leukotrien C4-Synthese durch Basophile bewirken. Ebenfalls nach Zusatz von GM-CSF oder IL-3 wirkt der Komplementfaktor C3 als potenter Basophilenaktivator mit Auslösung einer Histaminausschüttung und Leukotriensynthese (Bischoff et al., 1990; Brunner et al., 1991). Beide Mechanismen könnten bei einer systemischen anaphylaktischen Reaktion eine Rolle spielen, jedoch weniger im Rahmen der Urtikaria, bei der die Mastzelle als Effektorzelle die zentrale Rolle spielt.

5.5 Kutane Expression proinflammatorischer Zytokine bei der Urtikaria

5.5.1 IL-3

Im Unterschied zur normalen Haut, in der immunhistochemisch keinerlei Expression von IL-3 in der Epidermis festzustellen war, fand sich in den Urtikariabiopsien eine Anfärbung der Basalmembranzone mit dem IL-3-Antikörper (nicht gezeigt).

Im Vergleich zu einer eher schwachen IL-3-Immunreaktivität perivaskulärer Zellen in der Dermis normaler Haut zeigten diese Zellen bei der AU und DU in der oberen Dermis eine signifikant vermehrte IL-3-Expression. Bei der CRU und in der tiefen Dermis aller Urtikariaformen sowie in der nicht-läsionalen Haut der Urtikariapatienten ergaben sich keine signifikanten Veränderungen (Abb. 22, S. 83). Tendenziell ähnliche, aber weniger deutlich und nicht signifikant ausgeprägte Resultate ergaben sich für die interstitiellen Zellen im dermalen Bindegewebe.


83

Abb. 22: Immunhistochemische TNF-alpha-, IL-3- und IL-8-Expression perivaskulärer Zellen in der oberen Dermis normaler Haut sowie läsionaler Haut von Urtikariapatienten. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF ± SD dar.

x p < 0,05, § p < 0,01, + p < 0,001 im Vergleich zu normaler Haut.

Der obere dermale Gefäßplexus wies bei allen untersuchten Urtikariaformen eine signifikant erhöhte endotheliale Expression von IL-3 auf, bemerkenswerterweise sowohl in läsionaler als auch in nichtläsionaler Haut. Diese Veränderungen waren am ausgeprägtesten bei der DU, wo sich zusätzlich auch im Bereich des tiefen dermalen Gefäßplexus eine signifikante Hochregulation von IL-3 fand, und am wenigsten ausgeprägt bei der CRU (Abb. 23, S. 84).


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Abb. 23: Immunhistochemische TNF-alpha-, IL-3- und IL-8-Expression von Endothelzellen in der oberen Dermis normaler Haut sowie läsionaler (A) und nicht-läsionaler (B) Haut von Urtikariapatienten. Bei der DU wird neben der oberen Dermis (ob. D.) auch die untere Dermis (unt. D.) berücksichtigt. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF ± SD dar.

x p < 0,05, § p < 0,01, + p < 0,001, * p < 0,0001 im Vergleich zu normaler Haut.


85

In sequentiellen Biopsien eines Patienten mit Kälteurtikaria war die endotheliale IL-3-Expression 5 und 15 Minuten nach Kälteprovokation unverändert, stieg jedoch nach insgesamt 30 Minuten signifikant an. In Quaddeln nicht-atopischer Individuen mit positiver Pricktest-Reaktion auf Hausstaubmilbe ließ sich nach 15 Minuten keine signifikant veränderte IL-3-Expression der dermalen Endothelzellen nachweisen (Tab. 16).

Tabelle 16: Endotheliale Zytokin-Immunreaktivität in Urticae nach Pricktestung und in kontralateraler normaler Haut sowie in normaler Haut und provozierter Quaddel eines Patienten mit Kälteurtikaria 30 min nach Eiswürfelapplikation. (In den 5 und 15 min nach Eiswürfelapplikation entnommenen Biopsien war noch keine Vermehrung der endothelialen Zytokinreaktivität vorhanden.)

 

TNFalpha

IL-3

Urticae bei positivem Pricktest (N=7)

 

 

Normale Haut

0.83 ± 1.54

2.40 ± 2.37

Pricktest-Reaktion nach 15 min

1.72 ± 3.44

1.16 ± 0.66

Kälteurtikaria (N=1)

 

 

Normale Haut

1.01 ± 0.98

5.31 ± 1.93

Provozierte Quaddel nach 30 min

4.36 ± 0.84*

13.00 ± 2.68*

Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF ± SD dar. * p < 0.0001 im Vergleich zu normaler Haut.

Mithilfe des Wilcoxon-Rank-Testes untersuchten wir, ob eine Korrelation zwischen zytokin-positiven perivaskulären und interstitiellen dermalen Zellen und Mastzellzahlen in diesen Biopsien hergestellt werden konnte. Eine signifikante positive Korrelation ergab sich zwischen der Anzahl von IL-3-positiven Zellen und der von Mastzellen in den AU-, CRU- und DU-Biopsien (p jeweils < 0,05).

Da sich das Verteilungsmuster Tryptase-positiver Mastzellen in den Urtikariabiopsien von dem der Zytokin-positiven Zellen unterschied, ermittelten wir die Anzahl Tryptase-positiver und Zytokin-positiver Mastzellen in Serienschnitten und konnten nur wenige IL-3-positive Mastzellen bei der DU feststellen ( s. Tab. 17, S. 86).


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Tabelle 17: Prozentsatz Tryptase-positiver Zellen, die gleichzeitig mit Zytokin-Antikörpern (anti-TNF-alpha, anti-IL-3, anti-IL-8) reagieren, in Biopsien normaler Haut und verschiedener Urtikariaformen. Pro Biopsie wurden jeweils 500-1200 Mastzellen in Serienschnitten ausgewertet.

anti-

TNFa

IL-3

IL-8

 

 

 

 

AU (N=9)

0.05

0.00

0.00

CRU (N=10)

0.06

0.01

0.00

DU (N=6)

0.05

0.06

0.01

Normale Haut (N=10)

0.00

0.00

0.00

Die Diskussion der IL-3-Immunreaktivität in den Urtikariabiopsien erfolgt unter der Überschrift TNF-alpha (s. unter 4.5.2) wegen des sich weitgehend entsprechenden Expressionsmusters von IL-3 und TNF-alpha.

5.5.2 TNF-alpha

In der Epidermis normaler Haut wurde TNF-alpha nur von einzelnen Zellen exprimiert im Gegensatz zur Urtikaria, wo die epidermale TNF-alpha-Expression sowohl in läsionaler, als auch in nicht-läsionaler Haut signifikant hochreguliert war (Tab. 18, S. 87).

Ebenso wie die IL-3-Expression war auch die TNF-alpha-Expression der perivaskulären Zellen in der oberen Dermis bei der AU und DU signifikant vermehrt im Vergleich mit normaler Haut (Abb. 22, S. 83). Bei der CRU und in der tiefen Dermis aller Urtikariaformen fanden sich keine signifikanten Veränderungen. In nicht-läsionaler Haut zeigte sich lediglich eine signifikant erhöhte perivaskuläre TNF-alpha-Expression in der oberen Dermis von Patienten mit DU. Im Bereich der dermalen interstitiellen Zellen ergab sich eine signifikant erhöhte TNF-alpha-Expression bei der AU und bei der DU nur in der oberen Dermis.


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Tabelle 18: Immunohistochemische Expression von TNF-alpha and IL-8 in der Epidermis normaler Haut sowie läsionaler und nicht-läsionaler Haut bei verschiedenen Urtikariaformen.

 

TNFa

IL-8

 

läsional

nicht-läsional

läsional

nicht-läsional

AU (N=9)

3.9 ± 2.1§

3.6 ± 1.8+

6.5 ± 2.9

5.4 ± 2.0x

CRU (N=10)

3.7 ± 1.8+

2.9 ± 1.9§

8.1 ± 2.0

6.8 ± 3.3

DU (N=6)

4.7 ± 1.4+

4.8 ± 1.4+

6.7 ± 2.9

6.6 ±2.1

Normale Haut (N=10)

 

0.6 ± 0.8

 

7.8 ± 1.6

Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF ± SD dar. xp<0.05; §p<0.01; +p<0.001 im Vergleich zu normaler Haut.

Die Expression von TNF-alpha auf dermalen Endothelzellen verhielt sich bei allen untersuchten Urtikariaformen parallel zu der von IL-3 sowohl in läsionaler als auch in nichtläsionaler Haut (Abb. 23, S. 84). Auch in den sequentiellen Biopsien der Kälteurtikaria und in Quaddeln nicht-atopischer Individuen mit positiver Pricktest-Reaktion auf Hausstaubmilbe entsprachen die Veränderungen der endothelialen TNF-alpha-Expression denen der endothelialen IL-3-Expression (Tab. 16, S. 85).

Im Wilcoxon-Rank-Test ergab sich eine signifikante positive Korrelation zwischen TNF-alpha -positiven perivaskulären und interstitiellen dermalen Zellen und Mastzellzahlen in den AU- und DU-Biopsien (p jeweils < 0,05).

In Serienschnitten bestimmten wir die Anzahl Tryptase-positiver und Zytokin-positiver Mastzellen und konnten nur wenige TNF-alpha-positive Mastzellen in den Urtikariabiopsien feststellen (Tab. 17, S. 86). Dieser Befund steht in Widerspruch zu der Tatsache, daß TNF-alpha in Mastzellen präformiert vorhanden ist. Denkbar wäre eine Maskierung des intrazellulären TNF-alpha durch andere Substanzen, so daß er durch den Antikörper in der Immunhistochemie nicht erkannt wird.


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Da die Expression von IL-3 und TNF-alpha in den untersuchten Biopsien zahlreiche Parallelitäten aufweist, wird in der folgenden Diskussion auf beide Zytokine eingegangen.

Die vorliegende Analyse der IL-3- und TNF-alpha-Immunreaktivität in der Haut von Urtikariapatienten deutet auf einen zentralen Part der Endothelzellen bei der Pathogenese der Urtikaria. Die Hochregulation von TNF-alpha in der Epidermis legt außerdem eine Rolle der Keratinozyten im Rahmen der Urtikaria nahe, wohingegen IL-3 und TNF-alpha aus Mastzellen kaum Bedeutung zu haben scheinen. Interessanterweise beschränken sich die Änderungen der IL-3- und TNF-alpha-Expression nicht auf die läsionale Haut, sondern betreffen in ähnlich ausgeprägter Form auch die nicht-läsionale Haut von Urtikariapatienten. Die Intensität der Immunreaktivität beider Zytokine entspricht dem Ausmaß des zellulären Entzündungsinfiltrates, das bei der AU und DU dichter ist als bei der CRU (Haas et al., 1998b). Möglicherweise beeinflußen gegenregulatorische Prozesse den chronischen Krankheitsverlauf der CRU.

Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit denen vorausgegangener Untersuchungen, die auf die Bedeutung der Endothelzellen bei der Entstehung der Urtikaria hinweisen. So wurde eine Hochregulation von P-Selektin, ICAM-1 und ELAM-1 bei der Kälte- und cholinergischen Urtikaria gezeigt, eine Hochregulation von Molekülen der MHC-Klasse II bei mehreren Urtikariaformen, von P-Selektin, E-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1 bei der Urticaria factitia, von E-Selektin bei der DU sowie von E-Selektin und ICAM-1 bei der Urticariavasculitis (Barlow et al., 1994; Haas et al., 1996; Haas et al., 1998a; Kano et al., 1998; Zuberbier et al., 1997). Daß Mastzellprodukte, die bei der Degranulation freigesetzt werden, zu dieser Hochregulierung der endothelialen Adhäsionsmoleküle beitragen, wurde durch in vivo- und in vitro-Studien an Ratten gezeigt. Mastzelldegranulation induzierte via Histamin und PAF P-Selektin-abhängiges sogenanntes Rollen der Leukozyten und CD18-abhängige Leukozytenadhäsion (Gaboury et al., 1995). Da IL-3 und TNF-alpha auch die Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle hochregulieren können, verstärken sie möglicherweise die Aktivierung der Endothelzellen und ihre eigene Expression auf diesen Zellen in einem positiven Rückkopplungsmechanismus (Khew-Goodall et al., 1996; Walsh et al., 1991).

Die der Quaddelbildung bei der Urtikaria zugrundeliegenden Pathomechanismen werden in der Dermis, speziell im Bereich der dermalen Gefäßplexus vermutet. Eine Beteiligung der Epidermis, wie wir sie für die TNF-alpha-Expression gefunden haben, wurde bisher nur bei der


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AU beobachtet, bei der ebenfalls TNF-alpha und IL-6 immunhistochemisch und mittels RT-PCR in läsionaler Haut nachgewiesen wurden, nicht in nicht-läsionaler Haut. Bei parallel nachgewiesener Induktion der Expression des niedrig-affinen IgE-Rezeptors CD23 auf Keratinozyten bei der AU vermuten die Autoren einen IgE-vermittelten Prozess (Becherel et al., 1997). In den meisten Fällen ist die Urtikaria jedoch nicht IgE-mediiert, so daß die Beteiligung auch anderer Stimuli zu vermuten ist (Henz et al., 1998).

Bemerkenswert ist die signifikante Hochregulation von IL-3 und TNF-alpha in der nicht-läsionalen Haut von Urtikariapatienten. Abnorme Reaktivität und erhöhter Histamingehalt des Gewebes wurden gleichfalls in nicht-läsionaler Haut bei Urtikaria festgestellt, ebenso wie Hochregulation der Expression von endothelialen Adhäsionsmolekülen, beta2-Integrinen, Molekülen der MHC-Klasse II und des eosinophilen MBP (letzteres nur bei der DU) sowie ein Anstieg der Mastzellzahlen (Haas et al., 1995b; Haas et al., 1996; Haas et al., 1995c; Haas et al., 1998a; Haas et al., 1998b; Kaplan et al., 1978; Zuberbier et al., 1997).

Obwohl Mastzellen nur gering zu der IL-3- und TNF-alpha-Expression bei der Urtikaria beizutragen scheinen, legt die positive Korrelation zwischen der Anzahl Tryptase-positiver Mastzellen und der Zytokin-positiver perivaskulärer und interstitieller dermaler Zellen nahe, daß beide Parameter in ähnlicher Weise mit der urtikariellen Entzündung zusammenhängen.

Die hinsichtlich der Expression von IL-3 und TNF-alpha erhobenen Befunde sprechen unter Berücksichtigung bereits bekannter Daten für folgende pathophysiologische Ereignisse bei der Urtikaria: Mastzellen schütten sowohl präformierte als auch neu generierte vasoaktive Mediatoren aus, die zu Vasodilatation, Verlangsamung des kapillären Blutflusses und Rollen der Leukozyten entlang des Endothels führen. Hochregulation und Aktivierung der endothelialen Adhäsionsmoleküle und ihrer Liganden auf Leukozyten führen zum Anhaften der Leukozyten an die Gefäßwände und zu ihrer Einwanderung in die Gewebe, wo sie die lokale Quaddelreaktion durch eigene vasoaktive und chemotaktische Zytokine amplifizieren. Die Hochregulation von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen auch in Gefäßen nicht-läsionaler Haut spricht für eine ständige unterschwellige Aktivierung der Endothelzellen des gesamten Integuments durch zirkulierende Faktoren, beispielsweise Zytokine wie TNF-alpha, Allergene, oder auch lösliche Adhäsionsmoleküle wie P-Selektin (Kano et al., 1998; Zuberbier et al., 1997). Die dadurch erhöhte Reaktionsbereitschaft der dermalen Gefäße kann schon bei geringen oder unspezifischen Reizen zu Mastzellstimulation und damit über die beschriebenen Mechanismen


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zur Quaddelbildung führen und den chronisch-rezidivierenden Charakter der Urtikaria erklären. Weitere Untersuchungen hinsichtlich der Art solcher zirkulierender Faktoren könnten zu Fortschritten auf dem Weg zu einer effizienten Urtikariatherapie führen.

5.5.3 IL-8

In der Epidermis sowohl normaler Haut als auch aller Biopsien der Urtikariapatienten wurde IL-8 suprabasal kräftig exprimiert mit geringer Abnahme der Reaktivität bei der AU (Tab. 18, S. 87). Im Bereich der perivaskulären Zellen in der oberen Dermis zeigte sich in normaler Haut eine deutliche IL-8-Immunreaktivität mit signifikanter Abnahme in läsionaler Haut aller Urtikariaformen (Abb. 22, S. 83). Hinsichtlich der interstitiellen Bindegewebszellen in der Dermis ergaben sich keine signifikanten Änderungen der IL-8-Expression im Vergleich der untersuchten Gewebe.

Die endotheliale IL-8-Expression des oberen Gefäßplexus war insgesamt gering ohne signifikante Unterschiede der Expression in läsionaler und nicht-läsionaler Haut von Urtikariapatienten (Abb. 23, S. 84), in sequentiellen Biopsien einer Kälteurtikaria sowie in Pricktest-Reaktionen auf Hausstaubmilbe im Vergleich zur Expression in normaler Haut (nicht gezeigt).

Im Wilcoxon-Rank-Test war die Korrelation zwischen IL-8-positiven perivaskulären und interstitiellen dermalen Zellen und Mastzellzahlen signifikant negativ bei der AU (p = 0,017), bei der CRU (p = 0,009) und bei der DU (p < 0,025). In Serienschnitten konnten wir praktisch keine Tryptase-positiven und zugleich IL-8-positiven Zellen in normaler Haut und in den Urtikariabiopsien feststellen (Tab. 17, S. 86).

Im Vergleich zu der Hochregulation von IL-3 und TNF-alpha in den Urtikariabiopsien ist der fehlende Anstieg der IL-8-Expression verwunderlich, insbesondere da IL-8 von stimulierten humanen Mastzellen in vitro reichlich sezerniert wird (Möller et al., 1998; Möller et al., 1993). Die epitheliale IL-8-Positivität entspricht den von anderen Autoren erhobenen Befunden in normaler Haut und bei inflammatorischen Hautkrankheiten, die unabhängig von der Herkunft des verwendeten monoklonalen Antikörpers waren (Macleod et al., 1997; Sticherling et al., 1991). Der monoklonale Antikörper gegen IL-8, der in unserer Studie benutzt wur


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de, soll eine nicht-funktionale, intrazellulär gespeicherte Form des IL-8-Moleküls nachweisen, das in seiner aktiven Form extrazellulär sezerniert wird (Schroder, 1995). Dadurch ließe sich die unsererseits beobachtete verminderte IL-8-Expression epidermaler und perivaskulärer Zellen bei der Urtikaria und die zuvor beschriebene geringere IL-8-Expression bei inflammatorischen Dermatosen erklären (Sticherling et al., 1991). Weitere Untersuchungen mit Antikörpern, die das aktivierte IL-8-Molekül erkennen, wären zur Klärung der Rolle von IL-8 bei der Urtikaria ergänzend sinnvoll.


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