Hermes, Barbara: Pathogenetische Untersuchungen zur Ausbildung unterschiedlicher Phänotypen und zur Vermehrung humaner Mastzellen bei Wundheilung und Urtikaria

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Pathogenetische Untersuchungen zur Ausbildung unterschiedlicher
Phänotypen und zur Vermehrung humaner Mastzellen
bei Wundheilung und Urtikaria

Habilitationsschrift

zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach
Dermatologie und Venerologie

vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité

der Humboldt-Universität zu Berlin


von
Frau Dr. Barbara Hermes geboren am 16.08.1950 in Münster

Präsident: Prof. Dr. rer. nat. J. Mlynek

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Eingereicht am:14. Februar 2001
Tag der letzten Prüfung: 4. Dezember 2001

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Th. Rufli
2. Prof. Dr. med. T. Schwarz

Zusammenfassung

Bei der Wundheilung und fibrosierenden Prozessen sowie bei der Urtikaria ist eine Mastzellvermehrung bekannt. Mastzellen (MZ) üben bei der Urtikaria eine Schlüsselfunktion aus und scheinen auch zum Bindegewebsumbau beizutragen. In humanem Narbengewebe (5-369 Tage alt) wurden MZ-Zahlen und MZ-Subpopulationen mittels Enzym- und Immunhistochemie im Vergleich zu normaler Haut untersucht. Außerdem wurden in Gewebsextrakten Aktivität und mRNA-Expression der MZ-Proteasen und in vitro ihre mitogene Wirkung auf Fibroblasten und Keratinozyten bestimmt. Zur Klärung von Mechanismen, die zur MZ-Vermehrung beitragen könnten, analysierten wir die Expression von MZ-Chemoattraktoren und MZ-Wachstumsfaktoren sowie ihrer Rezeptoren in humanem Narbengewebe (a), läsionaler und nicht-läsionaler Urtikariahaut (b) und in normaler Haut (c): SCF, c-Kit, NGF-R TrkA, NGF-R p75, GM-CSF, GM-CSF-R (a, b, c); NGF, TGF-(, TGF-(-R I, TGF-(-R II (a,c) mittels Immunhistochemie (a, b, c) und RT-PCR (a, c). Zusätzlich wurde die Expression der proentzündlichen Zytokine IL-3, -8, TNF-( untersucht (b, c).

Tryptase und Chymase enthaltende MZ waren in Narben gegenüber normaler Haut signifikant vermindert ebenso wie Chymaseaktivität und -mRNA-Expression in Narbengewebsextrakten. Die Anzahl Tryptase-haltiger MZ war unverändert, obwohl Tryptaseaktivität und -mRNA in Narben vermehrt waren. Beide Proteasen erhöhten in vitro die mitogene Antwort von Fibroblasten, jedoch nicht von Keratinozyten. c-Kit+-MZ fanden sich in der mittleren und tiefen Dermis von Narben signifikant vermehrt. SCF, TGF-(, TGF-(-R I und II, NGF-R p75 und TrkA zeigten sich sowohl immunhistochemisch als auch in der RT-PCR in Narbengewebe hochreguliert im Vergleich zu normaler Haut, wohingegen NGF, GM-CSF und GM-CSF-R nur schwach exprimiert waren ohne Unterschied zwischen beiden Geweben. Mittels FACS-Analyse wurde erstmalig die Expression von TGF-(-R I und II auf isolierten Haut-MZ nachgewiesen. Im Gegensatz zu diesen Befunden waren in Urtikariagewebe SCF- und NGF-R p75-exprimierende Zellen vermindert im Vergleich zu normaler Haut. Die Zahl von c-Kit+-, NGF-R TrkA+-, GM-CSF+- und GM-CSF-R+ -Zellen zeigte sich unverändert. Hingegen war die Expression von IL-3 und TNF-( auf Endothelzellen in läsionaler und nicht-läsionaler Urtikariahaut signifikant hochreguliert.

Die dargestellten Ergebnisse mit signifikanter Verminderung von Chymase- und Tryptase-haltigen MZ in humanem kutanen Narbengewebe sprechen für MZ-Degranulation nach Trauma. Nachfolgend findet sich in Narbengewebe eine Chymase--, Avidin--, Tryptase+-, c-Kit+-MZ-Subpopulation, am ehesten Folge einer Einwanderung und Proliferation von unreifen MZ oder MZ-Vorläufern, die von den vermehrt exprimierten Wachstumsfaktoren SCF und TGF-(, eventuell auch von NGF über seine vermehrt exprimierten Rezeptoren, induziert werden könnten. Neben NGF und TGF-( scheint auch SCF eine Rolle bei der Wundheilung zu spielen. Bei entzündlichen Hautkrankheiten unterschiedlicher Prägung wie Wundheilung und Urtikaria liegen offenbar verschiedenartige Regulationsmuster der MZ-Proliferation und -Differenzierung vor. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass bei Trauma Feedbackmechanismen über Wachstumsfaktoren wie SCF, TGF-( und NGF und ihre Rezeptoren auf MZ ablaufen, bei der Urtikaria unter Mitberücksichtigung bereits bekannter Daten aus der Literatur vorzugsweise über eine Interaktion von Mast- und Endothelzellen.

Abstact

In wound healing and fibrosing processes as well as in urticaria an increase of mast cells (MC) has been observed. MC are key-players in urticaria, and might also contribute to tissue repair. In human cutaneous scar tissue (5-369 days old) and normal skin MC dynamics and MC subtypes were analysed by enzyme- and immunohistochemistry. Moreover, the activity of the MC proteases in extracts of both tissues and their in vitro effect on the mitogenesis of fibroblasts and keratinocytes were assessed. To elucidate mechanisms involved in mast cell accumulation, expression of MC chemotaxins, MC growth factors and their receptors was evaluated comparing cutaneous scar tissue (a), lesional and non-lesional skin of urticaria (b) and normal skin (c): SCF, c-Kit, NGF-R TrkA, NGF-R p75, GM-CSF, GM-CSF-R (a, b, c); NGF, TGF-(, TGF-(-R I, TGF-(-R II (a,c) by immunohistochemistry (a, b, c) and by RT-PCR (a, c). Additionally, expression of proinflammatory cytokines (IL-3, -8, TNF-() was studied (b, c).

Tryptase and chymase containing MC were markedly decreased in scars as well as chymase activity and mRNA expression, whereas overall numbers of tryptase containing MC did not differ from those in normal skin, although tryptase activity and mRNA expression were increased in scar extracts. Both proteases induced a dose-dependent mitogenic response in 3T3-fibroblasts, but not in HaCaT-keratinocytes. Numbers of c-Kit+ MC were significantly increased in the mid and lower dermis of scars. Furthermore, SCF, TGF-(, its receptors I and II, the NGF-R p75 and TrkA were shown to be upregulated in scars both by immunohistochemistry and by RT-PCR, while NGF, GM-CSF and the GM-CSF-R were only weakly expressed without differences between scar and normal tissue. In addition, expression of TGF-(-R I and II could be shown on isolated human skin MC by FACS-analysis. In contrast to these findings, SCF- and NGF-R p75-expressing cells in urticaria tissue were downregulated compared to normal skin. Numbers of c-Kit+, NGF-R TrkA+, GM-CSF+ and GM-CSF-R+ cells remained unchanged. However, IL-3 and TNF-( expression was upregulated on endothelial cells in lesional and non-lesional skin of urticaria.

These data show that numbers of resident MCTC are very low in human cutaneous scars suggesting massive mediator release from these cells after wounding. Instead, scar tissue is populated by a chymase-, avidin-, tryptase+, c-Kit+ MC subpopulation that is reflecting most probably an immigration and / or proliferation of immature MC and their precursors which might be promoted by SCF and TGF-beta, possibly also NGF via its receptors. Next to TGF-( and NGF, also SCF seems to play a role in wound healing. Our findings suggest different regulation patterns of MC increase in inflammatory conditions of the skin. After wounding, feedback mechanisms via growth factors (SCF, TGF-(, possibly NGF) and their receptors on MC could be operative, while in urticaria in accordance with data from the literature interactions between MC and endothelial cells appear to be essential.

Schlagwörter:
Schlagwörter

Fibrosierung, Chymase, Tryptase, Mastzellwachstumsfaktoren

Keywords:
Keywords

fibrosis, chymase, tryptase, mast cell growth factors


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Inhaltsverzeichnis

TitelseitePathogenetische Untersuchungen zur Ausbildung unterschiedlicher Phänotypen und zur Vermehrung humaner Mastzellen bei Wundheilung und Urtikaria
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
1 Zusammenfassung
2 Die Mastzelle
2.1Historie
2.2Entwicklung der Mastzelle
2.3Morphologie der Mastzelle
2.4Mediatoren
2.4.1Proteasen
2.4.1.1Tryptase
2.4.1.2Chymase
2.4.1.3MCT und MCTC
2.4.2Wachstumsfaktoren sowie Rezeptoren
2.4.2.1SCF und SCF-Rezeptor
2.4.2.2NGF und NGF-Rezeptoren
2.4.2.3GM-SCF und GM-CSF-Rezeptor
2.4.2.4TGF-beta und TGF-beta-Rezeptoren
2.4.2.5IL-3
2.4.3Zytokine
2.4.3.1TNF-alpha
2.4.4Chemokine
2.4.4.1IL-8
2.5Spezifische Funktionen der Mastzelle in ausgewählten Krankheitsmodellen
2.5.1Wundheilung / Fibrosierung und Mastzellen
2.5.2Urtikaria und Mastzellen
3 Fragestellungen
4 Untersuchungsmethoden
4.1Gewebe
4.2Immunhistochemie
4.3Enzymhistochemische sequentielle Doppelfärbung
4.4Immunfluoreszenzdoppelfärbung
4.5Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Mastzellproteasen
4.6Bestimmung der mitogenen Wirkung von Mastzellproteasen auf Fibroblasten und Keratinozyten
4.7Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion
4.8FACS-Analyse von Mastzellen
4.9Mikroskopische Auswertung
4.10Statistische Auswertung
5 Ergebnisse und Diskussion
5.1Mastzellen in Narbengewebe
5.1.1MCTC und MCT
5.1.2c-Kit-positive Mastzellen
5.1.3Pathophysiologische Bedeutung von Mastzellsubtypen in Narbengewebe
5.2MC-Proteasen in Narbengewebe
5.2.1Mitogene Wirkung der Mastzellproteasen auf Fibroblasten und Keratinozyten
5.3Mastzellwachstums- sowie chemotaktische Faktoren und Rezeptoren in humanem Narbengewebe
5.3.1SCF und SCF-Rezeptor
5.3.2NGF und NGF-Rezeptoren
5.3.3GM-SCF und GM-CSF-Rezeptor
5.3.4TGF-beta und TGF-beta-Rezeptoren
5.4Kutane Expression von Mastzellwachstums- sowie chemotaktischen Faktoren und Rezeptoren bei der Urtikaria
5.4.1SCF und SCF-Rezeptor
5.4.2NGF-Rezeptoren
5.4.3GM-SCF und GM-CSF-Rezeptor
5.5Kutane Expression proinflammatorischer Zytokine bei der Urtikaria
5.5.1IL-3
5.5.2TNF-alpha
5.5.3IL-8
6 Zusammenfassende Betrachtung
Bibliographie Literatur
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Monoklonale Antikörper für die APAAP-Färbungen
Tabelle 2: Monoklonale Antikörper für die Immunfluoreszenzdoppelfärbung
Tabelle 3: Chymase- und tryptasehaltige Mastzellen sowie c-Kit-positive Zellen in normaler Haut und Narbengewebe. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 0,0625 mm2 ± SD dar.
Tabelle 4: Anzahl der jeweils unterschiedlich gefärbten Mastzellen in normaler Haut (gesamte Dermis) im Vergleich zu Narbengewebe und Verhältnis von MCTC und MCT in Prozent. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW ± SD pro 0,0625 mm2 dar.
Tabelle 5: Immunreaktivität basaler Epidermiszellen mit den Antikörpern YB5.B8 gegen c-Kit und TA99 gegen Melanosomen. Zahlen entsprechen MW der markierten Zellen pro 0,0625 mm Epidermislänge ± SD.
Tabelle 6: : Densitometrische Analyse der Signalintensität von Banden einer RT-PCR mit DNA-Primern für Chymase, Tryptase und c-Kit. MW ± SD von N = 5, * p < 0,05 im Vergleich zu normaler Haut.
Tabelle 7: Durch Chymase und Tryptase erzielte maximale Hemmung der mitogenen Antwort von HaCaT-Keratinozyten auf Stimulation mit EGF und alpha-Thrombin. Die Werte für EGF und alpha-Thrombin wurden jeweils auf 100 gesetzt. Optimale Konzentrationen der Mastzellproteasen stehen in Klammern. Mittelwert von N = 3.
Tabelle 8: Immunhistochemische epidermale und dermale Expression der NGF-, GM-CSF- und TGF-beta-Rezeptoren in normaler Haut und Narbengewebe. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 6,25 nm Länge (Epidermis) bzw. pro 0,0625 mm2 (Dermis) ± SD dar. (- = nicht signifikant bei p > 0,05)
Tabelle 9: Densitometrische Analyse der RT-PCR-Signalintensität mit DNA-Primern für verschiedene Wachstumsfaktoren und ihre Rezeptoren. MW ± SD von N = 5 (# N = 6), * p < 0,01,
Tabelle 10: Nachweis des p75-NGF-R und des GM-CSF-R auf avidinpositiven Mastzellen in normaler Haut und Narbengewebe. Die Anzahl (N) der jeweils ausgezählten avidinpositiven Mastzellen steht in Klammern.
Tabelle 11: : Anzahl GM-CSF-R-positiver Zellen in frischen (le 35 Tage) und älteren Narben (> 35 - 369 Tage). Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 6,25 nm Länge (Epidermis) bzw. pro 0,0625 mm2 (Dermis) ± SD dar. * p < 0,026.
Tabelle 12: Immunhistochemische Expression von TGFbeta1 in normaler Haut versus Narbengewebe. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF ± SD dar.
Tabelle 13: FACS-Analyse von isolierten Mastzellen aus normaler Haut hinsichtlich der Expression der TGF-beta-Rezeptoren Typ I und Typ II. Angabe des Prozentsatzes der rezeptorpositiven Zellen in bezug auf die untersuchten Zellen.
Tabelle 14: Immunhistochemische epidermale und dermale Expression von SCF in normaler Haut und Urtikariabiopsien. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 6,25 nm Länge (Epidermis) bzw. pro 0,0625 mm2 (Dermis) ± SD dar (N = 5).
Tabelle 15: Immunhistochemische dermale Expression des NGF-R-p75 in normaler Haut und Urtikariabiopsien. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro 0,0625 mm2 ± SD dar (N = 5).
Tabelle 16: Endotheliale Zytokin-Immunreaktivität in Urticae nach Pricktestung und in kontralateraler normaler Haut sowie in normaler Haut und provozierter Quaddel eines Patienten mit Kälteurtikaria 30 min nach Eiswürfelapplikation. (In den 5 und 15 min nach Eiswürfelapplikation entnommenen Biopsien war noch keine Vermehrung der endothelialen Zytokinreaktivität vorhanden.)
Tabelle 17: Prozentsatz Tryptase-positiver Zellen, die gleichzeitig mit Zytokin-Antikörpern (anti-TNF-alpha, anti-IL-3, anti-IL-8) reagieren, in Biopsien normaler Haut und verschiedener Urtikariaformen. Pro Biopsie wurden jeweils 500-1200 Mastzellen in Serienschnitten ausgewertet.
Tabelle 18: Immunohistochemische Expression von TNF-alpha and IL-8 in der Epidermis normaler Haut sowie läsionaler und nicht-läsionaler Haut bei verschiedenen Urtikariaformen.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Darstellung der MCT (A) und MCTC (B) in normaler Haut mittels enzymhistochemischer sequentieller Doppelfärbung (jeweils x 100).
Abb. 2: Narbengewebe mit weitgehendem Fehlen von MCTC in der enzymhistochemischen Färbung (x 200)
Abb. 3: Chymase- und tryptasehaltige Mastzellen sowie c-Kit-positive Zellen in der Dermis von normaler Haut im Vergleich zu frischen und alten Narben. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW ± SD pro 0,0625 mm2 dar.
Abb. 4: Narbengewebe mit zahlreichen c-Kit-positiven Mastzellen (APAAP-Färbung mit dem c-Kit-Antikörper YB5.B8; x 100)
Abb. 5: Schwach angefärbte, blasse MCT in Narbengewebe (rechts im Bild) neben normalen MCT in der angrenzenden normalen Haut (links im Bild); enzymhistochemische Färbung, x 400.
Abb. 6: Proteaseaktivitäten in Gewebsextrakten aus normaler Haut und Narben jeweils derselben Patienten (mU/mg Protein). MW + SD; N = 7.
Abb. 7: Durch semiquantitative RT-PCR ermittelte mRNA-Expression von Chymase, Tryptase und c-Kit in Gewebsextrakten aus Narben und normaler Haut. Repräsentatives Beispiel von N = 5 Experimenten. 1 = Kontrolle ohne cDNA; 2 = normale Haut; 3 = Narbe.
Abb. 8: Dosisabhängiger Effekt von Chymase (a) und Tryptase (b) auf die Mitogenität von in 5 % FCS inkubierten 3T3-Fibroblasten allein oder nach Zugabe von EGF (5 ng/ml). MW ± SD; N = 3.
Abb. 9: : Maximale mitogene Antwort von subkonfluenten 3T3-Fibroblasten auf verschiedene Wachstumsfaktoren und Serinproteasen. Der durch 5% FCS erzielte mitogene Effekt wurde als 100 % definiert. MW ± SD; N = 3.
Abb. 10: Maximale mitogene Antwort von subkonfluenten HaCaT-Keratinozyten auf verschiedene Wachstumsfaktoren und Serinproteasen. Der durch 5% FCS erzielte mitogene Effekt wurde als 100 % definiert. MW ± SD; N = 3.
Abb. 11: Immunhistochemische Expression von SCF in normaler Haut (n.Haut) versus Narbengewebe. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF in der Epidermis sowie in der oberen (ob.), mittleren (m.) und unteren (u.) Dermis ± SD dar. Die Werte unterscheiden sich jeweils signifikant voneinander (Epidermis: p = 0,0007, obere Dermis: p = 0,001, mittlere Dermis: p = 0,0007, untere Dermis: p = 0,002).
Abb. 12: SCF-Reaktivität in normaler Haut (A) und in Narbengewebe (B). APAAP-Färbung mit anti-SCF, jeweils x 100.
Abb. 13: Immunfluoreszenzdoppelfärbung desselben Ausschnitts mit Avidin (A) und dem c-Kit-Antikörper YB5.B8 (B), normale Haut, x 1000.
Abb. 14: : Immunhistochemische Expression des NGF-R-p75 in normaler Haut [(A), x 200] und in Narbengewebe [(B), x 100]. APAAP-Färbung mit anti-NGF-R-p75.
Abb. 15: Durch semiquantitative RT-PCR ermittelte mRNA-Expression verschiedener Wachstumsfaktoren und ihrer Rezeptoren im Vergleich zu GAPDH in Gewebsextrakten aus Narben und normaler Haut. Repräsentatives Beispiel von N = 5 Narben mit einem Narbenalter von 23 - 56 Tagen. 1 = Kontrolle ohne cDNA; 2 = Narbe; 3 = normale Haut.
Abb. 16: Immunfluoreszenzdoppelfärbung desselben Ausschnitts mit Avidin (A) und anti-NGF-R-p75 (B), normale Haut, x 1000.
Abb. 17: Immunhistochemische Expression des GM-CSF-R in normaler Haut (A) und in Narbengewebe (B). APAAP-Färbung mit anti-GM-CSF-R, x 400.
Abb. 18: Immunfluoreszenzdoppelfärbung desselben Ausschnitts mit Avidin (A) und anti-GM-CSF-R (B), Narbengewebe, x 1000.
Abb. 19: Immunhistochemische Expression von SCF in normaler Haut. APAAP-Färbung mit anti-SCF, x 400.
Abb. 20: SCF-Reaktivität bei der AU (A) und bei der DU (B), jeweils läsionale Haut. APAAP-Färbung mit anti-SCF, x 400.
Abb. 21: Immunhistochemische Expression des NGF-R-p75 in normaler Haut (A) und in läsionaler Haut bei der DU. APAAP-Färbung mit anti-NGF-R-p75, x 400.
Abb. 22: Immunhistochemische TNF-alpha-, IL-3- und IL-8-Expression perivaskulärer Zellen in der oberen Dermis normaler Haut sowie läsionaler Haut von Urtikariapatienten. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF ± SD dar.
Abb. 23: Immunhistochemische TNF-alpha-, IL-3- und IL-8-Expression von Endothelzellen in der oberen Dermis normaler Haut sowie läsionaler (A) und nicht-läsionaler (B) Haut von Urtikariapatienten. Bei der DU wird neben der oberen Dermis (ob. D.) auch die untere Dermis (unt. D.) berücksichtigt. Die angegebenen Zellzahlen stellen MW pro HPF ± SD dar.

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Mon Sep 2 13:07:45 2002