II Gute Zellen, Schlechte Zellen: hämatopoetische Stammzellen, zirkulierende Tumorzellen und das Bemühen, die einen von den anderen zu trennen

1. Einführung: Transplantation hämatopoetischer Vorläuferzellen

Das Konzept der Transplantation hämatopoetischer Vorläuferzellen geht auf erste tierexperimentelle Untersuchungen in der Mitte des vorigen Jahrhunderts zurück (Jacobson et al., 1951), die zeigten, daß die Übertragung von Milzzellen oder Knochenmark syngener Spender auf Empfänger nach Ganzkörperbestrahlung deren Tod verhinderte. Allerdings war zu jenem Zeitpunkt die Grundlage dieses protektiven Effektes unklar; Jacobson (Jacobson, 1952) favorisierte hormonelle Faktoren. Die Transplantation hämatopoetischer Vorläuferzellen bei Patienten erfuhr bis zum Ende der 60er Jahre geringe Beachtung, zumal eine 1970 publizierte Metaanalyse ein eher entmutigendes Resümee zog. Der Durchbruch der heutigen Knochenmarktransplantation begann mit der Erkenntnis der Bedeutung der Histokompatibilitätstestung. Die erste erfolgreiche Knochenmarktransplantation unter Berücksichtigung der Kompatibilität der Zelloberflächenmerkmale von Spender und Empfänger wurde bei einem Kind mit schwerer kombinierter Immundefizienz durchgeführt (Good et al., 1969). Die Zahl durchgeführter Transplantationen stieg mit der Einführung der autologen Knochenmarktransplantation und der Erkenntnis, daß auch im peripheren Blut Vorläuferzellen nachgewiesen werden können: Durch subletale Schädigung des Knochenmarks im Rahmen einer Chemotherapie sind sie in der Erholungsphase des Knochenmarks vermehrt in der Peripherie nachweisbar, ferner kann eine Ausschwemmung hämatopoetischer Vorläuferzellen durch Gabe geeigneter Wachstumsfaktoren induziert werden. Die maschinelle Anreicherung zirkulierender Vorläuferzellen aus dem peripheren Blut verringerte nicht nur das mit der Knochenmarkpunktion verbundene Risiko, sondern erlaubte auch die Gewinnung erheblich größerer Zahlen von Vorläuferzellen. Die Fähigkeit peripherer Vorläuferzellen, eine Regeneration des Knochenmarks im Empfänger zu bewirken, unterscheidet sich von der der Vorläuferzellen des Knochenmarks in der Geschwindigkeit der Rekonstitution, in der Manipulierbarkeit der gewonnenen Zellfraktion sowie in der Qualität und Intensität der beobachteten Nebenwirkungen (Bennett et al., 1995;Faucher et al., 1994;Peters et al., 1993;Pettengell et al., 1993). Unklar ist jedoch, ob dies den in das periphere Blut mobilisierten Vorläuferzellen per se zuzuschreiben ist oder eher dem Einsatz hämatopoetischer Wachstumsfaktoren (Janssen et al., 1994).
Die Indikation zur Transplantation hämatopoetischer Vorläuferzellen soll nur prinzipiell skizziert werden. Die autologe Transplantation erlaubt eine Umgehung der mit den meisten zytostatisch [Seite 4↓]wirksamen Therapeutika zu erwartenden Hämatotoxizität, so daß eine Erhöhung der applizierten Dosis über diese Grenze hinaus möglich wird1. Voraussetzung ist die Sensitivität der jeweiligen Erkrankung gegenüber den verwendeten Therapeutika und eine mit der Dosis steigende Wirksamkeit gegenüber der malignen Erkrankung. Bei der allogenen Transplantation wird über den Aspekt der direkten Toxizität hinaus erwartet, das hämatopoetische System des Empfängers durch ein gesundes allogenes Transplantat weitgehend zu ersetzen, so daß schon auf der frühestmöglichen Ebene eine Zerstörung potentiell oder nachweislich aberranter klonogener Zellen erfolgen kann. Ferner wird erhofft, daß das Transplantat eine Abwehrfähigkeit gegen bösartige Zellklone über spezifische Erkennung dieser entwickelt, welche dem Empfänger aus verschiedenen Gründen versagt war (sog. GvL- (Graft versus Leukemia)-Effekt).

Folgende Ziele der Transplantation hämatopoetischer Vorläuferzellen lassen sich zusammenfassen:


Aus Sicht des Patienten formulierte Ziele, welche sich aus den obigen teilweise ergeben, sind eine höhere kurative Chance bzw. ein verlängertes ereignisfreies Überleben, verbunden mit einer höheren Lebensqualität als unter anderen, nicht die Transplantation von Vorläuferzellen einschließenden Therapiemodalitäten.
Die Probleme der Hochdosistherapie in Kombination mit einer Knochenmark- oder Stammzelltransplantation sind vielfältiger Natur: Sie betreffen die Infektionskontrolle unter der Therapie, die therapieassoziierte Toxizität einschließlich der Gefahr sekundärer Neoplasien, das Transplantatversagen ebenso wie eine überschießende Immunantwort des Transplantats gegen den Wirt bis hin zur immer noch oft tödlich verlaufenden akuten Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion (GvHD, Graft versus Host Disease), ferner gesundheitsökonomische Aspekte und das Problem der Langzeitrehabilitation. Diese zu diskutieren ist nicht das Thema der vorliegenden [Seite 5↓]Arbeit. Ich werde mich auf den Aspekt der Identifizierung und Eliminierung potentiell schädlicher Zellen aus den zu transplantierenden Vorläuferzellen konzentrieren und mich mit den dabei verwendeten Modellen der Vorläuferzellen und der zu eliminierenden Zellen beschäftigen.

2. Das Problem der Quantifizierung der Vorläuferzellen

Das Konzept der Transplantation hämatopoetischer Vorläuferzellen basiert auf einem Modell, das sich in der Praxis der Hochdosistherapie bewährt hat: Pluripotente Vorläuferzellen des blutbildenden Systems können bei einem Spender oder beim Patienten selbst gewonnen und auf einen Empfänger übertragen werden; sie siedeln sich nach Infusion im Knochenmark an und tragen durch Teilung und fortschreitende Differenzierung zur Rekonstitution der Blutbildung bei. Bis heute ist es jedoch weder möglich, die eigentliche Vorläuferzelle dieses Modells zu charakterisieren, noch genau zu sagen, wie viele dieser Vorläuferzellen mindestens benötigt werden, um in einer für den Empfänger vertretbaren Zeit eine funktionsfähige Hämatopoese nach Myeloablation zu erzielen. Lediglich aus tierexperimentellen Untersuchungen mit Titration der transplantierten Zellen sind Annäherungen bekannt. Es sind daher Operationalisierungen vorgeschlagen worden, die mit hoher Wahrscheinlichkeit ein „Engraftment“, also eine dauerhafte Regeneration des peripheren Blutbildes, erwarten lassen. Ursprünglich wurden die im Transplantat enthaltenen mononukleären Zellen gezählt und eine Zielgröße von 1-3x108 mononukleärer Zellen je Kilogramm des Empfängergewichts angestrebt. Ein in vitro-Modell, in welchem Vorläuferzellen zu Kolonien („colony-forming units“, CFU) von erythroiden oder granulozytär-monozytären Zellen des Blutes expandieren und differenzieren, erlaubt eine qualitative Aussage über die Wachstums- und Teilungsfähigkeit der gewonnenen Vorläuferzellen. Eine Quantifizierung der Kolonien als alleinige Methode zur Abschätzung der Zahl von Vorläuferzellen im Transplantat wird angesichts der in multizentrischen Studien belegten geringen Verläßlichkeit mittlerweile nur in wenigen Zentren akzeptiert (Serke et al., 1998).
Als Standardmethode gilt die durchflußzytometrische Bestimmung der Zahl von Zellen innerhalb des gewonnenen Transplantates, welche das Oberflächenantigen CD34 tragen (Krause et al., 1996). CD34 ist ein membranständiges Antigen, das auf hämatopoetischen Vorläuferzellen, ferner auf Endothelzellen kleinerer Gefäße (Fina et al., 1990;Krause et al., 1996) und embryonalen Fibroblasten (Brown et al., 1991) nachgewiesen werden kann. Die höchste Antigendichte von CD34 ist auf frühen Vorläuferzellen beschrieben worden, nimmt aber mit fortschreitender Differenzierung der Zellen ab (Civin et al., 1987). Vollständig differenzierte Zellen des Blutes sind CD34-negativ. Die stark CD34-positiven Zellen sind in Größe und Morphologie Lymphozyten vergleichbar und wachsen in vitro in Kolonien vielfältigster [Seite 6↓]hämatopoetischer Differenzierung aus (DiGiusto et al., 1994;Murray et al., 1995). Die eher willkürliche Unterscheidung nach stärkerer oder schwächerer Expression des CD34-Antigens hat dazu geführt, daß weitere Antigene hinzugezogen wurden, um möglichst frühe Vorläuferzellen charakterisieren zu können. Als Konsensus gilt derzeit, daß die frühesten charakterisierbaren Vorläuferzellen des Blutes folgende Antigenkombination tragen: CD34stark pos. , CD38 schwach bis neg. , HLA-DR schwach bis neg. , CD90pos. , CD117pos. , Rhodamin123schwach pos., bei Fehlen weiterer linienspezifischer Antigene (Baum et al., 1992;Fritsch et al., 1993;Olweus et al., 1996;Recktenwald und Waller, 1996). Die Transplantation von 2 Mio. CD34-positiven Zellen je Kilogramm des Körpergewichtes im autologen Bereich bzw. 4 Mio. CD34-positiven Zellen bei der allogenen Transplantation werden weitgehend als für die Regeneration erforderliche Mindestdosis akzeptiert. Diese Zahl muß jedoch als operationale Größe verstanden werden, da die eigentlichen Vorläuferzellen hinsichtlich ihrer Oberflächenantigene bis heute nicht charakterisiert sind. Im Gegenteil: jüngste Untersuchungen beim Hund belegen in ähnlicher Weise wie zuvor bei der Maus die Existenz einer Population ruhender, fibroblastenähnlicher Vorläuferzellen des Blutes, welche nicht das CD34-Antigen tragen (Ema et al., 2000;Huss et al., 2000). Diese Zellen beginnen erst mit Eintritt in den Zellzyklus, CD34 an ihrer Oberfläche zu exprimieren.
Das Modell der Ausdifferenzierung aller Blutzellen aus Vorläuferzellen, welche schließlich auf eine gemeinsame pluripotente Vorläuferzelle zurückgehen, läßt sich am Wechsel des Phänotyps, also der Expression verschiedener Antigene an der Zelloberfläche im Zuge der Differenzierung, kohärent nachvollziehen. Es wird angenommen, daß die Änderung des Phänotyps der CD34-negativen Vorläuferzelle zu einem CD34-positiven Phänotyp ebenfalls einen Differenzierungsschritt darstellt, der mit Verminderung der Pluripotenz und der langfristigen Überlebensfähigkeit der Zelle einhergehen könnte (Dao und Nolta, 2000). Beim jetzigen Wissensstand hat sich dennoch die Quantifizierung CD34-positiver Zellen zur Abschätzung der Eignung des Stammzellasservates für die Transplantation bewährt. Ferner ist vorstellbar, daß bei einer ausreichenden Zahl CD34-positiver Zellen eine genügende Anzahl eigentlicher (CD34-negativer?) Vorläuferzellen im gewonnenen Transplantat enthalten ist, um eine erfolgreiche Regeneration des peripheren Blutbildes zu gewährleisten.

3. Das Problem potentiell schädlicher Zellen im Stammzelltransplantat

Die CD34-positiven Zellen, mit deren Hilfe die Wahrscheinlichkeit einer Regeneration des peripheren Blutbildes in adäquater Zeit befriedigend vorhergesagt werden kann, machen nur einen geringen Anteil der im Transplantat enthaltenen Zellen aus. Die Gesamtzahl umfaßt auch Zellpopulationen, die in der allogenen Transplantation in verschiedener Hinsicht, zum Beispiel [Seite 7↓]durch Expansion im Rahmen einer Immunantwort gegen den Empfänger, eine schwere Schädigung des Wirtes nach sich ziehen können. Zum Teil kann das Risiko derartiger Komplikationen durch Auswahl eines geeigneten Spenders vermindert werden, zum Teil nur durch Entfernung der betreffenden Zellen aus dem Transplantat. So kann bei Inkompatibilität der AB0-Blutgruppenmerkmale zwischen Spender und Empfänger durch Aufbereitung des Transplantates unter Entfernung der Erythrozyten oder des Plasmas und Versorgung des Empfängers mit AB0-kompatiblen Blutprodukten die Gefahr einer klinisch relevanten Hämolyse vermindert werden. Die HLA-Kompatibilität von Spender und Empfänger macht eine schwere Abstoßungsreaktion zwar weniger wahrscheinlich, schließt sie jedoch nicht aus (Bortin, 1970). Es liegt nahe, das HLA-System als Repräsentanz der Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger zu verstehen, welche sich im klinischen Einsatz bewährt hat. An diesem Beispiel wird jedoch zugleich deutlich, daß theoretisch bessere Modelle für die Kompatibilität durchaus vorstellbar sind. So könnte die Kenntnis weiterer Faktoren, die eine bessere Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger definieren, eine Transplantation weniger riskant gestalten oder im Idealfall die derzeit erforderlichen Methoden der Immunsuppression oder Myeloablation entbehrlich machen.
Probleme der Inkompatibilität sind bei der autologen Transplantation bis auf Berichte von anekdotenhaftem Charakter nicht bekannt. Hier tritt jedoch mit der zu behandelnden Grunderkrankung ein Problem auf, welches im Folgenden ausgeführt werden soll: die Existenz zirkulierender Tumorzellen im Blut des Patienten.
Die Metastasierung maligner Tumoren in entfernte Organe ist mit dem Modell der hämatogenen Aussaat erklärbar: Zellen des Primärtumors gelangen in die Blutbahn, können in Kapillarnetzen entfernt gelegener Organe durch Adhäsionsprozesse oder Embolisierung der Zirkulation entweichen und durch Implantation und Ausbildung eines eigenen Blutgefäßnetzes zu Metastasen in dem befallenen Organ expandieren. Als Besiedelung des Knochenmarks ist die hämatogene Metastasierung bei zahlreichen soliden Tumoren wie auch bei malignen hämatologischen Erkrankungen Teil der Diagnostik zur Stadieneinteilung der Tumorausbreitung. Bei hämatologischen Erkrankungen ermöglicht der Nachweis maligner Zellen im peripheren Blut eine Diagnose, eine prognostische Einschätzung und, zum Beispiel bei der chronischen myeloischen Leukämie, eine Entscheidung über Art und Intensität der erforderlichen Therapie.
Zahlreiche Studien liegen mittlerweile zum Charakter der in Blut oder Knochenmark nachgewiesenen Tumorzellen vor (Pantel et al., 1999). So wird im Fall des Mammakarzinoms vermutet, daß zumindest manche der im Knochenmark lokalisierten Zellen über Jahre hinweg in einer Latenzphase ruhen, zu einem nicht vorhersagbaren Zeitpunkt jedoch wieder in den Zellzyklus eintreten und expandieren könnten (Pantel et al., 1999). Darüber hinaus scheinen im Zuge der Stammzellmobilisierung unter Gabe hämatopoetischer Wachstumsfaktoren auch [Seite 8↓]Tumorzellen in das periphere Blut mobilisiert und mit der Stammzellapherese angereichert zu werden (Brugger et al., 1994). Der Vergleich mit ruhenden oder mobilisierten Vorläuferzellen der Hämatopoese liegt nahe.
Am Beispiel des Mammakarzinoms und der Keimzelltumoren soll folgenden Fragen nachgegangen werden:

  1. Wie lassen sich Tumorzellen in Blut oder Knochenmark - und somit in für die Hochdosistherapie gewonnenen Transplantaten - diagnostizieren und quantifizieren?
  2. Ist der Nachweis von Tumorzellen von Relevanz für den Patienten?
  3. Im Kontext der Hochdosistherapie stellt sich die Frage, ob die Tumorzellen von Bedeutung für den Verlauf der Transplantation sind und gegebenenfalls entfernt werden müßten.

4. Nachweis zirkulierender Tumorzellen: Methodik

Grundsätzlich lassen sich Tumorzellen im Blut über Eigenschaften identifizieren, die herkömmlichen Zellen des Blutes fehlen. Der Nachweis solcher Merkmale hat Modellcharakter für die Präsenz von Tumorzellen im Blut oder Knochenmark, solange die Spezifität der Methode und die Kenntnis der untersuchten Eigenschaft falsch positive Ergebnisse ausschließen. Sinkt die Spezifität einer Methode aufgrund neuer Beobachtungen, wird ihre Eignung zur Tumorzelldetektion fraglich, wie geschehen bei der t(14;18)-Translokation als Beleg für die Präsenz von B-Zell-Lymphomzellen im peripheren Blut (Aster et al., 1992;Limpens et al., 1991). Bei Eingrenzung auf das periphere Blut oder Knochenmark als dem Bezugssystem der Methode können jedoch Eigenschaften bzw. Moleküle der zu detektierenden Zellen als geeignet akzeptiert werden, die in Bezug auf andere Organe aufgrund mangelnder Spezifität nicht für den Nachweis von Tumorzellen in Frage kämen.
Ersten Arbeiten über Karzinomzellen im Knochenmark zufolge galt die Expression von Zytokeratinfilamenten als charakteristisch für epitheliale Zellen und somit als geeignet zum Nachweis nichthämatopoetischer Zellen im Knochenmark. Abgesehen von möglichen Störquellen wie unter der Punktion eingeschleppter epithelialer Zellen kann mit Berechtigung angenommen werden, daß Cytokeratin-positive Zellen im Blut oder im Knochenmark epithelialen Ursprungs und möglicherweise Tumorzellen sind. Gestützt wird diese Annahme zum einen durch Untersuchungen an Blut- und Knochenmarkproben gesunder Spender, die mittlerweile in zahlreichen Studien verschiedener Zentren durchweg negativ ausfielen, zum anderen durch Wachstum von Kolonien Cytokeratin-positiver Zellen aus immunzytochemisch positiv befundeten Blut- und Knochenmarkproben in vitro. Ein Vorteil der immunzytochemischen Färbung Cytokeratin-positiver Zellen ist deren Quantifizierbarkeit, was Verlaufsuntersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten unter der Therapie ermöglicht. Diesem Vorteil stehen ein hoher [Seite 9↓]zeitlicher, finanzieller und personeller Aufwand gegenüber, denn die Sensitivität der Methode wird durch die Zahl der untersuchten Zytozentrifugenpräparate bestimmt (Franklin et al., 1996).
Molekularbiologische Methoden wie die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) erscheinen diesbezüglich vorteilhafter: Die Auswertung der Befunde ist schneller und einfacher, es können größere Probenzahlen gleichzeitig untersucht werden, und das Testresultat (positiv/negativ) gilt als besser objektivierbar. Eine quantitative Aussage ist jedoch, zumindest bei der „klassischen“ PCR-Methode, nicht möglich2. Die Nutzung der PCR zum Nachweis tumorspezifischer genomischer DNA-Sequenzen ist oftmals durch mangelnde Spezifität, relativ geringe Sensitivität und technische Probleme begrenzt, zumal in Frage kommende Genabschnitte eine erhebliche Größe erreichen. Eine Ausnahme stellen jedoch tumorspezifische Chromosomentranslokationen oder physiologische Genrearrangements einer monoklonal expandierten Zellpopulation dar. Wenn die Nachweismethode zwar bei manchen Erkrankungen auf patientenspezifische DNA-Sequenzen abgestimmt werden muß, ist eine höhere Spezifität der Methode durch diese Zielsequenz gewährleistet, welche – wie bei der CML oder den Tumoren der Ewing-Familie - durchaus von pathophysiologischer Bedeutung für die Erkrankung sein kann oder zumindest charakteristisch für eine monoklonal expandierende Zellpopulation ist.
Die Kombination von reverser Transkription und anschließender Amplifiaktion der von einer bestimmten Gensequenz transkribierten RNA (RT-PCR) hat sich als Methode zum Nachweis von Tumorzellen häufiger bewährt. Zielsequenz ist eine tumorspezifisch (oder für die normale Hämatopoese atypisch) exprimierte RNA-Sequenz. Problematisch ist hier eher eine mangelnde Spezifität, da für verschiedene als tumorspezifisch erachtete RNA-Sequenzen bei Ausreizung der Sensitivität falsch positive Ergebnisse, offenbar durch minimale basale Expression, beobachtet wurden(Bostick et al., 1998). Transkripte tumorspezifischer Translokationen sind nicht immer von diesem Problem ausgeschlossen.


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5. Spezifischer Nachweis von Mammakarzinom- und Hodentumorzellen im Blut

Bei unserer Suche nach einem spezifisch exprimierten Molekül zum Nachweis von Mammakarzinomzellen im peripheren Blut erwies sich, nach Prüfung anderer in Frage kommender Transkripte, der Rezeptor für den Epithelialen Wachstumsfaktor (Epithelial Growth Factor Receptor, EGF-R) als sensitiv und spezifisch (Hildebrandt et al., 1997). Gleichzeitig erwies sich in unseren Untersuchungen die andernorts propagierte RT-PCR auf die für Cytokeratin 19 (CK 19) kodierende mRNA für die Detektion von Tumorzellen als ungeeignet; falsch positive Ergebnisse waren am ehesten durch Pseudogene zu erklären, welche vermutlich durch virale reverse Transkription und Reinsertion in das Genom entstanden sind. Mindestens fünf solcher Pseudogene sind für CK 19 bekannt (Ruud et al., 1999).
Aufgrund der bekannten Expression des EGF-R in Zellen des Knochenmarksstromas (Satomura et al., 1998) kam eine Verwendung für die Detektion von Karzinomzellen im Knochenmark nicht in Frage. Diese Begrenzung der Eignung war jedoch für unsere Fragestellung, die Detektion der Tumorzellkontamination in Stammzellasservaten des peripheren Blutes, nicht relevant. Ein möglicher Vorteil der für den EGF-R kodierenden mRNA als Zielsequenz lag in der Assoziation einer vermehrten Expression des Rezeptors mit einem negativen Östrogenrezeptorstatus des Tumors und einem ungünstigen klinischen Verlauf (Newby et al., 1995), was die Möglichkeit nahelegte, mit EGF-Rezeptor-positiven Zellen eine klinisch relevante Subpopulation von Tumorzellen zu detektieren. Ein Patent für die von uns entwickelte Methode wurde 1997 angemeldet (Hildebrandt und Mapara, 1997).
Hinsichtlich der Detektion von Tumorzellen im peripheren Blut konzentrierten sich die Bemühungen der meisten Arbeitsgruppen auf die Erkrankungen, die das Gros der Indikationen für die Hochdosistherapie stellen und, angesichts ihres systemischen Charakters oder ihres Metastasierungsmusters, die Präsenz oder eine klinische Relevanz zirkulierender Tumorzellen erwarten lassen. Beispiele für derartige Erkrankungen sind das Neuroblastom (Bensinger et al., 1990;Brenner et al., 1993;Civin et al., 1996), das Mammakarzinom (Cote et al., 1999;Cote et al., 1991;Mansi et al., 1987;Ross et al., 1993) und Lymphome (Bensinger et al., 1990;Gribben et al., 1991;Pettengell et al., 1993). Hingegen war der Aspekt zirkulierender Tumorzellen im Blut bei Patienten mit Keimzelltumoren bisher nicht thematisiert worden. Diese Tatsache ist vermutlich durch den geringen Anteil bedingt, den diese Entität an der Gesamtzahl autologer Transplantationen ausmacht, denn die Indikation für die Hochdosistherapie kann derzeit nur für relativ kleine, definierte Untergruppen von Patienten mit fortgeschrittenem oder rezidiviertem Keimzelltumor als gesichert angesehen werden (Bosl, 1993).
Ziel unserer ersten Studie zu diesem Thema war, Techniken für die sensitive Detektion von [Seite 11↓]Keimzelltumorzellen im peripheren Blut und in Stammzellasservaten zu etablieren. Hierfür wurden Zellen geeigneter Tumorzellinien in mononukleäre Zellen des Blutes in Titration eingesät („Spiking“), eine von uns auch beim Mammakarzinom genutzte Methode, um etablierte und neue Methoden bzw. Sequenzen auf ihre Sensitivität hin vergleichend zu untersuchen. In diesem Fall verglichen wir die klassische Methode immunzytochemischer Detektion mit der RT-PCR.
Die immunzytochemische Methode erlaubte eine Detektion von einer Tumorzelle in 105 mononukleären Zellen; dies entsprach der schon zuvor beim Mammakarzinom beobachteten Sensitivität. Bei der Suche nach geeigneten Sequenzen für die RT-PCR war der zuvor etablierte Nachweis der EGF-R mRNA (Hildebrandt et al., 1997) aufgrund geringer Sensitivität nicht geeignet. Eine andere Zielsequenz, die Keimzell-Alkalische Phosphatase (Germ cell alkaline phosphatase, GCAP) erwies sich wiederum als überaus sensitiv; obendrein war die Spezifität des Nachweises durch die Methode der RT-PCR gewährleistet, da nur auf der RNA-Ebene eine Differenzierung zwischen der Tumorzell-assoziierten GCAP und der in der Proteinsequenz nahezu identischen, aber auch in der normalen Hämatopoese exprimierten Plazentaren Alkalischen Phosphatase (PLAP) möglich war. Ein monoklonaler Antikörper, der zwischen diesen Isoformen der Alkalischen Phosphatase unterscheiden könnte, ist derzeit nicht bekannt.
Die Sensitivität der RT-PCR auf GCAP unterschied sich je nach verwendeter Zellinie deutlich: einer Sensitivität von 1:104 in einer Linie stand eine Sensitivität von über 1:106 in einer anderen Linie gegenüber. Dies reflektiert möglicherweise ein in vivo ähnlich beobachtetes Phänomen: Schär et al. (Schär et al., 1997) zeigten, daß der Grad der GCAP-Expression je nach Grad der Differenzierung des Primärtumors schwankte – ein eventueller Nachteil für die Tumorzelldetektion im Blut bzw. im Stammzellasservat, da somit mögliche intra- und interindividuelle Schwankungen der Sensitivität unserer Methode nicht auszuschließen waren. Dennoch erlaubte die Kombination zweier Methoden, die immunzytochemische Detektion Cytokeratin-positiver Zellen und der Nachweis der GCAP mRNA mittels der RT-PCR, die Vorteile beider Methoden zu vereinen und die Wahrscheinlichkeit der Detektion von Tumorzellen zu erhöhen: Die teilweise überlegene, aber schwankende Sensitivität der RT-PCR mit der etwas geringeren, aber stabilen Sensitivität eines vielfach erprobten und validierten Verfahrens.
Bei der Untersuchung von Patientenproben zeigte sich bei der RT-PCR auf die für GCAP kodierende mRNA eine höhere Sensitivität als bei der immunzytochemischen Färbung Cytokeratin-positiver Zellen (Hildebrandt et al., 1998). Dennoch waren in Proben mancher Patienten Cytokeratin-positive Zellen bei negativem Resultat der RT-PCR feststellbar: möglicherweise war hier das oben beschriebene Phänomen niedriger mRNA-Expression Ursache des negativen PCR-Befundes, so daß in diesen Fällen die immunzytochemische Färbung bezüglich der Sensitivität überlegen war. Die von uns beschriebene Rate kontaminierter Stammzellasservate (etwa 30%) war mit Ergebnissen einer anderen, im selben Jahr publizierten [Seite 12↓]Untersuchung vergleichbar, welche zum Nachweis der Tumorzellen im Blut eine RT-PCR auf die für β-HCG kodierende mRNA etabliert hatte (Fan et al., 1998).
Festzuhalten ist, daß mit Hilfe immunzytochemischer und molekularbiologischer Methoden Zellen oder Transkripte in Blutproben detektiert werden können, die – bei geeigneter Zielsequenz bzw. Antigen - bei gesunden Spendern nicht, bei Patienten mit malignen Tumoren jedoch in einem erheblichen Prozentsatz nachweisbar sind und als Indiz für die Präsenz von Tumorzellen im Blut betrachtet werden können. Voraussetzung für die Nutzung der Zielsequenz bzw. des Antigens ist, daß vorliegende experimentelle Daten die Eignung zur Tumorzelldetektion stützen, zum Beispiel anhand von Befunden an Tumorzellinien, ferner daß Vergleichsproben gesunder Spender und Zellinien hämatopoetischen Ursprungs obligat negativ für die Zielsequenz oder das Antigen sind. Für die Detektion von Zellen des Mammakarzinoms etablierten wir auf diesem Weg eine RT-PCR-Methode zum Nachweis der EGF-R mRNA, für die Keimzelltumoren eine RT-PCR-Methode für die GCAP mRNA. In beiden Tumorarten wurden vergleichende Untersuchungen mit immunzytochemischer Färbung auf Cytokeratin durchgeführt.
Es muß jedoch betont werden, daß positive Befunde mit den genannten Methoden in keinem Fall eindeutige Beweise für das Vorhandensein maligner Zellen, sondern höchstens für Zellen nicht hämatopoetischen Ursprungs sind. Ferner ist unklar, ob diese Zellen an der hämatogenen Aussaat des Tumors beteiligt sind und somit eine Bedrohung für den Patienten darstellen. Das Wachstum von Tumorzellen aus dem peripheren Blut in vitro (Brugger et al., 1994;Putz et al., 1999) kann als Beleg für die Vitalität und Expansionsfähigkeit der Tumorzellen betrachtet werden, ist jedoch den immunzytochemischen Methoden und der RT-PCR an Sensitivität unterlegen und belegt nicht den möglichen invasiven Charakter der Tumorzellen. Ein Beleg mit größerer Tragfähigkeit bezüglich der Relevanz residualer Tumorzellen wurde von der Arbeitsgruppe um K. Pantel (Scheunemann et al., 1999) erbracht: Einzelne Zytokeratin-positive Zellen in einem ansonsten histopathologisch unauffälligen Lymphknoten eines Patienten mit Ösophaguskarzinom führten nach subkutaner Injektion bei SCID-Mäusen zum Wachstum von Tumoren.


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6. Nachweis von Tumorzellen in Transplantaten: klinische Relevanz

Methoden zum Nachweis von Tumorzellen sollen helfen, die prognostische Bedeutung zirkulierender Tumorzellen zu beurteilen, ferner zu prüfen, ob Methoden zur Eliminierung solcher Zellen erfolgreich eingesetzt wurden. Die zugrundeliegenden Hypothesen sind folgende:

Anders als bei minimaler residualer Tumorerkrankung im Knochenmark (Braun et al., 2000;Diel et al., 1996) oder in peripheren Lymphknoten (Izbicki et al., 1997;Scheunemann et al., 1999) ist bei Karzinomen die klinische Relevanz von Tumorzellen im Blut erst kürzlich erstmals belegt worden (Cote et al., 1999). Für Karzinomzellen in Stammzellasservaten im Rahmen der Hochdosistherapie kommt zu dem diagnostisch-prognostischen Aspekt die von Tumorzellen möglicherweise ausgehende Rezidivgefahr nach Transfusion hinzu. Bei Patienten mit follikulärem Lymphom und nachgewiesener t(14;18)-Translokation unter den Zellen des transplantierten Stammzellasservates war die Rezidivwahrscheinlichkeit höher als bei Patienten mit t(14;18)-negativen Asservaten (Gribben et al., 1991). Offen bleibt jedoch selbst bei dieser aufschlussreichen klinischen Studie, ob den Tumorzellen selbst pathologische Bedeutung zukommt oder ob sie nur Ausdruck fortgeschrittener Erkrankung sind. Die weitestreichenden, letztlich aber nicht beweisenden Untersuchungen zur klinischen Relevanz von malignen Zellen in transplantierten Asservaten (Brenner et al., 1993;Deisseroth et al., 1994;Rill et al., 1994) zeigten bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, Neuroblastom oder chronisch-myeloischer Leukämie, als Beleg für einen Beitrag von Tumorzellen im Asservat zu Rezidiven, genmarkierte Zellen des Asservats an Orten eines Rezidivs nach Hochdosistherapie, allerdings neben nichtmarkierten Zellen.
Einen Beleg für die prognostische Bedeutung von Tumorzellen im Asservat konnten wir bei Patienten mit Keimzelltumoren nach Hochdosistherapie erbringen, worauf im folgenden eingegangen werden soll.


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7. Klinische Relevanz bei Patienten mit Hodentumoren

An sich ist die Geschichte der Therapie der Keimzelltumoren ein Beispiel für eine stadiengerechte multimodale Therapie, deren Erfolg auf der Einführung einer geeigneten zytostatischen Therapie basiert (Bosl und Motzer, 1997). Selbst die Patienten, die nicht genügend auf die konventionelle Therapie ansprechen, können in erheblichem Anteil von Hochdosis-Therapieansätzen profitieren, unter Zuhilfenahme von zuvor gesammelten Knochenmark- oder Stammzellasservaten (Bajorin et al., 1988;Beyer et al., 1994). Welche Bedeutung haben die in Stammzellasservaten nachgewiesenen Tumorzellen?
Wir untersuchten die Beziehung zwischen dem Nachweis von Tumorzellen im Asservat und dem ereignisfreien bzw. Gesamtüberleben nach Hochdosis-Chemotherapie im Vergleich zu etablierten prognostischen Faktoren (Hildebrandt et al., 2000). 57 Patienten wurden in klinische Therapieprotokolle eingeschlossen, welche eine konventionell dosierte Chemotherapie, gefolgt von Hochdosistherapie, beinhalteten (Beyer et al., 1996). Bei allen Patienten war zuvor entweder eine Progredienz des Keimzelltumors unter bzw. ein Rezidiv nach cis-platin-haltiger Chemotherapie diagnostiziert worden. Als konventionelle Therapie vor Hochdosistherapie wurden Paclitaxel und Ifosfamid (TI), gefolgt von Paclitaxel, Ifosfamid und Cisplatin (TIP, n=44), Cisplatin, Etoposid und Ifosfamid (PEI, n=12) oder Cisplatin, Ifosfamid und Vinblastin (VIP, n=1) verwendet. Sechs der ursprünglich 57 Patienten erhielten wegen massiver Progredienz des Tumors (n=4) oder wegen reduzierter Nierenfunktion (n=2) keine Hochdosistherapie.
Die Stammzellapheresen wurden nach dem ersten Zyklus der Chemotherapie unter Gabe von hämopoetischen Wachstumsfaktoren (G-CSF 5-10 µg/kg/d s.c.) durchgeführt. Eine Probe vom ersten bzw. einzigen gewonnenen Aphereseprodukt wurde auf Tumorzellkontamination untersucht. Hierbei wurden aus frischen, d.h. nicht kryokonservierten Proben Zytozentrifugenpräparate für die immunzytochemische Färbung und aus kryokonservierten Proben RNA-Präparationen für die RT-PCR hergestellt.
Insgesamt wurden 42/57 Proben mittels der immunzytochemischen Methode auf Cytokeratin-positive Zellen untersucht, 48/57 Proben mittels der RT-PCR auf GCAP-Transkripte und 33 Proben mit beiden Techniken. 16/57 Proben (28%) wiesen einen entweder immunzytochemisch, RT-PCR-gestützt oder in beiden Techniken positiven Befund auf. Für 51 Patienten, die letztlich mit der Hochdosistherapie behandelt wurden, ergab sich folgende Verteilung: 13/42 Proben (29%) positiv in der RT-PCR auf GCAP, und 4/37 Proben (11%) positiv in der immunzytochemischen Färbung.


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Patienten- und Tumorcharakteristika wie Tumorlokalisation und Metastasierungsmuster zu Studienbeginn (n=57) und unmittelbar vor Hochdosistherapie (n=51) zeigten zunächst keinen Zusammenhang mit der Präsenz von Tumorzellen in den Asservaten. Auch die Zuordnung zu prognostischen Gruppen anhand klinischer Risikofaktoren (Beyer et al., 1996) erbrachte keinen Unterschied in der Verteilung Tumorzell-positiver Asservate zwischen diesen klinisch definierten Gruppen (vgl. Tabellen 1 und 2, Seite 73 dieser Schrift).
Mit Kaplan-Meier-Analysen (Kaplan und Meier, 1958) analysierten wir das Gesamtüberleben und das ereignisfreie Überleben der in die Studie eingeschlossenen Patienten (vgl. Abb. 1A-D, Seite 75 dieser Schrift). Die Überlebensrate für alle 57 Patienten betrug 1 Jahr nach Studienbeginn 64% (Gesamtüberleben) und 38% (ereignisfreies Überleben). Unter den 16 Patienten, deren Asservate mit mindestens einer der beiden Methoden positiv auf Tumorzellkontamination reagierten, lagen diese Zahlen nach einem Jahr bei 43% (Gesamtüberleben) und 0% (ereignisfreies Überleben). Diesen Zahlen standen ein Gesamtüberleben von 71% und ein ereignisfreies Überleben von 52% nach einem Jahr bei Patienten mit negativ getesteten Asservaten gegenüber. Ähnliche Zahlen fanden sich bei Analyse nur derjeniger Patienten, welche tatsächlich der Hochdosistherapie unterzogen wurden. Beide zur Tumorzelldetektion eingesetzten Methoden waren auch allein betrachtet in der Lage, Patienten mit verkürztem ereignisfreien Überleben nach Hochdosistherapie zu identifizieren. Patienten, deren Asservate in der RT-PCR positiv getestet worden waren, zeigten in keinem Fall ein ereignisfreies Überleben über 6 Monate hinaus, gegenüber 51% der Patienten mit negativ getesteten Asservaten (p=0,012). Bei alleiniger Auswertung der immunzytochemisch untersuchten Asservate zeigten sich ähnliche Überlebensraten (0% bei Tumorzelldetektion vs. 50% bei negativ getesteten Asservaten; p=0,008).
Der Nachweis von Tumorzellen im Asservat korrelierte ebenfalls mit dem Ansprechen auf die Hochdosistherapie. 32 der 51 Patienten, die der Hochdosistherapie unterzogen worden waren, erzielten mindestens eine markernegative partielle Remission (63%). Von diesen erlitten im weiteren Verlauf 14 (44%) ein Rezidiv. Fünf dieser vierzehn Patienten (36%) hatten Asservate erhalten, die positiv auf Tumorzellkontamination waren, gegenüber zwei von achtzehn Patienten ohne ein Rezidiv nach Hochdosistherapie (11%, p=0,035). Die Überlebensanalyse zeigte ein verkürztes ereignisfreies und Gesamtüberleben nach Hochdosistherapie für die Patienten, die zwar mit einer mindestens markernegativen Remission gut auf die Hochdosistherapie angesprochen hatten, aber nach unseren Untersuchungsbefunden Tumorzellen in den Asservaten aufwiesen.
Der prognostische Zugewinn, der bezüglich des Ansprechens auf eine Hochdosistherapie mit der Untersuchung auf kontaminierende Tumorzellen erzielt werden kann, wurde anhand des Vergleichs mit zuvor etablierten klinischen Faktoren (Beyer et al., 1996) untersucht. In univariaten [Seite 16↓]Analysen waren, bis auf den Faktor einer primär mediastinalen Tumorlokalisation, sowohl die klinischen Faktoren als auch die Variable „Tumorzellkontamination“ in der Lage, einen ungünstigen Verlauf in Bezug auf Gesamtüberleben und ereignisfreies Überleben vorherzusagen. In der Regressionsanalyse zeigte jedoch die Variable „Tumorzellkontamination“ den höchsten prädiktiven Wert für eine geringe ereignisfreie Überlebenswahrscheinlichkeit (Tabelle 3, Seite 76 dieser Schrift). Sogar innerhalb der gemäß klinischer Parameter prognostisch günstigen Gruppe konnten mit Hilfe der Tumorzelldetektion Patienten mit verkürztem Gesamtüberleben oder ereignisfreiem Überleben identifiziert werden.

Birgt die Detektion residualer Tumorzellen tatsächlich zusätzliche prognostische Information bezüglich des klinischen Verlaufs nach Hochdosistherapie? Drei Beobachtungen scheinen diese Annahme zu stützen. Zum einen konnten anhand der Tumorzelldetektion sogar innerhalb der 32/51 Patienten mit gutem Ansprechen auf die Hochdosistherapie diejenigen identifiziert werden, die ein verkürztes ereignisfreies und Gesamtüberleben aufwiesen. Gleiches gilt für die Untersuchung der 35 Patienten, die aufgrund etablierter klinischer Parameter eine günstige Prognose nach Hochdosistherapie erwarten ließen. Schließlich belegten die Ergebnisse der Regressionsanalyse (Tabelle 3, Seite 76 dieser Schrift) die herausgehobene Bedeutung der Tumorzellkontamination als stärksten unabhängigen Prognosefaktor bei den eingeschlossenen Patienten.
Wichtige Fragen wurden durch diese Studie eher aufgeworfen als beantwortet: Tragen die Tumorzellen in den Asservaten über ihre offensichtliche prognostische Bedeutung selbst zu Rezidiven der Tumore bei? Ist die Depletion von Tumorzellen aus einem positiv getesteten Stammzellprodukt anzustreben, um Patienten vor einer durch die Reinfusion bedingten Rezidivgefahr zu schützen? Sollte alternativ bei positiv getesteten Asservaten ein weiteres, möglichst negativ getestetes und somit nicht oder unterhalb der Nachweisgrenze kontaminiertes Stammzellkonzentrat gewonnen werden, welches vielleicht mit einem geringeren Rezidivrisiko verbunden wäre? Vor allem bringt jedoch die prognostische Bedeutung der Daten der vorgestellten Studie bei Bestätigung durch andere Zentren die Therapeuten in Zugzwang, wenn positive Stammzellasservate ein äußerst geringes Ansprechen auf die Hochdosistherapie befürchten lassen; Nutzen und Risiko der aggressiven Therapie müßten dann besonders kritisch beurteilt werden.

8. Eliminierung zirkulierender Tumorzellen

Die Gültigkeit des Modells der Rezidiventstehung durch kontaminierende Tumorzellen, welche mit einem Knochenmark- oder Stammzellasservat im Rahmen der Hochdosistherapie reinfundiert [Seite 17↓]werden, kann noch nicht als bewiesen gelten; viele der vorliegenden Daten, von denen einige im vorausgehenden Kapitel diskutiert wurden, scheinen jedoch in diese Richtung zu weisen oder zumindest nicht das Modell zu widerlegen. Die sich als Konsequenz ergebenden Bemühungen, diese Tumorzellen aus den Asservaten zu entfernen, sind in den letzten Jahren aus dem Stadium experimenteller Studien zur Routine in spezialisierten Laboratorien geworden. Die Vielfalt der zu diesem Zweck eingesetzten Möglichkeiten soll hier nicht erschöpfend dargestellt werden. Im Kern laufen die Methoden jedoch auf grundsätzlich zwei verschiedene Prinzipien hinaus: Erstens, das Bemühen, die Tumorzellen aus dem Asservat spezifisch zu eliminieren, oder zweitens, diejenigen Zellen, welche für die Rekonstitution der Hämatopoese und somit für den Erfolg der Hochdosistherapie als erforderlich betrachtet werden, in einem Aufreinigungsverfahren anzureichern und dadurch von unerwünschten Zellen zu isolieren.
Am Beispiel des Mammakarzinoms versuchten wir, die Präsenz und die Zahl kontaminierender Tumorzellen zu bestimmen, um dann diese Zellen aus Blutproben zu eliminieren. Die Problematik der Detektion residualer Tumorzellen wurde oben ausgeführt. Das auf der Detektion der für den Epidermal Growth Factor (EGF)-Rezeptor kodierenden mRNA basierende RT-PCR-Verfahren wurde zum Monitoring der Tumorzellkontamination und Depletion im experimentellen Maßstab eingesetzt.
Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden in definiertem Verhältnis mit Tumorzellen einer Mammakarzinom-Linie versetzt. Zur Entfernung der Tumorzellen wählten wir das Verfahren der immunmagnetischen Selektion: paramagnetische Kügelchen (sog. „beads“) werden – direkt oder über einen Brückenantikörper – mit einem Antikörper verknüpft, welcher ein für die zu selektierende Zelle spezifisches Antigen erkennt und an diese bindet. Dieses Verfahren ermöglicht es, nach Applikation eines Magneten den aus beads, Antikörpern und Tumorzellen bestehenden Komplex zu isolieren. Prinzipiell ist dies sowohl zur Anreicherung als auch zur Entfernung einer bestimmten Zellpopulation mittels geeigneter Antikörper möglich.
Wenn Tumorzellen aus einer Blutprobe eliminiert werden sollen, setzt dies sowohl ein Verfahren zur spezifischen und effizienten Eliminierung als auch ein sensitives Verfahren zur Dokumentation der Tumorzellentfernung voraus. Im Falle der immunmagnetischen Selektion muß ein für die zu selektierenden Zellen spezifisches Antigen durch einen Antikörper an der Oberfläche der Tumorzellen detektierbar sein. Für die Mammakarzinomzellen nutzten wir einen Antikörper, welcher an das Oberflächenantigen HEA 125 (Epithelial Membrane Antigen, EMA; (Simon et al., 1990) bindet. Für das Monitoring der Tumorzelldepletion kam dieses Antigen nicht in Frage, da eine immunzytochemische Färbung die Verwendung eines weiteren, gegen ein anderes Epitop des Antigens gerichteten und somit nicht kreuzreagierenden Antikörpers voraussetzen würde; dieser war jedoch nicht verfügbar. Eine Detektion mittels der RT-PCR kam ebenfalls nicht in Frage, da auch in mononukleären Zellen des Blutes gesunder Spender [Seite 18↓]Transkripte für EMA nachweisbar waren. Wir nutzten daher wiederum Zytokeratin als Antigen für die immunzytochemische Färbung und die EGF-Rezeptor-mRNA für die RT-PCR (Hildebrandt et al., 1997). Im Idealfall läßt sich die Tumorzellkontamination vor Depletion in der Ausgangsfraktion und nach Depletion nicht mehr in der nicht gebundenen Zellfraktion, jedoch im bead-Antikörper-Tumorzell-Komplex nachweisen (vgl. Abbildung 7C, Seite 64 der vorliegenden Schrift).
Eine immunmagnetische Selektion kann auch zu ausschließlich diagnostischen Zwecken – bei Vorliegen einer geeigneten Antikörper-Antigen-Kombination – durchgeführt werden; die Tumorzellen können in diesem Fall durch ein spezielles Konstrukt, in welchem die Antikörper über ein DNA-Verbindungsstück an die paramagnetischen Kügelchen gekoppelt werden, selektiert und anschließend mittels DNAse von den beads abgetrennt und immunzytochemisch untersucht werden. Vorteil ist hier, daß eine Quantifizierung der Tumorzellen aus unprozessiertem Vollblut erfolgen kann. Im Falle der Hodentumoren erlaubte diese Methode einen Nachweis von bis zu 10 Tumorzellen in 5 ml Vollblut.

Abbildung 1: Selektierte Cytokeratin-positive Tumorzelle mit umgebenden paramagnetischen Kügelchen.

Die Tumorzelle wurde immunmagnetisch aus einer Vollblutprobe über anti-PLAP-Antikörper isoliert und mit einem anti-Cytokeratin-Fab-Fragment (Micromet, Baxter Deutschland, Unterschleißheim) gegengefärbt.

Für die klinisch-therapeutische Anwendung hat die immunmagnetische Selektion CD34-positiver Zellen die größte Verbreitung gefunden, da sich bei dieser Methode klinische Vorteile mit einer breiten Anwendungsbasis verknüpfen. Nicht die zu eliminierenden, sondern die für die Wiederherstellung der Hämatopoese und somit für das Gelingen der Transplantation als relevant erachteten Zellen werden angereichert und so von nicht gewünschten oder nicht benötigten Zellen getrennt, in einem vergleichsweise kleinen Volumen kryokonserviert und später transfundiert. Auf diesem Weg reduziert sich auch die für die Kryokonservierung erforderliche Menge des Stabilisators Dimethylsulfoxid (DMSO), dessen Infusion mit zum Teil erheblichen Nebenwirkungen für den Patienten verbunden ist. In den USA war dies die primäre Indikation für die Zulassung eines derartigen Selektionsverfahrens im klinischen Maßstab (CeprateTM System, Cellpro, Bothell, USA).
[Seite 19↓]Die Selektion CD34-positiver Zellen im klinischen Maßstab bot uns die Möglichkeit, die etablierten Verfahren zur Detektion von Karzinomzellen einzusetzen, um den gewünschten Effekt einer Reduktion der Zahl kontaminierender Tumorzellen zu belegen (Mapara et al., 1997). Hier erwies sich die RT-PCR-gestützte Methode des Nachweises der EGF-Rezeptor-mRNA als weniger sensitiv als die vergleichend eingesetzte immunzytochemische Färbung, wenn sie auch anderen mittels der RT-PCR detektierten Indikatorsequenzen überlegen war. Beide Verfahren wiesen zudem in einem erheblichen Anteil der selektierten Zellfraktionen weiterhin Tumorzellen nach, trotz einer Reduktion der Tumorzellzahl um 1,9 log im Median (Spannweite: 0,7 bis über 3 log). Eine weitere Reduktion kontaminierender Tumorzellen ist zwar durch anschließende oder sogar parallele Antikörper-vermittelte immunmagnetische Depletion unerwünschter Zellen prinzipiell möglich (Mapara et al., 1999). Allerdings ist der klinische Nutzen einer weiteren Depletion, angesichts des finanziellen und logistischen Aufwands, bei möglichem weiteren Verlust erwünschter CD34-positiver Zellen, derzeit fraglich, zumal hier bezüglich der kontaminierenden Zellen in einem Grenzbereich diagnostischer Sensitivität operiert wird.
Wenn hingegen im allogenen Bereich eine Reduktion immunkompetenter T-Lymphozyten auf ein definiertes Maß angezielt wird, ist nach unserer Erfahrung im Allgemeinen mit alleiniger Selektion der CD34-positiven Zellen eine genügende Reduktion CD3-positiver Lymphozyten mit dem hierzu verwendeten System (Isolex 300i, Version 1.1.3; Baxter Biotech, Unterschleißheim) erzielbar. Angesichts der für die allogene Transplantation benötigten höheren Zahl CD34-positiver Zellen erschien es hier eher bedeutsam, den mit der Selektion obligat verbundenen Verlust CD34-positiver Zellen zu minimieren. Mit einer Zusammenstellung und statistischen Auswertung unserer Ergebnisse zur CD34-Selektion konnten wir Wege zur Optimierung der Ausbeute CD34-positiver Zellen aufzeigen (Hildebrandt et al., 2000).
Derartige Untersuchungen machen jedoch deutlich, wie sich mit Eintritt der immunmagnetischen Selektion im klinischen Maßstab und mit Fragen methodischer Optimierung der Wechsel eines ursprünglich im Sinne einer operationalen Größe eingeführten Modells der CD34-positiven Zelle zu einem im Routineverfahren hergestellten Medizinprodukt endgültig vollzieht. Erst langfristige Verlaufsbeobachtungen werden zeigen,
- ob eine Reduktion der Zahl der Tumorzellen im Stammzellasservat mit einer geringeren Rezidivgefahr verbunden ist,
- ob die Selektion CD34-positiver Zellen zu Produkten führt, mit denen nach echter Myeloablation eine normale und dauerhafte Hämatopoese wiederhergestellt werden kann, und
- in welchen Anwendungsfeldern der erhebliche logistische und finanzielle Aufwand solcher Selektionsmethoden tatsächlich durch höhere therapeutische Erfolge für den Patienten gerechtfertigt wird.


Fußnoten und Endnoten

1 Eine Dosiserhöhung ist nur innerhalb der Grenzen, die durch anderweitige Toxizität der jeweiligen Substanz gezogen werden, möglich. So ist beispielsweise die applizierbare Dosis von Anthrazyklinen durch die zu erwartende Kardiotoxizität nur geringfügig über das im Rahmen der Standardtherapie gewohnte Maß hinaus möglich. Üblicherweise werden daher Substanzklassen mit nachgewiesener Wirksamkeit gegenüber der Grunderkrankung und – abgesehen von der Hämatotoxizität – vertretbarer Toxizität bei Dosiseskalation verwendet, wie die Gruppen der Alkylantien, der Topoisomerase II-Inhibitoren, Antimetaboliten oder Nitrosoharnstoffe.

2 Erst neuere Techniken erlauben einen quantitativen Nachweis basierend auf der PCR-Methode ( Nitsche et al., 1999), oftmals jedoch mit geringerer Sensitivität gegenüber der „klassischen“PCR.



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14.10.2004