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3.  Allgemeiner Material- und MethodenTeil

3.1. Patienten, operative Bedingungen

Hämostaseparameter wurden bei Patienten (Tabelle 1-8) im Zeitraum von 6/89 bis 1/91 im Endstadium einer Lebererkrankung vor, während und nach ihrer ersten OLT in der Charité, Universitätsklinikum der Humboldt-Universität zu Berlin, Campus Virchow-Klinikum, gemessen. Retransplantationen wurden nicht untersucht.

Die OLT wurde nach Standardtechniken unter Verwendung eines veno-venösen Bypasses von V.porta und V.femoralis zur V.axillaris während der anhepatischen Phase durchgeführt (249,250,251).

Zur Kompensation des intraoperativen Blutverlustes wurden Erythrozytenkonzentrate (EK) und frisch gefrorenes Plasma (FFP) gegeben. Angestrebt wurde eine Hämoglobinkonzentration von > 10 g/dl. Generell wurde eine Einheit FFP zusammen mit einer EK Einheit gegeben. Indikationen für FFP und EK Gaben waren ein Abfall der Hämoglobinkonzentration auf Werte unter 9 g/dl bzw. ein Rückgang des Serumalbumins auf Werte unter 3 g/dl und/oder die Verkürzung der partiellen Thromboplastinzeit auf 20 Sekunden und weniger. Patienten mit massivem Aszites zum Zeitpunkt der OLT erhielten gehäuft zusätzliche FFP-Konzentrate, um den vermehrten Proteinverlust während der Laparatomie zu kompensieren. Vor und während der OLT wurden weder Thrombozytenkonzentrate, Frischblutkonserven oder Faktorenkonzentrate transfundiert.

Die Spenderleber wurde während der sog. kalten Ischämiezeit nach Entnahme in einer eisgekühlten Konservierungsflüssigkeit, der UW-CSS Lösung (DuPont, Paris, Frankreich) (Tab.1), aufbewahrt. In ihr erfolgte vor Implantation die Präparation und Spülung der Spenderleber.

Tabelle 1 : Zusammensetzung der UW-Lösung

Belzer UW-CSS Lösung

Raffinose (30mM)

K-Lactobionat (100 mM)

KH2PO4 (25 mM)

HES (5g%)

MgSO4

Adenosin (5mM)

Glutathion (3mM)

Allopurinol (1mM)

Insulin (40 Einheiten)

Penicillin G (200000 Einheiten)

Dexamethason (16mg)

3.2. Probenentnahme (Abb. 3)

Arterielle Blutproben wurden zu 8 bis 10 Zeitpunkten vor, während und nach der OLT entnommen:

Die Blutproben wurden mit 1/10 Volumen Natriumzitrat (0.1 M/l) antikoaguliert. Für die Bestimmung der t-PA Aktivität wurde ein Teil des antikoagulierten Blutes im Verhältnis 1:1 mit Azetatpuffer (0.2 mol/l, pH:3.9) versetzt, um in vitro die Komplexbildung von t-PA mit PAI zu unterdrücken. Zur PAI Bestimmung wurde das Blut in CTAD-Röhrchen (Natriumcitrat, Theophyllin, Adenosin, Dipyridamol) antikoaguliert, um die Aktivierung der Thrombozyten und damit die Freisetzung von intrathrombozytärem PAI zu verhindern. Die Proben wurden innerhalb von 15 Minuten nach Entnahme bei 3000 U/Minute während 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand bei -40oC bis -70oC eingefroren. Die Thrombelastographie und die Thrombozytenaggregationsmessungen wurden unmittelbar nach Entnahme (s.u.) durchgeführt.

3.3. Bestimmung der Laborparameter

3.3.1. Fibrinolyseparameter

Die Thrombelastographie (TEG) mit rekalzifiziertem Vollblut wurde mit einem Thrombelastographen von Hellige (Freiburg, Deutschland) durchgeführt. Zeichen einer gesteigerten Fibrinolyse wurden mit der WBLT (whole blood clot lysis time (275)) und der MA+45/MA Ratio (s.u.) quantifiziert (Abb.4). Die WBLT ist die Zeit zwischen Maximalamplitude und kompletter Lyse im TEG. Mit ihr kann das Bestehen und der Ausprägungsgrad einer Hyperfibrinolyse bestimmt werden (Abb.4). Wir definierten zusätzlich über den Quotienten aus der Amplitude 45 Minuten nach der Maximalamplitude (MA) und der MA (MA+45/ MA Ratio) einen Parameter, der bei Blutproben mit fehlenden klassischen Hyperfibrinolysezeichen eine gesteigerte Fibrinolysebereitschaft anzeigt (Abb.4). Wir legten fest, daß diese gesteigerte Fibrinolysebereitschaft bei einer MA+45/ MA Ratio von unter 0,95 besteht.

Die folgenden Parameter wurden mit kommerziell erhältlichen Kits bestimmt (vgl.Tab.10):

Die Messung der t-PA Aktivität erfolgte in angesäuerten Plasmaproben durch Messung der amidolytischen Aktivität von Plasmin - durch t-PA Aktivierung aus Plasminogen freigesetzt - gegenüber dem chromogenen Substrat S-2251 (336) (Chromogenix, Stockholm, Schweden). Die Sensitivitätsgrenze lag bei 0.10 IU/ml (Tab.2).

Die PAI (PAI-1) Aktivität wurde nach Zugabe einer bekannten Menge t-PA im Überschuß zu den Plasmaproben bestimmt. Ein Teil dieses t-PA Überschusses wurde durch das vorhandene PAI inaktiviert. Die verbleibende t-PA Menge setzte umgekehrt proportional zur vorhandenen PAI Menge aus Plasminogen Plasmin frei, das entsprechend dem t-PA Aktivitätsassay bestimmt werden konnte (Chromogenix). Die Sensitivitätsgrenze lag bei 5 AU/ml (Tab.10).

Die t-PA Ag Konzentration wurde in einem ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) mit Hilfe von monoklonalen anti-t-PA Antikörpern mit einer Sensitivitätsgrenze von 0.5 ng/ml gemessen (Chromogenix) (Tab.2).


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Ein Immunosorbent-Aktivitätsassay wurde zur kombinierten Bestimmung von aktivierbarer scu-PA und tcu-PA (Biopool, Umea, Schweden) verwendet. Dabei wurde die u-PA Aktivität


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Abbildung 3 : Zeitpunkte der Probenentnahmen und der Perfusatgewinnung


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Abbildung 4 : Parameter zur Auswertung eines Thrombelastogramms:

1. WBLT: Vollblutgerinnsellysezeit
2. MA+45/MA: Quotient aus der Amplitude 45 Minuten nach der Maximalamplitude (MA+45) und MA


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ebenfalls über Plasminentstehung und dessen Reaktivität mit dem chromogenen Substrat D-But-CHT-Lys-pNA bestimmt. Die Sensitivitätsgrenze lag bei 30 pg/ml (0.004 IU/ml) (Tab.2). Zur Bestimmung der u-PA Ag und scu-PA Konzentrationen wurde ein Enzymimmunoassay verwendet (Biopool), bei dem die Sensitivitätsgrenze bei 1ng/ml Urokinase lag (Tab.2).

Die Referenzwerte (Tab.10) für t-PA, PAI und u-PA Aktivitäten sowie für t-PA und u-PA Ag Werte wurden bei einer Gruppe von 34 gesunden und nüchternen Freiwilligen, denen zwischen 8 und 9 Uhr morgens nach einer Ruhephase von 15 Minuten Blut abgenommen wurde, bestimmt. Die Geschlechtsverteilung dieser Gruppe war ausgewogen (Ratio 50%). Keine der Frauen nahm Kontrazeptiva ein. Das mittlere Alter war 38.1 (Spannweite: 21-76) Jahre.

Die Parameter des u-PA wurden darüberhinaus entsprechend der im Gaubius Institut TNO-IVVO (Leiden, Niederlande) etablierten Methoden gemessen: u-PA Ag wurde durch ELISA, wie zusammenfassend bei Binnema et al. (22,76) beschrieben, bestimmt, jedoch wurden Esel anti-Ziegen IgG konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, USA) anstatt von konjugierten Kaninchen anti-Ziegen IgG verwand. Der Assay bestimmte u-PA Ag unabhängig von seiner molekularen Konfiguration, d.h. die inaktive Proenzymform scu-PA, die aktive Enzymform tcu-PA und tcu-PA im Komplex mit Inhibitoren. Die durch Plasmin aktivierbare scu-PA Aktivität und die tcu-PA Aktivität wurden mit einem BIA (Bioimmunoassay) gemessen (143), einem Immunoassay wie bereits bei Mahmoud und Gaffney für t-PA beschrieben (222). Im ersten Schritt dieses Assays wurde u-PA durch Kaninchen anti-u-PA IgG immobilisiert. Im folgenden Schritt wurde die Plasminogenaktivatoraktivität mittels des synthetischen Substrates S-2251 (Chromogenix) nach der Methode von Verheijen et al. (336) bestimmt. Die u-PA Aktivität und die Summe aus u-PA und Plasmin-aktivierbarer scu-PA wurden parallel bestimmt, letztere nach einem 30minütigen Aktivierungsschritt mit 1 mU/ml humanen Plasmin. Die Ergebnisse im BIA wurden kalibriert mit scu-PA bzw. u-PA Ag aus humanen Fibroblasten (22). Die untere Sensitivitätsgrenze dieser Assays war 0.2 ng/ml und die Variation innerhalb des Assays betrug 6%, wenn eine Menge von 25µl Plasma im Test verwendet wurde (Tab.2).

Die Bestimmung der PAP Komplexe (Technoclone, Wien, Österreich) wurde mit einem ELISA unter Verwendung monoklonaler Antikörper (116) bestimmt. Die Sensitivitätsgrenze lag bei 1ng/ml (Tab.10). Die Messungen von α2-Antiplasmin, C1-Inhibitor und Plasminogen (Behring Werke AG, Marburg, Deutschland) erfolgten mit Routinemethoden (Tab.2).


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Tabelle 2 : Bestimmungsmethoden und Normalbereiche der Hämostaseparameter

Parameter (Einheit)

Referenzbereich

Bestimmungsmethode

Plasminogen (%)

65-150

Behring Werke AG, Marburg, Deutschland

t-PA Aktivität (IU/ml) (n=34)*

0,3-2

Chromogenix, Stockholm, Schweden

t-PA Antigen (ng/ml) (n=34)*

1,2-12,5

Chromogenix, Stockholm, Schweden

u-PA Aktivität (ng/ml) (n=34)*

<0,1

Biopool, Umea, Schweden

u-PA Antigen (ng/ml) (n=50)*

1,65-6,24 (Median:3,24)*

Gaubius Institut, Leiden, Niederlande

scu-PA (ng/ml) (n=50)*

1,2-2,95 (Median: 2,10)

Gaubius Institut, Leiden, Niederlande

tcu-PA (ng/ml) (n=50)*

<0,2

Gaubius Institut, Leiden, Niederlande

i-PA (AU) (n=37)*

65-150

Methode nach Himmelreich, Gaubius Institut, Leiden, Niederlande

α2-Antiplasmin (%)

75-130

Behring Werke AG, Marburg, Deutschland

C1-Inhibitor (%)

75-130

Behring Werke AG, Marburg, Deutschland

PAI Aktivität (AU/ml) (n=34)*

0-39

Chromogenix, Stockholm, Schweden

PAP Komplexe (ng/ml) (n=36)*

0-15

Technoclone, Wien, Österreich

 

Fibrinogen (g/l)

1,6-4

Nach Clauss, Hofmann-LaRoche, Basel, Schweiz

AT III Aktivität (%)

75-130

Behring Werke AG, Marburg, Deutschland

Protein C Aktivität (%)

70-140

Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland

totales Protein S Antigen (%)

65-150

Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland

freies Protein S Antigen (%)

70-140

Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland

Fibrinmonomer (0-+++)

0

Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland

D-Dimere (mg/l)

<0,5

Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland

TAT Komplexe (mg/ml) (n=34)*

1-4,1

Behring Werke AG, Marburg, Deutschland

F XIII (%)

70-130
70-130

Behring Werke AG, Marburg, Deutschland

Clot Solubility Assay (166)

vWF Antigen (%)

50-200

Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland

 

SThrombomodulin (ng/ml) (n=37)*

0-45

Diagnostica Stago, Asniere, Frankreich

 

Tumornekrosefaktor (pg/ml)

0-12

Medgenix Diagnostics, Fleurus, Belgien

Neopterin (nmol/l)

0-6

Henning, Berlin, Deutschland

Kathepsin B (mU/l)

0-0,1

Nach Assfalg-Machleidt (6)

IL-6 (pg/ml)

0-12,5

Fa. R&D Systems GmbH, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland

IL-8 (pg/ml)

0-31,2

Fa. R&D Systems GmbH, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland

sL-Selectin (ng/ml)

487,3-1096,3

Bender MedSystems Diagnostics GmbH, Wien, Österreich

sE-Selectin (ng/ml)

23-79,2

Bender MedSystems Diagnostics GmbH, Wien, Österreich

sICAM (ng/ml)

129,9-297,4

Bender MedSystems Diagnostics GmbH, Wien, Österreich

EPI Komplexe (ng/ml)

0-100

E.Merck, Darmstadt, Deutschland

 

Aprotinin (KIU)

-

Nach Müller-Esterl (242)

* an begrenzter Fallzahl bestimmt und deshalb als vorläufiger Normalbereich anzusehen

3.3.2. Gerinnungsparameter

Mit kommerziell erhältlichen Kits wurden bestimmt: Aktivitäten des Protein C und des Protein S und die Konzentrationen des vWF Ag, des freien und gebundenen Protein S, der Fibrinmonomere und D-Dimere (Boehringer, Mannheim, Deutschland); AT III Aktivität (Behring Werke AG, Marburg, Deutschland); Fibrinogen nach Clauss (Hoffmann-LaRoche, Basel, Schweiz) (Tab.2).

Die F XIII Aktivität wurde mit einer photometrischen Methode (Berichrom F XIII, Behring Werke AG (85)) bestimmt. Parallel wurden die F XIII Aktivitäten in einer 12-titrigen Modifikation des etablierten F XIII Assays (Clot Solubility Assay (166)) gemessen (Tab.2).

Die TAT Komplexe wurden mit einem ELISA (Behring Werke AG) bestimmt. Die Sensitivitätsgrenze lag bei 0.5 mg/ml und die Referenzwerte (Tab.10) beziehen sich auf die bei 3.3.1. erwähnte Probandengruppe.

3.3.3. Thrombozytenzahl und Thrombozytenfunktionsmessung (Abb.5)

Die Thrombozytenzahl wurde in einem automatischen Thrombozytenzähler (H3, Bayer Technikon, München, Deutschland) bestimmt. Plättchenreiches Plasma wurde durch sechsminütige Zentrifugation bei 600 U/Minute gewonnen. Das nach Abpipetieren verbleibende Blut wurde für weitere 20 Minuten bei 3000 U/Minute zentrifugiert. Auf diese Weise wurde plättchenarmes Plasma gewonnen. Bei in vitro Untersuchungen wurde Gesunden Blut ohne Stauung aus der Kubitalvene entnommen und die Plättchenzahl auf den angestrebten Wert von 200.000/µl eingestellt. Dieses plättchenreiche Plasma mit definierter Plättchenzahl wurde als PRP bezeichnet. Während der OLTs wurde die Plättchenzahl des PRP jeweils durch Verdünnung mit plättchenarmem Plasma oder durch weitere Konzentrierung bei langsamerer Zentrifugation (200 U/Minute) auf die Ausgangsthrombozytenzahl des PRP der ersten Abnahme eingestellt. Dies war wichtig, um unterschiedliche Aggregationskapazitäten bei variierenden Plättchenzahlen zu verhindern. Die Thrombozytenaggregation wurde nach Born (32) durch ein automatisches Thrombozytenaggregationstracersystem (APACT, Labor GmbH, Ahrensburg, Deutschland) (Abb.5a) aufgezeichnet und digital gespeichert. Vor jeder Einzelmessung wurden die Werte für 0% und 100% der maximalen Thrombozytenaggregation mit plättchenarmem Plasma bzw. PRP kalibriert. Die Aggregation wurde induziert durch Kollagen (Endkonzentrationen 0.5 und 1µg/ml), ADP (1 und 2µmol/l), Ristocetin (1.2mg/ml) und Arachidonsäure (500µg/ml). Bei jeder Aggregationskurve wurde


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Abbildung 5 : a) und b) Prinzip der Messung der thrombozytären Aggregationsfähigkeit im Thrombozytenaggregationstracersystem mit plättchenreichem Plasma (PRP) und c) Bestimmung der Maximalamplitude und der Fläche unter der Aggregationskurve (area under the curve (AuC)) bei der Auswertung.


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die Maximalamplitude (MA) und die Fläche unter der Aggregationskurve bis 200 Sekunden nach Zugabe der aggregationsauslösenden Substanz (AuC) bestimmt (s.Abb.5a-c). Zusätzlich wurde bei der Kollagen-induzierten Aggregation die Lag-Phase bestimmt, d.h. die Zeit zwischen Zugabe von Kollagen zu PRP und Anstieg der Kurve mit Überschreiten der 0% Linie. Niedrige Plättchenzahlen im PRP beeinflußten die Aggregabilitätsmessungen bei den verschiedenen Agentien in unterschiedlichem Ausmaß (s.5.5.1.1.).

3.3.4. Leukozytäre Proteasen, Zytokine und lösliche Adhäsionsmoleküle

Die Kathepsin B Aktivität wurde mit Hilfe des fluorogenen Substrates Z-Phe-Arg-NMec (6) und die Konzentration des Elastase-α1-Proteaseinhibitors Komplex (EPI; E.Merck, Darmstadt, Deutschland) (252) mit einer Sandwich-ELISA Meßtechnik bestimmt. Der TNF wurde durch den immunoradiometrischen Assay (IRMA, Medgenix Diagnostics, Fleurus, Belgien) und Neopterin durch den Radioimmunassay (Henning, Berlin, Deutschland) gemessen. sE-Selectin, sL-Selectin, s-ICAM (Bender MedSystems Diagnostics GmbH, Wien, Österreich), IL-6 und IL-8 (Fa. R&D Systems GmbH, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) wurden mit Sandwich-Elisas bestimmt.

3.3.5. sThrombomodulin

sThrombomodulin wurde mit dem Enzymimmunoassay (152,192) (Diagnostica Stago, Paris, Frankreich) bestimmt (Tab.2).

3.3.6. Aprotinin

Die Aprotininkonzentration wurde mit monoklonalen Antikörpern im ELISA nach der Methode von Müller-Esterl (242) bestimmt.

3.4. Statistische Auswertungen

Mit Hilfe des Martinez und Iglewicz Testes (226) konnte für die Verteilung der meisten Parameter keine Normalverteilung belegt werden. Es wurde deshalb der nicht-parametrische Wilcoxon signed-ranks Test eingesetzt, um Unterschiede verbundener Parameter und der nicht-parametrische Man-Whitney Test, um die Unterschiedlichkeit nicht-verbundener Parameter zu prüfen. Ergebniswerte im Text und in den Abbildungen wurden, soweit nicht anderweitig erwähnt, als Medianwerte mit Spannweiten angegeben. Bei der Evaluation des i-PA Assays (s.5.2.1.) wurden Mittelwert und Standardabweichung benutzt, da Normverteilung nachgewiesen werden konnte. Werte für p < 0.05 wurden als signifikant und Werte für p < 0.01 als hochsignifikant gewertet.

Die Bestimmung der Verbundenheit zweier Meßreihen wurde mit Hilfe der Korrelationsanalyse berechnet, wobei der empirische Korrelationskoeffizient r den Grad der linearen Abhängigkeit zwischen beiden Meßreihen angibt. Es wurden dabei nur Korrelationen mit r > 0,5 und < 1 bzw. r < -0,5 und > -1 berücksichtigt (Ausnahme 5.2.1.c)). Die Signifikanz der Verbundenheit wurde durch p bestimmt. Werte für p < 0.05 wurden als signifikant und Werte für p < 0.01 als hochsignifikant gewertet.


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15.09.2004