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5.  Weiterführende Untersuchungen zur Pathophysiologie der Hämostasestörungen bei orthotoper Lebertransplantation

5.1. Einleitung

Die Untersuchungen zur Pathophysiologie der Hämostasestörungen bei OLT (Kapitel 4) lieferten einen interessanten Ersteindruck, der sich zumeist mit den Untersuchungsergebnissen anderer Transplantationszentren deckte. Die pathophysiologischen Gesamtzusammenhänge blieben jedoch in weiten Teilen ungeklärt bzw. spekulativ. Weiterführende Untersuchungen waren daher notwendig. Im folgenden werden zunächst Untersuchungen zum intrinsischen fibrinolytischen System vorgestellt. Die Messungen der u-PA Aktivitäten wurden in Leiden am Gaubius Institut mit der dort entwickelten Methode (s.3.3.1.) durchgeführt. Neben diesem F XII-unabhängigen Plasminogenaktivator kommt jedoch auch dem F XII-abhängigen Plasminogenaktivator klinische Bedeutung zu, sodaß zur Klärung der Bedeutung des gesamten intrinsischen fibrinolytischen Systems (5.2.) seine Bestimmung erforderlich war. Als Methodik stand nur die aufwendige Fibrinplattenmethode zur Verfügung. Es wurde daher eine chromogene Substratmethode entwickelt, die es erlaubte, die Aktivität des F XII-abhängigen Plasminogenaktivators schnell und auf eine im Routinelabor praktikable Weise zu bestimmen (s.5.2.1.).

Sinnvoll erschien es, die Bedeutung des F XIII, des fibrinstabilisierenden Faktors, zu untersuchen (s.5.3.). Hierfür wurde eine neue Methode etabliert, da der bisher benutzte Clot Solubilitätstest nur eine semiquantitative und zeitaufwendige Messung der F XIII Aktivität erlaubte.

Desweiteren wurde die Bedeutung der Leukozyten, Endothelzellen und Thrombozyten für die Hämostase während und nach OLT untersucht. Es wurde der Verlauf leukozytärer Proteasen, Zytokine, Adhäsionsmoleküle und des Endothelzellmarkers Thrombomodulin (s.5.4.) sowie die Thrombozytenfunktion (s.5.5.) untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluß verschiedener Konservierungslösungen auf die Thrombozytenfunktion gemessen.

Abschließend galt es, die Auswirkung der Spenderleber auf die Gesamthämostase - nach Entnahme, kalter Ischämiezeit, Implantation und Flushing - zu untersuchen (s.5.6.). Dieses geschah durch Bestimmung der Hämostaseparameter und der Thrombozytenfunktion systemisch und im Perfusat der Spenderleber.

5.2. Bedeutung des intrinsischen fibrinolytischen Systems bei der Entwicklung einer gesteigerten Fibrinolyse während orthotoper Lebertransplantation

5.2.1. Entwicklung einer Methodik zur Bestimmung der F XII-abhängigen fibrinolytischen Aktivität

a) Einleitung

Der Nachweis des F XII-abhängigen Plasminogenaktivators ist durch die Tatsache erschwert, daß seine Molekularstruktur noch unbekannt ist und daher noch keine spezifischen Antikörper in Testsystemen verwandt werden können. Die Aktivität dieses Plasminogenaktivators kann mit Hilfe von Fibrinplatten bestimmt werden. Die intrinsischen fibrinolytischen Proaktivatoren werden dabei durch Dextransulfat (DS), d.h. durch Kontaktaktivierung, aktiviert. DS bindet die Kontaktfaktoren v.a. F XII, Präkallikrein und HMW Kininogen [Seite 50↓](s.Abb.2) an seiner Oberfläche und führt so zur verstärkten Interaktion zwischen ihnen mit konsekutiver Aktivierung. Es entstehen v.a. F XIIa und Kallikrein, die selbst schwache intrinsische Plasminogenaktivatoren sind, deren Hauptaufgabe jedoch in der Aktivierung potenterer Plasminogenaktivatoren liegt. Parallel zur DS Stimulation wird die Inhibitorkonzentration reduziert. Dieses geschieht erstens durch Verdünnung der Plasmaprobe (1:10) und zweitens durch isoelektrische Präzipitation bei einem pH von 5.9 (Azetatessigsäure). Bei der isoelektrischen Präzipitation bleiben die meisten Inhibitoren in Lösung (155,157), während die fibrinolytisch aktiven Komponenten präzipitieren und in einem EDTA-Gelatine Puffer (pH 7,8) aufgenommen werden können. Die entstandene Lösung ist eine DS stimulierte Euglobulinfraktion (DEF) nach Kluft (185). DEF wird auf sog. Fibrinplatten in Gegenwart von monoklonalen t-PA und u-PA Antikörpern aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 18 Stunden wird die Fläche des aufgelösten Fibrins als Folge der Plasminentstehung gemessen und ausgedrückt als Produkt (mm2) von zwei aufeinander senkrecht stehenden Durchmessern der kreisrunden Lysezonen (157). Obwohl die Fibrinplattenmethode modifiziert wurde (245), handelt es sich um eine arbeitsintensive und zeitaufwendige Methode. Es wurde eine eigene chromogene Substratmethode entwickelt, die eine schnelle, zuverlässige und wiederholbare Bestimmung der Aktivität des F XII-abhängigen Plasminogenaktivators ermöglicht. Es wurde nachgewiesen, daß diese Aktivität identisch bzw. in enger Beziehung zu der mit Hilfe von Fibrinplatten ermittelten F XII-abhängigen fibrinolytischen Aktivität steht. Die so gemessene Aktivität wird i-PA (intrinsische Plasminogenaktivator) Aktivität genannt.

b) Prinzip der Methode

In einer chromogenen Substratmethode wurde die Aktivität von angesäuertem Plasma (AP), das mit DS (MW 1.000.000, Serva, Heidelberg, Deutschland) stimuliert (DSAP) wurde, nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten - mit Hilfe der p-Nitroanillinfreisetzung aus dem chromogenen Substrat S-2251 (Chromogenix, Stockholm, Schweden) - gemessen. Die spektrophotometrische Veränderung der Lichtabsorption pro Stunde (405nm) wurde aufgezeichnet und die Aktivität in Prozent entsprechend einer Standardkurve mit steigender Konzentration von angesäuertem und DS stimuliertem gepooltem Plasma (DSAPP) ermittelt. Als Leerwert wurde angesäuertes Plasma, das mit destilliertem Wasser anstatt DS versetzt wurde (H2OAP bei Plasma oder H2OAPP bei gepooltem Plasma), verwendet und der gemessene Wert (meist Null) vom Aktivitätswert des DSAP(P) abgezogen. Die gemessene Aktivität entsprach der i-PA Aktivität.

c) Evaluierung der Methode

Beim i-PA Assay lag eine 3.5-fache Verdünnung und eine Senkung des pHs auf 4.4+0.2 (Natriumacetatpuffer pH 3.9, 0.2 M) vor.

Es wurde die Aktivität von C 1 -Inhibitor und α 2 -Antiplasmin in DSAP und DEF der entsprechenden Plasmen bestimmt. Bei DSAP konnte die Inhibitoraktivität bis auf 10% und bei DEF bis auf 1% reduziert gemessen werden (Abb.18).

Der Ansäuerungsschritt wurde evaluiert durch Vergleich der Aktivität von DSAP mit DS stimuliertem, jedoch nicht angesäuertem Plasma (DSP) (Abb.19). Die Aktivität von DSAP lag weit über der Aktivität von DSP.


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Der Einfluß der Plasmaverdünnung wurde mit Hilfe einer Plasmaverdünnungskurve untersucht. Es zeigte sich eine deutliche Aktivitätszunahme mit zunehmender Verdünnung trotz Abnahme der Plasmakonzentration (Abb.20). Dieses erklärt sich durch die Abnahme der Inhibitorpotenz mit zunehmender Verdünnung.

Wir evaluierten den optimalen pH des Tris-Tween Puffers in der Mikrotiterplatte. Es ergaben sich bei pH-Werten zwischen 8.3 und 8.6 lineare Standardkurven. Lag der pH niedriger als 8.3


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Abbildung 18 : C1-Inhibitor und α 2–Antiplasmin Aktivitäten in Dextransulfat-stimulierter Euglobulinfraktion (DEF), Dextransulfat-stimulierter und angesäuerten Plasmaproben (DSAP) und nur angesäuerten Plasmaproben (H2OAP) bei Verwendung von Plasma 6 gesunder Patienten

 


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Abbildung 19 : Bestimmung der Aktivität in Dextransulfat-stimulierten und angesäuerten Plasmaproben (DSAP) und in nur Dextransulfat-stimulierten Plasmaproben (DSP) im i-PA Assay bei Verwendung von Plasma drei Gesunder

 

Abbildung 20 : Evaluierung der i-PA Aktivität in gepoolten Dextransulfat-stimulierten Plasmaproben (DSAPP) bei abfallender Plasmaverdünnung (Standardabweichung in der Abbildung).


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zeigte sich ein deutliches Sättigungsverhalten gefolgt von einer Reaktionshemmung bei steigenden DSAPP Konzentrationen. Bei einem pH größer als 8.6 konnte ebenfalls ein Sättigungsverhalten jedoch in abgeschwächter Form gesehen werden (Abb.21).

Der Einfluß negativ geladener Polysaccharide wie DS zeigte sich beim Vergleich der Aktivitäten von DSAP und H2OAP. Lag keine Stimulation mit DS vor, konnten fast keine Aktivitäten gemessen werden (Abb.22).

Die Evaluierung der Inkubationszeit und Inkubationstemperatur im i-PA Assay zeigte bei einer Inkubation von 20 Minuten bei Raumtemperatur oder 25°C optimale Resultate (Abb.23, 24a),b)). Eine verlängerte Inkubation bis 120 (150 bei 25°C) Minuten war jedoch immer noch vereinbar mit reproduzierbaren Ergebnissen.

Die reaktiven Komponenten des Komplementsystems lassen sich bei hohen Temperaturen schnell inaktivieren (173,228). Ein Teil einer DSAPP wurde im Wasserbad bei 56°C für 30 Minuten inkubiert, während ein Teil parallel bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Aktivitäten beider Teile zeigten vergleichbare Aktivitätswerte (Abb.25). Es konnte somit eine Beteiligung des Komplementsystems bei der i-PA Aktivität weitgehend ausgeschlossen werden.

Die Beteiligung der Kontaktfaktoren an der Aktivierung von i-PA wurde untersucht. Es wurde DSAP mit Hilfe von F XI-freiem Plasma (Lot: GK 1104-66, George King Bio Medical, INC, USA) hergestellt. Die gemessene Aktivität im i-PA Assay entsprach der Aktivität von DSAPP (Abb.26). Wurde DSAP mit Hilfe von Hageman Faktor (F XII)-freiem (Lot: GK 1205-914E2, George King Bio Medical, INC) und Fletcher Faktor (Präkallikrein)-freiem (Lot:GK 1703-331D2, George King Bio Medical, INC) Plasma hergestellt, konnte im i-PA Assay keine [Seite 55↓]Aktivität gemessen werden (Abb.27). Wurde zu Hageman Faktor-freiem Plasma gepooltes Plasma in steigender Konzentration zugesetzt, zeigte sich ein Sättigungsverhalten bezüglich der F XII Zugabe (Abb.28). Bei Mischungen von Fletcher Faktor-freiem Plasma mit gepooltem Plasma wurde ein nahezu linearer Anstieg der i-PA Aktivität mit steigender Konzentration des gepoolten Plasmas erkennbar (Abb.28).

Um zu überprüfen, ob die Kallikreinaktivität mitverantwortlich war bei der im i-PA Assay gemessenen Aktivität, wurde die Kallikreinaktivität in DSAPP nach der von Kluft beschriebenen Methode (182) mit Hilfe des Kallikrein-spezifischen Substrates PKK (Boehringer, Mannheim, Deutschland) gemessen. Steigenden Konzentrationen von DSAPP (2 bis 40 µl) wurden 200µl Trisimidazole Puffer (u=0.15; pH 7.9 mit 0.1% Carbowax) und 40µl PKK (1mM in destilliertem Wasser) zugesetzt. Auch bei steigenden DSAPP Konzentrationen war keine Kallikreinaktivität meßbar (Abb.29a). In einem 2.Schritt wurden ansteigende Mengen von reinem Kallikrein dem Testsystem zugefügt. Hier konnte in dosisabhängiger Form die Kallikreinaktivität im Assay wiedergefunden werden (Abb.29b).

Wir bestimmten die Kallikreinaktivität in DSAPP nach unterschiedlichen Inkubationszeiten von angesäuertem, gepooltem Plasma (APP) mit DS (Abb.30). Es ergab sich ein zweiphasiger Verlauf: Eine zunehmende Kallikreinaktivität war meßbar bei ansteigender Inkubationszeit bis zu einer Inkubationszeit von 10 Minuten gefolgt von einem Abfall der Kallikreinaktivität bei längerer Inkubationszeit (Abb.30).

In einer weiteren Versuchsreihe wurde Kallikrein-freies DEF mit Hilfe einer CNBr-aktivierten Sepharosesäule, die mit monoklonalen Kallikreinantikörpern (Kallikreinantikörper von


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Abbildung 21 : Prüfung der pH-Abhängigkeit (Tris-Tween Puffer) der i-PA aktivität bei steigenden Konzentrationen von Dextransulfat-stimuliertem und angesäuertem, gepooltem Plasma (DSAPP) (Standardabweichung in der Abbildung)

 

Abbildung 22 : Bestimmung der Aktivität in Dextransulfat-stimulierten und angesäuerten, gepoolten Plasmaproben (DSAPP) und in nur angesäuerten, gepoolten Plsmaproben (H2OAPP) bei 10 gesunden im i-PA Assay (Standardabweichung in dr Abbildung).

 


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Abbildung 23 : Evaluierung des Einflusses der Inkubationszeit von Dextranssulfat (DS) mit angesäuertem Plasma (AP) von 3 Gesunden im i-PA Assay.

 


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Abbildung 24 : Evalution des Einflusses der Inkubationszeit von Dextransulfat mit angesäuertem, gepootem Plasma bei a) 25°C und b) 37°C im i-PA Assay (Standardabweichungen in den Abbildungen).

 


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Abbildung 25 : Wärmeinkubation von Dextransulfat-stimulierten und angesäuerten, gepoolten Plasmaproben (DSAPP) zum Ausschluß einer Beteiligung des Komplementsystems bei der gemessenden Aktivität im i-PA Assay (Standardabweichung in der Abbildung).

 

Abbildung 26 : Aktivitäten in Dextransulfat-stimulierten und angesäuerten, gepoolten Plasmaproben (DSAPP) und Dextransulfat-stimulierten und angesäuerten F XI-freien Plasmaproben im i-PA Assay (Standardabweichung in der Abbbildung).

 


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Abbildung 27 : Aktivitäten in Dextransulfat-stimuliertem und angesäuertem, gepööltem Plasma (DSAPP) und Dextransulfat-stimuliertem und angesäuertem, F-XII- (Hagemann Faktor) (DSAP-FXII) bzw. Kallikrein- (Fletcher Faktor)(DSAP-Kallikrein) freiem Plasma im i-PA Assay (Standardabweichung in der Abbildung).

 

Abbildung 28 : Aktivitäten von Dextransulfat-stimuliertem, angesäuertem, F XII-bzw. Kallikrein-freiem Plasma (DSAP-XII bzw. DSAP-Kallikrein), bei denen in steigender Konzentration F XII-bzw. Kallikrein-freies Plasma durch gepooltes Plasma (PP) ersetzt wurde. Parallel wurde die Aktivität eibner Plasmaverdünnungskurve im i-PA Assay bestimmt (Standardabweichung in der Abbildung).

 


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Abbildung 29 : Kallikreinaktivität gemessen mit dem Kallikrein-spezifischen Substrat PKK bei a) ansteigender Konzentration von Dextransulfat-stimuliertem, angesäuertem, gepooltem Plasma (DSAPP) (Standarabweichung in der Abbildung) und b) gleichbleibender DSAPP Konzentration und ansteigender Kallikreinkonzentration.

 


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Abbildung 30 : Kallikreinaktivität gemessen mit dem Kallikrein-spezifischen Substrat PKK (Boehringer Mannheim) in Dextransulfat-stimulierten, angesäuerten Plasmaproben von 3 Gesunden.

 


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Abbildung 31 : Aktivitätsmessung bei steigender Konzentration von Dextransulfatstimulierter Euglobulinfraktion (DEF) und Kallikrein-freier DEF im i-PA Assay (Standardabweichung in der Abbildung).

 

Abbildung 32 : Aktivität von Dextransulfat-stimulierten und angesäuerten Plasmaproben bei der Verwendung von zwei Plasminogen-freien Plasmen und von gepooltem Plasma im i-PA Assay (Standardabweichung in der Abbildung).


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Behring Werke Ag, Marburg, Deutschland) beschichtet war, hergestellt. Im i-PA Assay wurde bei Zugabe steigender Konzentrationen von DEF bzw. steigender Konzentrationen von

Kallikrein-freier DEF die Aktivität gemessen (Abb.31). Es zeigte sich eine lineare Kurve mit ansteigender Kallikrein-freier und normaler DEF. Die Werte der normalen DEF lagen jedoch höher (30%).

Zusammenfassend ist über die Abhängigkeit der i-PA Aktivität - mit inovativer Methodik bestimmt - von den Faktoren des Kontaktsystems folgendes zu sagen: Die Aktivierung scheint partiell direkt über Kallikrein und nur mittelbar über F XII zu erfolgen, während sie unabhängig vom F XI ist. Diese Ergebnisse bestätigen vorhergehende Untersuchungen, bei denen die F XII-abhängige Plasminogenaktivatoraktivität (77,183) mit der Fibrinplattenmethode bestimmt wurde.

Kallikrein wird im i-PA Assay als nahezu geschwindigkeitsbestimmender Schritt benötigt; dennoch ist die gemessene Aktivität nicht identisch mit Kallikrein. Die Ergebnisse zeigen, daß während der Inkubationszeit Kallikrein gebildet wird - in ansteigender Konzentration während der ersten 10 Minuten - gefolgt von einem schnellen Inaktivierungsprozeß. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten ist daher kein aktives Kallikrein mehr vorhanden. Parallel kommt es zur Bildung von i-PA Aktivität, sodaß ein direkter Aktivierungsmechanismus von i-PA durch Kallikrein angenommen werden kann. Der Inaktivierung von Kallikrein kommt bei Verwendung von DEF keine oder nur geringe Bedeutung zu, denn wird DEF statt DSAP im i-PA Assay verwendet, ist die Kallikreinaktivität für einen wesentlichen Teil der gesamten Aktivität verantwortlich (Abb.31). Die Ergebnisse mit Kallikrein-freiem DEF zeigen jedoch, daß i-PA auch in Abwesenheit von Kallikrein entsteht und mit dem chromogenen Substrat S-2251 reagiert. Die Diskrepanz zwischen der noch zu messenden Kallikreinaktivität in DEF und dem Fehlen der Kallikreinaktivität in DSAPP kann durch das höhere Inhibitorpotential in DSAPP (10%) im Vergleich zu DEF (1%) erklärt werden.

Bei Verwendung von Plasminogen-freiem Plasma zur Herstellung von DSAP zeigte sich eine der DSAPP vergleichbare Aktivität im i-PA Assay (Abb.32). Ebenfalls bestand kein Einfluß von Fibrinfragmenten auf die i-PA Aktivität (Abb.33).

Wurde die i-PA Aktivität in Gegenwart von inaktivierenden t-PA und/oder u-PA Antikörpern gemessen, ergaben sich keine Aktivitätseinbußen (Abb.34). Wurden in einer zweiten Versuchsreihe t-PA (10 IU/ml) oder u-PA (10 IU/ml) dem DSAP zugefügt und die Aktivität bestimmt, konnte die t-PA Aktivität nicht und die u-PA Aktivität reduziert wiedergefunden werden. Es wird daher ein kompletter (t-PA) bzw. partieller (u-PA) Hemmechanismus bzw. Inaktivierungsmechanismus im DSAP gegenüber t-PA und u-PA diskutiert (Abb.35).

Das Verhalten der i-PA Aktivität auf den Zusatz verschiedener Inhibitoren wurde untersucht und das 50% Inhibitorprofil erstellt (Tab.12) (92,277,347).

Das 50% Inhibitorprofil zeigte, daß es sich bei i-PA um eine Trypsin-ähnliche Serinprotease handelt, die aber weder mit Trypsin noch mit F XIIa identisch war. Die äquivalente Inhibitordosis von PKSI-527 (347) gegenüber der F XII-abhängigen fibrinolytischen Aktivität in der Fibrinplattenmethode (C.Kluft, Gaubius Institut, Leiden, Niederlande, persönliche Mitteilung) und gegenüber der i-PA Aktivität im i-PA Assay, bestätigten die enge Beziehung beider Aktivitäten bzw. machten ihre Identität wahrscheinlich.


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Abbildung 33 : Evalution des Einflusses von Fibrinfragmenten (FF) im i-PA Assay in Dextransulfat-stimulierten und angesäuerten Plasmaproben (DSAP) von 6 Gesunden.

 

Abbildung 34 : Einfluß des Zusatzes von t-PA und/oder u-PA Antikörpern (t-PA Ak bzw. u-PA Ak) auf die Aktivität von Dextransulfat-stimulierten und angesäuerten Plasmaproben (DSAP) von 6 Gesunden im i-PA Assay.

 


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Abbildung 35 : Einfluß des Zusatzes von t-PA (10 IU/ml) und u-PA (10 IU/ml) auf die zu messende Aktivität von Dextransulfat-stimulierten und angesäuerten Plasmaproben im i-PA Assay (n=10), (Standardabweichung in der Abbildung).

 

Abbildung 36 : Evaluierung des Einflusses von verschiedenen antikoagulierenden Substanzen auf die Standardkurven mit ansteigenden Mengen von Dextransulfat-stimuliertem und angesäuertem, gepooltem Plasma (Standardabweichung in der Abbildung).

 


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Tabelle 6 : 50% Hemmprofil der i-PA Aktivität bei Gebrauch unterschiedlicher Inhibitoren

Inhibitor

50% Hemmprofil

Aprotinin

44 KIU/ml

Benzamidin

52 µg/ml

Chymostatin

keine Hemmung

Leupeptin

1,43 µg/ml

Soybean Trypsin Inhibitor

0,33 µg/ml

Lima Been Trypsin Inhibitor

keine Hemmung

Trypsin Inhibitor (Ovomucoid)

keine Hemmung

Trypsin Inhibitor (frei von Ovomucoid, Weiße vom Hühnerei)

keine Hemmung

Trypsin Inhibitor (Weiße vom Putenei)

keine Hemmung

Trypsin Inhibitor (partiell isoliertes Ovomucoid vom Huhn)

keine Hemmung

Corn Inhibitor

keine Hemmung

PKSI

0,0035 mmol/l

Die Evaluierung der i-PA Aktivität in Zitratplasma, plättchenreichem Plasma, CTAD und EDTA Plasma zeigten einen vergleichbaren Verlauf (Abb.36). Nur die Standardkurve mit Serum lag in ihrer Aktivität höher. Der Unterschied entsprach jedoch der fehlenden 10% Verdünnung des Serums mit dem Antikoagulanz.

Die Präzision des i-PA Aktivitätsassays wurde im Vergleich zur F XII-abhängigen Aktivität der bereits etablierten Fibrinplattenmethode bestimmt.

Bei 84 Plasmaproben von Patienten mit koronarer Herzkrankheit ergab sich eine hochsignifikante Korrelation (p=0.006, r=0.3; Median (Spannweite): 42,8 (9,1-86,3)).

Das Gaubius Institut (Leiden, Niederlande) stellte fünf Plasmaproben, die in unterschiedlichem Ausmaß frei vom F XII-abhängigen Plasminogenaktivator waren, zur Verfügung. Es ergab sich eine hochsignifikante Korrelation (p=0.0002, r=0.995) zwischen der Aktivität des F XII-abhängigen Plasminogenaktivators (Fibrinplattenmethode) und der i-PA Aktivität (i-PA Assay).

Bei 8 Patienten mit Myokardinfarkt wurde die intrinsische fibrinolytische Aktivität mit Fibrinplatten bestimmt, wobei mit Hilfe von u-PA Antikörpern zwischen dem u-PA Anteil und dem F XII-abhängigen Anteil unterschieden wurde. Parallel wurde die i-PA Aktivität im i-PA Assay bestimmt. Es zeigte sich eine signifikante Korrelation zwischen der i-PA Aktivität und der totalen intrinsischen Aktivität und zwischen dem F XII-abhängigen Teil und der i-PA Aktivität. Keine Korrelation bestand zwischen der i-PA Aktivität und dem u-PA-abhängigen Teil (Abb.37a-c).

Die Spezifität der Methode wurde mit Hilfe der Gelfiltration bestimmt. Die Proteine der DSAPP wurden dabei nach ihrem Molekulargewicht fraktioniert erhalten (high liquid gelfiltration column (Superose 12 HR10/30 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (HPLC); Fließrate: 0.4ml/Min.) und die Reaktivität der Einzelfraktionen im i-PA Assay überprüft. Es wurde die i-PA Aktivität in 48 Fraktionen mit Hilfe der chromogenen Substrate S-2288, S-2366 (Abb.38a), S-2251, S-2302 und S-2444 (Abb.38b) gemessen. Es konnte mit allen


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Abbildung 37 : Korrelation zwischen der Aktivität im i-PA Assay von Dextransulfat-stimulierten, angesäuerten Plasmaproben (DSAP) und der Fibrinplattenmethode mit Dextransulfat-stimulierter Euglobulinfraktion (DEF) (BAU: blood activator units nach Kluft, 186) bei Plasmaproben von 8 Myokardpaienten.

(a) Korrelation zwischwn totaler intrinsischer fibrinolytischer Aktivität und i-PA Aktivität, b) F XII-abhängige fibrinolytische Aktivität, d,h. der Aktivität nach Einsatz von u-PA Antikörpern, und i-PA Aktivität und c) u-PA abhängige fibrinolytische Aktivität, d.h. totale Aktivität ohne die F XII-abhängige Aktivität, und i-PA Aktivität.

 


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Abbildung 38 : Bestimmung der i-PA Aktivität in 48 Proteinfraktionen, die entsprechend ihrem Molekulargewicht mit der Methode der Gelfiltration fraktioniert erhalten wurden

a) mit Hilfe der chromogenen Substrate S-2228, S2366 und b) mit S-2251, S2302 und S-2444.

 


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Abbildung 39 : Histiogramm der i-PA Aktivität (n=37 Gesunde); Mittelwert mit Standardabweichung: 97 (17,2)%.

 

Abbildung 40 : Bestimmung der i-PA Aktivität in 6 gepoolten Plasmaproben, die zu 6 verschiedenen Zeitpunkten im Gaubius Institut, Leiden, Niederlande, vom Blut der Mitarbeiter (n=36) gewonnen wurde; Median (Spannweite 25-75%) = 111,7 (107,3-116,3) (Standardabweichung in der Abbildung).

 


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Substraten nur ein isolierter Aktivitätspeak gesehen werden, der einem Molekulargewicht von 134 kD entsprach.

d) detaillierte Beschreibung der evaluierten Methodik

Frisch gewonnenes und antikoaguliertes Blut wurde sofort auf Eis gelegt und bei 2000g während 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das gewonnene Plasma wurde vorzugsweise bei -70°C eingefroren. Wurde die Probe aufgetaut, geschah dies in einem 37°C warmen Wasserbad bis 3/4 des Plasmas flüssig waren. Die restlichen 1/4 wurden durch Schütteln der Probe bei Raumtemperatur aufgelöst. Das Plasma wurde anschließend sofort mit Azetatpuffer (pH=3.9, 0.2 molar) im Verhältnis 1:1 angesäuert. Zu 100 Volumenprozent des resultierenden angesäuerten Plasmas (AP) wurden 75 Volumenprozent DS (MG 1.000.000) zugefügt. Nach sorgfältiger Mischung und einer Inkubation von 20 Minuten erhielt man DSAP. Da Voruntersuchungen (s.Abb.23, Abb.24a),b)) gezeigt hatten, daß das so gewonnene DSAP bis zu 2 Stunden lang seine Aktivität nicht veränderte, war eine parallele Bestimmung der Aktivität von mehreren Plasmaproben möglich. DSAP hatte einen pH von 4.4+0.2 und das Plasma war 3.5fach verdünnt. 20µl DSAP wurden auf Mikrotiterplatten pipetiert, die 135 µl Puffer pro Vertiefung (0.1 M Tris-HCL/ 0.1% Tween 80, pH 8.47) enthielten. Als letzter Schritt wurde das chromogene Substrat S-2251 (Chromogenix) mit einer Endkonzentration von 0.69 mmolar (verdünnt mit dem Tris-Tween Puffer) in jede Vertiefung gegeben. Die spektrophotometrischen Veränderungen der Absorbtion pro Stunde bei 405 nm wurde während 2 Stunden in 15 minütigen Abständen aufgezeichnet und die Aktivität ausgedrückt als Prozent der Aktivität von gepooltem Normalplasma (DSAPP) - abgelesen an einer Standardkurve mit verschiedenen Verdünnungsstufen von Normalplasma. Zur Bestimmung von Nullwerten wurde die DS Stimulation ersetzt durch Zugabe von destilliertem Wasser (H2OAPP). Diese Nullwerte - meist Null - wurden von den DSAP bzw. in der Standardkurve von den DSAPP Werten abgezogen, um die i-PA Aktivität zu erhalten.

e) Normalwerte und Verteilung der i-PA Aktivität

Bei der i-PA Aktivität konnte Normalverteilung (5%) (Martinez und Iglewicz Test, 226) mit einem signifikanten Normalitätstestwert (1,185) gemessen werden (Abb.39).

Zusätzlich wurde die i-PA Aktivität in gepooltem Plasma bestimmt, das zu sechs unterschiedlichen Zeitpunkten innerhalb von 3 Jahren gewonnen worden war (Abb.40).

5.2.2. Bestimmung der Parameter des intrinsischen fibrinolytischen Systems während orthotoper Lebertransplantation

In der folgenden Untersuchung wurden die u-PA Parameter nicht mit dem kommerziell erhältlichen Kit von Biopool sondern mit den sensitiveren in Leiden entwickelten Assays gemessen (scu-PA und tcu-PA im BIA und die Summe von scu-PA, tcu-PA und tcu-PA-Inhibitorkomplexen, d.h. u-PA Ag im ELISA) (vgl.3.3.1.).

Die i-PA Aktivität wurde mit Hilfe der neu entwickelten chromogenen Substratmethode bestimmt (s.5.2.1.).


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5.2.2.1.  u-PA

In einer ersten Studie (129,134) untersuchten wir das Verhalten von u-PA während OLT. Bei 29 Patienten (Tab.2) wurden zu 7 verschiedenen Zeitpunkten während der OLT arterielle Blutproben entnommen. Alle Patienten erhielten intraoperativ eine kontinuierliche Aprotinin-Infusion beginnend mit 0,2 Millionen KIU/Std. mit Anästhesiebeginn und 0,4 Millionen KIU/Std. mit Beginn der anhepatischen Phase. Mit Operationsende wurde die Dosierung auf 0,1 Mill. KIU/Std. reduziert und Heparin in einer Dosierung von 250 IE/Std. gegeben.

Es wurden die Konzentrationen von u-PA Ag, scu-PA, tcu-PA und die t-PA Aktivität bestimmt. Zeichen einer Hyperfibrinolyse oder gesteigerten Fibrinolyse wurden mit dem TEG erfaßt (s.3.3.1.).

Tabelle 7 :Diagnose und Charakteristika von 29 Patienten mit primärer orthotoper Lebertransplantation

Diagnose

Anzahl

weibl.

männl.

Alter*

Postnekrotische Zirrhose

15

6

9

43(22-63)

Alkoholtoxische Zirrhose

3

2

1

57(46-60)

Akute Hepatitis

2

2

0

25,37

Primäre biliäre Zirrhose

4

4

0

50(40-47)

Primäre sklerotische Zirrhose

4

0

4

48(42-56)

Leberzellcarcinom

1

0

1

44

Total

29

14

15

44,5(22-63)

*Median(Spannbreite) in Jahren

5.2.2.1.1. Ergebnisse (1)

Mittels TEG fanden sich keine Anhaltspunkte für eine signifikante Hyperfibrinolyse (119) bei allen 29 OLTs während des Beobachtungszeitraumes bis 60 Minuten nach Beginn der Reperfusion. Zeichen einer gesteigerten Fibrinolyse mit Hilfe der MA+45/MA Ratio waren am ausgeprägtesten in der anhepatischen Phase (Abb.41).

Präoperative Medianwerte von u-PA Ag und scu-PA lagen mehr als 2-fach höher als die medianen Normalwerte (p>0.01). Am Ende der präanhepatischen Phase konnte ein leichter Abfall beider Parameter (Abb.42) (scu-P:n.s.) beobachtet werden gefolgt von stabilen Werten in der anhepatischen Phase. Mit Reperfusion der Spenderleber kam es zu hochsignifikanten Abfällen von u-PA Ag und scu-PA, die 60 Minuten später nur noch minimal erhöht waren (u-PA Ag) bzw. völlig (scu-PA) im Normalbereich lagen.

Präoperative Medianwerte der tcu-PA Konzentration (Abb.42) lagen deutlich über der Nachweisgrenze; in einem Kollektiv von gesunden Probanden lagen sie hingegen unterhalb der Nachweisgrenze (119). Nach einem nicht signifikanten Abfall in der präanhepatischen und anhepatischen Phase konnte während letzterer ein signifikanter zweifacher Anstieg der tcu-PA Werte gesehen werden. Der sich anschließende Abfall erreichte erst 60 Minuten nach Reperfusionsbeginn ein Signifikanzniveau. Die Werte lagen jedoch zu diesem Zeitpunkt noch immer 2-fach über der Nachweisgrenze und unterschieden sich nicht von den Ausgangswerten. Bei 3 Patienten lagen die tcu-PA Werte während der gesamten Operation unterhalb der Nachweisgrenze.

Die t-PA Aktivitätswerte lagen präoperativ im oberen Normalbereich. Während der präanhepatischen und anhepatischen Phasen (Abb.43) zeigte die t-PA Aktivität einen allmählichen Anstieg, der am Ende der anhepatischen Phase Signifikanzniveau erreichte. Mit Reperfusion kam es zu einem Abfall der t-PA Aktivitätswerte in den Normalbereich.


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Einer der 29 transplantierten Patienten wurde von den statistischen Berechnungen in Abb.42 und 43 ausgeschlossen, weil die präoperativen u-PA und t-PA Werte extrem hoch lagen und


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Abbildung 41 : Verhältnis der Thrombelastogrammparameter MA +45 (=Amplitude 45 Minuten nach der Maximalamplitude (MA)) und MA (= MA+45/MA Ratio) im Verlauf von 29 orthotopen Lebertransplantationen in der anhepatischen Phase und in der Reperfusionsphase.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

3

4

5

6

7

MA+45/MA

0,75-0,92

0,82-0,95

0,82-0,97

0,8-0,99

0,87-0,97

Statistische Signifikanzen

 
 

p(3/6)

p(3/7)

p(4/6)

p(4/7)

MA+45/MA

= 0.0046

= 0.0052

= 0.0029

= 0.0026


[Seite 75↓]

Abbildung 42 : Verlauf der Konzentrationen von urokinase-type Plasminogenaktivator Antigen (u-PA Ag), single chain u-PA (scu-PA) und two chain u-PA (tcu-PA) während 28 orthotoper Lebertransplantationen.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

u-PA Ag (ng/ml)

3-14,5

2,1-11

1,8-9

2,5-10

2,6-8,8

2,4-8

1,7-8

scu-PA (ng/ml)

0-6,54

1,7-6,7

0,7-5,3

1,2-5,7

0,8-4,4

0,7-4

3-5,2

tcu-PA (ng/ml)

0-1

0-0,9

0-1

0-1,14

0-0,9

0-0,9

0-1

Statistische Signifikanzen

 

u-PA Ag

p(1/2)=0.002

p(4/5)=0.0003

p(4/6)=0.0004

p(4/7)=0.000001

scu-PA

 

p(4/5)=0.006

p(4/6)=0.0001

p(4/7)=0.0007

tcu-PA

p(3/4)=0.0235

  

p(4/7)=0.0335


[Seite 76↓]

Abbildung 43 : Verlauf der t-PA (tissue-type Plasminogenaktivator) Aktivitäten in 28 orthotopen Lebertransplantationen und einer getrennt ausgewerteten Transplantation mit hochsignifikant höheren Ausgangswerten.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

t-PA Akt. (IU/ml)

0-3,6

0-26,8

0,3-19

1,2-17

0-29

0-27

0-7,1

Statistische Signifikanzen

 

t-PA Aktivität

p(1/4)=0.0023

p(4/6)=0.0002

p(4/7)=0.00001


[Seite 77↓]

Abbildung 44 : Verlauf von urokinase-type Plasminogenaktivator Antigen (u-PA Ag), single chain u-PA (scu-PA) und two chain u-PA (tcu-PA) bei einer Patientin, deren Werte während der orthotopen Lebertransplantation getrennt ausgewertet wurden, da hochsignifikant höhere Ausgangswerte vorlagen.


[Seite 78↓]

die Wahrscheinlichkeit, daß diese Konzentrationen von u-PA Ag, scu-PA und tcu-PA und die t-PA Aktivitätswerte Teil der untersuchten Gruppe der anderen OLTs waren, geringer als 10-5 (p(u-PA Ag)<10-7, p(scu-PA)<10-5, p(tcu-PA)<10-5, p(t-PA)<10-5) war (116). Es handelte sich um eine 22-jährige Frau, die seit 14 Jahren an einer autoimmunen Hepatitis mit schwerer Leberzirrhose litt. Bei der Laparatomie zeigte sich eine diffuse Peritonitis mit 6 Litern purulenter Aszitesflüssigkeit. Während der OLT fielen die u-PA Ag Werte von präoperativ 128 auf 20,5 ng/ml, die scu-PA Werte von 70,2 auf 4,5 ng/ml und die tcu-PA Werte von 19 auf 3,5 ng/ml ab (Abb.44). Die t-PA Aktivitätwerte waren 8,25 IU/ml zu Beginn der Operation und fielen während der Operation auf 0,010 IU/ml ab (Abb.43). Zwei Tage nach der OLT kam es bei der Patientin zu diffuser intraabdomineller Blutung mit konsekutivem Transplantatversagen, das eine Retransplantation erforderlich machte. Diese verlief erfolgreich. In der untersuchten Gruppe war dies die einzige Patientin mit diffuser Peritonitis intraoperativ und schweren Blutungskomplikationen postoperativ, die zur Retransplantation führten.

5.2.2.1.2. Diskussion (1)

Die erhöhten u-PA Werte im Plasma präoperativ sind vereinbar mit der verlängerten Halbwertszeit von u-PA bei Patienten im Endstadium einer Lebererkrankung (179). Der geringfügige, jedoch teilweise signifikante Abfall von u-PA Ag und scu-PA während der präanhepatischen Phase könnte als transfusioneller Verdünnungseffekt erklärbar sein. In der anhepatischen Phase war jedoch auffällig, daß es trotz Fehlen der hepatischen Clearance von u-PA nicht zu einem Anstieg von u-PA Ag und scu-PA kam. Wäre für u-PA die Leber nicht nur Clearanceorgan sondern auch Syntheseort, würde der Ausfall beider Funktionen in der anhepatischen Phase die relativ stabilen Werte erklären.

Tcu-PA, d.h. die aktive u-PA Form, stieg in der anhepatischen Phase signifikant an. Dieses macht einen Prozeß der scu-PA Aktivierung in dieser Phase wahrscheinlich. Parallel ist ein langsamerer, aber ebenfalls signifikanter Anstieg der t-PA Aktivität zu beobachten.

Der Abfall der u-PA Parameter mit Revaskularisation der Spenderleber ist durch die beginnende hepatische Clearance erklärt.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, daß erstens neben t-PA auch u-PA eine Rolle bei der Entwicklung der gesteigerten Fibrinolyse bei OLT spielt und daß zweitens die vorliegenden Daten die Leber als u-PA Syntheseorgan wahrscheinlich machen.


[Seite 79↓]

In einer 2. Untersuchung (138) wurden bei 43 OLTs (Tab.3) u-PA Parameter im Perfusat der Spenderleber und in der korrespondierenden systemischen Zirkulation 5 Minuten nach Reperfusion gemessen. Elf Patienten erhielten Aprotinin als dreimaligen Bolus (Abb.6) und die folgenden 32 Patienten als kontinuierliche Infusion (vgl.5.2.2.1.).

Tabelle 8 :Diagnose und Charakteristika von 43 Patienten mit primärer orthotoper Lebertransplantation (Alter (Median (Spannbreite) in Jahren)

 

Aprotinin als
Bolusgabe

Aprotinin als
Infusionsgabe

Diagnose

weibl.

männl.

Alter*

weibl.

männl.

Alter*

Postnekrotische Zirrhose

2

3

50(45-64)

7

11

45(22-63)

Alkoholtoxische Zirrhose

3

1

48(39-55)

2

2

54(46-60)

Akute fulminante Hepatitis

0

0

-

2

0

25,57

Primäre biliäre Zirrhose

0

0

-

4

0

50(40-47)

Primäre sklerotische Cholangitis

0

0

-

0

4

48(42-56)

Sekundäre biliäre Zirrhose

0

1

51

0

0

-

Budd-Chiari Syndrom

1

0

46

0

0

-

Total

6

5

49(39-64)

15

17

45(22-63)

*Median(Spannbreite) in Jahren

5.2.2.1.3. Ergebnisse (2)

Die medianen u-PA Ag Werte lagen im Perfusat und in der korrespondierenden Zirkulation 1.6-fach über den Medianwerten einer Kontrollgruppe von 50 Gesunden (p<0.01) (Abb.45). Die Perfusatspiegel lagen gering, aber signifikant höher als die systemischen Spiegel. Wurde die Art der Aprotiningabe berücksichtigt, ergab sich bei Bolusgabe kein signifikanter Unterschied zwischen Perfusat und systemischen Spiegeln, während bei höherdosierter Infusionsgabe die Werte im Perfusat signifikant über den systemischen Werten lagen (Abb.46).

Die medianen scu-PA Werte lagen im Vergleich zum Normalkollektiv systemisch 1.2-fach und im Perfusat 1.7-fach höher (beide: p<0.01). Sowohl in der gesamten Gruppe als auch in der Unterteilung nach Art der Aprotininapplikation lagen die Perfusatwerte signifikant über den korrespondierenden systemischen Werten (Abb.45,46).

Die medianen tcu-PA Werte lagen systemisch 2-fach und in den Perfusatproben 2.6-fach über der Nachweisgrenze (Abb.45). Sowohl in der gesamten Gruppe als auch bei Bolusgabe lagen die tcu-PA Werte im Perfusat signifikant über den systemischen Werten.

5.2.2.1.4. Diskussion (2)

Bei der Interpretation der Ergebnisse muß man sich vergegenwärtigen, daß das Perfusat eine Mischung aus Blut und Konservierungslösung ist. Es ist daher von einer erniedrigten Konzentration der Plasmaproteine im Perfusat im Vergleich zur systemischen Zirkulation auszugehen (vgl.Tab.10). Die deutlich erhöht gemessenen u-PA Parameter im Perfusat sprechen daher für eine hepatische u-PA Freisetzung als Hinweis auf eine mögliche hepatische Synthese.


[Seite 80↓]

Abbildung 45 : Konzentrationen von urokinase-type Plasminogenaktivator Antigen (u-PA Ag), single chain u-PA (scu-PA) und two chain u-PA (tcu-PA) im Perfusat (P) und der korrespondierenden systemischen Zirkulation (S) bei 43 orthotopen Lebertransplantationen (Spannweiten in der Abbildung).

Statistische Signifikanzen

 

u-PA Ag

p(P/S)<0.01

scu-PA

p(P/S)<0.01

tcu-PA

p(P/S)<0.01

[Seite 81↓]

Abbildung 46 : Konzentrationen von urokinase-type Plasminogenaktivator Antigen (u-PA Ag), single chain u-PA (scu-PA) und two chain u-PA (tcu-PA) im Perfusat (P) und in der korrespondierenden systemischen Zirkulation (S) bei 11 orthotopen Lebertransplantationen, bei denen Aprotinin als Bolus und bei 32 orthotopen Lebertransplantationen, bei denen Aprotinin als höherdosierte Infusion gegeben wurde (Spannweiten in der Abbildung).

Statistische Signifikanzen

 
 

Infusionspatienten

Boluspatienten

u-PA Ag

p(P/S)<0.01

p(P/S) n.s.

scu-PA

p(P/S)<0.05

p(P/S)<0.05

tcu-PA

p(P/S) n.s.

p(P/S)<0.05


[Seite 82↓]

Wurden die Ergebnisse in Abhängigkeit von der Art der Aprotininapplikation ausgewertet, ergab sich, daß in Gegenwart höherer Aprotininwerte (Infusionsgabe) tcu-PA Werte vergleichbar in Perfusat und systemischer Zirkulation waren, während u-PA Ag und scu-PA Werte im Perfusat signifikant höher lagen. Bei niedrigeren Aprotininwerten (Bolusgabe) waren die u-PA Ag Werte in Perfusat und systemischer Zirkulation vergleichbar. Scu-PA und tcu-PA lagen jedoch im Perfusat signifikant höher.

Durch die unterschiedliche Patientenzahl bei der Gabe von Aprotinin als Bolus- bzw. Infusion ist die Vergleichbarkeit von Werten im Perfusat und systemischer Zirkulation begrenzt. Dieses könnte erklären, warum die höheren u-PA Ag Werte im Perfusat der größeren Infusionsgruppe in der kleineren Bolusgruppe nicht wiedergefunden wurden. Höhere tcu-PA Perfusatspiegel bei Aprotininbolusgabe und fehlender Unterschiedlichkeit bei Infusionsgabe sprechen für eine verstärkte scu-PA Aktivierung in der Spenderleber in Gegenwart niedrigerer Aprotininspiegel. Tcu-PA wird durch hydrolytische Spaltung von scu-PA unter Einwirkung der Proteasen Plasmin und Kallikrein freigesetzt (10). Beide werden durch Aprotinin gehemmt. Die vorliegenden Ergebnisse lassen sich mit der Vorstellung vereinbaren, daß höhere Konzentrationen von Aprotinin (Abb.67) die Freisetzung beider Proteasen und damit die tcu-PA Entstehung hemmen. Auswirkungen des für Aprotinin beschriebenen zytoprotektiven Effektes (210) konnten bei den vorliegenden Ergebnissen nicht gefunden werden. Eine höhere Aprotininkonzentration führte nicht zur verminderten hepatischen u-PA Freisetzung.

5.2.2.2. i-PA

Wir untersuchten die aktivierbare i-PA Aktivität im Verlauf von 47 OLTs (Tab.9). 13 Patienten erhielten Aprotinin als Bolus (Abb.6) - und 34 Patienten als Infusionsgabe (s.5.2.2.1.).

Tabelle 9 : Diagnose und Charakteristika von 47 Patienten mit primärer orthotoper Lebertransplantation

Diagnose

Anzahl

weibl.

männl.

Alter*

Postnekrotische Zirrhose

23

9

14

47(21-64)

Alkoholtoxische Zirrhose

8

5

3

52(39-60)

Akute Hepatitis

3

3

0

29(23-37)

Budd-Chiari Syndrom

1

1

0

46

Primäre biliäre Zirrhose

4

4

0

50(40-47)

Sekundäre biliäre Zirrhose

1

0

1

51

Primäre sklerotische Zirrhose

4

0

4

48(42-56)

Leberzellcarcinom

2

0

2

45,60

Metastasenleber

1

0

1

45

Total

47

22

25

44(21-63)

Median(Spannbreite) in Jahren

5.2.2.2.1. Ergebnisse

Präoperative i-PA Aktivitätswerte waren signifikant (p<0.0001) tiefer als in einer normalen Kontrollgruppe (n=37, vgl.5.2.1.e)).


[Seite 83↓]

Abbildung 47 : Intrinsische Plasminogenaktivator (i-PA) Aktivität im Verlauf von 47 orthotopen Lebertransplantationen und im Perfusat (P).

Spannweite n

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

8

P

i-PA AU/µl

0-79,3

1-100,4

3,4-82,6

6,7-74,2

6-76,2

2,3-77,8

7,7-50

12,9-48,9

1,1-43,9

Statistische Signifikanzen

 

i-PA

p(3/5)=0.0031

p(3/4)=0.0024

p(5/6)=0.0019

p(4/P)=0.0000

p(5/P)=0.000


[Seite 84↓]

Bis zum Ende der anhepatischen Phase und in der frühen Reperfusionsphase war ein signifikanter Anstieg der i-PA Aktivität erkennbar gefolgt von einem Abfall 15 Minuten nach Reperfusionsbeginn. Die Perfusatspiegel lagen hochsignifikant unter den Spiegeln in der systemischen Zirkulation (Abb.47). Bei Berücksichtigung der unterschiedlichen Aprotininmedikation fielen signifikant niedrigere Spiegel in der höherdosierten Infusionsgruppe auf bei tendenziell gleichartigem Verlauf.

5.2.2.2.2. Diskussion

Während der anhepatischen Phase kam es zum hochsignifikanten Anstieg der i-PA Aktivität. Bei Interpretation der Werte muß in Betracht gezogen werden, daß intraoperativ bei allen OLTs Aprotinin - in der Mehrzahl der untersuchten Patienten als höher dosierte kontinuierliche Infusion (s.5.2.2.1.) - gegeben wurde. Systemisch wurden dabei mediane Spiegel von 60 KIU/ml zu Beginn der anhepatischen Phase und von 100 KIU/ml zu Beginn der Reperfusion erreicht. Diese Spiegel lagen weit über der 50%igen Inhibitordosis von Aprotinin (5.2.1.c)) gegenüber der i-PA Aktivität und erklärten daher die im Vergleich zu Normalpersonen deutlich niedrigeren i-PA Spiegel. Der beobachtete anhepatische i-PA Anstieg wurde trotz der Dosiserhöhung der Aprotininmedikation zu diesem Zeitpunkt beobachtet. Bei fehlender Aprotininmedikation wäre daher in diesem Zeitraum eine wesentlichere Steigerung der i-PA Aktivität zu erwarten. Es kann somit von einer Steigerung der aktivierbaren i-PA Aktivität während der anhepatischen Phase ausgegangen werden. Die hochsignifikant niedrigeren i-PA Werte im Perfusat lassen sich durch die Verdünnung mit Konservierungslösungsresten (vgl.Kapitel 5.6.) erklären. Sie sprechen gegen eine hepatische Freisetzung bzw. Synthese von i-PA.

5.2.2.3. Zusammenfassende Diskussion

Beim intrinsischen fibrinolytischen System müssen zunächst Proaktivatoren aktiviert werden. Dieses kann indirekt durch Plasminentstehung im Rahmen des extrinsischen fibrinolytischen Systems oder direkt durch externe Triggermechanismen wie Fremdoberflächenkontakt des Blutes gegeben sein. Die potentielle Aktivität des intrinsischen fibrinolytischen Systems liegt weit über der Kapazität des extrinsischen Systems (188).

Während der anhepatischen Phase der OLT konnte eine deutliche Steigerung der intrinsischen fibrinolytischen Aktivität (i-PA, u-PA) gefunden werden (Abb.48). Der hypothetisch verantwortliche Pathomechanismus führt zunächst zur t-PA Erhöhung zum einen durch das Fehlen der Leber als Clearanceorgan von t-PA und zum anderen durch Stauung des Blutes im venösen System mit vermehrter endothelialer t-PA Freisetzung. In einer Untersuchung (12) wurde der anhepatische t-PA Anstieg in Abhängigkeit vom Vorhandensein eines veno-venösen Bypasses untersucht. Es ergaben sich keine Unterschiede, sodaß der veno-venöse Bypass keinen Einfluß auf die t-PA Spiegel zu haben scheint. Operativ gesteigerte Fibrinbildung erhöht zusätzlich die t-PA Aktivität. Es kommt zunächst lokal - im Bereich der Fibringerinnsel - zur t-PA induzierten Plasmingenerierung. Plasmin baut Fibrin ab und initiiert andererseits die Aktivierung des intrinsischen fibrinolytischen Systems. Es überführt scu-PA in seine zweikettige Form, aktiviert F XII und führt damit zur Kallikreingeneration, wodurch die Voraussetzungen zur i-PA Aktivierung gegeben sind (Abb.2). Die intrinsischen Plasminogenaktivatoren tcu-PA und i-PA führen in einer feed-back Reaktion zur zunehmenden Plasminfreisetzung, wodurch die primär eher schwache, lokalisierte,


[Seite 85↓]

Abbildung 48 : Pathophysiologie der Hyperfibrinolyseentwicklung bei der orthotopen Lebertransplantation.

 


[Seite 86↓]

Abbildung 49 : Therapeutische Ansatzpunkte von Aprotinin bei der Verminderung der Hyperfibrinolyseentwickling während orthotoper Lebertransplantation.


[Seite 87↓]

extrinsische fibrinolytische Aktivität exponentiell gesteigert wird. Darüberhinaus kommt das Blut während der anhepatischen Phase über den veno-venösen Bypass in Kontakt mit einer Fremdoberfläche, wodurch weitergebend eine gesteigerte Aktivierung des Kontaktsystems induziert wird (Abb.48).

Zusammenfassend kann festgehalten werden, daß während der anhepatischen Phase mehrere Aktivierungsmechanismen des fibrinolytischen Systems potenzierend ineinandergreifen. Bei Operationen mit kardiopulmonalen Bypässen konnten vergleichbare Ergebnisse gefunden werden (95,189,341).

Das Fehlen der hepatischen Clearancefunktion in der anhepatischen Phase bedingt Aktivitätssteigerungen von t-PA, u-PA und i-PA, die über die jeweiligen Konzentrationsveränderungen hinausgehen und zusammen mit einer verlängerten biologischen Halbwertszeit von freiem Plasmin zu einer mitunter klinisch relevanten Hyperplasminämie bzw. Hyperfibrinolyse führen (Abb.48).

Aprotinin hemmt Kallikrein, Plasmin, i-PA und u-PA und greift auf diese Weise regulierend in eine überschießende Aktivierung des fibrinolytischen Systems ein (Abb.49). Damit erklären sich die weitgehend fehlenden Zeichen einer Hyperfibrinolyse bei höher dosierter Aprotinin-Infusion (126).

Die Ergebnisse machen deutlich, daß das intrinsische fibrinolytische System in Interaktion mit dem extrinsischen fibrinolytischen System entscheidend zur Entwicklung der gesteigerten Fibrinolyse bei OLT beiträgt (118) und daß dem extrinsischen fibrinolytischen System dabei die wesentliche Triggerfunktion zukommt. Weiterhin wird deutlich, daß u-PA durch die Leber geklärt, aber wohl auch synthetisiert wird, während die Leber bei i-PA nur eine Clearancefunktion einnimmt.

Spätere Untersuchungen bestätigten (175) diese Ergebnisse, doch konnten andere Untersucher (296) bei laboranalytischer Beschränkung auf F XII und C1-Esteraseinhibitor diese Interpretation nicht untermauern.


[Seite 88↓]

5.3.  Bedeutung der Faktor XIII Aktivität bei orthotoper Lebertransplantation

Wir untersuchten im Verlauf von 10 konsekutiven OLTs (Diagnosen vgl. Tab.10) das Verhalten von F XIII in der systemischen Zirkulation und im Perfusat (131). Dabei wurde die F XIII Aktivität mit dem etablierten Clot Solubilitätstest (166) und einem neu eingeführten photometrischen Assay (85) (vgl. 3.3.2.) gemesen.

Aprotinin wurde als kontinuierliche Infusion gegeben (s.5.2.2.1.).

Tabelle 10 : Diagnose und Charakteristika von 10 Patienten mit primärer orthotoper Lebertransplantation

Diagnose

Anzahl

weibl.

männl.

Alter*

Postnekrotische Zirrhose

6

3

3

37(21-52)

Primäre biliäre Zirrhose

1

2

0

48(42-51)

Primäre sklerotische Zirrhose

1

1

0

48

Leberzellcarcinom

1

0

1

45

Total

10

6

4

43(21-52)

*Median(Spannbreite) in Jahren

5.3.1. Ergebnisse

Die Durchführung des photometrischen Assays mit Hilfe eines Autoanalysers war mehr als 10-mal so schnell wie der Clot Solubilitätstest. Es zeigte sich eine sehr gute Präzision innerhalb einer Serie und zwischen verschiedenen Serien (‘within-run’ und ‘day to day precision’), und es konnte eine hochsignifikante Korrelation zwischen den Werten beider Assays beobachtet werden (Abb.50).

Präoperative F XIII Aktivitätswerte (Abb.51) lagen niedriger als in einer normalen Vergleichsgruppe (p<0.01). Mit Beginn der anhepatischen Phase kam es zum signifikanten Abfall der F XIII Aktivität gefolgt von einem kurzen nicht signifikanten Anstieg in der Reperfusionsphase und einem signifikanten Abfall 10 Minuten später. Im Perfusat lagen die F XIII Aktivitätswerte weit über den systemischen Werten.

5.3.2. Diskussion

Während Hämostaseaktivierung mit gesteigerter Thrombin- und Fibrinbildung kommt es zu erniedrigten Plasmaspiegeln von F XIII, da F XIII zusammen mit Fibrin präzipitiert. Bei hyperfibrinolytischen Zuständen entsteht vermehrt Plasmin. Dieses führt bei Überschreiten des Inhibitorpotentials zu einem freien Vorkommen von Plasmin im Plasma. Plasmin spaltet nicht nur Fibrin sondern im Plasma auch Fibrinogen, F V, F VIII und F XIII. Bei OLT kommt es sowohl zur Hyperfibrinolyse als auch zur Hämostaseaktivierung. Beide sind in der Lage die F XIII Spiegel zu reduzieren. Es ist daher vorstellbar, daß reduzierte F XIII Spiegel eine bedeutende Rolle bei der erhöhten Blutungsneigung intra- und postoperativ spielen. Einen erworbenen partiellen Mangel an F XIII beobachtet man darüberhinaus bei ausgeprägter Leberzirrhose (20).

Bei den F XIII Untersuchungen im Verlauf der OLTs konnte während der anhepatischen Phase ein Abfall der F XIII Aktivität beobachtet werden. Dies ist wahrscheinlich durch die gesteigerte Fibrinolyse in dieser Phase zu erklären. Eine fehlende hepatische Synthese hat bei der langen Halbwertszeit von F XIII (ca. 50 Stunden) nur eine untergeordnete Bedeutung. Die


[Seite 89↓]

Abbildung 50 : Korrelation zwischen photometrisch gemessenen und im Clot Solubilitätstest bestimmten F XIII Aktivitäten (n=24).


[Seite 90↓]

Abbildung 51 : Verlauf der F XIII Aktivität bei 10 orthotopen Lebertransplantationen und im Perfusat (P).

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

P

F XIII (%)

32-122

36-136

34-105

46-119

32-98

23-96

17-91

41-143

Statistische Signifikanzen

 

F XIII

p(2/3)=0.04

p(5/6)=0.02

p(5/P)=0.07


[Seite 91↓]

Spannweite der F XIII Aktivität zeigte, daß es 60 Minuten nach Beginn der Reperfusionsphase zu Werten unter 20% bei einigen Patienten kam. Bei kongenitalem F XIII Mangel kommt es erst bei F XIII Werten unter 5% zu Spontanblutungen (214). Jedoch muß davon ausgegangen werden, daß bei den komplexen Gerinnungsstörungen während OLT auch geringradig erniedrigte Werte an einer gesteigerten Blutungsneigung und einer gestörten postoperativen Wundheilung Anteil haben können (78,115,119,120,125,275). Mit Beginn der Reperfusion und der in dieser Phase nachgewiesenen gesteigerten Prothrombinaktivierung wären abfallende F XIII Werte zu erwarten gewesen. Überraschenderweise lagen die F XIII Werte im Perfusat höher als in der systemischen Zirkulation, und systemisch kam es mit Reperfusionsbeginn zum Anstieg der Werte. Dieses spricht für eine F XIII Freisetzung aus der Spenderleber, die den erwarteten F XIII Abfall überlagert. Die Ergebnisse bestätigen Voruntersuchungen der F XIII A und B Untereinheiten bei Knochenmark- und Lebertransplantationen, die deutlich machten, daß das F XIII A Protein in Zusammenhang mit der Hämatopoese (höchstwahrscheinlich in Megakaryozyten) und die F XIII B Untereinheit in der Leber gebildet wird (357).

Die photometrische Bestimmungsmethode zeigte eine hohe Präzision und eine hochsignifikante Korrelation zu dem Clot Solubilitätstest. Dadurch konnten vorhergehende Untersuchungen (85) bestätigt werden. Die photometrische Bestimmungsmethode erlaubt die schnelle und einfache Bestimmung der F XIII Aktivität bei Gerinnungs- und Wundheilungsstörungen. Sie ermöglicht die rasche Detektion einer F XIII Mangelsituation und schafft damit die Vorraussetzung zur möglichen Substitutionstherapie, die auch im Rahmen von Blutungskomplikationen bei OLT in Betracht gezogen werden kann.


[Seite 92↓]

5.4.  Bedeutung leukozytärer Aktivierungsprodukte, Endothel-Leukozyten-Adhäsionsmoleküle und des Endothelzellmarkers Thrombomodulin bei der Pathogenese von Hämostasestörungen während orthotoper Lebertransplantation

5.4.1. Leukozytäre Aktivierungsprodukte

Die Bedeutung der Leukozyten in der Pathogenese der gesteigerten Gerinnungsaktivierung bei OLT wurde durch Bestimmung ihrer Mediatoren, Kathepsin B, Elastase, TNF und Neopterin sowie der TAT Komplexe als Marker vor, während und nach 13 OLTs (Tab.11) untersucht (141). Die Patienten erhielten Aprotinin als kontinuierliche Infusion (s.5.2.2.1.).

Tabelle 11 : Diagnose und Charakteristika von 13 Patienten mit primärer orthotoper Lebertransplantation

Diagnose

Anzahl

weibl.

männl.

Alter*

Postnekrotische Zirrhose

8

4

4

49 (24-65)

Primäre biliäre Zirrhose

2

2

0

49,52

Primäre sklerotische Zirrhose

2

2

0

42,48

Alkoholtoxische Zirrhose

1

0

1

47

Total

13

8

5

48 (24-65)

*Median(Spannbreite) in Jahren

5.4.1.1. Ergebnisse

TAT Komplexe (Abb.52) stiegen langsam in der präanhepatischen und anhepatischen Phase an gefolgt von einem deutlicheren Anstieg in der frühen Reperfusionsphase. In der späteren Reperfusionsphase zwischen einer und 12 Stunden nach Reperfusionsbeginn fielen die Werte signifikant ab mit abgeschwächterem Abfall in den folgenden 48 Stunden. Die Perfusatspiegel der TAT Komplexe lagen tendenziell höher als in korrespondierenden systemischen Proben (Tab.12).

Tabelle 12 : Leukozytäre Mediatoren im Perfusat (P) und in der korrespondierenden systemischen Zirkulation zum Abnahmezeitpunkt 4 (Werte werden gegeben als Median (Spannweite))

Parameter

Perfusat

systemische
Zirkulation (4)

p(P/4)

TNF (pg/ml)

24 (2,5-1020)

16,6 (6,8-52,4)

n.s.

Neopterin (nmol/l)

179 (80-1008)

9,3(5,8-26,4)

0,001

Kathepsin B (mU/l)

45513 (967-524265)

103,5(55,7-204,4)

0,0022

EPI Komplexe (ng/ml)

761 (399-1396)

604 (276-1205)

0,0499

TAT Komplexe (µg/l)

77 (32-1300)

56 (17-381)

0,0995

Die Spiegel des TNF (Abb.52) blieben während der präanhepatischen und anhepatischen Phase unverändert. Mit Revaskularisation der Spenderleber kam es zu einem signifikanten und anhaltenden Anstieg. Maximalwerte wurden 36 Stunden nach Reperfusion gesehen, denen ein hochsignifikanter Abstieg folgte. Kein signifikanter Unterschied bestand zwischen Perfusat- und korrespondierenden systemischen Spiegeln (Tab.12).


[Seite 93↓]

Abbildung 52 : Verlauf der leukozytären Mediatoren (Neopterin, Tumornekrosefaktor (TNF), Elastase-α1-Proteinasekomplexe (EPI), Kathepsin B) und der Thrombin-Antithrombin III (TAT) Komplexe während und nach 23 orthotopen Lebertransplantationen.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

TAT (mg/ml)

7,3-50

8,7-66

14,5-93

17-381

46-800

55-925

44-710

6,7-110

4,5-68

6,6-50

TNF (pg/ml)

10,2-99

7,4-36

10,1-118

6,8-52,4

3,5-447

3,6-444

17,2-377

0-117

11,8-103

4-43

Neopterin (nmol/l)

6-23,8

0-26

7,1-26

5,8-26,4

9,1-82,3

8,9-58,4

7,1-36

6-43,3

12,6-63

9,7-121

Kathepsin B (mU/l)

31,3-238

62,8-247

61,5-243

55,7-204

136-16338

158-5469

93-1180

33-309

36,8-458

37,9-444

EPI (ng/ml)

118-1267

150-1000

199-1445

276-1205

352-1353

349-1797

326-1789

239-1971

204-1326

175-605

Statistische Signifikanzen

 

TAT Komplexe:

p(1/2) =0.0022

p(2/3) =0.0108

p(3/4) =0.0376

p(4/5) =0.0455

p(5/6) =0.0096

p(7/8) =0.0022

p(9/10) =0.0022

Tumornekrosefaktor:

   

p(4/6) =0.0192

p(4/7) =0.0019

 

p(9/10) =0.0029

Neopterin:

   

p(4/5) =0.0015

p(5/6) =0.0464

p(6/7) =0.0030

p(8/9) =0.0281

Kathepsin B:

   

p4/5) =0.0015

p(6/7) =0.0159

p(7/8) =0.0015

 

EPI Komplexe:

  

p(3/4) =0.0330

p(4/5) =0.0058

p(6/7) =0.0107

p(7/8) =0.0046

p(9/10) =0.0033


[Seite 94↓]

Abbildung 53: Verlauf von Aprotininspiegeln während und nach 23 orthotopen Lebertransplantationen.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

P

Aprotinin (KIU/ ml)

0,1-58,1

21,7-87,8

25,7-151,1

28,4-178,9

41,6-198

0-219,1

46,8-282,5

42,2-142,6

17,8-237

13,8-269,3

27,1-131,3

Statistische Signifikanzen

 

Aprotinin

p(1/2) =0.0058

p(2/3)=0.0277

p(3/4)=0.0037

p(7/8)=0.0015

p(8/9)=0.0414


[Seite 95↓]

Abbildung 54 : Korrelationen zwischen leukozytären Mediatoren (Neopterin, Tumornekrosefaktor (TNF), Elastase-α1-Proteinasekomplexe (EPI), Kathepsin B) und Thrombin-Antithrombin III Komplexen (TAT)

a) während und nach 23 orthotopen Lebertransplantationen und
b) im Perfusat (Abnahmezeitpunkt, Signifikanzniveau der Korrelation
(+=tendentiell, *=signifikant, **=hoch signifikant), Korrelationskoeffizient).


[Seite 96↓]

Die Neopterinkonzentrationen (Abb.52) zeigten keine Veränderungen während präanhepatischer und anhepatischer Phase. Mit Reperfusionsbeginn kam es zu einem signifikanten Anstieg mit Maximalwerten 5 Minuten nach Reperfusionsbeginn gefolgt von einem signifikanten Abfall mit Minimum 1 Stunde nach Reperfusionsbeginn und einem zweiten Anstieg mit Maximalwerten 36 Stunden nach Reperfusion. Mediane Perfusatspiegel erreichten 15-fach höhere Konzentrationen im Vergleich zu den korrespondierenden systemischen Spiegeln (Tab.12).

Die Kathepsin B Spiegel (Abb.52) blieben im Verlauf der präanhepatischen und anhepatischen Phase konstant. Mit Reperfusion kam es zu einem exzessiven, hochsignifikanten Anstieg der Werte mit Maximum 5 Minuten nach Reperfusionsbeginn und signifikant niedrigeren Werten 10 Minuten später. 12 Stunden nach Reperfusionsbeginn waren bereits wieder präoperative Werte erreicht. Die Spiegel im Perfusat lagen weit (440-fach) über den korrespondierenden Spiegeln der systemischen Zirkulation (Tab.12).

Die Plasmawerte der EPI Komplexe (Abb.52) stiegen signifikant in der anhepatischen Phase an. Mit Reperfusion kam es zu einem hochsignifikanten Anstieg bis zu Maximalwerten 60 Minuten nach Beginn der Reperfusion gefolgt von einem kontinuierlichen Abfall. Die Spiegel im Perfusat waren signifikant höher (1.3-fach) als in der systemischen Zirkulation (Tab.12).

Signifikant ansteigende Aprotininspiegel (Abb.53) wurden in jeder OLT gesehen mit Maximalwerten in der frühen und späten Reperfusionsphase. Der Vergleich der Perfusatspiegel mit systemischen Werten zeigte signifikant niedrigere Aprotininspiegel im Perfusat (Abb.53).

Signifikante Korrelationen ergaben sich beim Vergleich der Verläufe von TNF, Neopterin, Elastase, EPI-Komplexen und Kathepsin B und zwischen den Spiegeln der leukozytären Mediatoren und der TAT Komplexe. Dieses galt besonders für die Reperfusionsphase (Abb.54). Korrelationen zwischen Aprotinin und leukozytären Parametern bestanden nicht.

Im Perfusat war eine signifikante Korrelation zwischen TNF Spiegeln und Neopterin und zwischen den Konzentrationen von TAT und EPI Komplexen meßbar (Abb.54).

5.4.1.2. Diskussion

Fünfzehnfach erhöhte Neopterinspiegel und 440-fach erhöhte Kathepsin B Spiegel im Perfusat gemeinsam mit einem 100%igen Anstieg der systemischen Neopterinspiegel und einem 700%igen Anstieg der systemischen Kathepsin B Spiegel mit Reperfusion der Spenderleber sprechen für eine Neopterin- und Kathepsin B-Freisetzung aus der Spenderleber, wenn arterielles Blut das partiell geschädigte endotheliale Bett der Spenderleber durchfließt (Flushing, vgl. 3.2.). Während der Konservierung der Spenderleber vor Implantation kommt es zur Schädigung der Leber (171,265,348) mit Alteration nicht nur des Leberzellendothels sondern auch der hepatischen Makrophagen und Leberzellen. So ist insbesondere bei Kathepsin B zusätzlich zur Freisetzung aus Neutrophilen am alterierten Gefäßendothel der Leber von einer intrahepatischen Freisetzung aus Hepatozyten und Makrophagen in der Reperfusionsphase auszugehen, die den extremen Anstieg der Kathepsin B Werte erkärt.

Parallel wurden leicht - aber signifikant - erhöhte Werte der EPI Komplexe und tendenziell erhöhte Konzentrationen der TAT Komplexe im Perfusat gemessen. Da im Perfusat nur die Höhe der TAT und EPI Komplexe signifikant miteinander korrelierten, ist eine Elastase-[Seite 97↓]vermittelte Prothrombinaktivierung in der Spenderleber und ein von der Spenderleber unabhängiger Anstieg von Neopterin und Kathepsin B wahrscheinlich.

In der systemischen Zirkulation konnte mit Beginn der Reperfusion ein Anstieg von Kathepsin B, EPI Komplexen, TNF und Neopterin parallel zu einem signifikanten Anstieg der TAT Komplexe gemessen werden. Auch ergaben sich signifikante Korrelationen zwischen den Parametern der leukozytären Aktivierung und den TAT Komplexen. Nur Kathepsin B korrelierte nicht mit Neopterin und den TAT Komplexen. Diese Ergebnisse sprechen für eine enge Beziehung zwischen leukozytärer Aktivierung und gesteigerter Thrombinentstehung mit Beginn der Reperfusionsphase. Eine Beteiligung der leukozytären Mediatoren an den DIC-artigen Gerinnungsstörungen und am hohen Transfusionsbedarf während der Reperfusionsphase (115,119,120,275) scheint daher wahrscheinlich. Auffällig ist, daß die Korrelationen zwischen leukozytären Mediatoren und TAT Komplexen ausgeprägt in der systemischen Zirkulation und schwach im Perfusat der Spenderleber zu finden sind (Abb.54).

Die Spiegel von TNF und Neopterin stiegen parallel mit Reperfusion der Spenderleber an. Die Neopterinspiegel lagen im Perfusat deutlich höher als in der systemischen Zirkulation - ein Unterschied der bei den TNF Werten nicht zu finden war. Die hohen Neopterinspiegel scheinen daher nicht TNF induziert zu sein (271), sondern sind als Ausdruck einer direkten Monozytenaktivierung zu werten.

Erhöhte TNF Werte (>100 pg/ml) am Ende der OLT scheinen einer Transplantatabstoßungsreaktion vorauszugehen (149). Die von uns untersuchten 13 Patienten zeigten keine Transplantatabstoßungsreaktionen postoperativ und die TNF Spiegel lagen nur bei 2 Patienten höher als 100 pg/ml.

Ob Aprotinin einen Einfluß auf den Verlauf leukozytärer Parameter hat, ist schwer zu beurteilen. Aus ethischen Gründen war ein Vergleich der erhobenen Daten mit einer Kontrollgruppe ohne Aprotininmedikation nicht möglich, da klinische Daten eindeutig für einen Vorteil einer intraoperativen Aprotiningabe gesprochen hatten (119,120,251). In einer Studie (284) wurden leukozytäre Parameter bei niedrig dosierter Bolusgabe und höherdosierter Infusionsgabe (s.5.2.2.1.) miteinander verglichen. Es ergab sich kein Unterschied im Verlauf der leukozytären Mediatoren zwischen beiden Dosismodalitäten (284).

5.4.2. Endothel-Leukozyten-Adhäsionsmoleküle und Zytokine

Die vorherigen Ergebnisse (s.5.4.1.) hatten gezeigt, daß es insbesondere während der Reperfusion zur verstärkten Freisetzung leukozytärer Mediatoren kommt. Zur Vervollständigung dieses pathophysiologischen Ansatzpunktes prüften wir während 23 OLTs (Tab.13) ob bzw. inwieweit Zytokine (TNF, IL-6, IL-8) und Endothel-Leukozyten-Adhäsionsmoleküle dabei involviert sind (142). Aprotinin wurde bei allen Transplantationen als kontinuierliche Infusion gegeben (s.5.2.2.1.).


[Seite 98↓]

Tabelle 13 : Diagnose und Charakteristika von 23 Patienten mit primärer orthotoper Lebertransplantation

Diagnose

Anzahl

weibl.

männl.

Alter*

Postnekrotische Zirrhose

13

7

6

44(30-63)

Primäre biliäre Zirrhose

4

4

0

50(40-47)

Primäre sklerotische Zirrhose

3

0

3

44

Akute fulminante Hepatitis

1

1

0

51

Leberzellcarcinom

2

0

2

45,60

Total

23

12

11

44(30-63)

*Median (Spannbreite) in Jahren

5.4.2.1. Ergebnisse

IL-6 Werte (Abb.55) zeigten einen hochsignifikanten Anstieg in der präanhepatischen Phase und mit Beginn und während der anhepatischen Phase. Ein erneuter hochsignifikanter Anstieg konnte in der späten Reperfusionsphase beobachtet werden gefolgt von einem signifikanten Abfall. Die Perfusatspiegel lagen hochsignifikant über den korrespondierenden systemischen Spiegeln (Tab.14).

IL-8 Werte (Abb.55) stiegen erst in der Reperfusionsphase hochsignifikant an. Perfusatspiegel lagen hochsignifikant über den systemischen Spiegeln (Tab14).

Das lösliche Adhäsionsmolekül sL-Selectin (Abb.56) fiel mit beginnender Reperfusion hochsignifikant ab gefolgt von einem signifikanten Abfall während der späteren Reperfusionsphase. Die Perfusatspiegel waren vergleichbar mit den Werten in der systemischen Zirkulation (Tab.14).

Die Spiegel des löslichen Adhäsionsmoleküls sE-Selectin (Abb.56) zeigten bis auf einen signifikanten Anstieg während der anhepatischen Phase keine weiteren Veränderungen. Die Perfusatwerte unterschieden sich nicht von den korrespondierenden systemischen Werten (Tab.14).

Die Werte des löslichen Adhäsionsmoleküls sICAM-1 (Abb.56) fielen signifikant während der anhepatischen Phase ab gefolgt von einem weiteren hochsignifikanten Abfall mit Beginn und im Verlauf der Reperfusionsphase. Die Perfusatspiegel unterschieden sich ebenfalls nicht von den systemischen Spiegeln (Tab.14).

Die TAT Spiegel (Abb.57) stiegen hochsignifikant in der präanhepatischen Phase und signifikant in der anhepatischen Phase und Reperfusionsphase an. Die Perfusatwerte unterschieden sich nicht von den korrespondierenden systemischen Werten (Tab.14).

Der Verlauf des TNF (Abb.57) zeigte keine signifikanten Veränderungen während des Beobachtungszeitraumes. Erst die Werte 60 Minuten nach Reperfusion lagen signifikant höher als in der anhepatischen Phase. Die Perfusatwerte unterschieden sich nicht von den systemischen Werten (Tab.14).


[Seite 99↓]

Abbildung 55 : Verlauf des Interleukin 6 (IL-6) und des Interleukin 8 (IL-8) während 23 orthotoper Lebertransplantationen.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

IL-6 (pg/ml)

2-267

0-371

13-227

18-962

16-817

19-869

17-2996

IL-8 (pg/ml)

32-3141

0-2528

41-1989

38-1559

70-6338

77-9089

37-6953

Statistische Signifikanzen

 

IL-6

p(1/2)= 0.0000

p(2/3)= 0.0015

p(3/4)= 0.0001

  

p(6/7)= 0.0000

IL-8

   

p(4/5)= 0.0060

p(5/6)= 0.0001

 


[Seite 100↓]

Abbildung 56 : Verlauf der löslichen Endothel-Leukozyten-Adhäsionsmoleküle sL-Selectin, sE-Selectin und sICAM-1 während 23 orthotoper Lebertransplantationen.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

sL-Selectin (ng/ml)

159-350

190-1350

430-1150

350-1370

320-1090

20-910

260-910

sICAM-1 (ng/ml)

173-1278

163-1336

147-1172

147-1153

111-1110

109-1161

101-1164

sE-Selectin (ng/ml)

12-126

14-112

14-92

14-96

16-78

14-76

10-78

Statistische Signifikanzen

 

sL-Selectin

  

p(4/5)=0.0064

 

p(6/7)=0.0458

sICAM-1

 

p(3/4)=0.0152

p(4/5)=0.0004

p(5/6)=0.0010

 

sE-Selectin

p(2/3)=0.0401

    


[Seite 101↓]

Abbildung 57 : Verlauf der Thrombin-Antithrombin III Komplexe (TAT ) und des Tumornekrosefaktors (TNF) während 23 orthotoper Lebertransplantationen.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

TAT (mg/ml)

1-48

19,5-66

14,5-74

15-402

42-720

50-910

34-720

TNF (pg/ml)

10,2-99

7,4-36,2

11-118

9-29,4

3,5-447

3,6-444

21,7-377

Statistische Signifikanzen

 

TAT

p(1/2)=0.0077

p(3/4)=0.0244

p(4/5)=0.05

TNF

  

p(4/7)=0.01


[Seite 102↓]

Abbildung 58 : Korrelationen zwischen Interleukin (IL) 6, IL 8, Tumornekrosefaktor (TNF) und Thrombin-Antithrombin III Komplexen (TAT) während 23 orthotopen Lebertransplantationen

(Abnahmezeitpunkt, Signifikanzniveau der Korrelation (+=tendentiell, *=signifikant, **=hoch signifikant), Korrelationskoeffizient).


[Seite 103↓]

Tabelle 14 : IL-6, IL-8, TAT, TNF und Endothel-Leukozyten-Adhäsionsmoleküle im Perfusat(P) und in der korrespondierenden systemischen Zirkulation zum Abnahmezeitpunkt 4 (Werte werden gegeben als Median (Spannweite))

Parameter

Perfusat

systemische
Zirkulation (4)

p(P/4)

IL-6 (pg/ml)

272 (42-1347)

118 (18-962)

0.0000

IL-8 (pg/ml)

316 (45-7928)

197 (38-1559)

0.002

sL-Selectin (ng/ml)

660 (390-1210)

690 (350-1370)

n.s.

sE-Selectin (ng/ml)

38 (18-132)

33 (16-78)

n.s.

sICAM-1 (ng/ml)

400 (140-1198)

368,5 (147-1153)

n.s.

TAT (mg/ml)

66 (32,5-13000)

55 (15-402)

n.s.

TNF (pg/ml)

39,75 (2,5-1020)

15,7 (9-29,4)

n.s.

Signifikante Korrelationen (Abb.58) ergaben sich in der Reperfusionsphase zwischen den Verläufen von IL-6 bzw. IL-8 und TNF wobei insbesondere zwischen dem Verlauf von IL-8 und TNF hochsignifikante Korrelationen mit hohen Korrelationskoeffizienten bestanden. Dieses betraf auch die Perfusatwerte. Gleichzeitig bestanden in der Reperfusionsphase signifikante Korrelationen zwischen IL-6 bzw. IL-8 und den TAT Werten.

5.4.2.2. Diskussion

Aktivierte Granulozyten, Monozyten, Makrophagen und Endothelzellen setzen neben lysosomalen Proteinasen (vgl. 5.4.1.) eine Reihe von pleiotrop wirksamen Zytokinen frei wie TNF, IL-6 und IL-8, die eine Abspaltung von zellgebundenen Adhäsionsmolekülen in der Zirkulation bewirken. Dieses betrifft sL-Selectin aus PMN-Granulozyten, sE-Selectin aus Endothelzellen und sICAM-1 aus Monozyten, Makrophagen und Endothelzellen (159). Diese löslichen und daher im Plasma meßbaren Adhäsionsmoleküle scheinen die Funktion der zellgebundenen Adhäsionsmoleküle kompetitiv zu hemmen (258), jedoch ist ihre physiologische Bedeutung in vivo noch unklar.

Bei IL-6 und IL-8 konnte während präanhepatischer und anhepatischer Phase (IL-6) und mit Beginn der Reperfusionsphase (IL-6, IL-8) ein hochsignifikanter Anstieg beobachtet werden. Die hohe Korrelation zwischen IL-6 bzw. IL-8 und TNF im reperfusionellen Verlauf bestätigte die beschriebene TNF-abhängige Freisetzung dieser Interleukine (2,86). Darüberhinaus machte die hohe Korrelation von TNF, IL-6 und IL-8 mit den Werten der TAT Komplexe während der Reperfusionsphase die pathophysiologische Bedeutung der Zytokine bei der Induktion einer systemisch gesteigerten Prothrombinaktivierung sehr wahrscheinlich.

Parallel zum Anstieg der Zytokine kam es zum Abfall der löslichen Adhäsionsmoleküle sL-Selectin und sICAM-1 wobei sE-Selectin keinen signifikanten Abfall während der OLT zeigte. Es muß beachtet werden, daß die Werte beider löslichen Selectine während des gesamten Beobachtungszeitraumes im Referenzbereich lagen. Nur die Werte von sICAM-1 lagen über dem Referenzbereich mit einer Ausnahme 15 Minuten nach Reperfusionsbeginn.

Die Ergebnisse zeigten, daß es bei der OLT zu einer Aktivitätssteigerung der Zytokine (IL-6, IL-8) kommt, ohne daß diese zu einer Erhöhung der löslichen Adhäsionsmoleküle führt. Erhöhte sICAM-1 Werte lagen bereits präoperativ vor, sodaß auch hier eine durch Zytokine bedingte Abspaltung nicht wahrscheinlich scheint. Löslichen Adhäsionsmolekülen insbesondere den Selectinen kommt daher pathophysiologisch bei der erhöhten Blutungsneigung während OLT keine Bedeutung zu.


[Seite 104↓]

5.4.3.  Thrombomodulin

Das lösliche sThrombomodulin wurde als endothelialer Marker und TAT Komplexe, Protein C und AT III Aktivitäten als Marker einer Prothrombinaktivierung im Perfusat und im Verlauf von 23 OLTs bestimmt (Patientenkollektiv s. Tab.13, 5.4.2.) (139).

5.4.3.1. Ergebnisse

Präoperative mediane sThrombomodulinspiegel (Abb.59) lagen deutlich über den Normalwerten (2). Sie blieben stabil während der präanhepatischen und beginnenden anhepatischen Phase mit leichtem - aber signifikantem - Anstieg am Ende der anhepatischen Phase. Mit Beginn der Reperfusionsphase kam es zu einem 2-fachen Anstieg der Werte mit Maximum 5 Minuten nach Beginn der Reperfusionsphase gefolgt von einem signifikanten Abfall 10 Minuten später. Im Perfusat lagen die sThrombomodulinwerte hochsignifikant über den Werten der korrespondierenden systemischen Zirkulation.

TAT Spiegel (Abb.60) zeigten einen signifikanten Anstieg in der anhepatischen Phase gefolgt von einem ausgeprägteren Anstieg mit beginnender Reperfusion. Die Perfusatspiegel lagen hochsignifikant über den systemischen Spiegeln. Die Gerinnungsinhibitoren AT III und Protein C (Abb.60) zeigten beide einen signifikanten Abfall mit beginnender Reperfusion und einen Anstieg 15 bis 60 Minuten nach Beginn der Reperfusion. Die Perfusatspiegel lagen bei beiden Parametern niedriger im Vergleich zur systemischen Zirkulation.

5.4.3.2. Diskussion

Die bisherigen Ergebnisse zeigten eine leukozytäre Aktivierung und eine ausgeprägte Prothrombinaktivierung systemisch mit beginnender Reperfusion und im Perfusat. Der Schädigung des vaskulären Bettes der Spenderleber scheint kausale Bedeutung bei diesen Aktivierungsprozessen zuzukommen.

sThrombomodulin hat sich in vitro als Marker einer endothelialen Schädigung erwiesen (153), und es wurde beschrieben, daß Plasmaspiegel von sThrombomodulin bei verschiedenen Erkrankungen erhöht sind, die mit Endothelzellschädigung oder proteolytischer Aktivität an der Oberfläche der Endothelzellen assoziiert sind (DIC (318,319), ARDS (adult respiratory distress syndrome) (319), thromboembolischen Erkrankungen (318,319), thrombotisch thrombozytopenische Purpura (317,343), Diabetes mellitus mit Mikroangiopathie (318,319,320), systemischer Lupus erythematodes (167), chronisch myeloische Leukämie (235)).

Die präoperativ erhöhten sThrombomodulinwerte und die ansteigenden Werte in der anhepatischen Phase sind erklärbar durch die verminderte hepatische Clearance präoperativ bei Patienten im Endstadium einer Lebererkrankung und das Fehlen dieser Funktion in der anhepatischen Phase. Der rasche Anstieg mit Reperfusion der Spenderleber, der in den Maximalwerten 2-fach über den präreperfusionellen Werten lag und vor allem die deutlich erhöhten sThrombomodulinwerte im Perfusat sprechen für eine Freisetzung von sThrombomodulin aus der Spenderleber. Die Schädigung des Endothels der Spenderleber während der kalten Ischämiezeit ist hier sicherlich von primärer Bedeutung (Kapitel 5.4.1., 5.4.2., 5.6.; 119,120,125).


[Seite 105↓]

Abbildung 59 : Konzentrationen von löslichem Thrombomodulin (sTM) und Thrombin-Antithrombin III Komplexen (TAT) im Verlauf von 10 orthotopen Lebertransplantationen und im Perfusat (P).

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

P

sTM (µg/ml)

10-140

14-150

8-140

20-163

30-398

35-310

35-175

50-750

TAT (µg/l)

1-50

2,8-66

11,2-93

15,7-381

26-800

36-925

35,8-710

32,5-1300

Statistische Signifikanzen

 

sTM

p(3/4)=0.03

p(4/5)=0.001

p(5/6)=0.01

p(4/P)=0.001

TAT

p(3/4)=0.004

p(4/5)=0.0001

p(5/6)=0.0006

p(4/P)=0.0001


[Seite 106↓]

Abbildung 60 : Aktivitäten von Antithrombin III (AT III) und Protein C im Verlauf von 10 orthotopen Lebertransplantationen und im Perfusat (P).

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

P

AT III (%)

11-123

13-103

9-103

16-101

15-109

14-91

16-119

15-96

Protein C (%)

2,5-110

2,5-70

2,5-62

5-79

6-65

6-55

9-51

2,5-29

Statistische Signifikanzen

 

AT III

p(4/5)=0.03

p(5/6)=0.004

p(6/7)=0.005

p(4/P)=0.0001

Protein C

 

p (5/6)=0.04

p(6/7)=0.02

p(4/P)=0.0001


[Seite 107↓]

Die Zeichen der vorbeschriebenen Prothrombinaktivierung (119,120) während der Reperfusionsphase mit hohen Spiegeln der TAT Komplexe und erniedrigten AT III und Protein C Werten systemisch und im Perfusat zeigten einen parallelen Verlauf zur sThromboglobulinfreisetzung und machen daher eine direkte Verbindung wahrscheinlich. Es ist jedoch auch möglich, daß beide Phänomene durch die gleiche Ursache, wie intrahepatischen Endothelzellschaden, induziert wurden. Ob leukozytäre Aktivierungsprodukte insbesonders die Proteolyse durch Elastase und/oder anderer Proteasen eine Rolle spielen, ist zu diskutieren (235).


[Seite 108↓]

5.5.  Bedeutung der Thrombozytenfunktion während orthotoper Lebertransplantation

5.5.1. Untersuchungen der Thrombozytenfunktion während orthotoper Lebertransplantation

Bei 10 Patienten wurden in einer konsekutiven Serie (125) Untersuchungen zur Thrombozytenfunktion während Lebertransplantation durchgeführt (Tab.10, s.5.3.) (132). Intraoperativ wurden EK und FFP jedoch keine Thrombozytenkonzentrate gegeben. Das intraoperative Management unterschied sich nicht von den Voruntersuchungen. Aprotinin wurde als kontinuierliche Infusion gegeben (s.5.2.2.1.).

5.5.1.1. Ergebnisse

Der mediane EK Bedarf (Spannweite) betrug 6 (4-8) Einheiten, die FFP Transfusionen 8 (4-16) Einheiten und die Plättchenzahl des unverdünnten plättchenreichen Plasmas lag bei 116000 (37000-246000)/µl. Niedrige Plättchenzahlen im PRP beeinflußten die Aggregabilitätsmessungen bei den verschiedenen Agentien in unterschiedlichem Ausmaß. Die Kollagen-induzierte Aggregation bei arteriellen Proben konnte aus diesem Grund bei einer, die ADP-induzierte Aggregation bei keiner, die Ristocetin-induzierte Aggregation bei zwei und die Arachidonsäure-induzierte Aggregation bei sechs OLTs nicht gemessen werden.

Mit Reperfusion der Spenderleber konnte ein signifikanter Abfall der Thrombozytenzahl beobachtet werden (Abb.61). Die Kollagen-induzierte Aggregationsfähigkeit war gleichbleibend während präanhepatischer und anhepatischer Phase. Unmittelbar mit Beginn der Reperfusion kam es zum Absinken der MA (Abb.62,63). Bei der ADP-getriggerten Plättchenaggregation kam es zu einem deutlichen Abfall der MA mit Reperfusion, während auch hier in präanhepatischer und anhepatischer Phase keine Veränderungen gesehen werden konnten (Abb.62,64). Die MA der Ristocetin-induzierten Plättchenaggregation lag signifikant niedriger nach Reperfusion im Vergleich zu anhepatischen Werten (Abb.62,65). Bei der Arachidonsäure-induzierten thrombozytären Aggregationsfähigkeit zeigte sich ein postreperfusioneller Abfall, der jedoch kein Signifikanzniveau erreichte (Abb.66).

5.5.1.2. Diskussion

Die vorliegende Untersuchung zeigte den Verlauf der Thrombozytenzahl und Aggregabilität während 10 OLTs. Mit Perfusion der Spenderleber kam es - wie vorbeschrieben (146,267) - zu einem signifikanten Abfall der Plättchenzahl. Dieser ist im Rahmen der postreperfusionellen gesteigerten Gerinnungsaktivierung (115,119,120,275) mit gleichzeitigem Anstieg der TAT Komplexe und Fibrinmonomere und Abfall der Gerinnungsfaktoren (Fibrinogen, vWF Ag) und Inhibitoren (AT III, Protein C, Protein S) zu interpretieren, wie spätere Untersuchungen bestätigten (281). Es wird außerdem eine Sequestration der Empfängerthrombozyten in der Spenderleber als Ursache für den postreperfusionellen Thrombozytenabfall vermutet (146,267). Hutchinson et al. (146) fanden in Hundelebertransplantationen Hinweise auf eine Verlagerung der Thrombozyten in den Disseraum, während Cossel et al. (63) eine Phagozytose der Thrombozyten durch Kupfferzellen für wahrscheinlich hielten. Spätere Untersuchungen konnten diese Ergebnisse bei 18 Schweinelebertransplantationen bestätigen (273). Trotzalledem ist der genaue pathophysiologische Mechanismus des intraoperativen Thrombozytenabfalls noch unzureichend geklärt.


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Abbildung 61 : Verlauf der Thrombozytenzahl während 10 orthotoper Lebertransplantationen.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

Thrombozytenzahl/µl

40.000-266.000

89.000-208.000

71.000-227.000

69.000-246.000

49.000-242.000

37.000-252.000

27.000-233.000

Statistische Signifikanzen

 

Thrombozytenzahl

p(4/5)=0.008

p(4/6)=0.011

p(4/7)=0.033


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Abbildung 62 : Kollagen-, Adenosindiphosphat (ADP)- und Ristocetin-induzierte Aggregationsfähigkeit im Verlauf von 10 orthotopen Lebertransplantationen.

Spannweiten

 

Zeitpunkt

1

2

3

4

5

6

7

8

MA-Kollagen (%)

30-87

42-89

0-88

0-89

0-83

0-93

0-87

0-77

MA-ADP (%)

4-81

19-83

3-78

0-74

0-51

0-45

0-74

0-73

MA-Ristocetin (%)

0-80

23-95

0-92

0-93

0-84

0-87

12-101

0-100

Statistische Signifikanzen

 

Kollagen

p(4/5)=0.018

p(4/6)=0.046

p(4/7)=0.064

ADP

p(4/5)=0.046

p(4/6)=0.006

 

Ristocetin

p(4/5)=0.014

p(4/6)=0.084

 


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Abbildung 63 : Verlauf einer Kollagen-induzierten Thrombozytenaggregationskurve vor und nach Reperfusionsbeginn bei orthotoper Lebertransplantation.

Abbildung 64: Verlauf einer ADP-induzierten Thrombozytenaggregationskurve vor und nach Reperfusionsbeginn bei orthotoper Lebertransplantation.

 


[Seite 112↓]

Abbildung 65 : Verlauf einer ADP-induzierten Thrombozytenaggregationskurve vor und nach Reperfusionsbeginn bei orthotoper Lebertransplantation.

 

Abbildung 66 : Verlauf einer Arachidonsäure-induzierten Thrombozytenagregationskurve vor und nach Reperfusion bei orthotoper Lebertransplantation.

 


[Seite 113↓]

Parallel zu der Abnahme der Thrombozytenzahl mit beginnender Reperfusionsphase konnte eine deutliche Abnahme der Kollagen-, ADP- und Ristocetin-induzierten Thrombozytenaggregation gemessen werden, die meist 60 Minuten nach Reperfusion noch nachweisbar war (Abb.62). Bei der Arachidonsäure-getriggerten Aggregation zeigte sich in den Fällen, in denen eine Aggregation gemessen werden konnte, ein ähnliches Bild (Abb.62e), jedoch konnte aufgrund der geringen Fallzahl kein Signifikanzniveau erreicht werden.

Die Spenderleber wird bis kurz vor Implantation in einer kalten Konservierungslösung gelagert. Es ist anzunehmen, daß es während dieser kalten Ischämiezeit zu einer intrahepatischen Gefäßendothelverletzung kommt. Es entsteht freiliegendes Subendothelium. Mit Reperfusion der Spenderleber passiert Empfängerblut das alterierte Gefäßendothel der Spenderleber. Es kommt dort zu verstärkter Thrombozyten- und Gerinnungsaktivierung mit Verbrauch von Gerinnungsfaktoren und Thrombozyten. Der Abfall von Thrombozytenzahl und thrombozytärer Aggregationsfähigkeit des Blutes nach Verlassen des Spenderorgans wird dadurch verständlich.

Bei Herzoperationen mit kardiopulmonalem Bypass war ebenfalls wiederholt eine thrombozytäre Dysfunktion beobachtet worden (114). Untersuchungen von Wenger et al. (351) hatten gezeigt, daß der Kontakt der Thrombozyten mit der Fremdoberfläche des Bypasses zu einem Verlust der Glykoproteine auf der Plättchenoberfläche führt (37,65,79,355). Dieser Pathomechanismus scheint bei dem veno-venösen Bypass in der anhepatischen Phase der OLT eine untergeordnete Rolle zu spielen, da während dieser Zeit kein Abfall der thrombozytären Aggregationsfähigkeit zu messen war. Wildevuur et al. (355) konnten zeigen, daß Aprotinin die Fähigkeit besitzt, die Ib-Rezeptorfunktion der Glykoproteine auf der thrombozytären Oberfläche zu erhalten. Dieses wird zum Teil durch die Aprotinin-bedingte Plasminhemmung erklärt (355). Bei den Ergebnissen ist zu diskutieren, ob ein veno-venöser Bypass im Gegensatz zum kardiopulmonalen Bypass den Rezeptorstatus der Thrombozyten geringfügiger alteriert oder ob die Aprotinin-Infusion den Verlust von Oberflächenrezeptoren erfolgreich verhindert hat. Die gleiche Aprotiningabe scheint jedoch mit beginnender Reperfusionsphase bei Aktivierungsprozessen an der ischämisch geschädigten Gefäßwand der Spenderleber nicht auszureichen, um thrombozytäre Aktivierungsprozesse zu verhindern.

Die Ergebnisse machen deutlich, daß postreperfusionell neben Störungen im Fibrinolyse- und Hämostasesystem auch eine herabgesetzte thrombozytäre Aggregationsfähigkeit zur erhöhten Blutungsneigung bei OLT führt.

Zeitgleich mit Verminderung der thrombozytären Aggregabilität bei Beginn der Reperfusionsphase gelangt Konservierungslösung in die systemische Zirkulation des Empfängers, und es erscheint prüfenswert, ob zwischen beiden Phänomenen ein kausaler Zusammenhang besteht.

5.5.2. Einfluß verschiedener Konservierungsflüssigkeiten auf die Thrombozytenaggregabilität in vitro

In vitro wurde der Einfluß verschiedenener Konservierungslösungen (Tab.15) auf die ADP-, Kollagen- und Ristocetin-induzierte Thrombozytenaggregation in PRP von 4 gesunden [Seite 114↓]Probanden geprüft (109,121,122).

Tabelle 15 : Zusammensetzung der UW-, Bretschneider und Euro-Collinslösung

Belzer UW-CSS Lösung

Euro-Collinslösung

Bretschneiderlösung

Raffinose (30mM)

Glukose (194mM)

KHC5H505

K-Lactobionat (100 mM)

KH2PO4 (15mM)

Mannit (30mM)

KH2PO4 (25 mM)

K2HPO4 (42mM)

KCl (9mM)

HES (5g%)

NaHCO3 (10mM)

MgCl x 6H2O (4mM)

MgSO4

KCl (15mM)

NaCl (15mM)

Adenosin (5mM)

 

Histidin (180mM)

Glutathion (3mM)

 

Histidin x HCl x H2O (18 mM)

Allopurinol (1mM)

 

Tryptophan (2mM)

Insulin (40 Einheiten)

  

Penicillin G (200000 Einheiten)

  

Dexamethason (16mg)

  

Tabelle 16 : Thrombozytenaggregation gemessen als Maximalamplitude in plättchenreichem Plasma mit definierter Thrombozytenzahl (PRP) von vier gesunden Probanden (1-4) bei Zusatz von Natriumchloridlösung (0,9% NaCl), Bretschneider- und Euro-Collinslösung

 

Kollagen
(1µg/ml)

ADP
(2µg/l)

Ristocetin
(1,2mg/ml)

250µl PRP +

Maximalamplitude (%)

Proband Nr.

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

20µl NaCl

79

84

  

75

80

  

67

58

  

20µl Euro-Collinslösung

80

82

  

74

79

  

70

60

  

20µl Bretschneiderlösung.

82

87

  

72

82

  

69

54

  

10µl NaCl Lösung

88

91

89

81

73

38

37

44

66

67

  

10µl Euro-Collinslösung

80

92

83

80

69

38

38

38

64

69

  

10µl Bretschneiderlösung

82

89

93

82

73

34

42

36

68

69

  

5.5.2.1. Ergebnisse

Die MA der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation war nach Zusatz kleinster Mengen UW-Lösung deutlich reduziert. Eine Dosisabhängigkeit konnte nicht beobachtet werden. Schon ein Zusatz von 0.5µl UW-Lösung zu 250µl PRP hemmte die Thrombozytenaggregation (Abb.67).

Bei der Kollagen-getriggerten Thrombozytenaggregation (Abb.68a)) kam es zu einer zweiphasigen Aggregationskurve bei Zusatz der UW-Lösung. Die Gabe von 5-10µl UW-Lösung führte zu einer dosisabhängigen Verminderung der MA. Bei größerem Zusatz von UW-Lösung wurde ein Anstieg der MA gesehen. Die Lag-Phase (Abb.68b), s.3.3.3.) verhielt sich analog zur MA mit Verlängerung bis zu einem Zusatz von 10µl UW-Lösung und anschließender Verkürzung bei Zugabe größerer Mengen. Die Ristocetin-induzierte Aggregation (Abb.69) war nicht durch Zugabe der UW-Lösung beeinflußt.

Die Zugabe verschiedener Mengen Kochsalzlösung, Euro-Collins- und Bretschneiderlösung zu PRP führte zu keiner Veränderung der Thrombozytenaggregation (Tab.15). Die Zugabe


[Seite 115↓]

Abbildung 67 : ADP-induzierte Thrombozytenaggregation gemessen als erreichte Maximalamplitude in der Aggregationsantwort bei Zusatz ansteigender Mengen von UW-Lösung (University of Wisconsin Konservierungslösung) unter Verwendung von Plasma vier gesunder Probanden.

 


[Seite 116↓]

Abbildung 68 : Bei der Kollagen-induzierten Thrombozytenaggregation wurde unter Verwendung von Plasma vier gesunder Probanden a) die erreichte Maximalamplitude in der Aggregationsantwort gemessen und b) die Lag-Phase bei Zusatz ansteigender Mengen von UW-Lösung (University of Wisconsin Konservierungslösung) bestimmt.

 


[Seite 117↓]

Abbildung 69 : Ristocetin-induzierte Thrombozytenaggregation gemessen als erreichte Maximalamplitude in der Aggregationsantwort bei Zusatz ansteigender Mengen von UW-Lösung (University of Wisconsin Konservierungslösung) unter Verwendung von Plasma vier gesunder Probanden.

 


[Seite 118↓]

Abbildung 70 : Kollagen (a)- und ADP (b)-induzierte Thrombozytenaggregation gemessen als erreichte Maximalamplitude in der Aggregationsantwort bei Zusatz ansteigender Mengen von UW-Lösung (University of Wisconsin Konservierungslösung), UW-Lösung* (UW-Lösung ohne Zusatz von Penicillin, Dexamethason und Insulin), Adenosin (5mM) und Glutathion (3mM).


[Seite 119↓]

von UW*-Lösung, eine UW-Lösung ohne Penizillin, Dexamethason und Insulin, führte zu einer leichten Verminderung der Thrombozytenaggregation (Abb.66a). Bei Adenosinzusatz

(5mM) kam es ebenfalls zur Verminderung der Thrombozytenaggregation, jedoch nicht so ausgeprägt wie bei Zusatz von UW- oder UW*-Lösung. Glutathionzugabe (3mM) beeinflußte die Plättchenaggregation (Abb.70b) nicht.

5.5.2.2. Diskussion

Die Entwicklung der UW-Konservierungslösung (344) führte zur Verbesserung der Organkonservierung mit Verlängerung der kalten Ischämiezeit des Transplantationsorgans im Tiermodell und in der humanen OLT (1,154,163,259,328,344). Eine höhere Überlebensrate der Patienten und eine niedrigere Inzidenz hepatischer arterieller Thromben konnte beobachtet werden (328,329).

Die Ergebnisse zeigten, daß im Gegensatz zu isotoner Natriumchloridlösung, Euro-Collinslösung und Bretschneiderlösung der Zusatz von UW-Lösung zu PRP in vitro die Thrombozytenaggregation hemmt. Während die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation schon durch kleinste Mengen UW-Lösung gehemmt wurde, zeigte die Kollagen-getriggerte Aggregation ein biphasisches Bild bei steigender Menge zugesetzter UW-Lösung. Die Ristocetin-induzierte Aggregation wurde von der UW-Lösung nicht beeinflußt.

Die Untersuchungen der UW*-Lösung und einzelner Komponenten der UW-Lösung ergaben, daß die Hemmung der Plättchenaggregation vor allem durch das Adenosin verursacht wurde. Das gesamte Hemmpotential der UW-Lösung war jedoch größer als die Adenosin-bedingte Hemmung. Die reduziertere Aggregationshemmung der UW*-Lösung im Vergleich zur UW-Lösung läßt vermuten, daß die fehlenden Komponenten der UW*-Lösung (Penizillin, Dexamethason, Insulin) mitverantwortlich an der Aggregationshemmung waren. Für Penizillin wurde bereits eine plättchenaggregationshemmende Eigenschaft vorbeschrieben (45,298). Die Hemmung der Thrombozytenaggregation durch die UW-Lösung scheint daher im wesentlichen durch Adenosin und Penizillin bedingt zu sein.

Die Adenosinkonzentration der vorliegenden in-vitro Untersuchung (0.01-0.4mMol/l) war vergleichbar mit der postulierten in-vivo Situation (119,122). Diese Zahlen müssen durch die Tatsache korrigiert werden, daß während der Konservierung der Spenderleber ein Teil des Adenosins in Inosin, Hypoxanthin und Xanthin überführt wird. Es wurde jedoch nachgewiesen, daß Störungen der Plättchenaggregation durch bestimmte Agentien in-vivo weit niedrigere Konzentrationen benötigen als in-vitro (148).

Mit Revaskularisierung der Spenderleber mischt sich UW-Lösung mit dem in die Spenderleber einströmenden Blut und gelangt nach Eröffnung der V.cava-Anastomose in die systemische Zirkulation. Es ist vorstellbar, daß die Verminderung der Thrombozytenaggregation mit Beginn der Reperfusionsphase durch Einwirkung der UW-Lösung mitbedingt ist. Zusätzlich zur - bei den meisten Patienten bereits präoperativ bestehenden - Thrombozytopenie und den geschilderten (s.Kapitel 4, 5.2., 5.3.) Störungen der plasmatischen Gerinnung und Fibrinolyse kann dies die erhöhte Blutungsbereitschaft in der Reperfusionsphase entscheidend bestimmen. Die Zusammensetzung der UW-Lösung ist komplex, und es wurde versucht, die Notwendigkeit einzelner Komponenten zu bestimmen. Adenosin wurde der UW-Lösung zur Stimulation der ATP-Resynthese zugesetzt. Ex-vivo zeigte sich an einem isoliert perfundierten Kaninchenlebermodell, daß das Weglassen von Adenosin zu keiner großen Störung der Leberfunktion und Verminderung der [Seite 120↓]Gallenflüssigkeit führte (314), während dies bei Weglassen von Raffinose und Glutathion der Fall war (154). Ob es sinnvoll ist, die UW-Lösung ohne den Adenosinanteil herzustellen, ist zu diskutieren. Die Aggregationshemmung durch die UW-Lösung kann zwar die Blutungsneigung postreperfusionell erhöhen; sie kann aber auch für das geringere postoperative Auftreten thromboembolischer Verschlüsse der A.hepatica mitverantwortlich gemacht werden (328,329). Die vorliegenden Ergebnisse wurden durch neuere Untersuchungen bestätigt (290). Weitere in-vivo Untersuchungen müssen klären, ob sich das völlige Weglassen des Adenosins oder die Verminderung seiner Konzentration in der UW-Lösung - z.B. durch ausgedehnteres Flushing - günstig auf die Hämostase und den postoperativen Verlauf der OLTs auswirken.


[Seite 121↓]

5.6.  Einfluß der Spenderleber auf die Hämostase und Thrombozytenfunktion des Empfängers

Zur Evaluierung der pathophysiologischen Bedeutung der Spenderleber verglichen wir bei 10 konsekutiven OLTs (Patientenkollektiv s.Tab.1, Kapitel 4) die Hämostaseparameter und die Aggregationsfähigkeit der Thrombozyten (Patientenkollektiv s.Tab.10, Kapitel 5.3.) im Perfusat (P) mit Werten in der korrespondierenden systemischen Zirkulation der Patienten (5 Minuten vor Reperfusion (Abnahmezeitpunkt 4; vgl.3.2.).

5.6.1. Ergebnisse

5.6.1.1. Fibrinolyseparameter

Die u-PA Aktivität (gemessen mit der Methode von Biopool, vgl. 3.3.1.) war im Perfusat erhöht. T-PA und PAI Aktivitäten, u-PA Ag (Biopool), Plasminogen und D-Dimere zeigten vergleichbare Werte und die Konzentrationen von t-PA Ag und PAP Komplexen und die Aktivität des C1-Inhibitors waren erniedrigt im Vergleich zur systemischen Konzentration kurz vor Reperfusion (Tab.17).


[Seite 122↓]

Tabelle 17 : Vergleich der Hämostaseparameter im Perfusat (P) der Spenderleber mit der systemischen Zirkulation 5 Minuten vor Reperfusion (Abnahmezeitpunkt 4)

Parameter (Einheit)

Zeitpunkt

Median

(Spannbreite)

p (4/P)

Plasminogen (%)

systemisch Perfusat

49
43

(22-74)
(10-77)

n.s.

t-PA Aktivität (IU/ml)

systemisch Perfusat

14,7
10,9

(0-30,4)
(0-15,6)

0.070

t-PA Antigen (ng/ml)

systemisch Perfusat

21,4
17,9

(14,3-44,9)
(7,2-28,8)

0.014

u-PA Aktivität (ng/ml)

systemisch Perfusat

0,1
0,16

(0-0,52)
(0-0,31)

0.050

u-PA Antigen (ng/ml)

systemisch Perfusat

0,3
0,32

(0-3,95)
(0-6,0)

0.200

C1-Inhibitor (%)

systemisch Perfusat

77
66

(55-107)
(27-92)

0.006

PAI Aktivität (AU/ml)

systemisch Perfusat

84
68

(0-34,8)
(0-27,5)

n.s.

PAP Komplexe (ng/ml)

systemisch Perfusat

34
16,5

(6-275)
(0,81-71)

0.006

Fibrinogen (g/l)

systemisch Perfusat

1,92
1,54

(1,1-2,7)
(0,5-2,2)

0.018

AT III Aktivität (%)

sytemisch Perfusat

70
38

(35-89)
(26-56)

0.004

Protein C Aktivität (%)

systemisch Perfusat

24
12

(8-54)
(0-24)

0.003

totales Protein S Antigen (%)

systemisch Perfusat

82,5
70

(41-98)
(11-106)

0.069

Fibrinmonomer (0-+++)

systemisch Perfusat

2
2

(0-3)
(0-3)

n.s.

D-Dimere (mg/l)

systemisch Perfusat

1,5
2

(0-4)
(0-16)

n.s.

TAT Komplexe (mg/ml)

systemisch Perfusat

30
105

(15-270)
(10-324)

0.005

vWF Antigen (%)

systemisch Perfusat

307
292

(194-405)
(36-446)

n.s.

5.6.1.2. Gerinnungsparameter

Die TAT Komplexe waren im Perfusat deutlich erhöht, während die Inhibitoren Protein C, totales Protein S Ag und AT III deutlich und Fibrinogen leicht erniedrigt waren. Die Konzentrationen des vWF Ag und der Fibrinmonomere unterschieden sich nicht in Perfusat und systemischer Zirkulation (Tab.17).

5.6.1.3. Thrombozytenfunktionsparameter

Die Thrombozytenzahl unterschied sich nicht signifikant zwischen Perfusatproben und systemischer Zirkulation (Tab.18). In der Ristocetin- und in der Kollagen (1µg/ml ) -induzierten Thrombozytenaggregation waren die maximalen Aggregationsantworten in den Perfusatproben geringer im Vergleich zur systemischen Zirkulation. In der ADP (2µmol/l) -getriggerten Aggregationsfähigkeit unterschieden sich die höheren Werte der MA in der systemischen Zirkulation nur tendentiell von den Werten der Perfusatproben (Tab.18).

Tabelle 18 : Vergleich der Thrombozytenaggregabilität (gemessen als Maximalamplitude (%)) und der Thrombozytenzahl im Perfusat (P) und der korrespondierenden systemischen Zirkulation (Abnahmezeitpunkt 4)

Agonist

Zeitpunkt

Median

(Spannbreite)

p (4/P)

Kollagen (1μg/ml)

Systemisch
Perfusat

63
30

(0-89)
(0-77)

0.018

ADP (2μmol/l)

Systemisch
erfusat

28
11

(0-74)
(0-73)

0.088

Ristocetin (1,2mg/ml)

Systemisch
erfusat

42
21,5

(0-93)
(0-82)

0.013

S

Sytemisch
Perfusat

154000
179000

(69 000-246 000)
(58 000-255 000)

n.s.

5.6.2. Diskussion

Zwischen Entnahme und Reperfusion wird die Spenderleber in einer kalten Konservierungslösung aufbewahrt, mit der sie auch unmittelbar nach Entnahme durchspült wird. Während dieser kalten Ischämiezeit kommt es durch reduzierten Zellstoffwechsel bei Endothelzellen, Hepatozyten und bei an der Gefäßwand verbleibenden Blutzellen zu Schädigungen mit Diffusionsstörungen und Zelluntergängen. Intravasal reichern sich auf diese Weise verschiedene primär intrazelluläre und aktiv sezernierte Substanzen an. In schlecht präservierten Transplantaten konnte eine Desquamation von Endothelzellen nachgewiesen werden (261). Durch Spülung der Spenderleber mit arteriellem Empfängerblut vor Öffnung der hepatocavalen Anastomose, dem sog. Flushing, wird erreicht, daß ein Großteil der Konservierungslösung und während der Lagerungszeit entstandener Freisetzungsprodukte herausgespült werden. Der Restteil scheint jedoch an der Genese postreperfusioneller Hämostasestörungen mitbeteiligt zu sein. Dieses wird unterstützt durch die Beobachtung, daß in humanen und tierexperimentiellen OLTs die Schwere der Hämostasestörungen von der Qualität des Spenderorgans (27,108,170) und der Länge der kalten Ischämiezeit (171,265,348) abhängt.


[Seite 123↓]

Das Perfusat ist eine Mischung aus arteriellem Blut, das in die Spenderleber einströmt, und Resten der Konservierungsflüssigkeit. Daraus erklärt sich, daß bei einem Großteil der Hämostaseparameter im Perfusat, verglichen mit der systemischen Zirkulation, entsprechende bzw. erniedrigte Werte gemessen wurden. Dieses traf zu für t-PA und PAI Aktivitäten, t-PA Ag, Fibrinogen, vWF Ag und Fibrinmonomere.

Im Gegensatz dazu fielen deutlich erhöhte Spiegel der TAT Komplexe und überproportional erniedrigte Spiegel der Proteaseinhibitoren Protein C, Protein S, AT III und des C1-Inhibitors auf. Diese Parameterkonstellation deutet auf eine ausgeprägte Prothrombinaktivierung im Transplantat mit Verbrauch der Inhibitoren hin. Die systemisch postreperfusionell beobachteten DIC-artigen Veränderungen können hierdurch ausgelöst sein (vgl.Kapitel 4). Die gleichzeitige Erhöhung leukozytärer Mediatoren (vgl. Kapitel 5.4.1., 141), der Zytokine IL-6 und IL-8 (vgl. 5.4.2., 142) und des endothelialen Markers sThrombomodulin (vgl. Kapitel 5.4.3., 136) im Perfusat sprechen für deren pathophysiologische Mitbeteiligung.

Porte et al. berichteten 1989 (273,275) erstmalig, daß tierexperimentell die fibrinolytische Aktivität im Perfusat signifikant höher sei als die fibrinolytische Aktivität in der systemischen Zirkulation. Sie (273) führten die von ihnen mit Hilfe der Euglobulinlysezeit gemessene Steigerung des fibrinolytischen Potentials im Perfusat auf eine Aktivitätserhöhung des extrinsischen fibrinolytischen Systems zurück. Es wurde jedoch im Rahmen dieser Untersuchung kein t-PA bestimmt. Die vorliegenden Ergebnisse können diese Vermutung nicht bestätigen, da t-PA Ag und t-PA Aktivität deutlich erniedrigt im Perfusat zu messen waren.

Bei den vorliegenden Ergebnissen fiel eine erhöhte u-PA Aktivität im Perfusat auf. Sie macht eine Aktivierung des intrinsischen fibrinolytischen Systems - vorstellbar am ischämisch alterierten Endothel des Gefäßbettes der Spenderleber als Fremdoberfläche (Abb.48, vgl.5.2.2.3.) - wahrscheinlich. Die vorbeschriebene erniedrigte i-PA Aktivität (vgl.5.2.2.2.) und die hochsignifikant erniedrigten PAP Komplexe im Perfusat scheinen jedoch einer verstärkten Plasminfreisetzung durch u-PA zu widersprechen. Plausibler scheint eine hepatische Freisetzung von u-PA die erhöhte u-PA Aktivität im Perfusat zu erklären (vgl.5.2.2.1.).

Beim Vergleich der ex vivo induzierten Thrombozytenaggregation in Proben aus Perfusat und systemischer Zirkulation zeigte sich eine verminderte Aggregationsantwort im Perfusat. Dieser Unterschied ließ sich nur für die Kollagen-induzierte und die Ristocetin-getriggerte Aggregation statistisch sichern. Die vorhergehenden Untersuchungen hatten gezeigt, daß die UW-Konservierungslösung in vitro zu einer Reduktion der Thrombozytenaggregation führt. Es ist zu diskutieren, ob die ex vivo gemessene Verminderung der Thrombozytenaggregation durch Einfluß der Konservierungsflüssigkeit bedingt ist und/oder auf die Wirkung endothelial sezernierter bzw. während der kalten Ischämiezeit durch Zellabbau freigesetzter Mediatoren zurückzuführen ist. Auch ist es möglich, daß eine submaximale Thrombozytenstimulation durch in der Transplantatleber gebildetes Thrombin (s.o.) mit konsekutiv verminderter Stimulierbarkeit der Thrombozyten erfolgt.


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15.09.2004