2 Das Endothel in der akuten Entzündung

Das Endothel bildet eine ca. 1000 m2 große Grenzschicht zwischen intra- und extravasalem Raum im adulten menschlichen Organismus. Im Rahmen von lokalen und systemischen Entzündungen ist es im Blutstrom zirkulierenden Pathogenen und ihren freigesetzten Agenzien ebenso ausgesetzt wie Faktoren der zellulären und humoralen Abwehr (Abb. 1) (Übersichtsartikel 16 H ).

Abb. 1 : In der Interaktion zwischen Pathogen und Wirt kommt dem Endothel zentrale Bedeutung zu. Die Adhäsion, Invasion und/oder sezernierte Produkte des Pathogens können das Endothel direkt manipulieren. Aktivierte Leukozyten, humorale Faktoren und während der Wirtsantwort freigesetzte Mediatoren beeinflussen endotheliale Funktionen. Das stimulierte Endothel verliert u.a. seine Barrierefunktion und anti-koagulatorische Oberfläche. Die verschiedenen Faktoren wirken in einem komplexen, dynamischen Prozess aufeinander ein.


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Epithelien, die eine wichtige zelluläre Barriere gegenüber Pathogenen bilden, sind zumeist speziellen Subgruppen von Pathogenen ausgesetzt. So mag das urogenitale Epithel mit Escherichia coli, aber nicht mit Streptokokkus pneumoniae konfrontiert werden. Im Gegensatz dazu können alle Pathogene und ihre Produkte, die den Blutstrom erreichen oder bei lokaler Infektion in den Bereich der Kapillarbetten gelangen, mit Endothelzellen interagieren. Daraus folgt, das Endothelzellen nicht nur durch Endothel-spezifische Pathogene, sondern auch durch nahezu jedes andere Pathogen und seine spezifischen pathogenen Mechanismen attackiert werden können.

Im Folgenden sollen einige ausgewählte Aspekte der Bakterien-Endothel Interaktion dargestellt werden. Dabei wird besonders auf interessante aktuelle Forschungsergebnisse und für das Verständnis der eigenen Arbeiten wesentliche Inhalte fokussiert.

2.1 Der erste Kontakt: Pathogen-Membran Interaktion

Bereits der Erstkontakt von Bakterien und ihren Produkten mit Endothelzellen kann in einer massiven Stimulation der Endothelzellen resultieren und einen wesentlichen Beitrag zur Ausprägung der Entzündungsreaktion leisten. Neben der direkten Adhärenz von Bakterien an Endothelzellen (2.1.1) spielen von Bakterien freigesetzte Effektormoleküle, z.B. Toxine (2.1.2) oder mit endothelialen Rezeptoren interagierende Moleküle (2.1.3), eine wesentliche Rolle in dieser Pathogen-Wirtszellinteraktion.

2.1.1 Bakterielle Adhärenz

Eine komplexe und sehr heterogene Komposition von Membranstrukturen des Pathogens und des Wirtes vermitteln den Adhäsionsprozess von Pathogenen. Häufig imitieren Oberflächenstrukturen des Pathogens endogene Liganden für Oberflächenstrukturen des Endothels und vermitteln so Adhäsion an oder Aufnahme in das Endothel.

Fibronektin bindendes Protein z.B. fördert die Anheftung und temporäre Invasion von Staphylokokkus aureus durch die Bindung von Fibronektin auf der Oberfläche von Endothelzellen (197). Die Expression dieses Moleküls in normalerweise nicht-[Seite 15↓]invasiven Bakterien induzierte deren Aufnahme in das Endothel und verdeutlicht die Bedeutung dieser molekularen Interaktion (196;197). Neben Fibronektin auf Endothelzellen bindet S. aureus an extrazelluläre Matrixproteine wie Vitronektin oder Elastin, was die Komplexität des Adhäsionsprozesses beispielhaft beleuchtet (138;196;197).

Darüber hinaus ermöglicht die Blut-exponierte Lage der Endothelzellen spezielle Invasionsstrategien hochspezialisierter Erreger: Listeria monozytogenes infiziert sehr effizient mononukleäre Phagozyten (224). Nach Adhärenz infizierter Monozyten an Endothelzellen breiteten sich Listerien im Endothel aus. Dabei kam der F-Aktin basierten Motilität der Listerien große Bedeutung für den Übergang von Zelle zu Zelle zu (59). Neben der Zell-Zell vermittelten Invasion konnte das listerielle Protein Internalin jedoch auch direkt die Aufnahme des Bakteriums in die Endothelzelle mediieren, so dass Listerien zwei unabhängige Mechanismen zur Attacke des Endothels nutzen können (224).

Wesentlich ist die aktuelle Beobachtung, dass bakterielle Adhäsionsmoleküle als potente Inhibitoren der Rekrutierung von Entzündungszellen zum Ort der Inflammation wirken können: Das freigesetzte „extracellular adherence protein“ von S. aureus blockierte effizient β2-Integrin vermittelte Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten (40). Offenbar können die biologischen Effekte bakterieller „Adhäsine“ weit über die Funktion der „simplen“ Adhärenz hinaus reichen.

Die Adhäsion von Pathogenen an Endothelzellen ist bereits ausreichend, um komplexe Signaltransduktionswege zu aktivieren: z.B. führte die Anheftung von E. coli (203) oderChlamydia pneumoniae ( 8 H, 19 H ) an Endothelzellen innerhalb von Minuten zu Endotoxin-unabhängiger Aktivierung verschiedener Proteinkinasen. Dabei ist noch weitgehend unklar, ob und inwieweit die einzelnen aktivierten Signalwege die Adhärenz des Keimes stabilisieren, die Aufnahme des Bakterium induzieren oder bereits Teil der unspezifischen Wirtsantwort des Endothels auf das Pathogen sind. Neuere Untersuchungen legen nahe, das äußere Membranproteine der Bakterien („outer membrane proteins“, OMP) für diese Aktivierung bedeutsam sind (33;234;239) ( 10 H ).

Für die meisten Pathogene, die mit dem Endothel interagieren, ist die Identifikation beteiligter Moleküle auf Seiten beider Interaktionspartner noch nicht erfolgt. Noch weniger Informationen liegen über die ausgelösten Effekte vor. Die gezielte Blockade solcher Adhäsionsmechanismen als potentielle Therapie (oder Prävention) von [Seite 16↓]bakteriellen Infektionen erscheint attraktiv. Allerdings muss bedacht werden, dass die hohe Redundanz dieser Mechanismen u.U. wirkungsvolle Effekte bei alleiniger Blockade eines Reaktionspartners zunichte macht.

Eigene Untersuchungen addressierten die durch L. monozytogenes ( 4 H , 5 H ), C. pneumoniae ( 8 H , 19 H ) und Bartonella henselae ( 10 H ) induzierte Aktivierung von Endothelzellen.

2.1.2 Bakterielle Toxine

Das Endothel ist ein primäres Ziel von Poren-bildenden bakteriellen Exotoxinen (18;19). Typische Vertreter dieser Toxinfamilie sind S. aureusα-Toxin und E. coli Hämolysin (HlyA) (17). Poren-bildende Exotoxine sind amphipatische Proteine, die unter Interaktion mit Lipidketten und nicht-polaren Anteilen integraler Membranproteine in die Zellmembran von Zielzellen inserieren (Abb. 2). Das Innere der definierten Pore bildet einen hydrophilen Kanal. Diese Pore (Innendurchmesser bei α-Toxin ca. 1 nm) erlaubt den Fluss von Ionen (17).

Abb. 2 : Linearisierte Darstellung von E. coli Hämolysin.

Die Rolle von HlyA und S. aureusα-Toxin für die Aktivierung von Endothelzellen ist relativ gut untersucht. Ein einmaliger Bolus von HlyA z.B. induzierte einen Zusammenbruch der endothelialen Barrierefunktion in vitro (205) und führte zur Ödembildung in isolierten Kaninchenlungen (191) sowie Ileum-Präparationen (141). Darüber hinaus liberierten HlyA-exponierte Endothelzellen vasoaktive Mediatoren wie Prostazyklin (PGI2) oder Stickstoffmonoxid (NO) (205;206;210). Durch die Induktion der Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle wurde die Rekrutierung [Seite 17↓]polymorphkerniger Granulozyten an den Ort der Entzündung gesteigert ( 1 H ). Insgesamt sind Poren-bildende bakterielle Exotoxine in der Lage, einen stark proinflammatorischen Phänotyp in Endothelzellen hervorzurufen.

Neben diesen Exotoxinen, die sich in die Zellmembran integrieren, binden manche bakteriellen Exotoxine (z.B. Shiga Toxin von enterohämorrhagischen E. coli; EHEC) an endotheliale Rezeptoren und induzieren ihre Translokation in das Zytosol der Zellen. Dieser Prozess wird als ein wesentlicher Virulenzfaktor von EHEC angesehen, die das Hämolytisch-urämische Syndrom (HUS) hervorrufen (107).

Im Vergleich zu diesen exemplarischen, relativ gut charakterisierten Beispielen für die Aktivierung von Endothelzellen durch bakterielle Toxine, ist wenig über ihre Interaktion mit anderen wichtigen Toxinen bekannt. So ist zwar erkannt, dass das Pneumolysin von S. pneumoniae signifikant zu Infektion und Schädigung von Endothelzellen beiträgt, die zugrundeliegende zelluläre Biologie ist jedoch weitgehend unerforscht (248).

Über extrazellulär sekretierte Proteine hinaus scheint durch Bakterien direkt in Endothelzellen injizierten Proteinen wesentliche pathologische Bedeutung zuzukommen. Gram-negative Bakterien sind in der Lage, über ein sog. Typ III Sekretionssystem (TTS) Proteine zu injizieren (Abb. 3) (43): Sowohl extrazelluläre als auch in Phagosomen befindliche Bakterien können potente bakterielle Effektorproteine in das Zytosol der Wirtszelle einbringen und damit die zelluläre Signalmaschinerie kontrollieren.

Abb. 3 : Model des Typ III-Injektisoms von Yersinien. Der aus verschiedenen bakteriellen Proteinen (Ysc) bestehende Apparat durchdringt die äußere Membran (OM), die Peptidoglykanschicht (PG) und die zytoplasmatische Membran (CM) des Bakteriums. Über die „Injektionsnadel“ werden bakterielle Effektorproteine in die Zielzelle eingebracht. Modifiziert nach (43).


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Das YopE Protein von Yersinia z.B. beeinflusste nach Injektion durch das TTS die Regulation des Zytoskeletts in Endothelzellen (8). Da auch Bakterien, die chronisch das Endothel infizieren, wie z.B. C. pneumoniae, offenbar ein TTS exprimieren (144), könnte hier ein neues, noch nahezu unbearbeitetes Forschungsfeld entstehen.

In eigenen Arbeiten wurde die Aktivierung von Endothelzellen durch die bakteriellen Poren-bildenden Toxine S. aureus α-Toxin und E. coli Hämolysin untersucht ( 1 H , 2 H , 12 H ).

2.1.3 Rezeptor-mediierte Aktivierung

Viele Wirtszellen, einschließlich Endothelzellen, erkennen die Anwesenheit von Mikroorganismen durch nicht-klonale Rezeptoren, die spezifisch für konservierte molekulare Muster sind (pathogen associated molecular patterns, PAMPs) (4;218). PAMPs repräsentieren molekulare Strukturen von Mikroorganismen, nicht aber von Säugetieren, wie z.B. Peptidoglykan oder Lipopolysaccharid (LPS). Die Erkennung solcher Strukturen ermöglicht dem natürlichen Immunsystem auf einfache Weise, zwischen „Selbst“ und „Fremd“ zu unterscheiden. Meist repräsentieren PAMPs Strukturen, die großen Gruppen von Mikroorganismen gemeinsam sind, wie beispielsweise bakterielle DNS mit unmethylierten CpG-Motiven (229). Letztlich führt diese Eigenschaft der PAMPs dazu, dass eine kleine Anzahl Keimbahn-kodierter Rezeptoren eine große Vielfalt von Mikroorganismen erkennen kann. Die Familie der Toll-artigen Rezeptoren (TLR), die derzeit 10 Mitglieder (TLR1-10) hat, spielt eine essentielle Rolle in der Erkennung mikrobieller Bestandteile (218). TLR1-10 konnten in Endothelzellen nachgewiesen werden (65). Interessanterweise war in atherosklerotischen Läsionen und nach proinflammatorischer Stimulation eine Hochregulation von TLR2 und 4 nachweisbar (65). Umgekehrt reduzierte Hypoxie die Expression von TLR4 (99). Obwohl diese Rezeptoren eine gewisse Spezifität aufweisen, binden sie häufig doch mehrere Liganden: Beispielsweise aktivierte neben dem LPS Gram-negativer Bakterien auch das Hitzeschock Protein 60 von Chlamydien (32) oder ein Fusions-Protein des Respiratory Syncytial-Virus TLR4 (92). Die Situation wird weiter kompliziert durch die Beobachtung, dass Zellen multiple TLRs in verschiedenen Kombinationen gleichzeitig nutzen, um verschiedene Aspekte einer Mikrobe simultan zu detektieren (218).

Im Gegensatz zu anderen Zellen besitzen Endothelzellen kein zellständiges CD14, sondern es wird ein Komplex aus LPS, löslichem CD14, TLR4 und dem [Seite 19↓]membranständigen Protein MD-2 benötigt, um das LPS Signal in die Zelle zu transduzieren (Abb. 4) (93).

Abb. 4 : LPS führt zu TLR4 vermittelter Stimulation von Endothelzellen. Die Rekrutierung mehrerer Adaptorproteine an TLR4 aktiviert verschiedene Signalpfade der Endothelzellen (ver-einfachte Darstellung).

Im Zytosol führt die Rekrutierung von verschiedenen Adaptorproteinen an TLR4 zur Aktivierung von weiteren, „downstream“ gelegenen Signalelementen. Diese beinhalten verschiedene Kinasen (z.B. Tyrosinkinasen, Mitogen-aktivierte Proteinkinasen, MAPK) und u.a. den Transkriptionsfaktor „Nuclear Factor-κB“ (NF-κB) (218).

Die Komplexität der aktivierten Signalwege ist beträchtlich und es bestehen multiple Interaktionen zwischen einzelnen Wegen auf verschiedenen Ebenen. Die Identifikation der einzelnen beteiligten Komponenten und die Einordnung ihrer Bedeutung in das Geschehen wird wesentliche Grundlagen für die Etablierung rationaler Therapien von Infektionskrankheiten legen (247). Von großem Interesse ist die Klärung der Frage, ob Endothelzellen auf Besatz der TLRs mit einer weitgehend stereotypen Antwort (z.B. Rekrutierung von Granulozyten, Expression proinflammatorischer Zytokine) reagieren oder je nach Pathogen/ Pathogenbestandteil eine eindeutig differenzierte Wirtsantwort erbringen können. Vor dem Hintergrund, dass das Repertoire an entdeckten, biologisch relevanten TLR Liganden ständig wächst und Endothelzellen mit nahezu jedem vorstellbaren TLR-Liganden in Kontakt kommen können, ist die intensive Untersuchung von TLR Funktion und Signaltransduktion dringlich.

Eigene Experimente adressierten die LPS-induzierte Aktivierung von Endothelzellen am Beispiel der Expression von Interleukin-8 (IL-8) und Cyclooxygenase (COX)-2 ( 6 H , 9 H , 17 H ).


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Insgesamt ist bereits der „oberflächliche“ Erstkontakt mit Pathogenen oder ihren Produkten in der Lage, tiefgreifende Veränderungen in der endothelialen Biologie hervorzurufen. Durch die besondere Lokalisation des Endothels ist die Vielfalt möglicher Interaktionen sehr groß. Auch bedingt diese, dass die Reaktionen des Endothels auf Stimulation neben lokalen häufig bedeutende systemische Wirkungen entfalten. Offensichtlich ist auch, dass eine Vielzahl von medizinisch relevanten Interaktionen bislang nur unzureichend erforscht ist.

2.2 Invasion des Endothels

Obwohl nur wenige Bakterien, wie Rickettsiae (219), B. henselae (52;53), C pneumoniae (204) und Listerien (224), im Endothel replizieren und persistieren, invadieren viele Bakterien [z.B. Neisseria meningitides (149), S. pneumoniae(48)] transient Endothelzellen. Bakterien entwickelten eine große Vielfalt an hochdifferenzierten Mechanismen zur Invasion von Wirtszellen. Neben der Initiierung „konservativer“ Rezeptor-mediierter Endozytose ist eine wichtige Strategie die direkte Affektion des Zytoskeletts durch Proteine des Pathogens (8;43;200). Über die Induktion von Membranausstülpungen und -faltungen induzieren die Keime ihre Aufnahme. In der Zelle verbleiben die Pathogene in der Vakuole [z.B. Chlamydien (204)] oder erreichen frei das Zytosol [z.B. Listerien (224)]. Nahezu alle diese Mechanismen nutzen das Aktin-Zytoskelett der Endothelzellen. Dabei sezernieren Bakterien Effektorproteine bereits extrazellulär, Gram-negative Bakterien injizieren Proteine per TTS, andere lysieren ihre Aufnahmevakuole durch Toxine. Besonders häufig konnte als Folge bakterieller Stimulation eine Modulation der Aktivität kleiner GTP-bindender Rho-Proteine mit subsequenter Manipulation des Zytoskeletts beobachtet werden (200). Intrazelluläre Replikation der Pathogene hat profunde Veränderungen des Metabolismus der Endothelzellen zu Folge. Ebenso mögen endotheliale Faktoren mit dem Metabolismus des Eindringlings interferieren.

Im Folgenden soll die Interaktion des Endothels mit Listerien, Chlamydien und Bartonellen, die in eigenen Arbeiten eine Rolle spielen, genauer betrachtet werden.


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2.2.1  Listeria monozytogenes

L. monozytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, ist ein opportunistisches Pathogen. Durch kontaminierte Lebensmittel übertragen, löst es bei Infektion insbesondere immungeschwächter Wirte, Schwangeren und Neugeborenen Septikämien und Meningitis aus (224). Listerien invadieren sowohl professionelle (z.B. Makrophagen) als auch nicht-professionelle (z.B. Endothelzellen, Fibroblasten) Phagozyten. Der Infektionsprozess kann grob in die Schritte Adhäsion, Invasion, Flucht aus dem phagosomalen Kompartment, intrazytosolische Replikation und Zell-zu-Zell Ausbreitung unterteilt werden (Abb. 5) (58;59;224).

Abb. 5 : Schematische Darstellung der Internalisation, Phagosomen-Lyse, Aktin-abhängigen Bewegung und Zell-Zell-Ausbreitung von Listerien (Inl, Internalin; LLO, Listeriolysin O; PLC, Phospholipase; ActA, Aktin bindendes Protein der Listerien). Abb. aus Ref. (166).

Die Adhäsion und Internalisation der Listerien ist wesentlich von listeriellen Internalinen abhängig: Internalin A förderte die Aufnahme durch Bindung an E-Cadherin, während Internalin B an die Met-Rezeptor Tyrosin Kinase band und via Posphatidyl-Insositol-3 Kinase den Transfer der Listerien in die Wirtszelle förderte (44;58;59;224). Darüber hinaus wird diskutiert, ob Listerien von infizierten Monozyten, die am Endothel adhärieren, in dieses übertreten können (59). Das porenbildende Toxin Listeriolysin O (LLO) lysiert die phagosomale Vakuole und ermöglicht die „Flucht“ der Listerien ins Zytosol. Dort wirken die freigesetzten listeriellen Phospholipasen (PLC) (Phosphatidyl-Inositol spezifische PLC, PI-PLC; Phosphatidyl-Cholin spezifische PLC, PC-PLC) auf Signalwege der Wirtszelle ein (224) ( 5 H ). Das Bakterium repliziert effizient im Zytosol von Endothelzellen. Es [Seite 22↓]polymerisiert Aktin der Wirtszelle mit Hilfe des listeriellen Proteins ActA und bewegt sich sowohl innerhalb einer Zelle als auch von Zelle zu Zelle mit Hilfe dieses Aktinvorschubs, der eine komplexe und faszinierende Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle darstellt (34;46;158). Infektion von Endothelzellen mit Listerien führt zu einer komplexen proinflammatorischen Aktivierung des Endothels, insbesondere durch NF-κB-abhängige Gentranskription: Sowohl die Expression von Zytokinen, Chemokinen als auch Adhäsionsmolekülen wurde durch Listerien gesteigert (45;58) ( 4 H , 5 H ).

Eigene Untersuchungen unter Einsatz verschiedener listerieller Deletionsmutanten beschreiben die Adhäsionsmolekül-Expression und adressieren die Leukozyten-Endothel-Interaktion in Listerien-infizierten Endothelzellen. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass die listeriellen PLC über die Bildung von Zeramiden in die Regulation NF-κB-induzierter Genexpression eingreifen ( 4 H , 5 H ).

2.2.2  Chlamydia pneumoniae

C. pneumoniae, ein Gram-negatives, obligat intrazelluläres Bakterium, ist ein häufiger Erreger respiratorischer Infektionen (Bronchitis, Pneumonie) sowie von Pharyngitis und Sinusitis (90;165). Kontrovers diskutiert wird die Frage, ob C. pneumoniae-Infektion (des Endothels) durch die Förderung inflammatorischer Reaktionen zur Ausbildung vaskulärer Läsionen und subsequenter Arteriosklerose beiträgt (61;128). C. pneumoniae invadiert und repliziert in Endothelzellen ebenso wie in professionellen Phagozyten (z.B. Monozyten, Makrophagen) (204).

Obwohl die unterliegendenden Mechanismen weitgehend unbewiesen sind, wird angenommen, dass Chlamydien über die Infektion von Monozyten bzw. kurze Phasen der Bakteriämie im Rahmen pulmonaler Infektionen Zugang zum Endothel erhalten. Durch die Induktion von Phagozytose gelangen infektiöse chlamydiale Elementarkörperchen in Zielzellen. Innerhalb weniger Minuten nach Aufnahme beginnt die Entwicklung metabolisch aktiver Retikularkörperchen (204). Die Chlamydien rekrutieren über im Detail unbekannte Mechanismen Lipide der Wirtszelle (z.B. Sphingomyelin, Cholesterol) zur chlamydialen Inklusion und replizieren effizient in den infizierten Wirtszellen (222;238). Infektion von Zielzellen führte zur Hochregulation von Adhäsionsmolekülen, Chemokin- und Wachstumsfaktorbildung sowie prokoagulatorischer Aktivierung. Obwohl Chlamydien [Seite 23↓]eine wesentliche Bedeutung als (endotheliales) Pathogen zukommt, ist wenig über molekulare Mechanismen der Zell-Interaktion bekannt. Beispielsweise legen Genom- und Proteomanalysen die Existenz eines funktionellen Typ 3-Sekretionsapparates der Bakterien nahe (144;223), dessen Bedeutung ist jedoch noch nicht erarbeitet.

Eigene Untersuchungen galten der Interaktion von Leukozyten mit C. pneumoniae infizierten Endothelzellen und analysierten die Bedeutung von NF-κB und MAP-Kinasen Aktivierung durch das Bakterium ( 8 H , 19 H ).

2.2.3  Bartonella henselae

Das Gram-negative Bakterium B. henselae ist ein fakultativ intrazelluläres Bakterium, das Zoonosen in Menschen und Katzen auslöst (115). Asymptomatisch infizierte Katzen übertragen über Biss- und Kratzwunden ebenso wie Katzenflöhe durch Bisse das Pathogen auf den Menschen. Insbesondere immungeschwächte Patienten können an Katzenkratzkrankheit, bazillärer Angiomatose oder bazillärer Peliose erkranken (116). Angioproliferative Läsionen, in denen aktive, proliferierende, atypische Endothelzellen mit Befall von B. henselae nachweisbar sind, stellen typische histopathologische Merkmale der bazillären Angiomatose und Peliose dar (52).

Abb. 6 : B. henselae Infektion von Endothelzellen resultiert in einer komplexen proinflamma-torischen und proangio-genetischen Stimulation der Zellen.

Neben einer, ähnlich zu anderen Bakterien verlaufenden, endozytotischen und Zytoskelett-abhängigen Aufnahme von B. henselae scheint ein besonderer Mechanismus der zellulären Invasion zu bestehen: Nach initialem Kontakt zwischen Pathogen und Endothelzelle kommt es innerhalb von Stunden zur Zytoskelett-mediierten Akkumulation der Bakterien auf der Oberfläche des Endothels. Dieses [Seite 24↓]bakterielle Agglomerat wird dann in Form des sog. Invasoms in toto innerhalb von ca. 24 h in die Zelle aufgenommen (54). Neben Aktin-abhängigen werden Tyrosinkinasen-vermittelte Effekte als wesentlich für die Ausbildung des Invasoms angesehen (53;54). Dabei ist noch unklar, welche Rolle bakteriellen Pili oder Membranproteinen zukommt. Die Invasion führt offensichtlich zur Expression spezieller Genprodukte in den Bartonellen, deren Funktion für den Verlauf der Interaktion unbekannt ist (110).

Infektion von Endothelzellen mit B. henselae prägt einen proangiogenetischen und proinflammatorischen Phänotyp des Endothels, wobei die zugrundeliegenden Mechanismen erst teilweise untersucht sind (Abb. 6). Insbesondere die wohl einzigartige Induktion von Angiogenese durch ein bakterielles Pathogen bietet interessante Forschungsansätze (52;53).

Eigene Experimente erbrachten Beiträge zum Verständnis der B. henselae-induzierten Signaltransduktion in Endothelzellen, subsequent erhöhter Leukozyten-Endothel-Interaktion und identifizierten ein Membranprotein der Bartonellen als potentiellen Pathogenitätsfaktor ( 10 H ).

2.3 Das Endothel in der Wirtsantwort

Eine große Anzahl sehr unterschiedlicher Pathogene und deren Produkte wirken über verschiedenste Pathomechanismen auf das Endothel ein. Einige stereotype, in ihrer deutlichen Mehrzahl proinflammatorische Antworten der Zelle auf Pathogen-induzierte Stimulation wurden identifiziert. Neben der direkten, Pathogen-assozierten Aktivierung spielt die „unspezifische“ Stimulation der Endothelzellen durch Produkte der Wirtsantwort eine wesentliche Rolle für das entzündliche Geschehen. Im Rahmen mancher hämorrhagischer Fieber oder akuten Phasen der systemischen, überbordenden, proinflammatorischen Wirtsantwort (z.B. Sepsis) wird gar postuliert, dass die quasi sekundäre Perturbation des Endothels entscheidend für den Verlauf der Erkrankung sein kann (161;228). Zusätzlich trägt das Endothel durch Liberierung proinflammatorischer Substanzen, Rekrutierung von Entzündungszellen, prokoagulatorische Aktivität und endotheliale Hyperpermeabilität wesentlich zur Aggravation der Entzündung bei.


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Im Folgenden soll im Überblick auf wesentliche und neue Aspekte dieses Zusammenspiels eingegangen werden. Dabei wird auf für das Verständnis eigener Arbeiten Notwendiges fokussiert.

2.3.1 Stimulation des Endothels

Auf Stimulation mit Pathogenen oder deren Bestandteilen (z.B. LPS, Lipoteichonsäure) oder von diesen liberierten Substanzen (z.B. Exotoxine) reagiert das Endothel mit der Produktion einer Vielzahl von meist proentzündlichen Zytokinen und Chemokinen (89). Diese können, sezerniert in den Blutstrom, zur systemischen Aktivierung des Organismus beitragen, oder, bei basolateraler Sekretion, in erster Linie lokale Prozesse beeinflussen. Die chemotaktische Rekrutierung von Entzündungszellen durch diese Produkte trägt wesentlich zur effektiven lokalen Bekämpfung von Pathogenen bei (148). Andererseits kann eine unangemessen starke und/oder andauernde Aktivierung zu erheblichen, teils chronischen Schäden betroffener Gewebe führen.

Neben sezernierten Zytokinen wird zunehmend die Bedeutung parakriner „Eigenstimulation“ des Endothels erkannt: Beispielsweise wird ein großer Teil des von Endothelzellen nach inflammatorischer Stimulation gebildeten Tumor Nekrose Faktors-α (TNF) nicht sezerniert bzw. durch Proteolyse von der endothelialen Oberfläche in den Blutstrom abgespalten, sondern verbleibt als membranständiges, transmembranöses TNF (tmTNF) auf der Oberfläche des Endothels (169).

Durch die Produktion vasoaktiver Substanzen nimmt das Endothel bedeutenden Einfluss auf die Regulation des Blutdrucks: Während Endothelin-1 ein potenter Vasokonstriktor ist, dilatieren PGI2 und NO Blutgefäße. Die Produktion dieser Mediatoren durch das Endothel wird von inflammatorischen Substanzen stark stimuliert: So induzierten Poren-bildende bakterielle Exotoxine wie S. aureusα-Toxin und E. coli HlyA die Ca2+-abhängige Liberierung von NO durch die NO-Synthase (NOS)-1 (205;206;210). Exposition von Endothelzellen gegenüber LPS oder TNF führte zur Expression Ca2+-unabhängiger NOS-2 und subsequenter Freisetzung großer Mengen an NO (112). Neben des gefäßdilatierenden Effektes können diese großen NO-Mengen zur Abtötung von Bakterien beitragen.

Aktuelle Studien weisen auf eine zentrale Rolle des vasodilatierenden Peptides Adrenomedullin (ADM) in der systemischen Inflammation hin (231;232): ADM wird [Seite 26↓]von proinflammatorisch stimulierten Endothelzellen freigesetzt (100) und scheint eine wesentliche Rolle für den Übergang von der hyperdynamischen zu hypodynamischen Phase der Sepsis zu spielen (117;231). Darüber hinaus waren Mäuse, die ADM in ihrem Gefäßsystem überexprimierten, resistent gegenüber einem Endotoxin-Schock (194). Die Bedeutung des ADM für die Regulation des Endothels und der Gefäßfunktion wird weiterhin durch eine Studie mit ADM-„knock-out“ Mäusen unterstrichen (37): Diese Tiere verstarben in uteri mit massiver Ödembildung und Gefäßmißbildungen. Eigene Untersuchungen demonstrierten eine Barriere-protektive Funktion von ADM gegenüber inflammatorischen Stimuli ( 12 H ).

Endothelzellen verlieren nach proinflammatorischer Stimulation ihre antikoagulatorische Funktion und verstärken die Blutgerinnung. Beispielsweise verloren Endothelzellen Thrombomodulin und Heparan Sulfat von der Zelloberfläche und exprimierten verstärkt Gewebsfaktor (130;204). Erhöhte Expression von Gewebsfaktor durch das Pathogen-aktivierte Endothel, adhärierende, mit Gewebsfaktor beladene Monozyten und leukozytäre Mikropartikel können im Konzert die Gerinnungskaskade aktivieren (142). Schließlich aktiviert die Serin-Protease Thrombin den G-Protein gekoppelten Protease-aktivierten Rezeptor-1 der Endothelzellen und verstärkt damit endotheliale Antworten wie Hyperpermeabilität, Adhäsionsmolekül-Expression und Zytokinproduktion (47).

Neben den beschriebenen Faktoren tragen z.B. die Rekrutierung der Komplement-Kaskade, nervale Faktoren und physikalische Reize (Blutdruck, Änderung der Blutströmung, u.s.w.) zur Aktivierung bei.

Insgesamt wird deutlich, dass komplexe, miteinander verwobene Kreisläufe der gegenseitigen Stimulation, Reaktion und Aktion in der Entzündung ablaufen, die kaum in einem linearen Text zu beschreiben sind. Dabei reagieren alle beteiligten Partner aufeinander und es ist schwierig abzuschätzen, wer den Verlauf der Reaktion letzlich bestimmt.

Eigene Untersuchungen fokussierten auf den Einfluss der Aktivierung der Rho-Proteine, der p38 MAPK und des Transkriptionsfaktors NF-κB auf die Entzündungsreaktion. Darüber hinaus wurde die Rekrutierung von Entzündungszellen sowie die Regulation der endothelialen Barrierefunktion genauer analysiert.


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2.3.2  Proinflammatorische Signaltransduktion in Endothelzellen

Die vielen unterschiedlichen Pathomechanismen von Pathogenen und Produkten der Wirtsantwort induzieren komplexe Signaltransduktionswege in Endothelzellen, die erst fragmentarisch bekannt sind. Auffällig ist, dass endogene proinflammatorische Substanzen, intakte Bakterien und pathogene Produkte teilweise gleiche Signalwege aktivieren (z.B. MAP-Kinasen). Unter der Aktivierung verschiedener Rezeptoren, Kinasen und Phosphatasen kommt es zur Änderung der Genexpression durch Transkriptionsfaktoren. NF-κB trägt zur Ausbildung eines proinflammatorischen Phänotypes des Endothels nachhaltig bei (51). Dabei zeigte sich, dass kleine GTP-bindende Rho-Proteine als wesentliche Schaltmoleküle wirken ( 3 H , 6 H , 9 H , 13 H , 17 H ).

2.3.2.1 Kleine GTP-bindende Rho-Proteine

Rho-Proteine sind Mitglieder der Ras-Superfamilie monomerer, kleiner GTP-bindender Proteine (213). Initial wurden sie als zentrale Regulatoren des Mikrofilamentsystems beschrieben. Weitergehende Untersuchungen zeigten, dass sie als molekulare Schalter auch andere bedeutende Zellfunktionen steuern (Abb. 7) (114;213).

Abb. 7 : Als zentrale Schaltmoleküle beeinflussen Rho-Proteine wichtige Zell- und Gewebsfunktionen. Interaktionen zwischen verschiedenen Rho-Proteinen als auch Rho-Protein-abhängigen Signalwegen führen zu komplexen, nur teilweise voneinander abgrenzbaren Signalpfaden.


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Die Vielfalt der Erkrankungen, mit denen diese GTP-bindenden Proteine verknüpft werden, betont die grundlegende Bedeutung der Rho-Proteine als molekulare Schaltstellen (21): Beispielsweise tragen Proteine der Rho-Familie wesentlich zur malignen Transformation bei, werden mit X-chromosomal vererbter mentaler Retardierung in Verbindung gebracht und sind an der Regulation des Blutdrucks maßgeblich beteiligt. Von wesentlicher Bedeutung war die Beobachtung, dass verschiedenste bakterielle Effektoren die Funktion von Rho-Proteinen manipulieren (5;6;24;103-105). Neben Prozessen der bakteriellen Adhäsion und Invasion haben eine Vielzahl von bakteriellen Toxinen Rho-GTPasen zum Ziel. Der Einsatz eines Teils dieser Gifte als hochspezifische molekulare Werkzeuge erbrachte neue Einblicke in die Funktion der GTPasen (12;103).

Rho-Proteine sind Guanin-Nukleotid bindende Proteine, die zwischen einem aktiven GTP-gebundenem und einem GDP-gebundenem, inaktivem Zustand wechseln (Abb. 8) (213).

Abb. 8 : Regulation kleiner GTP-bindender Proteine durch bakterielle Toxine (TcdB-10643, bot. C3-Toxin) und regulatorische Proteine.

In inaktivem Zustand sind Rho-GTPasen an negative Regulatoren (Rho GDP Dissoziations-Inhibitoren, GDIs), welche die GDP-Bindung stabilisieren und die Sequestrierung im Zytosol verstärken, gebunden. GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) führen durch erhöhte Aktivität der intrinsischen GTPase ebenfalls zur [Seite 29↓]Inhibition der Rho-Proteine. Umgekehrt tragen positive Regulatoren wie GDP/GTP Austauschfaktoren (GEFs) zur Aktivierung der Schaltmoleküle bei. Dabei gibt es jeweils mehrere dieser Proteine für die einzelnen GTPasen mit verschiedener Spezifität für die jeweiligen Ziel-GTPasen (79). Die unterschiedliche Expression dieser Regulatoren in einzelnen Zelltypen und die Beobachtung, dass die kleinen Proteine selbst wiederum reguliert werden, verdeutlicht die enge und äußerst komplexe Steuerung der Rho-GTPasen. Zusätzlich erschwert werden grundlegende (und verallgemeinernde) Aussagen durch die Tatsache, dass Rho-abhängige Effekte zwischen einzelnen Zelltypen stark variieren und die Übertragbarkeit von Versuchsergebnissen von einem Zell- oder Gewebetyp auf einen anderen praktisch nicht möglich ist (213).

Besonders gut untersucht wurde die Rolle von RhoA („Ras homologous member 1“), Rac1 („Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1“) und Cdc42 („cell division cycle 42“).

Obwohl Transfektionsversuche mit aktiven und inaktiven Mutanten der Rho-Proteine wesentlich zum Verständnis ihrer Funktion beitrugen, limitierte insbesondere die hohe Toxizität inaktiver Mutanten in primären Zellkulturen viele Analysen (213). Die Beobachtung, dass clostridiale Zytotoxine mit hoher Spezifität Rho-Proteine kovalent modifizieren und dadurch aktivieren/blockieren, ermöglichte die gezielte Untersuchung in nicht-transfizierten Zellen (5;6;103-105). Clostridium difficile Toxin B (TcdB)-10463 blockiert die Aktivität von RhoA, Rac1 und Cdc42 durch Monoglucosylierung an Aminosäure Threonin 35 (RhoA) und 37 (Rac1, Cdc42). TcdB-1470 inaktiviert Rac1 und Cdc42, jedoch nicht RhoA. Im Gegensatz dazu hat C. sordellii lethale Toxin (TcsL-1522) primär Ras als Zielmolekül. Klinisch betrachtet sind TcdB-10463 und TcdB-1470 kausal an der durch C. difficile verursachten, Antibiotika-assoziierten Kolitis beteiligt, während TcsL-1522 ein Virulenzfaktor für die Ausbildung eines Gasgangräns darstellt. Die Isoformen RhoA, RhoB und RhoC blockiert C. botulinum C3 Toxin durch ADP-Ribosylierung an Asparagin 41. Mit großem Erfolg setzt man diese Toxine zur Analyse der funktionellen Bedeutung kleiner GTPasen der Rho-Familie ein (103).

Verschiedene Studien wiesen darauf hin, das Rho-Proteine an der Aktivierung des (proinflammatorischen) Transkriptionsfaktors NF-κB teilhaben (145;146;160). Eigene Untersuchungen hatten daher zum Ziel, die Rolle von Rho-Proteinen in der [Seite 30↓]inflammatorischen Aktivierung von Endothelzellen näher zu untersuchen ( 6 H , 9 H , 13 H , 17 H ).

2.3.2.2 p38 Mitogen-aktivierte Protein Kinase

Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) sind wichtige, hochkonservierte Signal-transduzierende Enzyme in Eukaryonten (39;57;120). Neben der Rezeptor-vermittelten Zellaktivierung sind sie auch durch physikalische und chemische Reize aktivierbar und ermöglichen dadurch eine schnelle Adaptation der Zellen an wechselnde Stressoren (Abb. 9). MAPK sind Teil dreistufiger Kinasenkaskaden bestehend aus MAPK, MAPK Kinase (MAPKK) und MAPK Kinasen Kinasen (MAPKKK).

Abb. 9 : Kinasenkaskaden der MAPK. Von besonderer Bedeutung für die Regulation inflammatorischer Prozesse ist die p38 MAPK.

Dabei werden die „extracellular signal-regulated protein“ Kinasen (ERK), die c-Jun NH2-terminalen Kinasen (JNK) und p38 MAP Kinasen voneinander unterschieden (39;57;120). Es muss jedoch betont werden, dass - obwohl oft als parallele Signalwege dargestellt - multiple Interaktionen auf verschiedenen Ebenen zwischen den Kinasenkaskaden bestehen. Darüber hinaus gibt es jeweils zahlreiche [Seite 31↓]Isoenzyme innerhalb der einzelnen Familien (z.B. p38α, p38β1/2, p38γ, p38δ), deren jeweilige Funktion im Detail häufig noch unbekannt ist (120). In der Adaptation von Endothelzellen auf proinflammatorische Umweltreize spielt die p38 MAP Kinase eine besondere Rolle.

Der Einsatz spezifischer p38 MAP Kinase Inhibitoren reduzierte akute Inflammation, Sepsis und arthritische Veränderungen in verschiedenen Tiermodellen (120). In ersten klinischen Versuchen konnten bei Menschen antiinflammatorische Effekte durch Hemmstoffe der p38 MAP Kinase bei geringen Nebenwirkungen nachgewiesen werden (25;95).

Die proximalen, die p38 MAP Kinase aktivierenden Signalelemente sind noch weitgehend unerforscht: Drei Mitglieder der MAPK Kinasen (MKK)-Superfamilie, MKK3, 4 und 6, stimulierten nach Überexpression die p38 MAPK, welche wiederum downstream gelegene Kinasen wie die „MAPK-associated kinases“ 2/3 (MAPKAP-kinases2/3) oder 3pK-Kinase aktivierte (57;120). Experimente in Mäusen, in denen durch eine gezielte Mutation der MAPKAP Kinase 2 ein Teil des p38 MAPK-Signalwegs blockiert wurde, zeigten eine erhöhte Resistenz gegenüber einem Endotoxin-Schock bei einer zu ca. 90% reduzierten Bildung von TNFα, was gut mit der beobachteten protektiven Wirkung der p38 MAP Kinasen Inhibitoren übereinstimmt (118).

Neben den akut-inflammatorischen Signalwegen kommt den p38 MAP Kinasen eine wesentliche Rolle in der Regulation VEGF-abhängiger angiogenetischer Prozesse zu (139;242). Offenbar sind proinflammatorische Zytokinexpression, Proliferation, Migration und Permeabilität in hohem Maße durch p38 MAP Kinasen abhängige Prozesse gesteuert.

Vor diesem Hintergrund analysierten wir in unseren Experimenten die Bedeutung der p38 MAP Kinase in der Endotoxin ( 9 H )- und VEGF ( 11 H , 15 H )-induzierten Signaltransduktion in Endothelzellen.

2.3.2.3 Transkriptionsfaktor NF-κB

Viele unterschiedliche (proinflammatorische) Signalwege konvergieren in der Aktivierung von NF-κB (133;215). Neben Bakterien und bakteriellen Produkten, Viren, Zytokinen wie IL-1β oder TNF haben auch chemische und physikalische Reize in verschiedenen Zelltypen die Aktivierung von NF-κB zur Folge. Nach Translokation [Seite 32↓]in den Zellkern beeinflusst der Transkriptionsfaktor die Expression zahlreicher Gene in Endothelzellen, u.a. von Chemo- und Zytokinen, Adhäsionsmolekülen, Enzymen (z.B. COX-2, induzierbare NOS) und anti-Apoptose Molekülen (51;136;235). NF-κB ist Mitglied der Rel-Familie der Transkriptionsfaktoren, die inaktiv im Zytosol vorliegen und nach Aktivierung in den Nukleus translozieren (Abb. 10) (82;226).

Abb. 10 : Nach Phosphorylierung durch das Signalosom und Degradation durch das Proteasom von IκB transloziert NF-κB in den Nukleus.

Die aktive Form von NF-κB besteht aus zwei variablen Untereinheiten, z.B. klassischerweise dem Heterodimer p50/p65.


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In ruhenden Endothelzellen liegt NF-κB inaktiv in komplexierter Form im Zytosol vor. Die Assoziierung mit Inhibitorproteinen der IκB-Familie (z.B. IκBα, IκBβ, IκBγ) sequestriert den Transkriptionsfaktor im Zytosol (140). Dabei kontrollieren die verschiedenen IκBs NF-κB auf unterschiedliche Weise. IκBα wird nach Zellstimulation schnell, aber nur für eine begrenzte Zeit, degradiert. Die NF-κB-abhängige Nachbildung von IκBα kann durch negative Rückkopplung eine Terminierung der NF-κB Aktivität erzielen (140). Im Gegensatz dazu ist z.B. die Expression von IκBβ nicht durch NF-κB kontrolliert, wodurch eine persistierende Aktivierung von NF-κB erreicht werden kann (140).

Wenngleich mehrere, bislang teils unbekannte Wege zur Aktivierung von NF-κB führen, ist die Aktivierung des sogenannten NF-κB-Signalosoms von zentraler Bedeutung für die Regulation des Transkriptionsfaktors unter proinflammatorischen Bedingungen (101;192): Das Signalosom, u.a. bestehend aus der „NF- κ B-inducing kinase“ (NIK) sowie den IκB Kinasen (IKKα, IKKβ, IKKγ) phosphoryliert IκB im IκB/NF-κB Komplex an kritischen Serinresten. Die Phosphorylierung leitet eine Konformationsänderung der Inhibitoren ein, welche N-terminale Lysine als Substrat für eine Ubiquitinierung demaskiert. Proteolytische Degradierung der ubiquitinierten IκB Moleküle durch das 26 S-Proteasom legt die Kernlokalisierungssequenz des Transkriptionsfaktors frei (214). Im Zellkern interagiert NF-κB mit dekameren Konsensus-Sequenzen innerhalb der Promotorenregion unterschiedlichster Gene. Diese innerhalb weniger Minuten ablaufende Aktivierung eines Transkriptionsfaktors erlaubt die rasche Reaktion der Zelle auf verschiedenste Stimuli mit der sofortigen Expression von „Akut-Phase-Genen“ („early response genes“), die insbesondere in der Frühphase von Infektionen von wesentlicher Bedeutung sind (51;233).

Zusammenfassend initiieren verschiedenste proinflammatorische Stimuli bislang erst fragmentarisch bekannte Signalwege im Endothel, die schrittweise die verschiedenen, meist pro-entzündlichen Veränderungen des Endothels bewirken und damit die Enzündungsreaktion entscheidend mit prägen. Besondere Bedeutung kommt dabei der Rekrutierung von Entzündungszellen durch die Expression von Adhäsionsmolekülen durch das Endothel und dem Verlust der endothelialen Barrierefunktion zu. Die Darstellung wesentlicher Grundlagen beider Mechanismen im Bezug auf eigenen Arbeiten ist Gegenstand des folgenden Kapitels (2.3.3).


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2.3.3  Rekrutierung von Entzündungszellen

Neben humoralen Faktoren wie dem Komplementsystem und Proteasen beruht die Zerstörung von Pathogenen in der Frühphase von Infektionen auf phagozytierenden Zellen. Diese ersten und weitgehend unspezifischen Immunreaktionen sind von zentraler Bedeutung für die Bekämpfung von Pathogenen, da eine vollständige, optimierte Aktivierung von T- und B-Lymphozyten mehrere Tage beanspruchen kann. Die Wanderung von Leukozyten beim Verlassen der Gefäße wird durch ihre Bindung an vaskuläre Endothelzellen gesteuert. Dabei interagieren verschiedene Rezeptor-Ligandenpaare auf den beteiligten Zellen. Unter einer reversiblen, niedrigaffinen Bindung der Leukozyten an die Oberfläche des Endothels rollen sie auf der Oberfläche des Endothels entlang („Rolling“), gefolgt von festem Adhärieren („Adhesion“) und der Transmigration in subendotheliale Gewebe („Transmigration“) (83;240). Im Folgenden wird detaillierter auf polymorphkernige Granulozyten (PMN) sowie leukozytäre und endotheliale Adhäsionsmoleküle eingegangen.

2.3.3.1 Leukozytäre Liganden

Neben der Zell-Zell Interaktion erfüllen Integrine wichtige Funktionen in der Zell-Matrix Interaktion. Integrine sind eine Familie heterogener Glykoproteine und setzen sich aus je einer α- und β-Kette zusammen. Unter der Rekrutierung eines komplexen Arrangements von Proteinen und Kinasen sind Integrine mit dem Zytoskelett verbunden und nehmen an dynamischen Prozessen, wie der Zellmigration, teil (98). Anhand der β-Kette erfolgt die Einteilung der Integrine in Gruppen: β1 (CD29)-, β2 (CD18)- und β3 (CD61)-Integrine sind von besonderer Bedeutung für entzündliche Prozesse. Auf ruhenden Leukozyten sind z.B. Mac-1 (CD11b/CD18) und LFA-1 (CD11a/CD18) schwach exprimiert. Nach Stimulation werden die in zytoplasmatischen Granula gespeicherten Moleküle rasch auf der Zelloberfläche exponiert und können mit ICAM-1 auf Endothelzellen interagieren (129).

Auf der Oberfläche nahezu aller Leukozyten konnte das fukosylierte Tetrasaccharid SLex nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnten P-Selektin-Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1) und Lewis X (Lex) als Liganden der Lektindomäne endothelialer Selektine identifiziert werden (102).


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2.3.3.2  Rollen, Adhärieren und Transmigrieren von PMN

Obwohl insbesondere kapilläre und venöse Endothelzellen ständig mit Leukozyten in Kontakt kommen, findet keine dauerhafte Interaktion oder Aktivierung der „kollidierenden“ Zellen statt. Bei proinflammatorischer Aktivierung der Endothelzellen (und/oder Granulozyten) können Granulozyten jedoch gezielt „abgebremst“ werden. Ruckartig, teils von Endothel- zu Endothelzelle, gleiten und rollen die Granulozyten über das Endothel (Abb. 11) (83;131;179). Auf Seiten der Granulozyten ist auf der Spitze von Mikrovilli exponiertes L-Selektin an diesem Rollen maßgeblich beteiligt, auf Seiten des Endothels die transiente Expression von P-Selektin (143;216). Schließlich führt die Expression von E-Selektin auf der Endotheloberfläche zum Abbremsen und finalen Adhärieren der Granulozyten (123).

Neben E-Selektin trägt die endotheliale Expression von ICAM-1 maßgeblich zur Adhäsion bei. Die Bindung von leukozytären β2-Integrinen an ICAM-1 führt ihrerseits über die Induktion verstärkter β2-Integrinexpression auf Granulozyten zur Festigung der Interaktion (123). Insbesondere bei Monozyten kann neben diesen Faktoren die Bindung von leukozytären β1-Integrinen an endotheliales VCAM-1 zur Adhäsion beitragen (171).

Zusätzlich zu den „primären“ Adhäsionsmolekülen wirken weitere Faktoren, wie z.B. die Expression von endothelialem Plättchen-aktivierendem Faktor (PAF) (245) oder IL-8 (180), maßgeblich an der Adhäsion mit.

Im Anschluss wandern die Granulozyten zwischen den Endothelzellen durch die endotheliale Basalmembran. Die dabei auftretenden Interaktionen zwischen dem Zytoskelett der beteiligten Zellen und die Bedeutung von z.B. der Adhäsion an Matrixbestandteile ist äußerst komplex und erst ansatzweise verstanden (227).


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Abb. 11 : Das Rollen, Adhärieren und Transmigrieren von Granulozyten an/durch das Endothel ist wesentlich durch die koordinierte Expression von leukozytären und endothelialen Adhäsionsmolekülen gesteuert.

2.3.3.3 Endotheliale Adhäsionsmoleküle

Im Rahmen inflammatorischer Prozesse steuert die kontrollierte Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle wesentliche Anteile der Interaktion zwischen Leukozyten und Endothelzellen. Dabei kommt dem zeitlichen Verlauf der Expression der beteiligten Moleküle entscheidende Bedeutung zu. Im Folgenden wird auf die in eigenen Arbeiten untersuchten Reaktionspartner fokussiert [Selektine, Integrine, Mitglieder der Immunglobulin (Ig)-Super-Gen-Familie]. Neben diesen wurden weitere potentiell bedeutende Interaktionspartner wie CD99 identifiziert (183). Insbesondere weisen aktuelle Arbeiten auf eine wichtige Funktion endothelialer junktionaler Proteine (z.B. JAM-1, VE-Cadherin) im Rahmen des Transmigrationsprozesses hin (227).


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2.3.3.4 Selektine

Endothelzellen können P- und E-Selektin auf der Zelloberfläche exprimieren (106;132). Auf ihrer extrazellulären Domäne weisen beide Moleküle eine Ca2+-abhängige c-Typ Lektin-Domäne auf, die spezifisch an Kohlenhydrat-Seitenketten ihrer Liganden bindet. Zur Identifikation von Zielzellen dient eine „epithelial growth factor“ (EGF)-Domäne. Daneben finden sich eine variable Anzahl kurzer „Konsensus-Sequenzen“. Intrazellulär ist an die Transmembrandomäne der Moleküle ein kurzer zytoplasmatischer Bereich angeschlossen, der u.a. potentielle Phosphorylierungsstellen enthält (106;131).

P-Selektin wird präformiert in den Weibel-Palade-Körperchen gespeichert und innerhalb von Minuten nach Stimulation an der Oberfläche präsentiert (23). Das Molekül ist nur für 5-15 min auf der Zelloberfläche nachweisbar, dann wird es durch endozytotische Wiederaufnahme und/oder proteolytische Spaltung entfernt. P-Selektin vermittelt in der Interaktion mit granulozytärem L-Selektin die lockere Assoziation und das Rollen von PMN, Monozyten und Lymphozyten an aktivierte Endothelzellen (143).

E-Selektin wird erst nach ca. vierstündiger proinflammatorischer Stimulation maximal auf der Oberfläche der Endothelzellen exprimiert. Im Gegensatz zu P-Selektin wird E-Selektin unter der Kontrolle von u.a. dem Transkriptionsfaktor NF-κB transkriptionell reguliert. Daher spielt E-Selektin in späteren Phasen der Entzündung eine wichtige Rolle (1;124). Granulozyten erfahren durch die Bindung von endothelialen Selektinen an ihren L-Selektin assoziierten Liganden SLex eine zusätzliche Aktivierung. Bedingt durch die abflauende Selektin-Transkriptionsrate, die mRNA-Halbwertszeit sowie Proteolyse des exprimierten Proteins wird ca. 10-15 h nach Stimulation wieder eine basale Oberflächenexpression erreicht (15;81;123).

Obwohl Experimente mit Hilfe P- oder E-Selektin blockierender Antikörper eine wirksame Blockade der Leukozytenaktivierung in vitro und in vivo zeigten und die physiologische Rolle dieser Moleküle für die Rekrutierung der Entzündungszellen akzeptiert ist, scheint eine erhebliche Redundanz der Adhäsionsmoleküle zu bestehen (29): Experimente mit P- und E-Selektin-defizienten Mäusen zeigten zwar eine reduzierte Sterblichkeit in Peritonitismodellen, jedoch nur teilweise Effekte auf die Rekrutierung der Entzündungszellen zum Ort des Geschehens (30;31).


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2.3.3.5 Immunglobulin-Superfamilie

Die endothelialen Adhäsionsmoleküle ICAM-1, ICAM-2 und VCAM-1 sind Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie. Sie sind durch charakteristische Ig-Domänen von 70-120 Aminosäuren Länge und eine typische räumliche Struktur charakterisiert.

CD 54 (ICAM-1) wird neben Endothelzellen auf anderen residenten Zellen (z.B. Epithelzellen, Fibroblasten) und Leukozyten nachgewiesen (97). Wie E-Selektin ist ICAM-1 auf ruhenden Zellen gering exprimiert und wird nach proinflammatorischer Stimulation der Endothelzellen transkriptionell hochreguliert. Die in wesentlichen Anteilen NF-κB abhängige Expressionssteigerung erreicht - abhängig vom Stimulus - nach ca. 18-24 h ihr Maximum (125). ICAM-2 ist dagegen primär konstitutiv auf Endothelzellen exprimiert (50). Die extrazelluläre Domäne des einkettigen Glykoproteins besteht aus 5 Ig-ähnlichen Domänen, die als Liganden für die β2-Integrine LFA-1 und MAC-1 auf Granulozyten dienen können. Besatz von ICAM-1 führt zur Aktivierung zahlreicher, u.a. Tyrosin- und MAP Kinasen umfassenden, Signaltransduktionswegen in Endothelzellen (97). Welche Bedeutung und Folgen diese aktivierten Mechanismen für die Orchestrierung der PMN-Endothel Interaktion und die lokale Entzündungsreaktion insgesamt haben, ist kaum untersucht.

VCAM-1 (CD 106) wird von proinflammatorisch aktivierten Endothelzellen (147) und u.a. Epithelzellen (20) exprimiert. Endothelzellen zeigen keine konstitutive Expression von VCAM-1; eine Steigerung der transkriptionell regulierten Expression ist nach ca. 2-4 h nachweisbar, das Maximum wird nach ca. 16-24 h auf der endothelialen Oberfläche detektiert. Neben der Vermittlung des Rollens und Adhärierens von PMN an Endothelzellen binden auch Mono-, Lympho- und verschiedene Tumorzellen an VCAM-1. Dabei dienen die β1-Integrine α41 und α47 auf PMN und VLA4 auf Eosinophilen und Monozyten als Liganden von VCAM-1 (66).

2.3.4 Endotheliale Permeabilität

Ob im Blut vorhandene lösliche Bestandteile und korpuskuläre Elemente das Blutgefäß verlassen können, wird durch den Zustand des endothelialen Monolayers und die herrschenden physikalisch-chemischen Bedingungen bestimmt (202;220;221). Mit Ausnahme einiger Gefäßprovinzen (z. B. Leber, Sinosuide des [Seite 39↓]Knochenmarks) bildet unfenestriertes Endothel eine semipermeable Barriere. Endothelzellen müssen bereits bei physiologischen Bedingungen unter Einfluss einer Vielzahl von physikalischen (z. B. Schubspannung, Blutdruck) und chemischen (z. B. Katecholamine) Reizen diese Barrierefunktion aufrechterhalten (11).

Pathologische Verhältnisse lassen das Endothel aufgrund seiner exponierten Lage zum Ziel verschiedenster Stimuli werden, die auf unterschiedlichen Wegen die endotheliale Schrankenfunktion stören. Im Rahmen akuter Entzündungen kommt es regelmäßig zu erhöhter parazellulärer Gefäßpermeabilität (Abb. 12): Pathogene und ihre Produkte (Exotoxine, liberierte Enzyme, Endotoxin), aktiviertes Komplement, Thrombin oder durch aktivierte Granulozyten freigesetzte Substanzen (z. B. Sauerstoffradikale, Proteasen) können zu einem Verlust der endothelialen Barrierefunktion führen (7;11;134;202;221). Die austretenden Blutbestandteile sind in der Lage, die Entzündung zusätzlich zu aggravieren. Darüber hinaus vermögen durch Hypoxie und/oder Reperfusionsschäden induzierte Substanzen (z.B. VEGF) die endotheliale Permeabilität zu steigern. VEGF ist auch für das häufig beobachtete Ödem in der Umgebung maligner Tumore und Tumor-bedingte Angiogenese entscheidend mitverantwortlich (14;62;63) (Abb. 12).


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Abb. 12 : (A) VEGF induziert endotheliale Hyperpermeabilität durch die Induktion von Fenestrae und dem vesikulären-vakuolären Organell (VVO). (B) Kontraktion der Endothelzellen hat die Eröffnung interzellulärer Lücken mit parazellulärer Filtration zur Folge.

2.3.4.1 Transzelluläre Permeabilität

Die Beobachtung, dass das Endothel unter physiologischen Bedingungen eine selektive Barriere für Moleküle unterschiedlicher Größe und Gestalt darstellt, führte zur Entwicklung von sog. Mehr-Poren-Modellen (Transport durch Poren unterschiedlichen Durchmessers). Diese Theorien haben gemeinsam, dass insbesondere die geringe, stets beobachtbare basale Permeabilität über transzelluläre Kanäle/Poren stattfindet und einen geordneten Stoffaustausch ermöglicht. Allerdings ist die Identität und Lokalisation dieser Poren bis heute unklar (174).


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Die Entdeckung, dass VEGF die Ausbildung von Fenestrae in normalerweise unfenestriertem Endothel und einem vesikulären-vakuolären Organell (VVO) zu stimulieren vermochte, hat der Diskussion um transzelluläre Permeabilität neue Aktualität verliehen (Abb. 13) (14;62;63;71;72). VEGF ist weit über seine Bedeutung als Permeabilitäts-stimulierendes Agens hinaus ein wichtiger Regulator der Angio- und Vaskulogenese (175;176).

Abb. 13 : Nachweis von Fenestrae (A) und VVO (B) in VEGF exponierten, auf Polycarbonatfiltermembranen gewachsenen, humanen Endothelzellen. In (A) sind Fenestrae bei gleichzeitig geschlossenen Zell-Zell-Kontakten sichtbar (M, Filtermembran; F, Fenestrae; AJ Adherence junction; VVO, vesikulär-vakuoläres Organell).

Eine Vielzahl von Tumoren sezernieren VEGF mit der Folge von Tumor-induzierter Angiogenese und Tumor-assoziiertem Ödem (26). Insbesondere Hypoxie vermehrt die Expression und Sekretion von VEGF sowie die Expression der VEGF-Rezeptoren (137;175).

VEGF bindet hochspezifisch an die Rezeptoren VEGFR-1 („fms-like tyrosine kinase“, Flt-1) und VEGFR-2 („fetal liver kinase“, Flk-1; „kinase insert domain-containing receptor“, KDR) (175;193). Bei beiden VEGF-Rezeptoren handelt es sich um transmembranöse Glykoproteine mit einer extrazellulären Ligand-bindenden und einer intrazellulären Tyrosin-Kinase Domäne.


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Die Rezeptor-Okkupation führt zu einer komplexen Aktivierung der Endothelzellen, wie sie für andere permeabilitätserhöhende Stimuli bekannt ist: Neben einer Erhöhung des intrazellulären Ca2+, Aktivierung der PLCγ und PKCα/βII sowie der PKB/Akt Kinase wurden auch MAP Kinasen in VEGF-exponierten Endothelzellen aktiviert (73;74;175;193). Trotz der Aktivierung dieser Signalwege, die auch Induktoren parazellulärer Permeabilität zum Ziel haben, hat VEGF-Stimulation von Endothelzellen keine Zellkontraktion und Eröffnung parazellulärer Lücken zur Folge: Topische Injektion von VEGF in Ratten und Mäusen induzierte Fenestrae, d.h. nahe den geschlossenen Zell-Zell-Kontakten gelegene, durch Diaphragmen verschlossene Strukturen (14;62;72). Darüber hinaus erhöht VEGF Permeabilität durch das Vesikulo-Vakuoläre Organell (VVO). Feng et al. (71;72) demonstrierten, dass das Organell etwa 14-18 % des Zytosols der untersuchten Endothelien okkupiert. VVO´s repräsentierten traubenartige Gebilde von ca. einhundert, miteinander verbundenen Vesikeln und Vakuolen. Das Organell konnte über multiple Öffnungen mit luminalen und abluminalen Oberflächen in direkten Kontakt treten. Die Koinzidenz von erhöhten VEGF-Spiegeln in abführenden Tumorgefäßen, erhöhter Permeabilität und vermehrter VVO-Aktivität spricht für eine zentrale Bedeutung von VEGF für die Induktion eines peritumoralen Ödems (62;63). Allerdings liegen bis heute kaum Untersuchungen zur Natur dieser endothelialen Struktur vor. In klinischen Studien wird versucht, mit Hilfe von Antagonisten des VEGF-Systems Tumore zu behandeln (26).

Vor dem Hintergrund der besonderen Eigenschaften und der zentralen Bedeutung von VEGF für physiologische (Vaskulogenese) und pathophysiologische (Hypoxie-induzierte Hyperpermeabilität und Angiogenese) Phänomene untersuchten wir in eigenen Studien Mechanismen VEGF-induzierter Hyperpermeabilität ( 7 H , 11 H , 15 H ).

2.3.4.2 Parazelluläre Permeabilität

Parazelluläre Permeabilität wird primär im Rahmen inflammatorischer Prozesse beobachtet. Eine große Anzahl sehr unterschiedlicher Stimuli führen über die Ausbildung interzellulärer Lücken zu erhöhter parazellulärer Permeabilität (7;11;22;202;221): Beispielsweise induzierten bakterielle Poren-bildende Exotoxine (E. coli HlyA, S. aureusα-Toxin), bakterielle Proteasen oder virale Produkte (HIV-Tat [Seite 43↓]Protein) parazelluläre Hyperpermeabilität. Aktivierte lösliche Bestandteile des Blutes (Komplement, Thrombin) oder Produkte stimulierter Granulozyten (Sauerstoffradikale, Proteasen) können ebenso parazelluläre Lückenbildung hervorrufen. Von elementarer Bedeutung für die Regulation parazellulärer Permeabilität sind das endotheliale Zytoskelett und die junktionalen Zell-Zell Verbindungen.

2.3.4.3 Zytoskelett

Endothelzellen enthalten ein elaboriertes Mikrofilamentsystem, das grob in ein kortikales Filamentnetz, einen „Junktion-assoziierten“ und einen “Stressfaser”-bildenden Anteil untergliedert werden kann. Für die Regulation der Permeabilität scheint das oft als “peripheral dense band” bezeichnete „Junktion-assoziierte“ Filamentsystem besonders wichtig zu sein.

Die generelle Bedeutung des Mikrofilamentsystems für den Erhalt der endothelialen Barrierefunktion wurde eindrucksvoll durch Untersuchungen mit F-Aktin depolymerisierenden Substanzen belegt: Verkürzung der Aktin-Filamente durch z.B. Botulinum C2-Toxin oder Cytochalasin D führte zum Anstieg der endothelialen Permeabilität in vitro (209) und im isolierten Organmodell (67). Umgekehrt stabilisierte eine Blockade der Abdissoziation von G-Aktin am “pointed” Ende mittels Phalloidin das F-Aktin und damit die endotheliale Barrierefunktion (209).

Wie eine Vielzahl von Studien belegen, kontrahieren Endothelzellen unter pathophysiologischen Bedingungen der Entzündung. Diese aktive Kontraktion trägt substantiell zur interzellulären Lückenbildung mit folgendem parazellulärem Flüssigkeitsfluss bei (Abb. 14) (11;22;202). Das Mikrofilamentsystem bildet mit dem endothelialen Myosin ein kontraktiles Zytoskelett; die Zellen enthalten neben Aktin die Proteine Myosin II, Tropomyosin, “Z-line”-Protein und α-Actinin, die zum Aufbau von kontraktilen Aktin-Myosin-Einheiten benötigt werden.

In mehreren Studien wurde mit unterschiedlichen Verfahren gezeigt, dass z.B. Thrombin-exponierte Endothelzellen kontrahieren und dazu ein intaktes Mikrofilamentsystem benötigen. Die Kontraktion der Zellen war von einer Öffnung interzellulärer Spalten begleitet (11;22;202).

Einen direkten Hinweis für die Notwendigkeit einer dynamischen Aktin-Myosin-Interaktion für die Kontraktion von Endothelzellen ergaben Untersuchungen mit [Seite 44↓]chemisch modifiziertem Myosin (NEM-S1-Myosin) (187): Wenn kein regulärer Zyklus der Aktin-Myosin-Interaktion mehr möglich war, wurde auch keine Kontraktion und Lückenbildung nachgewiesen.

Abb. 14 : Die Balance zwischen kontraktilen und fixierenden Kräften trägt wesentlich zur Regulation parazellulärer Permeabilität bei. Neben der Aktivierung Aktin-Myosin abhängiger Zellkontraktion kann auch die Modifikation der Zell-Zell und/oder Zell-Matrix Kontakte zu endothelialer Hyperpermeabilität führen (Hsp27, heat shock protein 27; RhoKi, Rho Kinase; MLC-Ph-ase, Myosinleichketten Phosphatase; Cad, Cadherin; Vinc, Vinculin; Ta, Talin; Pax, Paxillin; FAP, focal adhesion plaque).

Für eine erfolgreiche Kraftübertragung - und damit Kontraktion der Endothelzellen - ist die Phosphorylierung der Myosinleichtkette (MLC) an Aminosäure Threonin 18 und/oder Serin 19 notwendig (202;220;221). Verschiedene Kinasen, z.B. die MLC-Kinase, Rho-Kinase (in vitro) oder PKC können die MLC direkt an diesen kritischen Aminosäuren phosphorylieren. Eine dominante Rolle scheint dabei der Rho-Kinase zuzukommen: Neben einer direkten Phosphorylierung kann die Rho-Kinase durch gleichzeitige Inhibition der MLC-Phosphatase substantiell die Phosphorylierung der MLC erhöhen (150;151;202;220;221). Möglicherweise ist die konzertierte Aktion von MLC- und Rho-Kinase letztlich für die Kontraktion der Endothelzellen verantwortlich.


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Obwohl die Rolle der aktiven Kontraktion für parazelluläre Permeabilität unbestritten ist, muss darauf hingewiesen werden, das die meisten vorliegenden Untersuchungen zu dieser Fragestellung an Thrombin-stimulierten Zellen vorgenommen wurden. Welche Rolle den entsprechenden Kinasen bei anderen Stimuli wie Poren-bildenden bakteriellen Exotoxinen oder Sauerstoffradikalen zukommt, ist weitestgehend unbekannt. Bisherige Ergebnisse lassen jedoch vermuten, dass sehr unterschiedliche Signalwege, ausgelöst durch diverse Stimuli, letztlich durch Aktivierung der MLC-Phosphorylierung eine aktive Kontraktion der Endothelzellen auslösen.

Neben der Aktin-Myosin Interaktion scheinen endotheliale Zell-Zell/Zell-Matrix-Kontakte zur Regulation der endothelialen Barrierefunktion entscheidend beizutragen (11;55;182). Die endothelialen Zellverbindungen (Zonula occludens, Zonula adhaerens, Nexus) sind komplexe, dynamische Strukturen (7;162). Neben mit zur Nachbarzelle gerichteten Elementen sind sie z. T. innerhalb der Zelle über eine Vielzahl von Adaptorproteinen mit dem Zytoskelett verbunden. Die Komposition partizipierender Proteine, ihre Verbindungen untereinander sowie ihre Lokalisation konnten durch wechselnde Ca2+-Spiegel, Serin-, Threonin- und Tyrosin-Phosphorylierung und die Effektoren kleiner GTP-bindender Rho-Proteine modifiziert werden (55).

Eine direkte Beeinflussung der Zell-Zell/Zell-Matrix Verbindungen durch Ca2+-Entzug (Integrin-Matrix Interaktion, VE-Cadherin/Catenin-System) oder Proteasen-Einwirkung (z.B. Elastase) führte zu einem Versagen der endothelialen Barrierefunktion (111;208).

Verschiedene Stimulantien endothelialer Hyperpermeabilität zeigen eine Umverteilung oder den Verlust von Vimentin, Vinculin, α-Actinin und Spektrin: Dabei wurden diese Proteine (z.B. Vimentin, Vinculin) durch verschiedene Kinasen phosphoryliert (7;55;182;202). Wie bedeutsam diese beschriebenen Veränderungen für die Permeabilitätsregulation letztlich sind, ist nicht im Detail bekannt.

Eigene Untersuchungen hatten zum Ziel, neben Aspekten der basalen Permeabilitätsregulation ( 3 H , 18 H ) auch erste therapeutische Ansätze zu erarbeiten ( 2 H , 12 H ).


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2.4 Konsequenzen der Endothelaktivierung

Die Aktivierung des Endothels trägt maßgeblich zur Ausprägung der Symptome Rötung, Schwellung, Überwärmung und Schmerz als Merkmale der akuten Entzündung bei. In manchen Situationen haben endotheliale Fehlfunktionen fundamentalen Einfluss auf den Verlauf infektiöser Erkrankungen. Im Rahmen systemischer Infektionen (z.B. der Sepsis) ist das Endothel an der Ausbildung von Multiorganversagen beteiligt (89). Darüber hinaus ist der Verlust der endothelialen Barrierefunktion eine Vorraussetzung zur Entwicklung des lebensbedrohlichen Lungenödems beim akuten Atemnotsyndroms des Erwachsenen (ARDS) (70;89;228).

Die Überwindung der endothelialen Barriere kann einen entscheidenden Schritt bei der Invasion von Pathogenen in besonders geschützte Kompartimente, wie etwa das Gehirn, unter Überwindung der Blut-Hirn Schranke, darstellen (149).

Endotheliale Schädigung und die Aktivierung prothrombotischer Signale durch von EHEC produziertes Shiga Toxin konnten als wichtige Pathomechanismen in der Entwicklung mikroangiopathischer Prozesse des HUS identifiziert werden (107).

Hoch Endothel-affine Bakterien wie Rickettsiae lösen schwerste Infektionserkrankungen, wie z.B. „Rocky Mountain spotted“-Fieber durch die primäre Infektion von Endothelzellen aus (219). Multiple, auf das Endothel einwirkende Faktoren der induzierten Immunantwort und die direkte Aktivierung dieser Zellen trägt wesentlich zur Ausbildung oft fatal verlaufender Infektionen wie der Sepsis (89) oder hämorrhagischer Fieber bei (186).

Zunehmende Aufmerksamkeit fokussiert auf der Rolle von chronischer Infektion des Endothels für die Krankheitsentstehung. Mitglieder der Bartonella-Spezies werden als kausatives Agens für die Entstehung der Katzenkratzkrankheit und bazillären Angiomatose-Peliose angesehen (52;53). Es wird postuliert, das die Infektion von Endothelzellen mit Kaposi´s Sarkoma assoziiertem Herpesvirus ursächlich an der Entstehung des Kaposi Sarkoms beteiligt ist (164). Weiterhin stark umstritten ist die Hypothese, dass chronischen viralen oder bakteriellen Infektionen eine bedeutende Rolle für die Entstehung und Progression der Arteriosklerose zukommt (153;167).

Ob es sich nun um einfache, lokale oder schwere systemische Entzündungen handelt, besteht bei allgemeiner Betrachtung kein Zweifel daran, dass die Aktivierung [Seite 47↓]von Endothelzellen wesentlich zur Ausbildung resultierender Erkrankungen beiträgt. Vor diesem Hintergrund kann das Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen entscheidende Impulse zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Bekämpfung von Infektion und Inflammation liefern.


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19.05.2004