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5  Diskussion

5.1 Funktion von Rho-Proteinen in Endothelzellen

Initiale Untersuchungen identifizierten Rho-Proteine als zentrale Regulatoren des Mikrofilamentsystems (213) ( 3 H ). Weiterführende Analysen ergaben, dass diese Moleküle auch als wichtige Schaltmoleküle in verschiedenen Signaltransduktionswegen in eukaryonten Zellen wirken (114;172;213). Eigene Untersuchungen prüften die Rolle der Rho-Proteine in der proinflammatorischen Transformation von Endothelzellen.

Die Exposition von Endothelzellen gegenüber Bakterien und ihren Bestandteilen (z.B. LPS) sowie Produkten der körpereigenen Immunantwort (z.B. Zytokine wie TNF), hat die Aktivierung der Endothelzellen zur Folge. Verschiedenste Signalwege, die meist die Stimulation NF-κB abhängiger Gentranskription beinhalten, tragen zur Ausprägung der Zellantwort bei.

Die Blockade der Rho Proteine RhoA, Cdc42 und Rac1 durch C. difficile Toxin TcdB-10643 reduzierte die LPS-induzierte Tyrosinphosphorylierung, NF-κB Aktivität sowie folgende IL-8- ( 9 H ) und COX-2-Expression ( 17 H ) im Endothel, hatte jedoch keinen Effekt auf LPS-induzierte p38 MAP Kinasen Aktivität. Stimulation der p38 MAP Kinase alleine war ausreichend, um die IL-8-Bildung zu induzierten. Somit induziert LPS in Endothelzellen sowohl einen Rho abhängigen als auch einen Rho unabhängigen Signalweg, die beide zur Aktivierung von NF-κB beitragen (Abb. 15)

Abb. 15 : LPS stimuliert Rho abhängige und Rho unabhängige Signalwege in Endothelzellen.


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Darüber hinaus zeigten Essler et al. (69), dass Blockade von Rho die LPS induzierte, Rho-Kinase abhängige Reorganisation des Zytoskeletts in Endothelzellen verhindert. Vor dem Hintergund, dass LPS Endothelzellen über die Rekrutierung von TLR4 aktiviert, scheinen nach unseren Beobachtungen Rho-Proteine in die proximale Signaltransduktion dieses bedeutenden Rezeptors involviert zu sein. Der TLR4- Signalpfad weist starke Übereinstimmungen mit dem des IL-1-Rezeptors auf (4;243). Die Beobachtung, dass Rho direkt mit dem IL-1-Rezeptor assoziiert, kann als weiterer Hinweis auf eine mögliche Rolle von Rho als Element des TLR-Signalweges interpretiert werden (195). Außerdem konnte die GTPase Rac1 als ein Teil des TLR2 Signalweges in Zelllinien identifiziert werden (9).

Neben den beschriebenen Signalwegen aktiviert LPS die PKC in Endothelzellen. Unsere Untersuchungen ergaben, dass Rho-, nicht jedoch Ras-Inhibition, die Aktivierung der PKC blockiert ( 6 H ). Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass Rho als ein Ankermolekül der translozierenden PKCα an der Zellmembran fungiert. Diese Hypothese verifizierten mehrere Studien anderer Arbeitsgruppen (42;185;198).

TNFα ist ein potentes Zytokin und aktiviert zahlreiche proinflammatorische und anti-apoptotische Signalwege in Endothelzellen. Die elektive Blockade einzelner Rho-GTPasen in Endothelzellen demonstrierte die Abhängigkeit TNFα-induzierter NF-κB Genexpression, DNA-Bindung und der Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern von RhoA ( 13 H ). Interessanterweise unterblieb die NF-κB Translokation, obwohl die zytosolischen Inhibitoren von NF-κB, IκB, degradiert waren. Diese Blockade der Translokation war unabhängig von der Unversehrtheit des Mikrofilamentsystems und der Rho-Kinase Aktivität. Über den zugrundeliegenden Mechanismus kann derzeit nur spekuliert werden. Eine prüfbare Hypothese ist, dass für die Translokation von NF-κB eine Rho abhängige Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors nach TNFα-Stimulation erfolgen muss. Ein solcher Mechanismus wurde für das NF-κB homologe Protein Dorsal in Drosophila melanogaster beschrieben (60).

Endothelzellen sind gegenüber einer Vielzahl proapoptotischer Stimuli resistenter als andere Zellen, wie z.B. Leukozyten. Dazu trägt die Expression antiapoptotischer Moleküle, die durch NF-κB positiv reguliert wird, wesentlich bei (51;241). In diesen Zellen hat TNFα-Stimulation einerseits die Aktivierung Caspase 8-abhängiger Apoptose zur Folge. Anderseits wird gleichzeitig die Expression antiapoptotischer Moleküle (z.B. „inhibitors of apoptosis“, IAP) induziert, die wiederum Caspase 8 [Seite 69↓]hemmen können (16;51;230;241). Blockiert man die (NF-κB-abhängige) Transkription dieser antiapoptotischen Moleküle, nimmt die Empfindlichkeit der Endothelzellen gegenüber Apoptose signifikant zu. Vor diesem Hintergrund analysierten wir Apoptose in Endothelzellen mit blockierten Rho-Proteinen ( 14 H ). Die Inhibition der Rho-Proteine induzierte massive Apoptose von Endothelzellen, wobei insbesondere intaktes RhoA für das Überleben der Zellen notwendig war. Diese Apoptose wurde durch Aktivierung der Caspasen 9 und 3 exekutiert, die Caspase 8 spielte keine Rolle (Abb. 16). Aktivierung der Caspase 9 erfolgt klassischerweise durch eine Freisetzung mitochondrialer Faktoren (56;64). Diese kann u.a. durch pro- und antiapoptotische Moleküle der Bcl-2 Familie reguliert werden (56). Da TcdB-10643 die Expression der antiapoptotischen Bcl-2 Proteine Bcl-2 und Mcl-1 reduzierte ( 14 H ), darf angenommen werden, dass der Destabilisierung der mitochondrialen Funktion eine wesentliche Rolle für die beobachtete Apoptose zukommt (56).

Abb. 16 : Synopsis von Rho-Inhibition und endothelialer Apoptose. Blockade der Rho-Proteine durch bakterielle Toxine (TcdB-10643, Bot. C3 Toxin) führt zur reduzierten Expression anti-apoptotischer Moleküle, Aktivierung der Caspase (Casp) 9 und Apoptose. Erhöhung von cAMP blockiert auf unbekanntem Weg die Caspasen-Aktivierung und Apoptose.


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Nach diesen und anderen Untersuchungen wirken Rho-Proteine als zentrale Schaltmoleküle in der proinflammatorische Aktivierung von Endothelzellen mit. Aktuelle Untersuchungen legen nahe, dass klinisch eingesetzte Hemmstoffe der HMG-Co Enzym A Reduktase einen wichtigen Teil ihrer vaskuloprotektiven Wirkung über die Hemmung der Rho-Proteine entfalten (10;121;122). Das Produkt Mevalonsäure der HMG-Co Enzym A Reduktase ist Ausgangssubstrat für posttranslationelle Prenylierung der Rho-GTPasen, die für deren Aktivierbarkeit und Membranlokalisation notwendig ist (121;213). Darüber hinaus hemmte das Statin Simvastatin S. aureus-induzierte Inflammation in vitro und in vivo (170). Zusammengefasst stützen diese Beobachtungen die Hypothese, dass Rho-Protein-abhängige Prozesse zentrale Funktionen im Gefäßsystem, und insbesondere in Endothelzellen, spielen.

5.2 Parazelluläre endotheliale Permeabilität

Durch Retraktion der Endothelzellen unter dem Einfluß inflammatorischer Agenzien kommt es regelmäßig zur interzellulären Lückenbildung mit der Folge des Verlusts der endothelialen Barrierefunktion gegenüber Wasser und Makromolekülen. Eine Vielzahl von Untersuchungen belegte, dass der Zustand des endothelialen Mikrofilamentsystems eine wichtige Rolle für diese Regulation spielt (11;151;202;220;221). Kleine GTP-bindende Rho-Proteine wurden als zentrale Schaltmoleküle in der Organisation des Zytoskeletts erkannt (213). Große clostridale Zytotoxine modifizieren GTPasen durch kovalente Modifikation; C. difficile Toxin B-10463 blockiert RhoA, Rac1 und Cdc42 durch Glukosylierung (5;6;103-105).

Nachdem wir die Glukosylierung von Rho-Proteinen durch TcdB-10643 in Endothelzellen verifiziert hatten, prüften wir die Hypothese, dass TcdB-10463-induzierte Hemmung der Rho-Proteine endotheliale Permeabilität erhöht ( 3 H ). Bei gleichzeitigem Abfall des endothelialen F-Aktins führte TcdB-10463 zu einem zeit- und dosisabhängigen Kollaps der endothelialen Barrierefunktion (Anstieg der Wasserfiltration, Abfall des Albuminreflektions-Koeffizienten). Der Verlust der Permselektivität war von der Ausbildung parazellulärer Lücken begleitet.

Die gleichzeitige Hemmung der drei GTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42 durch TcdB-10643 führte auch in einer Studie von Adamson et al. (2) zu einem Verlust an Aktin-Stressfasern sowie von endothelialer Hyperpermeabliltät in vivo und in vitro. [Seite 71↓]Zusätzlich zeigten die Autoren, dass in den TcdB-01643 behandelten Zellen das junktionale VE-Cadherin verloren ging. Für die endotheliale Hyperpermeabilität nach TcdB-10643 scheint am ehesten die Blockade von Rac1 verantwortlich zu sein (237): Die Expression von dominant-negativem Rac1 mittels viraler Vektoren induzierte spontan endotheliale Hyperpermeabilität. Im Gegensatz dazu führte die Aktivierung von RhoA in mehreren Studien zur Steigerung der Permeabilität (35;150;151;220;221). Dies bedeutet, dass u.U. den einzelnen GTPasen gegensätzliche Funktionen (in Endothelzellen) zukommen können. Zur Verkomplizierung der Analyse von Rho-Proteinen trägt auch die Beobachtung bei, dass die Effekte der Rho-Proteine auf das Zytoskelett zwischen verschiedenen Zellarten variieren können (213). Von erheblichem Einfluss auf die Analyse ist weiterhin das Vorgehen in der Untersuchung: So scheint es ein wesentlicher Unterschied zu sein, ob in primären Zellkulturen normotop exprimierte Rho-Proteine am Ort ihren natürlichen Lokalisation blockiert werden oder ob ektop überexprimierte Mutanten in Zelllinien Verwendung finden (213).

Insgesamt bestätigten diese Resultate die enorme Bedeutung des F-Aktinfilamentsystems für die Regulation endothelialer Permeabilität und gaben einen ersten Hinweis darauf, dass Rho-Proteine wichtige Funktionen in der Anpassung von Endothelzellfunktionen unter inflammatorischen Bedingungen haben.

Überraschenderweise führten Untersuchungen zur Rolle des Mikrotubulussystems für die Regulation der endothelialen Barrierefunktion zurück zum Mikrofilamentsystem und den Rho-Proteinen ( 18 H ): Die Depolymerisation von Mikrotubuli in konfluenten Endothelzellkulturen hatte einen Verlust der endothelialen Barrierefunktion bei gleichzeitiger massiver Ausbildung von F-Aktin Stressfasern und einem Anstieg des endothelialen F-Aktingehalts zur Folge. Im Gegensatz dazu führte die Depolymerisation des F-Aktins zu keinen sichtbaren Veränderungen des Mikrotubulussytems in den Zellen. Stabilisierung der Mikrotubuli reduzierte sowohl die Ausbildung der Stressfasern als auch die endotheliale Hyperpermeabilität.

Die beschriebenen Alterationen des Mikrofilamentsystems als Folge der Mikrotubulus-Depolymerisation legen nahe, dass die beobachtete Hyperpermeabilität letztlich doch unter Einfluss des Mikrofilamentsystems auftritt. Verin et al. (225) demonstrierten, dass die Depolymerisation von Mikrotubuli zu vermehrter Phosphorylierung der Myosinleichtkette und folgender Kontraktion der Zellen führt. [Seite 72↓]Da die Depolymerisation von Mikrotubuli zur Freisetztung des GDP-Austauschfaktors GEF-H1 und damit zur Aktivierung Rho-Kinase abhängiger Phosphorylierung der Myosinleichtkette führte, schließt sich der Kreis zwischen Mikrotubulus-Depolymerisation und endothelialer Zellkontraktion und Hyperpermeabilität (Abb. 17) (119).

Abb. 17 : An Mikrotubuli gebundener GDP-Austauschfaktor GEF-H1 ist inaktiv. Durch Depolymerisation der Mikotubuli freigesetztes, aktives GEF-H1 kann über die Aktivierung Rho-abhängiger Mechanismen zur Kontraktion von Endothelzellen und folgender Hyperpermeabilität führen.

Ob inflammatorische Stimuli indirekt die Zellkontraktion über Perturbation der Mikrotubuli herbeiführen, müssen weitere Studien klären. Interessanterweise kann die Polymerisation der Mikrotubuli auf die Freisetzung von NO, PGE2 oder PGI2 Einfluss nehmen und Migrationsprozesse der Endothelzellen regulieren (76;126). Insgesamt deuten diese Experimente auf eine potentiell wichtige, bislang wenig untersuchte Rolle der Mikrotubuli unter inflammatorischen Bedingungen in Endothelzellen hin.


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5.3  Transzelluläre endotheliale Permeabilität

Neben parazellulärer Permeabilität kann - insbesondere unter hypoxischen Bedingungen - transzelluläre Permeabilität auftreten (62;63;72). Für die Induktion dieser speziellen Hyperpermeabilität, die bei geschlossenen Zell-Zell-Verbindungen beobachtet wird, kommt dem vaskulären endothelialen Wachstumfaktor (VEGF, früher auch als vaskulärer Permeabilitätsfaktor, VPF, bekannt) besondere Bedeutung zu (77;175;193). Zunächst war unklar, ob VEGF seine Wirkung direkt am Endothel ausübt oder durch die Aktivierung anderer Zellen.

Wir demonstrierten, dass VEGF durch direkte Einwirkung auf Endothelzellen endotheliale Permeabilität erhöht ( 7 H ). Auffällig war einerseits die schnelle Aktivierung der Zellen durch VEGF (P-Selektin-Expression, Bildung von Inositol-1,4,5-Phosphat) innerhalb von Minuten und andererseits der Permeabilitätsanstieg nach einer Verzögerung von ca. 150 min nach Stimulation. Im Gegensatz dazu riefen zwei Endothelzell-unspezifische Mitogene („platelet-derived growth factor“, PDGF; „granulocyte-monocyte derived colony stimulated factor, GM-CSF) diesen Effekt nicht hervor. VEGF-Exposition der Endothelzellen hatte die Translokation von Wasser und Makromolekülen (Albumin) über den endothelialen Monolayer bei (elektronenmikroskopisch) geschlossenen Zell-Zell Verbindungen auf den Filtermembranen zur Folge ( 7 H ).

Zahlreiche Untersuchungen in vitro und in vivo bestätigten diesen Effekt auf die endotheliale Permeabilität (63;72). Interessanterweise war in manchen Gefäßbetten, wie z.B. der Haut, ein schneller VEGF induzierter Permeabilitätsanstieg nachweisbar, während in anderen die Filtration mit deutlicher Verzögerung anstieg (13;62;63;71;72). Darüber, ob neben Endothelzellen andere Zellen zu diesem Effekt beitragen oder verschiedene Endothelzellen unterschiedlich reagieren, kann bislang nur spekuliert werden.

Eigene, fortführende Untersuchungen in vitro und in vivo demonstrierten eine zentrale Bedeutung von tmTNF und p38 MAP Kinase für VEGF induzierte Permeabilität (Abb. 18) ( 11 H , 15 H ): Die Expression von tmTNF auf der Oberfläche von Endothelzellen war für VEGF-induzierte Hyperpermeabilität, nicht jedoch für VEGF-assoziierte Proliferation notwendig. Unstimulierte Endothelzellen exprimieren bereits geringe Mengen von tmTNF auf der Zelloberfläche. Diese Expression resultierte in erhöhter basaler Aktivität der p38 MAP Kinase und von NF-κB ( 11 H , 15 [Seite 74↓] H ). Hemmung der p38 MAP Kinase blockierte den VEGF-induzierten Permeabilitätsanstieg in vivo und in vitro ebenso effektiv wie die Blockade des tmTNF. Die Expression von tmTNF ging mit einer erhöhten Expression von Gewebefaktor („tissue factor“) und IL-6 einher, welche sich gut mit der beobachteten NF-κB Aktivität erklären lässt (41;236). Grundsätzlich liegen wesentlich weniger Erkenntnisse über die Rolle von tmTNF (in Endothelzellen) als über lösliches TNF vor. Transgene Mäuse, die eine unspaltbare Form von tmTNF unter der Kontrolle des Endothel-spezifischen tie2-Promotors exprimieren, zeigten eine chronisch-inflammatorische Aktivierung in Leber und Niere (236). Wie sich diese Tiere in Infektion und Inflammation verhalten, ist bislang nicht untersucht.

Die bislang bekannten Effekte der p38 MAP Kinase auf endotheliale Permeabilität beziehen sich auf parazelluläre Permeabilität und die Phosphorylierung junktionaler Proteine (78;108;113;152;154). Wie eine Verknüpfung der Kinase mit Mechanismen transzellulärer Permeabilität aussehen könnte, ist offen. Bates et al. (14) formulierten eine Hypothese, in der VEGF-induzierte Bildung von Diazylglyzerol durch Aktivierung von Kationen-Kanälen transzelluläre Permeabilität induziert. Allerdings wird auch in dieser Hypothese keine mögliche, prüfbare molekulare Verbindung zu Fenestrae und VVO aufgezeigt. Insgesamt sind sowohl die Signalwege zur Induktion von Fenestrae als auch die Natur der VVOs weitgehend unerforscht.

Abb. 18 : Vereinfachte Darstellung des VEGF-Signalweges zu Permeabilität und Angiogenese. Aktivierung der p38 MAP Kinase erhöht Permeabilität und hemmt Angiogenese. Blockade von tm-TNF inhibiert ebenso VEGF induzierte endotheliale Hyperpermeabilität. Aktivierung von ERK stimuliert die Angiogenese.


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Eine weitere Dichotomie im Signalweg zu Vaskulogenese und Hyperpermeabilität fand sich in der intrazellulären Signaltransduktion (Abb. 18) ( 15 H ): Während Blockade der p38 MAP Kinase in vitro und in vivo endotheliale Permeabilität blockierte, induzierte sie gleichzeitig Angiogenese in vitro und in vivo. Dieser Prozess war begleitet von verlängerter ERK1/2-Aktivität und erhöhter Plasminogen Bildung sowie verringerter endothelialer Apoptose.

Die p38 MAP Kinase könnte also ein „molekularer Schalter“ zwischen Angiogenese und Hyperpermeabilität wirken. Experimente, die die VEGF-assoziierte Permeabilität unter inflammatorischen Bedingungen untersuchen und die Hypothese adressieren, dass VEGF-induzierte Angiogenese zur Regeneration inflammatorisch geschädigter Gewebe beiträgt, stehen aus.

5.4 Therapie der endothelialen Schrankenstörung

Neben dem direkten Eingriff in zur Hyperpermeabilität führende Signalpfade erwies sich die Erhöhung zyklischer Nukeotide (cAMP, cGMP) als wirkungsvolle Methode zur Stabilisierung der endothelialen Barrierefunktion (190;207;212) ( 2 H , 7 H , 12 H ). Die intrazellulären Spiegel dieser Signalmoleküle sind von der Bildung der Nukleotide durch Adenylyl- oder Guanylylzyklasen einerseits und der hydrolytischen Spaltung der zyklischen Nukleotide durch Phosphodiesterasen (PDE) andererseits abhängig (68;199). In Endothelzellen entwertet die PDE2 primär cGMP, die PDE3/4 cAMP (207;212) ( 2 H , 12 H ). Simultane Stimulation der Bildung der Nukleotide bei gleichzeitiger Inhibition der spezifischen PDEs erwies sich als besonders effektive Maßnahme zur Stabilisierung der endothelialen Barrierefunktion in vitro (207;212) und in vivo (190) ( 2 H , 12 H ).

Auf die hohe potentielle Bedeutung dieses Barriere-protektivien Mechanismus weisen aktuelle Untersuchungen zu dem endogenen Peptid Adrenomedullin (ADM) hin ( 12 H ): ADM erhöht in Zielzellen, einschließlich Endothelzellen, cAMP (94). Mäuse mit funktionslosem ADM-Gen starben in uteri mit einem massiven Hydrops fetalis (37). Eigene Experimente demonstrierten, dass ADM die endotheliale Barrierefunktion gegenüber H2O2-, Thrombin- und E. coli Hämolysin-induzierter Hyperpermeabilität schützt. Darüber hinaus reduzierte ADM Ödembildung in isolierten Kaninchenlungen. ADM blockierte durch cAMP abhängige Mechanismen [Seite 76↓]die Phosphorylierung der Myosinleichtkette und damit die Zellkontraktion, interzelluläre Lückenbildung und parazelluläre Flüssigkeitsfiltration ( 12 H ).

Abb. 19 : ADM stabilisiert die endotheliale Barrierefunktion durch Blockade der MLC-Phosphorylierung. An welcher Stelle die ADM induzierten, cAMP-abhängigen Mechanismen in die proximalen, zur Hyperpermeabilität führenden Signalpfade eingreifen, ist unbekannt.

Vor dem Hintergrund, dass Mäuse, die ADM in ihrem Gefäßsytem überexprimierten, resistent gegenüber einem Endotoxinschock waren (194), könnte ADM eine wesentliche, vasoprotektive Rolle im Rahmen systemischer Inflammation zukommen. Im Verlauf septischer Erkrankungen kam es zu einer verringerten vaskulären Antwortfähigkeit auf ADM (117;244). Einige Untersuchungen machten eine verringerte Expression von ADM Rezeptoren für diesen Effekt verantwortlich (155-157). Die Zugabe von Komplement Faktor H, dem primären ADM-bindenden Protein (163), restaurierte die vaskuläre Antwortfähigkeit gegenüber ADM (164). Ob ADM tatsächlich einen generellen permeabilitätsregulierenden Faktor und ein potentielles therapeutisches Agens zur Therapie endothelialer Schrankenstörungen darstellt, müssen weitere Untersuchungen klären.

Neben parazellulärer Permeabilität wurde auch VEGF-induzierte Permeabilität durch die Erhöhung zyklischer Nukleotide blockiert (G 1-7).


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5.5  Aktivierung von Endothelzellen durch Bakterien und bakterielle Produkte

Als Barriere zwischen Blut und Gewebe ist das Endothel Zielzelle einer Vielzahl teils sehr unterschiedlicher Angriffstrategien von Pathogenen. Porenbildende Exotoxine sind hochpotente bakterielle Virulenzfaktoren (17-19). Unsere Untersuchungen zeigten, dass die Poren-bildenden Exotoxine E. coli HlyA und S. aureusα-Toxin die Adhäsion von PMN an Endothelzellen durch die Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen erhöhen (1 H). In vivo Untersuchungen in der mesenterialen Mikrozirkulation von Ratten verifizierten den Effekt von S. aureusα-Toxin auf die Rekrutierung von PMN (170): In diesem Modell war eine α-Toxin induzierte P-Selektin Expression und PMN-Endothel Interaktion nachweisbar. Gleichlaufende Ergebnisse erbrachten Experimente mit α-Toxin-exponierten Aortenringen der Ratte (28). Interessanterweise induzierte das Toxin in isolierten Rattenherzen eine zusätzliche, offenbar ICAM-1 gesteuerte Rekrutierung von PMN (85).

Untersuchungen zur E. coli HlyA-vermittelten Aktivierung der PMN-Endothel Interaktion liegen nicht in diesem Umfang vor. Obwohl nur HlyA, nicht jedoch S. aureusα-Toxin, die Expression leukozytärer Adhäsionsmoleküle induzierte ( 1 H ), führen beide Toxine zur weitreichenden Stimulation von PMN und Makrophagen (Sauerstoffradikal-Produktion, Liberierung von Lipoxygenasenprodukten) (88;177;211). Insgesamt kann angenommen werden, dass diese massive Aktivierung beider Reaktionspartner eine verstärkte Interaktion auch in vivo zur Folge hat.

Neben der Expression der „klassischen“ Adhäsionmoleküle führten sowohl HlyA als auch S. aureusα-Toxin in unseren Untersuchungen zur starken Bildung von Plättchen-aktivierendem Faktor (PAF) auf Endothelzellen. PAF, das membranständig auf der Oberfläche von Endothelzellen nach Stimulation exponiert wird, kann durch die Bindung des PMN-ständigen PAF Rezeptors die Interaktion zwischen den Zellen verstärken (168;245). Entsprechend dieser Theorie blockierte ein PAF-Rezeptorantagonist (BN50727) wirkungsvoll die Endothel-PMN Interaktion ( 1 H ).

Beide Exotoxine führten in vitro und in vivo zu durch das Endothel geprägten proinflammatorischen Reaktionen: Die Synthese von z.B. PAF, NO und Leukotrienen, induziert durch Toxin bedingten Ca2+ Einstrom in die Zellen, kann die entzündliche Reaktion aggravieren und durch systemische Wirkungen zu Hypotension führen (28;85-87;205;206;210). Darüber hinaus bewirkten beide Toxine einen Kollaps der endothelialen Barrierefunktion in vitro (205) ( 2 H , 12 H ) und in vivo [Seite 78↓](141;188;189;191;205). Die zusätzliche, Toxin induzierte Rekrutierung der PMN und folgende Mediatorfreisetzung durch diese Zellen ist in der Lage, die Entzündung weiter zu perpetuieren.

Insgesamt induzieren diese Toxine eine massive proinflammatorische Reaktion der Endothelzellen und stellen ihre Potenz als bakterielle Virulenzfaktoren eindrucksvoll dar. Daher ist die Veröffentlichung von Prüfer et al. (170) bemerkenswert, in der ein schützender Effekt von Statinen (Simvastatin) vor S. aureusα-Toxin induzierter Inflammation in der Mikrozirkulation der Ratte demonstriert wurde.

Neben diesen sekretorischen Produkten wirken auch „komplette“ Bakterien auf das Endothel ein. Ein große Anzahl an Pathogenen invadiert zumindest kurzfristig das Endothel. Dabei ist häufig weder der Ablauf des Prozesses bekannt noch dessen Bedeutung für den weiteren Verlauf der Erkrankung (z.B. bei S. pneumoniae) (48;173). Ein Teil der Bakterien durchwandert unter Inanspruchnahme endothelialer Transportmechanismen das Endothel, um in andere Kompartimente zu gelangen (z.B. N. meningitides an der Blut-Hirn Schranke) (149). Eigene Experimente fokussierten auf die Interaktion von Endothelzellen mit Bakterien, die zumindest zeitweise im Endothel parasitieren und replizieren.

Unsere Untersuchungen demonstrierten, dass L. monozytogenes die klassischen Adhäsionsmoleküle P-Selektin, E-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1 in Endothelzellen hochreguliert ( 4 H , 5 H ). Im Gegensatz dazu hatte der apathogene L. innocua Stamm, der als Kontrolle fungierte, keinen solchen Effekt. Unter Einsatz von gereinigtem Listeriolysin (LLO) und genetisch manipulierten Listerien, die kein LLO mehr produzieren, zeigte sich eine LLO Abhängigkeit der P-Selektin Expression (Abb. 20). Da LLO zu einem Anstieg des intrazellulären Ca2+ in Endothelzellen führte, mag am ehesten die Aktivierung der Ca2+-abhängigen Exozytose von P-Selektin aus Weibel-Palade Körperchen diesem Effekt zugrunde liegen (23). Die LLO-Deletionsmutanten induzierten jedoch weiterhin die Expression der anderen Adhäsionsmoleküle. Als Konsequenz war vermehrte Adhärenz von PMN an die infizierten Endothelzellen darstellbar ( 4 H , 5 H ). Experimente mit blockierenden Antikörpern zeigten, dass insbesondere E-Selektin und ICAM-1 auf Seiten des Endothels und β2-Integrine auf Seiten der PMN an der Interaktion beteiligt waren.


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Abb. 20 : Hochregulation endothelialer Adhäsionsmoleküle durch listerielle Pathogenitätsfaktoren. Während die Expression von P-Selektin durch Listerilysin O (LLO) Ca2+-abhängig erfolgt, aktivieren listerielle Phospholipasen (PLC) durch Zeramidbildung E-Selektin Expression.

Diese phänomenologischen Beobachtungen lieferten die Grundlage für Experimente, die mit Hilfe weiterer listerieller Deletionsmutanten die zugrundeliegenden Signaltransduktionsmechanismen analysierten ( 5 H ). Listerien exprimieren eine Phosphatidyl-Inositol spezifische PLC (PI-PLC) und eine Phosphatidyl-Cholin spezifische PLC (PC-PLC) (45;224). Mit Hilfe von isogenen Deletionsmutanten des Wildtyps (EGD) für die PC-PLC (EGDΔplcA) und die PI-PLC (EGDΔplcB) untersuchten wir die Bedeutung der PLC für die Expression von E-Selektin. Beide Mutanten reduzierten die Protein und mRNA Expression von E-Selektin signifikant. In Folge war das Rollen und Adhärieren von PMN an Endothelzellen ebenfalls deutlich vermindert. Die bakteriellen PLC aktivierten eine massive Zeramidbildung und subsequente Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB in den Endothelzellen. Offensichtlich interferieren diese bakteriellen Pathogenitätsfaktoren direkt mit Signalwegen der Wirtszelle.

Eine Vielzahl von weiteren Pathogenen, die u.a. das Endothel attackieren, unter ihnen S. aureus, Rickettsia prowazekii und der Endothelzellen invadierende Pilz Candida albicans, setzten PLCs als Pathogenitätsfaktoren frei (80;184). In Übereinstimmung mit eigenen Ergebnissen induzierte die PLC von Clostridium perfringens die Expression von endothelialem ICAM-1 und darüber hinaus IL-8 (27). Allerdings stehen in vielen Fällen weder die gereinigten PLC noch entsprechende [Seite 80↓]Deletionsmutanten zur Verfügung, so dass die Untersuchung der molekularen Mechanismen noch aussteht.

Wenngleich eine einfache Übertragung von Experimenten mit anderen Zellen auf Endothelzellen nicht möglich ist, liefern sie doch wertvolle Hinweise auf potentiell bedeutende Signalwege im Endothel: Das listerielle Oberflächenprotein InlB wurde - neben Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) - als Ligand der Rezeptor-Tyrosin Kinase Met identifiziert (44). Ob und welche Bedeutung Internalin B induzierte Aktivierung der Phosphotidyl-Inositol-3 Kinase und Akt Kinase für die Ausprägung des proinflammtorischen Phänotyps von Endothelzellen hat, ist unbekannt (135). Vor dem Hintergrund der Arbeit von Lehner et al. (127) könnte die Untersuchung des p38 MAP Kinasen Signalpfades wichtige Erkenntnisse im Zusammenhang mit listerieller Endothelzellaktivierung erbringen: MK2-defiziente Mäuse, die ihren p38 Signalweg nur noch eingeschränkt aktivieren können, zeigten eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Infektion mit L. monozytogenes.

Bislang bleibt offen, ob chronische Infektion mit C. pneumoniae (von Endothelzellen) an der Entstehung von Arteriosklerose kausal beteiligt ist, als Risikofaktor mitwirkt oder bestehende Läsionen zusätzlich verschlimmert (61;128). Da die Rekrutierung von Leukozyten (Granulozyten, Monozyten) wesentlich zur Bildung inflammatorischer Läsionen der Gefäßwand beitragen kann, untersuchten wir die Effekte von Chlamydien auf die Interaktion der Endothelzellen mit Mono- und Granulozyten ( 8 H ).

C. pneumoniae induzierte die Oberflächenexpression endothelialer Adhäsionsmoleküle (E-Selektin, ICAM-1, VCAM-1) mit der Folge von vermehrtem Rollen, Adhärieren und Transmigrieren von Mono- und Granulozyten an/durch endotheliale Monolayer. Offensichtlich kann die Aktivierung von Endothelzellen durch C. pneumoniae in vitro hocheffizient Leukozyten rekrutieren. Ob diese Aktivierung auch in vivo nachweisbar ist und ob sie nur in der ersten, akuten Phase der Infektion besteht oder aber persistiert, muss noch geprüft werden. In vitro war in unseren Experimenten eine starke, bis zum Ende des Versuchszeitraums von 72 h andauernde, Expression von ICAM-1 und VCAM-1 nachweisbar.

In ersten Untersuchungen adressierten wir die Aktivierung wesentlicher proinflammatorischer Signalwege in C. pneumoniae infizierten Endothelzellen (Abb. 21) ( 8 H , 19 H ): Der Kontakt mit C. pneumoniae führte (unabhängig von chlamydialem LPS) zur minutenschnellen Aktivierung der MAP Kinasen ERK1/2, p38 [Seite 81↓]MAPK und c-Jun NH2 Kinase. Blockade der p38 MAP Kinase oder ERK reduzierte die Chlamydien-assoziierte Expression von IL-8, während die Oberflächenexposition von ICAM-1 nur von der p38 MAP Kinase abhängig war. Da die beobachtete Aktivierung der Kinasen von LPS unabhängig war, könnte, wie in der Untersuchung von Sasu et al. (181) für glatte Gefäßmuskelzellen gezeigt, das chlamydiale Hitze-Schock Protein 60 den Effekt hervorrufen.

Abb. 21 : Die Infektion von Endothelzellen mit C. pneumoniae führt zur Aktivierung zahlreicher, bedeutender Signalpfade in den Endothelzellen mit der Folge einer pro-inflammatorischen Genexpression. Die Verknüpfung der Signalpfade ist z.Z. noch unklar.

Es liegen bislang erst wenige Untersuchungen zur Aktivierung dieser wichtigen Signalwege durch Bakterien in Endothelzellen vor, die meisten Untersuchungen fokussierten auf LPS-induzierten Signalen. Untersuchungen mit Porphyromonas gingivalis, einem etiologisch bedeutsamen Erreger der Peridontitis demonstrierten, dass - je nach Situation - eine agonistische und antagonistische Funktion für die p38 MAP Kinase-Aktivierung in Endothelzellen durch ein Bakterium wahrgenommen werden kann (49). Weit über die Regulation proinflammatorischer Gene hinaus kann die Aktivierung dieser Kinasen Einfluss auf wesentliche Grundfunktionen der Zellen wie Apoptose oder Migration nehmen (39;57). Im Zusammenhang mit chlamydialer Infektion von Endothelzellen sind diese jedoch bislang nicht eingehend untersucht, auch für andere bedeutende Keime liegen allenfalls fragmentarische Erkenntnisse vor.


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Innerhalb von 30-60 min war die nukleäre Translokation und verstärkte DNA-Bindung von NF-κB, nach 4 h die starke Expression eines NF-κB abhängigen Reportergens in C. pneumoniae-infizierten Endothelzellen nachweisbar ( 8 H ). Übereinstimmend fand sich eine Aktivierung des NF-κB-Systems auch in anderen, Chlamydien-infizierten Zelltypen (32). Diese Aktivität von NF-κB kann wesentlich zur proinflammatorischen Transformation der (Endothel)zellen beitragen. Die Beobachtung, dass Aspirin die Chlamydien-abhängige Aktivierung von NF-κB, die Expression proinflammatorischer Zytokine als auch chlamydiale Replikation blockiert, lässt auf eine zentrale Rolle NF-κB-abhängiger Prozesse für die Pathogenese der Chlamydieninfektion schließen (217). Darüber hinaus induziert der Transkriptionsfaktor die Expression anti-apoptotischer Genprodukte in Endothelzellen (z.B. „Inhibitors of apoptosis“, IAP) (51;241). In der Literatur liegen Berichte über sowohl pro- (84;159) als auch anti-apoptotische Effekte (3;38;75) von Chlamydien vor, eingehende Untersuchungen zu Endothelzellen stehen aus. Interessanterweise können Chlamydia ssp. ein Protein („Chlamydia protein associating with death domains“, CADD) exprimieren, welches mit Proteinen der Todesrezeptoren interagiert (201).

Das Endothel ist eine spezifische Zielzelle von B. henselae und die Infektion von Endothelzellen stellt einen wichtigen Schritt in der Pathogenese der Katzenkratzkrankheit und bazillären Angiomatose dar (52;53).

B. henselae infizierte Endothelzellen innerhalb weniger Stunden und replizierte in den Zellen ( 10 H ). Die Infektion resultierte in Aktivierung von NF-κB und Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selektin und ICAM-1 auf mRNA und Proteinebene. Während E-Selektin für mehrere Stunden auf der Oberfläche der Zellen nachweisbar war (6-18 h), konnte ICAM-1 bis zum Ende des Untersuchungszeitraums von 6 Tagen vermehrt nachgewiesen werden. Blockade von NF-κB inhibierte die Expression der Adhäsionsmoleküle. Ein vermehrtes Rollen und Adhärieren von Granulozyten an Bartonellen-infizierten Endothelzellen war Folge der Adhäsionsmolekülexpression ( 10 H ).

B. henselae exprimieren zahlreiche Proteine in ihrer äußeren Membran („outer membrane proteins“, OMP), deren Funktion weitgehend unbekannt ist (33). Besonders prominent ist ein 43 kDa, Porin-artiges OMP (OMP43). Nach biochemischer Präparation der OMPs zeigten wir, dass diese - ebenso wie komplette Bakterien - die Aktivierung von NF-κB, Expression der Adhäsionsmoleküle und [Seite 83↓]verstärktes Rollen und Adhärieren von Granulozyten an Endothelzellen induzieren ( 10 H ). Demzufolge können OMP einen wesentlichen Pathogenitätsfaktor der Bartonellen darstellen.

OMP als potente Pathogenitätsfaktoren wurden auch für andere Bakterien beschrieben (234). Unklar ist, welche Strukturen auf den Endothelzellen als Rezeptoren/Akzeptoren für OMP dienen. Völlig offen ist auch, welche Rolle obengenanntem Phänomen für die Induktion der Vasoproliferation von Endothelzellen zukommt. Die Vorstellung, dass B. henselae, ganz ähnlich dem Agrobakterium tumefaciens in Pflanzen, über die Proliferation seines eigenen Habitats (der Wirtszelle Endothel) sein Überleben sichert, erscheint faszinierend (109).

Zunehmend wird deutlich, dass die Infektion der Wirtszellen nicht nur grundlegende Veränderungen derselben hervorruft, sondern auch fundamentale Rückwirkungen auf Genexpression und Stoffwechsel des Bakteriums hat: Nach Infektion fand man eine veränderte Genexpression in Bartonellen (110;144).

Zusammenfassend besitzen alle drei Bakterien (L. monzytogenes, C. pneumoniae, B. henselae), die Potenz, durch die vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen die Interaktion von Entzündungszellen mit Endothelzellen zu verstärken. Gemeinsam war ebenso die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB. In der Endothel-Pathogen Interaktion dieser Keime bleiben zahlreiche, wesentliche Fragen ungeklärt, die durch neuartige Ansätze adressiert werden können. So kann der Einsatz von Deletionsmutanten von C. pneumoniae und B. henselae ebenso wie die Aufreinigung von Pathogenitätsfaktoren neue Ergebnisse erbringen. Neben der globalen Analyse der Genexpression mit Hilfe von Genomics-Techniken erscheint insbesondere die Analyse des Proteoms der Bakterien/Wirtszellen mit und ohne Pathogen-Wirtsinteraktion aussichtsreich (96;110;144).

Auch ist es notwendig, die in vitro erhaltenen Ergebnisse in vivo zu überprüfen. Beispielsweise ist die Rolle der einzelnen Adhäsionsmoleküle für die Interaktion von Leukozyten mit endo- und epithelialen Zellen unbestritten (36;83;142;227;246). Dennoch zeigten Experimente mit Mäusen, denen ein oder mehrere Adhäsionsmoleküle fehlten, eine erhebliche Redundanz zwischen den einzelnen Molekülen in vivo (29;178). Entgegen erfolgversprechenden klinischen Studien bei der Blockade der Lymphozyten-Endothel Interaktion bei z.B. Multipler Sklerose oder [Seite 84↓]Psoriasis, waren die Ergebnisse bei der Blockade der neutrophilen Adhäsion bei z.B. Myokardinfarkt und hämorrhagischem Schock insgesamt eher negativ zu beurteilen (91).


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19.05.2004