Höcker, Michael : Differentielle Regulation von Schlüsselgenen der gastralen Säuresekretion durch Gastrin, oxidativen Stress und Helicobacter pylori: Identifikation und Charakterisierung beteiligter Signalwege,Transkriptionsfaktoren und regulatorischer Promotorelemente.

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Kapitel 3. Ergebnisse und Diskussion

3.1 Analyse des molekularen Sekretionsapparates gastraler ECL-Zellen


Als Grundlage für die weiteren Studien erfolgte zunächst eine detaillierte Charakterisierung der Komponeneten des Sekretionsapparates von ECL-Zellen des menschlichen Magens. Darüberhinaus sollte im Rahmen dieser Untersuchung geklärt werden, ob das in „normalen“ ECL-Zellen nachweisbare Expressionsmuster dieser Proteine im Verlaufe der Transformation dieses Zelltyps zu ECLomen einer Veränderung unterliegt. Zusammenfassend zeigte unsere Studie, daß ECL-Zellen des menschlichen Magens die typischen Bestandteile des neuroendokrin-neuronalen Sekretionsapparates aufweisen, der neben t-SNARE- und v-SNARE Proteinen auch das 25-kDa SNAP-Protein (Synaptosome-Associated Protein) sowie Syntaxin und Synaptobrevin umfaßt (10). Außerdem ließ sich neben der Präsenz des vesikulären Monoamintransporters Typ 2 (VMAT2), die Expression der Hormon-prozessierenden Enzyme Prohormonconvertase Typ1 und Carboxypeptidase E (CPE) in ECL-Zellen nachweisen. Hierdurch wurde demonstriert, daß der in neuronalen Zellen sowie in neuroendokrinen Zellen des Nebennierenmarkes und des endokrinen Pankreas nachgewiesene Sekretionsapparat, auch der sekretorischen Aktivität von ECL-Zellen des menschlichen Magens zugrundeliegt. Ein Vergleich des Expressionsmusters dieser Proteine in untransformierten ECL-Zellen mit dem von ECLomen zeigte, daß die Expression des Sekretionsapparates, prozessierender Enzyme sowie des vesikulären Monoamintransporters Typ 2 im Verlauf der ECL-Zell-Transformation aufrechterhalten wird und hierdurch die strukturelle Grundlage für eine sekretorische Aktivität von ECLomen erhalten bleibt (10). Nachdem durch diese Untersuchungen wesentliche Strukturelemente des Sekretionsapparates menschlicher ECL-Zellen des Magens identifiziert werden konnten, war es Ziel der nachfolgenden Studien, die molekukularen Mechanismen zu erarbeiten, die der Wirkung von Gastrin, dem zentralen peptidergen Stimulus von ECL-Zellen, auf seine Zielgene Histidindekarboxylase und Chromogranin A zugrundeliegen. Da diese beiden Gastrin-regulierten Gene eine zentrale Rolle für die Säureregulation im menschlichen Magen spielen, können weitere Einblicke hinsichtlich der molekularen Mechanismen ihrer Regulation durch Gastrin, einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis dieses physiologisch und pathophysiologisch wichtigen Regulationszusammenhanges erbringen.


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3.2 Regulation der gastralen HDC-mRNA Expression in vivo


Vorangegangene Untersuchungen hatten gezeigt, daß Hypergastrinämien unterschiedlicher Genese mit vermehrter gastraler HDC-mRNA Expression einhergehen. Unklar blieb hierbei, in welchem Zusammenhang die HDC-mRNA Expression zum Ausmaß und Zeitdauer der Hypergastrinämie steht und ob die Expressionsveränderungen mit der Kinetik einer transkriptionellen Regulation vereinbar sind. Zur Beantwortung dieser Fragen analysierten wir die HDC-mRNA Expression im Magen von Ratten nach Erzeugungung einer Hypergastrinämie durch intraperitoneale Injektion des Protonenpumpeninhibitors Omeprazol, wobei konventionelle "Northern Blot"-Techniken sowie das Verfahren der "in situ"-Hybridisierung verwendet wurden (1, 2). Da Analysen der Histaminspiegel und der HDC-Proteinexpression darauf hinwiesen, daß die HDC-Expression einem gewebe- und entwicklungsspezifischen Muster unterliegt, wurde das HDC-mRNA Expressionsmuster in verschiedenen Geweben erwachsener Ratten sowie im Verlaufe der Embryonalphase durch „Northern Blot"-Analyse untersucht. Unsere Untersuchungen zeigten, daß eine Omeprazol-induzierte Hypergastrinämie in der Korpusmukosa von Ratten innerhalb von 12 h zu einer 4-5-fachen Erhöhung der HDC-mRNA Konzentrationen führt. Durch nachfolgende in situ Hybridisierungen konnten die im „Northern Blot“ beobachteten HDC-mRNA-Expressions-veränderungen den ECL-Zellen der Korpusmukosa zugeordnet werden (1, 2). Parallel hierzu durchgeführte Messungen der Gastrin-Plasmakonzentrationen zeigten, daß die Plasmaspiegel des Peptidhormons 5-6-fach gegenüber Kontrollwerten erhöht waren (2). Die Untersuchung des gewebespezifischen Expressionsmusters zeigte in fetalen Ratten hohe HDC-mRNA-Konzentrationen in der Leber und weniger ausgeprägte HDC-mRNA-Expression in Magen und Pankreas (1). Die Analyse des perinatalen Zeitverlaufes der HDC-mRNA Expression zeigte parallele Expressionsverläufe des HDC-Gens in Magen und Leber. Hohe HDC-mRNA-Konzentrationen fanden sich in beiden Organen pränatal. Nach der Geburt fand sich zunächst keine HDC-Expression, erst am 7. postnatalen Tag war eine Expression von HDC-Transkripten in beiden Organen wieder detektierbar, wobei die gastrale HDC-mRNA Expression deutlich überwog (1). Zusammenfassend bestätigten unsere Studien die Beobachtung, daß es unter Bedingungen einer Hypergastrinämie zur Erhöhung der gastralen HDC-mRNA-Expression kommt. Hierbei entspricht der, in der vorliegenden Untersuchung


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erstmals erhobene detaillierte Zeitverlauf der HDC-mRNA-Expression unter Hypergastrinämie, einer transkriptionellen Regulation des HDC-Gens durch Gastrin. Darüberhinaus wurden die beschriebenen HDC-Expressions-veränderungen unter Hypergastrinämie durch unsere „in situ"-Hybridisierungen erstmals direkt dem ECL-Zell-Kompartiment der Magenmukosa zugeordnet. Die Analyse der embryonalen HDC-mRNA-Expression demonstrierte erstmals, daß es im Verlaufe der embryonalen Entwicklung zu einer Veränderung des gewebespezifischen Expressionsmusters des HDC-Gens kommt, wobei die zentrale Rolle des Magens als Expressionsort der HDC in der post-partalen Entwicklung unterstrichen wurde. Basierend auf diesen in vivo-Daten war es Ziel der weiteren Untersuchungen, die Wirkung von Gastrin auf die transkriptionelle Aktivität des HDC-Gens durch molekularbiologische in-vitro Untersuchungen weiter zu charakterisieren sowie die hieran beteiligten molekularen Mechanismen zu identifizieren. Hierbei stand neben der Analyse der beteiligten Signalwege und Transkriptionsfaktoren eine Charakterisierung der verantwortlichen Promotorelemente im Vordergrund.

3.3 Charakterisierung der Gastrin-responsiven Region des HDC-Promotors


Ein grundsätzliches Problem von molekularen Untersuchungen der Biologie von ECL-Zellen besteht in der fehlenden Verfügbarkeit einer permanenten ECL-Zellinie für in vitro Untersuchungen. Hierbei ist die Etablierung einer permanenten humanen ECL-Zellinie vor allem auch durch die Tatsache erschwert, daß technische Limitationen keine Präparation einer reinen ECL-Zellpopulation aus der Magenmukosa zulassen. Vor diesem Hintergrund wurde die humane Magenadenokarzinom-Zellinie AGS-B als Zellmodell für die nachfolgenden funktionellen HDC-Promotoranalysen etabliert (1, 2). Von uns durchgeführte immunhistochemische Analysen zeigten, daß diese Zellinie typische neuroendokrine Markerproteine wie Chromogranin A, Syntagmin und Synaptophysin exprimieren und somit eine neuroendokrine Differenzierung aufweisen (2). Da AGS-Zellen endogen keine CCK-B/Gastrin-Rezeptoren exprimieren, wurde ein Expressionskontrukt für den humanen CCK-B/Gastrin-Rezeptor stabil in diese Zellinie transfiziert (1, 2). Die nachfolgende rezeptorpharmakologische Analyse von CCK-B/Gastrin-Rezeptor-exprimierenden AGS-B Zellklonen ergab, daß die durch AGS-B-Zellen exprimierten CCK-B/Gastrin-Rezeptoren


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hinsichtlich von Bindungseigenschaften und Rezeptorzahl den Chakteristika von "Wild-Typ"-Rezeptoren entsprechen (2).

Nach Etablierung der AGS-B Zellinie erfolgte zunächst eine initiale Charakterisierung der HDC-Promotoren von Ratte und Mensch unter Verwendung von 1,8 kB- (Mensch) oder 1,3 kB-langen (Ratte) Fragmenten der HDC-5'-flankierenden Region. Hierzu wurden die entsprechenden Promotorfragmente nach Klonierung aus genomischen DNA-Bibliotheken von Ratte und Mensch isoliert und in Reportergenvektoren, die das Luciferase Reportergen umfaßten, kloniert (2, 4). Die funktionelle Analyse dieser HDC-Luciferase Reportergenkonstrukte zeigte eine dosis- und zeitabhängige Stimulation der transkriptionelllen Aktivität beider HDC-Promotoren durch Gastrin und sein Analogon CCK-8 (2, 4). Die zur Eingrenzung des Gastrin-responsiven Bereiches der HDC-Promotoren durchgeführte 5'-Deletionsanalyse zeigte, daß ein entsprechendes DNA-Element für beide Gene in proximalen Promotorabschnitten lokalisiert ist (2, 4). Durch Konstruktion und transiente Transfektion von 5'- und 3'-Promotor-Deletionsmutanten wurde eine weitere Eingrenzung der Gastrin-responsiven DNA-Sequenz im humanen HDC-Promotor erreicht (4, 8). Hierbei zeigte sich, das die Gastrin-abhängige Stimulation durch ein Gastrin-responsives, cis-regulatorisches Element (GAS-RE) im palindromen Sequenzbereich 5'-+1-ACCCTTTAAATAAAGGGCCCACACTGG+27-3', vermittelt wird (4, 8). Dieses Gastrin-responsive Element (GAS-RE), das keine Homologien zu bislang bekannten „Enhancer“-Elementen aufweist, war in der Lage nach Subklonierung in ein heterologes, Gastrin-unsensibles Promotor-Reportergen System (Herpes Simplex Virus (HSV)-Thymidinkinase-Luciferase), Stimulierbarkeit durch Gastrin zu vermitteln (4, 8). Hierbei war die Gastrin-Sensitivität dieses Elementes unabhängig von der Orientierung oder Distanz zum "Enhancer"-losen Thymidinkinase Minimalpromotor (4, 8). Die weitere Charakterisierung dieser Sequenz durch „Electrophoretic-Mobility-Shift-Analyse“ (EMSA) zeigte eine spezifische Bindung von zwei nukleären Proteinen (Transkriptionsfaktoren) mit einem Molekulargewicht von 35 kDa und 52 kDa an diesen Sequenzbereich (8). Hierbei stimuliert Gastrin die spezifische Bindung beider Proteine mit identischer Kinetik an den proximalen (hHDC +1 bis +19) oder distalen (hHDC +11 bis +27 Bp) Teil der GAS-RE Gesamtsequenz (+1 bis +27 Bp) (8). EMSA-Supershift-Analysen sowie erste Daten zur Proteinsequenz beider Faktoren deuten darauf hin, daß es sich hierbei um unbekannte Transkriptionsfaktoren handelt (8). Durch diese Untersuchungen konnte nach Etablierung einer transkriptionellen Regulation der HDC-Promotoren von Ratte und Mensch erstmals der Gastrin-responsive Bereich des


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humanen HDC-Promotors identifiziert und in seiner Sequenz aufgeklärt werden. Darüberhinaus wurden die an dieses Element bindenden nukleären Proteine als neuartige, bislang nicht beschriebene Transkriptionsfaktoren identifiziert.

Abb. 1. Schematische Darstellung der Promotorelemente und Transkriptionsfaktoren, die an der Vermittlung des Gastrineffektes auf den hHDC Promotor beteiligt sind. Abkürzungen: GAS-RE-BPs = Gastrin-responsive Element Binding Proteins; HDC-GAS-RE = HDC-Gastrin-responsives Element; TATA = TATA-Box. Weitere Einzelheiten siehe Text.

3.4 Analyse der HDC-aktivierenden Signaltransduktionswege


Nach der Identifikation und strukturellen Aufklärung des Promotorbereiches, der die Wirkung von Gastrin auf das menschliche HDC-Gen vermittelt sowie der Charakterisierung der hieran bindenden Transkriptionsfaktoren, sollte in den weiterführenden Studien die intrazelluläre(n) Signalkaskade(n) aufgeklärt werden, durch die Gastrin eine transkriptionelle Aktivierung des HDC-Gens auslöst. Hierzu wurden zunächst durch Einsatz geeigneter Reagentien verschiedene intrazelluläre Signalkaskaden (cAMP-, Ca2+, PKC-Signalwege) in AGS-B Zellen selektiv aktiviert und die Auswirkung dieser Manipulationen auf den HDC-Promotor untersucht. Es zeigte sich, daß im Gegensatz zu der in verschiedenen Systemen dokumentierten stimulatorischen Wirkung von Ca2+-vermittelten Signalwegen auf die Histaminsekretion, die transkriptionelle Aktivität der HDC-Promotoren durch diese Signalkaskaden nicht stimuliert werden kann (2, 4). Im Gegensatz hierzu führte direkte


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Aktivierung von Kinasen der Proteinkinase C (PKC)-Familie durch Anwendung des Phorbolesters PMA zur einer ausgeprägten Stimulation der hHDC-Promotoraktivität. Darüberhinaus war der transaktivierende Effekt von Gastrin auf beide HDC-Promotoren durch Blockade von PKCs komplett zu unterbinden (2, 4). Da PKC-abhängige Effekte häufig durch den AP-1 Transkriptionsfaktor-Komplex vermittelt werden, untersuchten wir die Bedeutung von AP-1 für die Gastrin-abhängige Aktivierung des HDC-Promotors im AGS-B Zellmodell (3). Zusammenfassend zeigten unsere Untersuchungen hierbei, daß PKC-abhängige Aktivierung des AP-1-Komplexes essentiell für die Vermittlung des Effektes von Gastrin ist, wobei die Wirkung von AP-1 jedoch indirekt sein muß, da der HDC-Promotor nicht durch AP-1 gebunden wird (3). Im weitern Verlauf der Signaltransduktions-Analyse zeigte sich, daß Kinasen der „Mitogen-aktivierten Proteinkinase“-Familie (MAPKinase-Familie) eine wesentliche Rolle für die Vermittlung der Wirkung von Gastrin auf das Gastrin-responsive Element des HDC Promotors einnehmen (5). Die MAP Kinase-Superfamilie umfasst im wesentlichen die beiden Untergruppen der "Extracellular Mitogen-Related Kinases" (ERKs) und "Jun-Kinases" (JNKs). Beide Kinasegruppen sind unterschiedlichen intrazellulären Signalkaskaden zuzuordnen, wobei ERK-Signalwege vorrangig durch "klassische" Wachstumsfaktoren und Mitogene wie „Epidermal Growth Factor“ (EGF) stimuliert werden können. JNK-vermittelte Signalkaskaden hingegen werden bevorzugt durch zelluläre Streßsituationen wie UV-Exposition oder Zytokine aktiviert. Unsere Untersuchungen zeigten, daß die Effekte von Gastrin auf den hHDC Promotor durch eine sequentielle Aktivierung einer Signalkaskade vermittelt werden, die in der Sequenz PKCs > Raf > MEK-1 > ERKs verläuft und von Gastrin durch einen Ras-unhängigen Mechanismus aktiviert wird (5 und Abb.1). JNK-assoziierte Signalwege spielen für die Wirkung von Gastrin in diesem Zusammenhang keine Rolle, obwohl der hHDC-Promotor durch die JNK-Kaskade potent transaktiviert werden kann (5). Durch diese Ergebnisse wurden sie intrazellülare Signalkaskade, die der Wirkung von Gastrin auf das Schlüsselgen der Histaminsynthese zugrundeliegt erstmals aufgeklärt, wodurch eine Basis für weitere molekulare Analysen der Abläufe Gastrin-abhängiger Genregulation im Magen geschaffen wurde. Angesichts der Bedeutung von Gastrin für die Kontrolle von gastraler Säureregulation, Mukosaproliferation und -Differenzierung können diese Daten einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis dieser Abläufe leisten und helfen, neue molekulare Interventionspunkte zu definieren.


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3.5 Gastrin und CgA-Promotorregulation


Die parallele Aktivierung des HDC- und CgA-Gens durch Gastrin in ECL Zellen des menschlichen Magens ist von wesentlicher physiologischer Bedeutung für den regelhaften Ablauf der Magensäuresekretion. Nach Identifizierung der Signalwege, Transkriptionsfaktoren und DNA-Elemente, die der Wirkung von Gastrin auf das humane HDC-Gen zugrundeliegen, war es Ziel der weiterführenden Untersuchungen, zu klären durch welche Mechanismen Gastrin eine Aktivierung des CgA-Gens herbeiführt und inwieweit die hierbei beteiligten molekularen Mechanismen Übereinstimmungen mit dem HDC-regulierenden Mechanismus aufweisen. Unsere Untersuchungen unter Verwendung von CgA-Reportergenkonstrukten zeigten, daß Gastrin-Stimulation von AGS-B Zellen zu einer dosisabhängigen Aktivierung des CgA-Promotors führt, die in ihrer Kinetik mit der Wirkung des Peptides auf den HDC-Promotor vergleichbar ist (7). Durch eine Kombination von 5’-Deletionsanalyse und gerichteter Promotor-Mutagenese konnte in funktionellen Untersuchungen ein Element im Bereich von CgA -92 bis -62 Bp als Gastrin-responsives Element des CgA-Gens identifiziert werden, wobei dieser Bereich keine relevanten Sequenzhomologien zum HDC-Promotor aufweist. Darüberhinaus zeigten EMSA-Studien, daß der Sequenzbereich CgA 5’-92/-62 -3’ Bp nicht durch die HDC-aktivierenden Transkriptionsfaktoren GAS-RE-BPs gebunden wird und somit ein weiteres, neues Gastrin-responsives Element (GAS-RE) repräsentiert (7). Durch funktionelle Mutationsanalyse dieses Elements konnte nachgewiesen werden, daß zwei Transkriptionsfaktor-Bindungsbereiche innerhalb dieser Sequenz für die Gastrin-abhängige Regulation essentiell sind: hierbei handelt es sich um eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor CREB (Cyclic AMP Binding Protein) sowie um ein Bindungselement für den Transkriptionsfaktor Sp1 (7). EMSA-Studien unter Verwendung dieses Elemente zeigten, daß Gastrin die Bindung beider Transkriptionsfaktoren an das CgA -92/-62 Bp Element stimuliert. Hingegen führt eine Mutation der Sp1- oder der CREB-Bindungsstelle zum Verlust der Gastrin-Sensitivität des CgA-Promotors (7). Ko-Expressionsexperimente unter Einsatz von entsprechenden Sp1- und CREB-Konstrukten zeigten, daß beide Faktoren eine synergistische Wirkung auf den CgA- Promotor haben (7). Eine Analyse der vermittelnden Signalwege erbrachte den Nachweis, daß der Effekt von Gastrin auf den CgA-Promotor durch den gleichen Signalweg vermittelt wird,


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der durch das Peptidhormon auch im Zusammenhang mit der Transaktivierung des HDC-Gens aktiviert wird. Darüberhinaus konnte die Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren CREB und Sp1 durch diese Kaskade als wesentlicher funktioneller Schritt der Gastrin-abhängigen Transaktivierung des CgA-Gens identifiziert werden (7). Diese Ergebnisse dokumentieren, daß die Gastrin-abhängige Regulation des HDC- und CgA-Gens in Magenepithelzellen offenbar durch Aktivierung der gleichen Signalkaskade herbeigeführt wird, sich jedoch auf der Ebene der Promotorelemente und hieran bindender Transkriptionsfaktoren grundsätzlich unterscheidet.

3.6 Gewebe-spezifische Aktivierung und Gastrin-abhängige Regulation des CgA-Promotors in transgenen Mäusen


Nach Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die der transaktivierenden Wirkung von Gastrin auf den CgA-Promotor in Magenepithelzellen zugrundeliegen, sollte in nachfolgenden transgenen in vivo-Experimenten untersucht werden, inwieweit durch Einsatz eines CgA-Promoterfragmentes, eine neuroendokrin-/ECL-Zell-spezifische Expression von heterologen Proteinen in einem transgenen Mausmodell herbeizuführen ist.

Abb. 2 Schematische Struktur des mCgA4.8kB-Luc Konstruktes. Abkürzungen: GAS-RE: Gastrin-responsive Element; TATA= TATA-Boy Element; Restriktionsenzym Schnitstellen: PvU II; BamHI; XhoI; HindIII; Die Klammern im Bereich der Luciferase Sequenz bezeichnen Genabschnitte, die in PCR-Assays odern durch „southern Blot Analyse“ detektiert wurden.


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Desweiteren sollte in diesen Studien geklärt werden, ob in einem solchen transgenen Mausmodell eine Gastrin-abhängige Regulation des CgA-Promotors auch unter in vivo Bedingungen nachzuweisen ist. Zur Herstellung eines entsprechenden transgenen Modells wurde ein Konstrukt angefertigt, in dem die Expression des Luciferase Reportergens unter der Kontrolle von 4.8 kB der CgA-Promotors der Maus steht (Abb. 2 und 12). Das Luciferase-Reportergen eignet sich für diesen Zweck besonders, da es durch ein einfaches und hoch-sensitives Verfahren in Gewebelysaten quantitativ nachgewiesen werden kann und hierdurch sowohl die Identifizierung von Reportergen-exprimierenden Geweben als auch quantitative Studien des Expressionsverhaltens des Transgens deutlich erleichtert werden. Darüberhinaus stehen kommerzielle Antikörper für eine immunhistochemische Analyse der Luciferase-Expression zur Verfügung.

Abb. 3 Gewebespezifische Expression des CgA4.8kB-Luciferase Transgens. Dargestellt sind die, der Expression des Transgens entsprechenden Luciferase Aktivitäten in verschiedenen Organen transgener Mäuse. Die in (A) und (B) dargestellten Daten entsprechen hierbei den Expressionswerten zweier unabhängiger Mauslinien.

Daher wurde unter Einsatz von Standardtechniken das CgA-Luciferase-Konstrukt in die Keimbahn von Mäusen eingebracht und durch „Southern Blot“- und PCR-Analysen von genomischer DNA insgesamt vier verschiedene transgene Mauslinien mit einer stabilen Intergration des 4.8kBCgA-Luciferase Transgens identifiziert. Nach Expansion dieser Linien wurde die Expression des Transgenes immunhistochemisch unter Verwendung eines


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spezifischen Luciferase-Antikörpers sowie durch Luciferase-Assays in Gewebelysaten und PCR-Analysen charakterisiert. Hierbei fand sich für das 4.8kBCgA-Luciferase Transgen ein Expressionsmuster, daß strikt dem Expressionsmuster des endogenen CgA-Gens entsprach (Abb. 3). Die Expression des Transgens war dabei ausschließlich in neuroendokrinen Zellen zu finden, während in nicht-neuroendokrinen Epithelzellen keine Expression nachzuweisen war (12). Im Magen der 4.8kBCgA-Luciferase Mäuse fand sich eine Expression des Transgens in ECL-Zellen, Gastrin-produzierenden G-Zellen des Antrums sowie in Somatostatin-produzierenden D-Zellen, wobei die Expression in ECL-Zellen quantitativ weit überwog. Die Wirkung von Gastrin auf die Aktivität des Transgenes wurde nach Erzeugung einer Hypergastrinämie durch mehrfache Injektion des Protonenpumpenblockers Omeprazol untersucht. Hierbei zeigte sich in 4.8kBCgA-Luciferase Mäusen eine selektive Erhöhung der Luciferase-Expression im Bereich des Magenkorpus, während im Bereich des Antrums keine Veränderungen der Luciferaseaktivität und somit der Aktivität des Transgens festzustellen war (12). Diese selektive Induzierbarkeit des CgA-Promotors im Magenkorpus steht im Einklang mit Untersuchungen zur Wirkung einer Hypergastrinämie auf die CgA-Protein- und mRNA-Expression im Rattenmagen, die eine selektive Steigerung der Expression beider Parameter im Bereich des Magenkorpus erbracht hatten (Literaturzitate siehe 12). Als physiologische Grundlage für diese Korpus-spezifische Regulation des CgA-Transgens ist eine spezifische Expression von CCK-B/Gastrin-Rezeptoren auf ECL-Zellen der Korpusmukosa anzusehen, während dieser Rezeptortyp auf anderen neuroendokrinen, CgA-exprimierenden Zellen des Magens nicht zu finden ist. Zusammenfassend zeigten unsere transgenen Studien, daß 4.8kB der Promotorsequenz des CgA-Gens alle regulatorischen Elemente umfaßt, die für eine Gewebe-spezifische Expression des CgA-Gens in neuroendokrinen Zellen erforderlich sind. Darüberhinaus erlaubt die Verwendung dieser CgA-Promotersequenz in transgenen Experimenten die Expression von heterologen Proteinen in neuroendokrinen Zellen, einschließlich der ECL-Zellen des Magens. Desweiteren weist das Transgen unter in vivo Bedingungen eine Stimulierbarkeit durch Gastrin auf, wodurch die Ergebnisse unserer in vitro Untersuchungen, die eine Transaktivierbarkeit des CgA-Promotors durch Gastrin erbracht hatten, bestätigt werden.


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3.7 Inhibition der CgA-Promoteraktivität durch Interferon-alpha


Klinische Studien demonstrierten eindrucksvoll, daß bei Patienten mit neuroendokrinem Hypersekretionssyndrom die klinische Symptomatik durch Interferon-alpha-Therapie deutlich zu bessern ist. Neben diesem klinischen Effekt kommt es unter Interferon-alpha-Gabe gleichzeitig zu einer Verminderung der CgA-mRNA-Expression im Tumorgewebe. Diese Beobachtung deutet daraufhin, daß der Effekt von Interferon-alpha durch eine Verminderung der CgA-Expression zu erklären ist und das hierbei eine Beeinflußung der transkriptionellen Aktivität des CgA-Gens von Relevanz sein könnte. Vor diesem Hintergrund gingen wir der Frage nach, inwieweit Interferon-alpha in der Lage ist die transkriptionelle Aktivität des CgA-Promotors zu beeinflussen und welche Mechanismen an einem solchen potentiellen Effekt von Interferon-alpha beteiligt sind. Unsere Untersuchungen zeigten, daß die Behandlung neuroendokriner Tumorzellen in vitro mit Interferon-alpha zur einer deutlichen Reduktion (ca. 50-60 %) der transkriptionellen Aktivität des CgA-Promotors führt (7). Die detaillierte Analyse der zugrundeliegenden Mechanismen zeigte, daß der Effekt von Interferon-alpha hierbei durch Interferenz mit einem, im Bereich CgA -71 Bp bis -64 Bp lokalisierten, cAMP-responsiven Element (CRE) des proximalen CgA Kernpromotors beruht. Eigene Untersuchungen sowie vorangegangene Studien anderer Gruppen hatten dokumentiert, daß dieses Element eine essentielle Rolle for die basale und stimulierte Aktivität des CgA-Promotors in neuroendokrinen Zellen spielt und die Bindung des Transkriptionsfaktors CREB an das CgA-CRE für die Regulation dieses Elementes verantwortlich ist (Literatur in 7). Der Transkriptionsfaktor CREB unterliegt hierbei einer Regulation durch das Adapterprotein CBP (CREB Binding Protein), das durch direkte Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor CREB eine Verbindung zu verschiedenen CREB-regulierenden intrazellulären Signalkaskaden herstellt. Vor diesem Hintergrund zeigten unsere Studien, daß die inhibierende Wirkung von Interferon-alpha auf das CgA-CRE -71/-64 Bp-Element durch eine funktionelle Inhibition des Adapterproteins CBP hervorgerufen wird (7). Durch diese Untersuchung wurde erstmals ein potentieller Wirkmechanismus für die Wirkung von Interferon-alpha im Rahmen des neuroendokrinen Hypersekretionsyndroms nachgewiesen und das CgA-Gen als molekulares Ziel der Interferon-alpha-Therapie identifiziert. Weitere Studien müssen zeigen inwieweit


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therapeutische Ansätze, die auf eine Verminderung der CBP/CREB-abhängigen CgA Expression beruhen, für eine Therapie des neuroendokrinen Hypersekretionssyndroms geeignet sind.

3.8 Oxidativer Stress und HDC-Genregulation


Eine Erhöhung des mukosalen oxidativen Stress repräsentiert eine charakteristische pathologische Situation für gastrale Epithelzellen. Hierbei scheint die zu beobachtende Aktivierung der Histaminsynthese einen wesentlichen Beitrag zum Ablauf der assoziierten Ulzerations- und Restitutionsmechanismen zu leisten. Daher untersuchten wir, ob oxidativer Stress eine direkte transaktivierende Wirkung auf das HDC-Gen ausüben kann und analysierten verschiedene molekulare Aspekte der zugrundeliegenden Regulations-mechanismen. Hierbei fand sich, daß oxidativer Stress den hHDC-Promotor dosis- und zeitabhängig transaktiviert, wobei dieser Effekt durch Aktivierung einer Signalkaskade vermittelt wird, die sich im proximalen Bereich wesentlich vom Gastrin-stimulierten Signalweg unterscheidet (6). Während der Effekt von Gastrin auf die ERK-Kaskade durch einen Ras-unabhängigen, PKC-abhängigen Mechanismus vermittelt wird, führt oxidativer Stress zu einer Ras-abhängigen Aktivierung von ERKs, die im Gegensatz zur Gastrin-abhängigen Aktivierung des HDC-Promotors unabhängig von PKCs verläuft (6 und Abb.1). Ein wesentlicher Schritt in der Aktivierung der HDC-aktivierenden Kaskade durch oxidativen Stress, ist die Phosphorylierung des EGF-Rezeptors (4). Die funktionelle Bedeutung der EGF-Rezeptoraktivierung für die Transmission der Effekte von oxidativem Stress wurde durch Expression einer Kinase-defizienten, dominant-negativen EGF-Rezeptormutante untersucht. Hierbei führte die funktionelle Inaktivierung des EGF-Rezeptors im AGS-B-Modell zu einer Reduktion des Wirkung von oxidativem Stress auf den hHDC-Promotor um etwa 50 % (6). Hinsichtlich der Aktivierung distaler Signalwege besteht eine Übereinstimmung zwischen der Wirkung von oxidativem Stress und Gastrin: von beiden Stimulatoren wird eine Kaskade aktiviert, die Raf, MEK-1 und ERKs umfaßt (6). Auf Promoterebene vermittelt der Sequenzbereich hHDC +2 bis +27 Bp den Effekt von oxidativem Stress. Dieses Element wurde in vorangegangenen Experimenten als Gastrin-responsives Element des HDC-Promotors identifiziert (6). Unsere Daten zeigen erstmals, daß oxidativer Stress die transkriptionelle Aktivität des humanen HDC-Gens direkt beeinflussen kann. Darüberhinaus


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konnten wir die zugrundeliegende Signalkaskade weitgehend aufklären und hierbei wesentliche Unterschiede zu der Gastrin-aktivierten, HDC-regulierenden Signalkaskade nachweisen. Da Entstehung und Verlauf von Gastritiden und gastroduodenalen Ulzerationen mit erhöhten oxidativen Stress in der Magenmukosa einhergehen, tragen diese Daten zu einem besseren Verständnis der assoziierten molekularen Abläufe bei und können darüber hinaus helfen, neue Interventionsstrategien zur Behandlung dieser pathologischen Veränderungen zu entwickeln.

3.9 Helicobacter pylori und HDC-Genregulation


Nachdem klinische und tierexperimentelle Studien Hinweise auf eine Aktivierung des gastralen Histaminmetabolismus im Rahmen einer Helicobacter pylori-Infektion geliefert hatten, war es Ziel unserer Untersuchung zu klären, inwieweit das Bakterium einen direkten Einfluß auf die transkriptionelle Aktivität des HDC-Gens nehmen kann. Da eine direkte Beeinflussung der HDC-Expression durch Hp einen neuen Pathogenitätsmechanismus repräsentieren würde, sind Kenntnisse über die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen zur Verbesserung des ätiologischen Verständnisses der Hp-Infektion sowie zur Definiton neuer therapeutischer Ansätze wünschenswert. Vor diesem Hintergrund lagen die Schwerpunkte der Untersuchung neben einer Charakterisierung der durch Hp aktivierten Signalwege, Transkriptionsfaktoren und DNA-Elemente, auf der Identifikation der beteiligten bakteriellen Virulenzfaktoren. Für die in vitro-Infektion mit Hp wurden AGS-B-Zellen nach Transfektion mit einem hHDC-Luziferase Reportergenkonstrukt mit 50-100 Bakterien/Epithelzelle kolonisiert und nach 3-stündiger Inkubation hinsichtlich ihrer Luziferasektivität analysiert. Unter diesen Infektionsbedingungen führte Hp zu einer 4-6-fachen Aktivitätssteigerung des humanen HDC-Promotors (11). Der Effekt von Hp war hierbei quantitativ ausgeprägter als der des Phorbolesters PMA, der in Voruntersuchungen als bislang potentester Stimulus der hHDC-Promotoraktivität charakterisiert werden konnte. Die nachfolgend durchgeführte 5’-Deletionsanalyse in Verbindung mit Elementtransferexperimenten zeigte, daß die zuvor als Gastrin-responsives Element des HDC-Promotors identifizierte Sequenz hHDC 5'-+1-ACCCTTTAAATAAAGGGCCCA-CACTGG+27-3' auch die Wirkung von Hp auf das hHDC-Gen vermittelt (11). Die durch Hp-aktivierten nukleären Proteine, die nach Hp-Infektion an dieses Element binden, entsprechen


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den zuvor charakterisierten GAS-RE-BPs, also den durch Gastrin induzierten HDC-bindenden Transkriptionsfaktoren (8, 11).

Basierend auf diese Charakterisierung des transaktivierenden Einflusses von Hp auf das HDC-Gen, untersuchten wir nachfolgend die der Wirkung des Keimes hierbei zugrundeliegenden Virulenzfaktoren. Hierzu wurden in in vitro-Infektionsexperimenten mit AGS-B-Zellen verschiedene isogene Hp-Mutanten eingesetzt. In diesen Mutanten sind durch genetische Manipulation bestimmte Genbereiche, die durch vorangegangene Studien als Sequenzen mit relevanter Humanpathogenität identifiziert wurden, funktionell inaktiviert. Außerhalb dieser pathogenen Genregionen liegenden Gene des Bakteriums bleiben hierbei unverändert und entsprechen dem Hp-„Wildtyp“. Unsere Untersuchungen ergaben, daß die transaktivierende Wirkung von Hp auf den humanen HDC-Promotor unabhängig von Virulenzfaktoren ist, die der CagA- oder VacA-Region des Keimes zuzuordnen sind. Beide Genbereiche wurden in klinischen Studien sowie tierexperimentell als Virulenzfaktoren identifiziert durch die eine erhöhte Humanpathogenität von Hp-Stämmen erklärt werden kann, wobei die Wirkung von cagA-PAI an die Aktivierung von JNK-assoziierten Signalkaskaden gebunden war. Im Gegensatz hierzu erbrachte unsere Untersuchung den überraschenden Befund, daß der HDC-aktivierende Effekt des Bakteriums auf einer Ras-unabhängigen Stimulation von Raf > MEK-1 > ERKs beruht und somit der durch Gastrin aktivierten Signalkaskade entspricht (11).

Abb. 4. Schematische Darstellung der molekularen Interaktionen von Hp mit Epitelzellen des Magens. Abkürzungen: TF1 und TF2 = Transkriptionsfaktor 1 und 2; GAS-RE-BPs=Gastrin-responsive Element Binding Proteins; IL-8=Interleukin 8. Weitere Einzelheiten siehe Text.


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Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen, daß Hp in der Lage ist, das Schlüsselgen der Histaminsynthese im Magen direkt zu aktivieren, wobei diese Wirkung auf die Aktivierung eines neuen Promotorelements und bislang noch nicht identifizierten Transkriptionsfaktoren beruht. Der zugrundeliegende Signalweg unterscheidet sich wesentlich von bislang bekannten Hp-aktivierten Signalkaskaden, wobei die Aktivierung dieser Signalkaskade durch Hp unabhängig von bislang bekannten Virulenzfaktoren abläuft. Die Transaktivierung des HDC-Promotors durch Hp scheint daher auf einem bislang nicht bekannten Mechanismus zu beruhen, durch den der Keim eine transkriptionelle Aktivierung von epithelial exprimierten Genen seines Wirtes auslösen kann (Abb. 4). Die Charakterisierung dieses neuen Mechanismus der Wirkung von Hp auf epitheliale Zielzellen im menschlichen Magen erweitert das Verständnis der molekularen Interaktion des Bakteriums mit seinem Wirt und kann zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Hp-assozierten Erkrankungen beitragen. Hierbei erscheint insbesondere der Eingriff in Signalkaskaden sowie Transkriptionsfaktor-DNA-Interaktionen als attraktiv. Erste tierexperimentelle Daten dokumentieren die potentielle Wirksamkeit solcher Ansätze ´zur Behandlung von Hp-getriggerten Veränderungen der Magenschleimhaut in vivo. Angesichts der zunehmenden Resistenzentwicklung gegen Antibiotika, die zur Eradikationstherapie von Hp eingestzt werden, sowie der relativ hohen Therapiekosten bei hoher Inzidenz von Hp-assoziierten Erkrankungen in Ländern der Dritten Welt, gewinnen alternative Therapiekonzepte zunehmend an Bedeutung. Inwieweit diese ersten experimentellen Ansätze zur Entwicklung anwendbarer Therapeutika führen bleibt in weiteren Studien zu klären.

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