Höhn, Thomas: Effekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim Neugeborenen

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Historisches/Entdeckung von NO

Die Rolle von Stickstoffmonoxid in der Physiologie und Pathophysiologie von Tier und Mensch war Gegenstand zahlreicher Untersuchungen während der vergangenen Jahre. Dies gilt nicht nur für seine Funktion als gasförmiges Signalmolekül, sondern auch und gerade wegen seiner vasodilatatorischen Wirkungen. Bis zur Entdeckung der vasoaktiven Wirkung und der Rolle als Neurotransmitter wurde Stickstoffmonoxid als schädigendes Agens betrachtet, das nicht nur die Umwelt, sondern auch das bronchiale und alveoläre Epithel der Lunge in Mitleidenschaft zieht. Im Jahre 1980 konnte Furchgott [Furchgott 1980] zeigen, dass der über Acetylcholin vermittelte Effekt der Vasodilatation in isolierten vaskulären, thorakalen Aortenringen beim Kaninchen abhängig von der endothelialen Funktion ist. Im gleichen Jahr gelang der Nachweis, dass Nitrovasodilatatoren durch die Freisetzung von Stickstoffmonoxid und dessen Effekt auf die glatte Muskulatur wirken [Murad 1986]. Im Folgenden wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Relaxierung der glatten Muskelzellen durch einen Anstieg des zyklischen GMP verursacht werden könnte [Furchgott 1984]. Furchgott und Ignarro folgerten beide im Jahr 1986, dass endothelium-derived relaxing factor (EDRF) und Stickstoffmonoxid identisch seien [Furchgott 1989, Ignarro 1987]. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass in Endothelzellen und in Makrophagen L-Arginin die Vorstufe von NO darstellt, welches danach zu Nitrit und Nitrat metabolisiert wird [Palmer 1987, Hibbs 1987, Palmer 1988].

1.2 Pathway der NO-Synthese

Stickstoffmonoxid wird durch Hydroxylierung von Stickstoff an der Guanidinogruppe von L-Arginin freigesetzt, eine Reaktion, die von NO-Synthetasen (NOS) katalysiert wird.


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Abbildung 1: Synthese von NO in der Endothelzelle und Wirkmechanismus in der glatten
Muskelzelle modifiziert nach: S. Moncada, Biochem Pharmacol 1989)


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1.3 NO-Synthetasen

Zur Zeit sind drei Isoformen von NOS bekannt: zwei konstitutive Formen, die endotheliale NOS (eNOS) und die neuronale NOS (nNOS), und die induzierbare Form (iNOS). Letztere wird durch Bakterien und Zytokine induziert, eine Hochregulierung führt zu deutlich höheren Konzentrationen von produziertem Stickstoffmonoxid als die der konstitutiven Formen [Cunha 1993]. Die resultierenden Stickstoffmonoxid-Konzentrationen besitzen einen antimikrobiellen Effekt gegen verschiedenste bakterielle Pathogene in vivo [Blomqvist 1993]. Eine Übersicht über die wichtigsten Reaktionswege vermittelt Abbildung 2.

Abbildung 2: Bildung reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffverbindungen (nach: Forman
& Torres, Mol Aspects Med 2001)

1.4 Vorkommen in verschiedenen Zelltypen

Die konstitutiven Formen von NOS sind sowohl in vaskulären Endothelzellen, als auch in Thrombozyten und neutrophilen Granulozyten nachweisbar. Das Enzym


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iNOS ist dagegen in Epithelzellen, vaskulären glatten Muskelzellen, Hepatozyten und vor allem in Makrophagen vorhanden, und wird bei inflammatorischen Zuständen schnell hochreguliert [Hibbs 1988, Shaul 1994, Asano 1994, Kobzik1993]. Diese Induktion kann sowohl durch Bakterien erfolgen, als auch durch bakterielle Produkte und durch Zytokine [Weisz 1996]. Die Reaktion des Lungengewebes hängt dabei von der Konzentration des entstehenden Stickstoffmonoxid und dem Vorhandensein verfügbarer Reaktionspartner ab [Liaudet 2000]. Im Gehirn konnte eine Expression von iNOS in Astrozyten, Mikroglia und auch in geringerem Umfang in Endothelzellen nachgewiesen werden [Heneka 2001; Murphy 1993; Brosnan 1997; Minghetti 1998].

1.5 Funktion

Bei zahlreichen Erkrankungen werden der Produktion von Stickstoffmonoxid durch gliale iNOS sowohl protektive als auch schädigende Effekte zugeschrieben [Kröncke 2001]. Zumindest in Lungengewebe konnte gezeigt werden, dass NO sowohl pro- als auch antioxidative Effekte besitzen kann [Weinberger 2001]. Bei niedrigen Konzentrationen von NO überwiegen die antioxidativen Eigenschaften von Stickstoffmonoxid. Dagegen werden bei hohen Konzentrationen oder anhaltender Produktion von NO (z. B. durch Hochregulation von iNOS oder Anwendung von exogenem Stickstoffmonoxid) zytotoxische, reaktive Stickstoffverbindungen geformt [Wink 1998, Kim 2001]. Auch scheint die Form des Zelluntergangs von der resultierenden NO-Konzentration abzuhängen, niedrige Konzentrationen von Stickstoffmonoxid führen eher zur Apoptose, während hohe Werte die Nekrose zur Folge haben [Bonfoco 1995, Nicotera 1999].

1.5.1 Signaltransduktion

Gemessen an der Reaktionsfreudigkeit anderer Radikale ist die von NO in biologischen Systemen eher gering. Die geringe Molekülgröße und die Lipophilie von NO ermöglichen einen einfachen Transfer über Zellmembranen und prädisponieren so dieses Molekül für die Funktion der Signaltransduktion. In den hierfür erforder-lichen Konzentrationen wird Stickstoffmonoxid durch die konstitutiven Formen von NOS (eNOS, nNOS) synthetisiert und in einem engen


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Konzentrationsrahmen gehalten [Kröncke 2001]. Der wichtigste zelluläre Rezeptor für NO ist die lösliche Guanylatcyclase (sGC) [Bellamy 2002], eine Reihe physiologischer Effekte werden durch Anheben der intrazellulären Konzentration von cGMP vermittelt. Dabei bindet NO an eine Hämgruppe auf dem Rezeptor und führt zu einer Konformations-änderung, die die Katalyse der cGMP-Synthese um ein Hundertfaches erhöht [Kosarikov 2001].

1.5.2 Vasodilatation

Das in der Endothelzelle produzierte Stickstoffmonoxid diffundiert über die Zellmembran in die benachbarte glatte Muskelzelle, wo die Guanylatzyklase aktiviert wird. Diese Aktivierung führt zu einem intrazellulären Anstieg der cGMP-Konzentration, dies wiederum vermittelt die Relaxierung der vaskulären glatten Muskulatur und bewirkt eine Vasodilatation (siehe Abbildungen 1 und 3).


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Abbildung 3: NO-Synthese und Diffusion zur glatten Muskelzelle (Durchgezogener
Pfeil: fördernder Effekt; gestrichelter Pfeil: hemmender Effekt; modifiziert nach:
Moncada & Higgs, NEMJ 1993)

1.5.3 Immunabwehr

Sobald NO in die Zielzelle (Krebszelle, Parasiten) gelangt, kommt es zu einer Bindung an kupfer- und eisenhaltige Proteine [Änggard 1994]. Als Resultat werden Kupfer und Eisen freigesetzt, welche in Kombination mit Sauerstoff toxische Radikale bilden. Dies bezeichnet man als 'massive oxidative injury' und setzt die


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Expression von iNOS voraus, welches zur Produktion von großen Mengen NO führt. Sowohl Endotoxin (Lipopolysaccharide) als auch proinflammatorische Zytokine (TNF-alpha, IL-1beta, IFN-gamma) triggern eine iNOS-Produktion, die letztendlich zu einer erheblichen Bildung von NO führt [Robbins 1994, Nakayama 1992]. Polymorphonukleäre Granulozyten (PMN) besitzen bereits 4h nach Lipopolysaccharid-Stimulation nicht nur einen höheren Nitritgehalt und eine vermehrte Aktivität der NOS, sondern sind auch schneller in der Lage, L-Arginin aufzunehmen [Sethi 2001].

1.6 Krankheitsbilder mit NO-Dysbalancen

Das klassische neonatale Krankheitsbild der vasalen Dysregulation ist die persistierende pulmonale Hypertension des Neugeborenen (PPHN). Dabei kommt es im Verlauf von Tagen zu einer nicht ausreichenden Produktion von NO und einer Zunahme des Vasokonstriktors Endothelin-1 mit dem Effekt einer verminderten Lungendurchblutung und resultierender Hypoxämie. Neugeborene mit PPHN besitzen in den ersten Lebensstunden nicht nur signifikant höhere Endothelin-1-Spiegel als gesunde Kontrollkinder, sondern synthetisieren im Krankheitsverlauf sogar größere Mengen an Stickstoffmonoxid [Endo 2001].

Auch das Krankheitsbild der kongenitalen Zwerchfellhernie ist häufig mit einer PPHN vergesellschaftet. In einem Nitrofen-induzierten Zwerchfellhernienmodell der neonatalen Ratte konnte gezeigt werden, dass die Expression der endothelialen NOS bei betroffenen Tieren deutlich gegenüber den Kontrollen vermindert war [North 1995]. In einem eNOS knock-out Modell der Maus ließ sich durch Hypoxie eine PPHN mit rechtsventrikulärer Hypertrophie reproduzierbar darstellen [Steudel 1998]. Dagegen zeigen adulte eNOS knock-out Mäuse primär systemische Blutdruckregulationsstörungen im Sinne einer arteriellen Hypertonie [Shesely 1996].

1.7 Inhalative NO-Applikation

Wendet man Stickstoffmonoxid in inhalativer Form an (iNO), so bleibt die Vasodilatation auf die Gefäße im Pulmonalkreislauf beschränkt. Dieser Effekt der selektiven pulmonalen Vasodilatation macht iNO in der Behandlung der


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pulmonalen Hypertension zu einem vielversprechenden therapeutischen Werkzeug. Bei spontanatmenden Lämmern konnte eine - durch das Thromboxanendoperoxidanalog U46619 oder Einatmen einer hypoxischen Gasmischung verursachte - pulmonale Hypertension durch inhalatives NO rückgängig gemacht werden [Frostell 1991]. Higenbottam und Mitarbeiter [Pepke-Zaba 1991] beschrieben eine selektive pulmonale Vasodilatation infolge iNO Therapie bei Erwachsenen mit pulmonaler Hypertension. Mittlerweile liegen die Daten von fünf randomisierten, kontrollierten Studien vor, deren Metaanalyse zeigt, dass sich die Oxygenierung von Kindern und Erwachsenen mit akutem hypoxischen Lungenversagen durch inhalatives NO kurzfristig verbessern lässt [Sokol 2000]. Ein Einfluss auf die Mortalität aber ließ sich aber ebenso wenig zeigen wie Auswirkungen auf Effektivitätsparameter der Intensivtherapie (Beatmungsdauer, Krankenhausliegedauer, Verweildauer auf der Intensivstation).

1.8 Indikationen für iNO in der Neonatologie

Bei Neonaten mit PPHN wurde eine Verbesserung der Oxygenierung zuerst von Kinsella [Kinsella 1992] und Roberts [Roberts 1992] im Jahre 1992 berichtet. Seither ist in einer Reihe von randomisierten, kontrollierten Studien der Nachweis der Wirksamkeit bezüglich einer verbesserten Oxygenierung unter iNO-Therapie geführt worden [NINOS 1997, Kinsella 1997, Davidson 1998]. Die Metaanalyse umfasst insgesamt zwölf randomisierte, kontrollierte Studien der Applikation von iNO bei reifen und beinahe reifen Neugeborenen [Finer & Barrington 2001]. Darin zeigen die Autoren, dass iNO den kombinierten Endpunkt Tod oder extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) signifikant reduziert und die Oxygenierung verbessert. Dabei kommt der Effekt durch den verringerten Bedarf von ECMO zustande, die Mortalität bleibt unter iNO-Therapie unverändert. In den folgenden Jahren ließ sich die Wirksamkeit von iNO auch bei der Therapie der PPHN von Frühgeborenen zeigen [Abman 1993, Ahluwalia 1994, Peliowski 1995, Subhedar 1997, Hoehn 1997, 1998]. Allerdings legt hier die Metaanalyse den Schluss nahe, dass mangels ausreichender Daten ein Wirksamkeitsnachweis von iNO für das Kollektiv der Frühgeborenen noch fehlt [Hoehn 2000, Barrington & Finer 2001].


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1.9 Hyperoxiewirkung auf das Gehirn

Bezüglich der Wirkung von Hyperoxie auf das unreife Gehirn existieren kaum Daten, verfügbare Untersuchungen deuten jedoch daraufhin, dass hohe Konzentrationen von Sauerstoff zur Schädigung des unreifen Gehirns führen [Ahdab-Barmada 1986]. Bei diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Sauerstoffexposition von 100% für drei Stunden ausreicht, um bei neugeborenen Ratten zu einer ausgedehnten neuronalen Nekrose zu führen. Dieses Schädigungsmuster war mit zunehmender postnataler Reife geringer ausgeprägt und jenseits des 10. Lebenstages praktisch nicht mehr nachweisbar.

1.10 Hyperoxiewirkung auf sonstige Organsysteme

Die Folgen einer Hyperoxieexposition Frühgeborener sind bezüglich ihrer Wirkung auf die unreife Retina [Bland 1980] und auf die unreife Lunge [Chen 1994, O'Donovan 2000, Appleby 2001] gründlich untersucht. Erst vor kurzem konnte gezeigt werden, dass die Frühgeborenenretinopathie mit ihrer Obliteration der sich entwickelnden Kapillaren der Retina zumindest teilweise durch die endotheliale NOS und daraus entstehendem Peroxynitrit mediiert wird [Brooks 2001]. Die Autoren fanden in einem Mausmodell einen protektiven Effekt einer eNOS-Inhibition (bei knock-out Tieren oder durch pharmakologische Blockade), der die sich entwickelnde Retina vor der Ausbildung einer Retinopathie des Frühgeborenen schützte. Dieser Effekt war unabhängig sowohl von der Expression als auch von der perizytären Verteilung von vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).

Die bessere Toleranz von Hyperoxie neonataler im Vergleich zu adulten Ratten war Gegenstand einer Untersuchung, die den Influx neutrophiler Granulozyten in die Hyperoxie-exponierte Lunge zum Gegenstand hatte. Dabei lagen die Neutrophilenzahlen der Neonaten selbst nach einer Woche noch unterhalb derer der erwachsenen Tiere nach nur 60h Sauerstoffexposition [Keeney 1995].


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1.11 L-Selectin

Leukozyten im peripheren Blut werden während ihrer Lungenpassage variablen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt. Demzufolge kann es zu einer Aktivierung kommen, die verschiedenste Effekte an entfernten Zielzellen auslösen kann [Stibenz 1994, Taglialatela 1998]. Die Expression des Leukozytenadhäsionsmoleküls L-Selectin (CD62L) wird auf der Zelloberfläche nach inflammatorischer Aktivierung schnell herunterreguliert [Bührer 1994]. Diese Herunterregulierung von L-Selectin wird durch Proteolyse innerhalb von Sekunden erreicht, als Trigger dienen eine Vielfalt von Stimuli wie bakterielle Toxine, aktiviertes Komplement, Zytokine und Wasserstoffperoxid [Kishimoto 1989, Berg 1990, Fraticelli 1996]. Die Herunterregulierung von L-Selectin stellt eines der frühesten, auf der Zelloberfläche stattfindenden Ereignisse der PMN-Aktivierung dar, und fungiert daher als hoch sensitiver Marker der Leukozytenaktivierung [Stibenz 1994].

1.12 Interaktion von NO und Sauerstoff

Abbildung 4: Reaktionswege von Peroxynitrat mit Kohlendioxid (modifiziert nach: Zhang,
Nitric Oxide 1997)


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Im Gegensatz zu oben Gesagtem ist NO in Anwesenheit von Sauerstoff und reaktiver Sauerstoffmetaboliten (ROS) instabil. Die Interaktion von NO und Sauerstoff führt zur Bildung reaktiver NO-Metaboliten (RNOS), die im Wesentlichen Stickstoffdioxid (NO2), Distickstofftrioxid (N2O3) und Distickstofftetraoxid (N2O4) umfassen. Diese Reaktionsprodukte verursachen Schädigung von Geweben durch oxidative Reaktion mit Proteinen, in vielen Fällen induzieren sie auch Kaskaden, die ultimativ den Zelltod zur Folge haben [Kim 2001]. Dabei bestimmt die Konzentration von Stickstoffmonoxid seine biologischen Effekte auf benachbarte Zellen und Gewebe. Die Reaktionsprodukte von Stickstoff und Sauerstoff beinhalten auch das starke Oxidans Peroxynitrit (siehe Abbildung 4), das Ergebnis der Interaktion von NO und Superoxidanion [Kröncke 2001].

1.13 Peroxynitrit

Peroxynitrit, jedoch nicht Stickstoffmonoxid oder Superoxid, nitriert Tyrosinreste von Zellproteinen und formt das stabile Produkt 3-Nitrotyrosin [Demiryürek 2000]. Diese Reaktion geschieht auch spontan, wird aber zusätzlich katalysiert durch Superoxiddismutase oder Kohlendioxid [Cross 1991, Ischiropoulos 1992, Zhang 1997]. Peroxynitrit besitzt nicht nur eine direkt schädigende Wirkung auf Proteine und Zellmembranbestandteile, sondern inhibiert in hohen Dosen auch exogen applizierten Surfactant [Robbins 1995]. Hyperoxie in Verbindung mit gesteigerter Produktion von Stickstoffmonoxid induziert Zelltod und DNA-Fragmentation in Lungengewebe [Raghuram 1999]. Auch dieser Effekt wird auf die Formation von Peroxynitrit zurückgeführt [Koppenol 1992, Lee 2000]. Auch in einem neonatalen, fokalen Ischämiemodell ließ sich zeigen, dass sich im Verlauf von 72h nach Reperfusion sowohl iNOS als auch Nitrotyrosin in neutrophilen Granulozyten und perivaskulären Endothelzellen immunhistochemisch nachweisen ließen [Coeroli 1998]. Ebenfalls in einem Hypoxie-Ischämiemodell gelang im Infarktbereich nicht nur der vermehrte Nachweis von iNOS und Nitrotyrosin, sondern der iNOS-mediierte Schaden ließ sich auch durch Gabe eines selektiven iNOS-Inhibitors reduzieren [Ikeno 2000]. Andere Autoren kamen in einem Inflammationsmodell


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beim Schwein zu dem Schluss, dass eine nur minimale Induktion von iNOS bei deutlichem Nachweis von Nitrotyrosin alternative Synthesewege für die Produktion von Nitrotyrosin verantwortlich sein müssen [Javeshghani 2001]. Hingegen zeigte sich in einer in-vitro-Untersuchung ein ausreichender Schutz vor einer Nitrierung von Tyrosinresten in Anwesenheit von physiologischen Mengen Glutathion [Kirsch 2001].

1.14 Hypothesen

Postnatal kommt es infolge des Einsetzens der Lungenatmung zu einem drastischen Anstieg der arteriellen Sauerstoffspannung (pO2 intrauterin: ca. 27-35mmHg, pO2 postnatal: ca. 70-100mmHg [Mildenberger 1999]). Entsprechend den aktuell gültigen Reanimationsrichtlinien für Neugeborene wird derzeit eine Reanimation grundsätzlich mit 100% Sauerstoff (falls verfügbar) durchgeführt [Kattwinkel 1999, Niermeyer 2000]. Vor diesem klinischen Hintergrund, der spezifischen biologischen Chemie von NO in der Perinatalperiode und offenen Fragen zur Interaktion von NO und Sauerstoff, wurden folgende Hypothesen generiert:

Zur Beantwortung der Fragestellungen wurden sowohl bakterielle Kulturen auf selektive Hemmung des Wachstums, unreife Ratten in unterschiedlichem postnatalen Alter auf ihr topographisches iNOS- und Peroxynitrit-Expressionsmuster und neonatale versus adulte PMN-Granulozyten auf ihre L-Selectin-Expression untersucht.


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Thu Dec 5 13:35:52 2002