Höhn, Thomas: Effekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim Neugeborenen

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Kapitel 2. Methoden

2.1 NO-Begasung von Bakterienkulturen

2.1.1 Materialgewinnung

Die untersuchten Bakterienkulturen stammten aus trachealen Isolaten beatmeter Früh- und Neugeborener, die auf der Intensivstation behandelt wurden. Die fünf Spezies Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa wurden in die Untersuchung einbezogen. Alle Proben wurden bis zur Untersuchung bei -20°C in glycerolhaltigem Medium aufbewahrt. Jeweils zehn verschiedenen Stämme jeder Spezies wurden auf Sojaagarplatten ausgestrichen und bei 37°C entweder NO oder Raumluft exponiert. Einzelne Kolonien wurden in eine brain heart infusion inokuliert und über Nacht wachsen gelassen. Mittels Verdünnung mit physiologischer Kochsalzlösung wurde eine Konzentration von ~1.5 x 108 colony-forming units (CFU) hergestellt und diese mit dem entsprechenden McFarland Standard verglichen [Hoehn 1998]. Nach einem weiteren Verdünnungsschritt lag die Zahl der CFU bei ~102. Diese Lösung wurde in einer standardisierten Menge von je 100µl auf jeweils vier Sojaagarplatten ausgewalzt, wovon wiederum jeweils zwei NO- und zwei Raumluft exponiert wurden.

2.1.2 NO-Exposition

Kulturplatten zur NO-Exposition wurden in einem luftdichten Container (gas pack system®) gelagert und über ein Konnektionssystem mit Druckminderer und Flowmeter an ein NO-Vorratssystem angeschlossen. Der Container wurde anschließend in einem Wärmeschrank bei 37°C deponiert und bei unterschiedlichen NO-Konzentrationen (40, 80, 120ppm) für 24 Stunden inkubiert. Die Konzentrationen von NO und NO2 wurden mittels eines elektrochemischen Detektors kontinuierlich gemessen (Bieler & Lang, Achern, Messgenauigkeit ~2% [Benzing 1993]). Da die NO2-Bildung von der zur Verfügung stehenden Reaktionszeit von NO und Sauerstoff abhängt, wurde in einem Vorversuch die benötigte Flussgeschwindigkeit der Druckluft ermittelt, die garantiert, dass während der Versuchsdauer keine toxischen NO2-Konzentrationen erreicht


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werden (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1: Flow von Raumluft und NO (600ppm in N2) und die gemessenen Konzentrationen von NO und NO2

NO-Konzentration

NO2-Konzentration

Druckluftflow

NO-Flow (600ppm)

40 ppm

1.3 - 1.4 ppm

2.5 l/min

0.21 l/min

80 ppm

2.0 - 2.8 ppm

12.5 l/min

1.6 l/min

120 ppm

5.5 ppm

12.5 l/min

2.5 l/min

2.1.3 Auswertung und Statistik

Nach 24stündiger Begasung wurden die Kulturen aus dem Container genommen und die Anzahl der CFU gezählt. Die Zahl der unter NO-Exposition gewachsenen CFU wurde als prozentualer Anteil der bei Raumluft gewachsenen CFU quantifiziert.

Spearman's Korrelationskoeffizienten und der Wilcoxon Rangsummentest gelangten als statistische Verfahren zur Anwendung, Signifikanz wurde bei einem p<0.05 angenommen. Die Linien der Boxplots stellen Minimum und Maximum dar, die Box enthält 50% der Beobachtungen der empirischen Verteilung.


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2.2 Hyperoxieexposition im Tiermodell

2.2.1 Tierhaltung

Terminverpaarte weibliche Wistar-Ratten wurden vom Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BGVV Berlin) bezogen. Neugeborene Ratten wurden unter Standardbedingungen (24stündiger Rhythmus mit Wechsel von hell/dunkel, freie Verfügbarkeit von Wasser und Futter) mit ihren Müttern gehalten. Die Untersuchungen fanden im Alter von 1, 3 oder 7 Tagen an insgesamt 74 neonatalen Ratten statt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den aktuellen Tierschutzvorschriften und mit Zustimmung der lokalen Aufsichtsbehörde (Landesamt für Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin; G 0232/00) durchgeführt.

2.2.2 Hyperoxieexposition

Sauerstoffexposition fand durch Positionieren des gesamten Käfigs mit der Rattenmutter und den Jungtieren in einem Transportinkubator statt. Die minimale Sauerstoffkonzentration betrug 80% für eine Gesamtdauer von 24h, die Kontrolltiere wurden bei Raumluft gehalten. Unmittelbar nach der Hyperoxieexposition wurden die Jungtiere anästhesiert und perfundiert.

2.2.3 Perfusion und Aufarbeitung der Gehirne

Die Gehirne wurden transkardial zunächst mit heparinisiertem PBS, dann mit Paraformaldehyd (4%) wie vorbeschrieben perfundiert [Ikonomidou 1999]. Zusammenfassend wurde nach Thorakotomie und einer rechtsatrialen Inzision eine Perfusionsnadel von der Herzspitze bis in die aszendierende Aorta vorgeschoben. Nach Applikation von jeweils 20ml (PBS und Paraformaldehyd) erfolgte eine kontinuierliche Perfusion mit eiskaltem Paraformaldehyd (4%) für mindestens 10 Minuten. Anschließend wurden die Gehirne in Paraformaldehyd für insgesamt 3-7 Tage gelagert, danach umdeponiert in angesäuertes PBS (pH 6,6) und eingebettet in Paraffin.


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2.2.4 Lichtmikroskopie

Die lichtmikroskopische Untersuchung wurde mittels eines konventionellen Mikroskops durchgeführt (CH2 bzw. BX60, Olympus, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan). Die folgenden Regionen wurden untersucht:

Abbildung 5: Frontalschnitt des Rattengehirns auf Höhe des motorischen Kortex
(primärer motorischer Kortex [MOP], sekundärer motorischer Kortex [MOS]; aus: Brain
maps: structure of the rat brain, Swanson LW, Elsevier)


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Abbildung 6: Frontalschnitt des Rattengehirns auf Höhe des Hippocampus
(Retrosplenialer Kortex [RSC], CA1 und CA3-Regionen des Hippocampus [HIP], Thalamus
[THA], medialer septaler Nucleus [MSN]; aus: Brain maps: structure of the rat brain,
Swanson LW, Elsevier)

2.2.5 Immunhistochemie

Die Gehirne wurden wie oben beschrieben perfundiert und in Paraffin eingebettet. Serielle Koronarschnitte wurden mit einer Schichtdicke von 10µm angefertigt (Leica Mikrotom VT 1000S, Leica, Nussloch) und auf silanbeschichtete Objektträger aufgebracht. Der iNOS-Antikörper stammte von der Firma Santa Cruz (Cat.-No. Sc-7271, Santa Cruz, Santa Cruz, USA), der Nitrotyrosin-Antikörper von Upstate Biotechnology (Cat.-No. 06-284, Upstate, Lake Placid, New York, USA). Die verwendete Konzentration der Antikörper betrug 1:100 (iNOS) bzw. 1:500 (Nitrotyrosin). Nach Deparaffinisierung durch Waschen in Xylen und einer absteigenden Alkoholreihe wurden die Schnitte in einem Zitratpuffer


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(0,01M, pH 6,6) erhitzt um Antigenstellen zu demaskieren. Anschließend wurden die Schnitte mit Leitungswasser gekühlt und in PBS gewaschen. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 0,6% Wasserstoffperoxid in PBS für 30 Minuten geblockt. Nach erneutem Waschen in PBS wurde für 20 Minuten mit 5% Ziegenserum in PBS inkubiert um unspezifische Bindungen zu verhindern. Dann wurden die Schnitte mit dem jeweiligen Primärantikörper über Nacht inkubiert. Nach Entfernen des Primärantikörpers und repetitivem Spülen mit PBS erfolgte die Inkubation mit einem biotinylierten Sekundärantikörper (anti-rabbit IgG antibody, 1:200, Vector Laboratories, Burlingame, USA). Die immunohistochemische Detektion positiver Zellen wurde mit Hilfe eines Avidin-biotinylierten Peroxidasekomplexes (ABC-kit von Vecstatin, Vector Laboratories, Burlingame, USA) und DAB-Substrat durchgeführt (ebenfalls von Vector Laboratories, Burlingame, USA). Nach mehrfachem Waschen in PBS und TRIS Puffer wurde eine Gegenfärbung mit Methylgrün (10%) für 5 Minuten angeschlossen. Zur endgültigen Fixierung wurden Butanol und Xylen verwendet. Die Schnitte wurden lichtmikroskopisch ausgewertet (CH2, Olympus, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan), die Fotodokumentation erfolgte mit einer Digitalkamera (C-3030, Olympus, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan).

2.2.6 RT-PCR

Für diese Untersuchungen wurden die Gehirne nach der Paraformaldehydperfusion in toto entnommen und in einzelne Gehirnareale zerteilt. Bis zur Weiterverarbeitung wurden die Proben bei -70°C eingefroren. Die RNA wurde mittels eines RNeasy®-Kits (Quiagen, Bothell, USA) isoliert, dabei wurde eine Konzentration von 0,1µg/µl in allen Proben angestrebt. Pro Tier wurden etwa 80mg Gehirngewebe für 30 Sekunden homogenisiert und mit 1ml RLT-Puffer und 10µl ß-Mercaptoethanol versetzt. Die Lysate wurden anschließend mit 5000rpm bei 4°C für 3 Minuten zentrifugiert, für die Messung wurden 500µl des Überstands mit der gleichen Menge Äthanol 70% verdünnt. Dann wurden 500µl der Lysat-Äthanol-Mischung auf die Säule aufgetragen (RNeasy® mini) und mit 10000rpm bei 4°C für 15 Sekunden zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Filtrats wurde die Prozedur mit dem Rest der Lysat-Äthanol-Mischung wiederholt. RW1 Puffer (700µl) wurde dann zur Säule hinzugefügt, anschließend mit 10000rpm für


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15 Sekunden zentrifugiert. Dann wurde ein 2ml-Gefäß mit der RNeasy® mini-Säule verbunden, mit 500µl RPE Puffer gefüllt und mit 10000rpm für 15 Sekunden zentrifugiert. Nach Verwerfen des Filtrats wurde die Prozedur mit der gleichen Menge RPE Puffer wiederholt, diesmal erfolgte die Zentrifugierung für 4 Minuten mit 13000rpm. Zur Eluation der RNA von der Säule wurde ein 1,5ml-Behälter benutzt. 50µl RNAse-freies Wasser wurde auf die Membran pipettiert und anschließend bei 13000rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Diese Prozedur wurde einmal wiederholt. Das Volumen der extrahierten RNA lag bei ca. 100µl. Die Konzentration der RNA wurde photometrisch gemessen (E260/E280) und auf Werte von 0,1µg/µl eingestellt.

Die reverse Transkription von 1µg RNA in cDNA wurde unter Verwendung von Random Hexameren und AMV reverser Transkriptase (Promega, Mannheim) und 1× PCR Puffer durchgeführt (20mM Tris · HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 2mM MgCl, und 100µg/ml bovinem Albumin). Die cDNA wurde mittels PCR in einem Gesamtvolumen von 30µl mit 5U/µl Taq DNA Polymerase (Gibco, Eggenstein) amplifiziert, weiter enthalten waren 4µl 1mM dNTP, 0,75µl MgCl (20mM), 5µl 10xPCR-Puffer, 15,6µl Aqua und 1µl von jedem Primer. Die Amplifikation erfolgte in einem mikroprozessorgesteuerten Thermocycler (Multicycler PTC-200 MJ Research, Biozym, Hessisch Oldendorf).

Die für die ß-Actin-Bestimmung verwendeten Primer hatten die folgende Sequenz (PCR-Produkt: 897 bp): 5'-CCC TAA ggC CAA CCg TgA AAA gAT g-3' (sense; 1663-1687nt) und gAA CCg CTC ATT gCC gAT AgT gAT g-3' (antisense; 2535-2559nt). Für die Amplifikation des ß-Actin wurden 30 Zyklen durchgeführt (30'' bei 94°C, 60'' bei 60°C und 60'' bei 72°C). Die Sequenzen der iNOS-Primer lauteten (PCR-Produkt: 388 bp; MWG-Biotech, Ebersberg): 5'-AgC ATC ACC CCT gTg TTC CAC CC-3' (sense; 1592-1613nt) und 5'-Tgg ggC AgT CTC CAT TgC CA-3' (antisense; 1979-1960nt). Für die iNOS-PCR wurden 30 Zyklen durchgeführt (30'' bei 94°C, 60'' bei 60°C und 60'' bei 72°C). Die PCR-Produkte wurden in einem Agarosegel (2%) elektrophoretisch aufgetrennt, die Darstellung erfolgte durch Zugabe von Ethidiumbromid und UV-Exposition zur Fotodokumentation.


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2.3 In-vitro Gasäquilibrierungsmodell

2.3.1 Probengewinnung

Nabelschnurblut wurde unmittelbar postnatal bei gesunden, reifen Neugeborenen entnommen, die entweder per Sectio oder vaginal spontan geboren wurden. Adultes venöses Blut stammte von gesunden Freiwilligen, in beiden Fällen lag ein entsprechendes Einverständnis vor. Keines der Neugeborenen zeigte klinische Zeichen einer Infektion oder wurde auf eine neonatologische Station aufgenommen. Nabelschnurblut und Erwachsenenblut wurden beide unter Zuhilfenahme eines Vakutainersystems abgenommen, dessen Zweck es war, eine Äquilibrierung mit Raumluft zu verhindern. Die Antikoagulation erfolgte mit Natriumcitrat, der pH wurde durch Hinzufügen von HEPES (N-[2-Hydroxyäthyl] Piperazin-N‘-[2-Ethansulfonsäure) konstant gehalten. Hämoglobinmessungen wurden mit einem Blutgasgerät ABL/OSM-3 durchgeführt (Radiometer Copenhagen, Dänemark).

2.3.2 Gasäquilibrierung von Vollblutproben

Nach Probengewinnung fand eine Gasäquilibrierung mit entweder 0%, 21% oder 100% Sauerstoff für 30 Minuten wie vorbeschrieben statt [Emeis 1998]. Der Flow des jeweiligen Gases wurde auf eine Luftblase pro Sekunde limitiert (Abbildung 7). Unmittelbar nach der Äquilibrierung wurden die Behälter luftdicht verschlossen und bei Raumtemperatur inkubiert. Blutgasanalysen wurden vor und nach der Äquilibrierung sowie nach 24 Stunden durchgeführt.


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Abbildung 7: Äquilibrierungsgerät für die Konditionen Hypoxie, Normoxie und Hyperoxie
(Fa. Witt, Gasetechnik GmbH, Witten)

2.3.3 Flowzytometrie (L-Selectin, Propidiumjodid)

Die Expression von L-Selectin wurde durch Reaktion mit dem monoklonalen antihumanen L-Selectin-Antikörper Leu-8 wie vorbeschrieben quantifiziert [Bührer 1994]. Die Viabilität der Zellen wurde mit der Aufnahme von Propidiumjodid getestet (4mg/mL, 15min, 4°C), das durch die Plasmamembran intakter Zellen ausgeschlossen wird. Die Durchflusszytometrie wurde mit einem FacScan® Zytometer durchgeführt (Becton Dickinson, Heidelberg), das mit einem 488 nm Argon Laser ausgestattet ist. Zur Datenanalyse wurde die Cellquest® Software (Becton Dickinson) verwendet. Die L-Selectin-Expression wurde in willkürlichen Einheiten ausgedrückt, die den Unterschied zwischen der Medianfluoreszenz der FITC-Leu-8-gefärbten und den FITC-IgG2-markierten Kontrollproben darstellen. Die Veränderung der Medianfluoreszenz wurde ebenfalls für die Propidiumjodidfärbung nach Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz errechnet (repräsentative Histogramme sind in Abbildung 8 dargestellt).


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Abbildung 8: Repräsentative Histogramme der durchflusszytometrischen
Fluoreszenzintensität aufgetragen gegen die Zellzahl von PMN-Zellen aus Nabelschnurblut
und Erwachsenenblut nach 100%, 21% oder 0% Sauerstoffexposition und Inkubation für 6h
(monoclonaler anti-humaner L-Selectinantikörper Leu-8; graue Fläche repräsentiert
Kontrollen, schwarze Kurve zeigt die Fluoreszenzintensität des FITC-markierten Leu-8 als
Marker der L-Selectin-Expression und deren Variation infolge Exposition gegenüber
verschiedenen O2-Konzentrationen).

2.3.4 Statistik

Die Daten sind als Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts angegeben. Der Wilcoxon Test wurde verwendet, um den zeitlichen Effekt innerhalb einer definierten Sauerstoffkonzentration zu errechnen, indem die initialen Fluoreszenzwerte mit denen am Ende der Untersuchung verglichen wurden. Mit dem Friedman-Test wurde nach signifikanten Unterschieden zwischen Proben verschiedener Gaskonzentrationen desselben Donors über den Untersuchungsverlauf gesucht. Fluoreszenzwerte im Vergleich Nabelschnur- und Erwachsenenblut wurden mit Hilfe des Mann-Whitney U-Tests zu verschiedenen Zeitpunkten und Gaskonzentrationen untersucht. Eine statistische Signifikanz wurde bei p<0.05 angenommen.


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Thu Dec 5 13:35:52 2002