Höhn, Thomas: Effekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim Neugeborenen

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Tracheale Isolate und NO-Begasung

3.1.1 NO-Exposition von S. agalactiae (GBS)

Mit zunehmender NO-Konzentration zeigte sich ein reduziertes Wachstum von B-Streptokokken. Statistische Signifikanz erreichte dieser Effekt erst bei einer Konzentration von 120ppm, dies auch nur in der Gruppe der 10µl-Inokulum-Platten (Abbildung 9).

Abbildung 9 : Wachstum von S. agalactiae (GBS) bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20)

3.1.2 NO-Exposition von S. aureus

Paradoxerweise fand sich in den 10µl-Inokulum-Kulturen ein vermehrtes Wachstum bei höheren NO-Konzentrationen (p<0.05). Dieser Effekt liess sich bei den Kulturen mit dem größeren Inokulum nicht bestätigen, das Wachstum von S. aureus war durch Zugabe von NO weder beeinträchtigt noch vermehrt (Abbildung 10).


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Abbildung 10: Wachstum von S. aureus bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20)

3.1.3 NO-Exposition von S. epidermidis

Abbildung 11: Wachstum von S. epidermidis bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20)

Sowohl bei 40ppm als auch bei 80ppm bestand kein Unterschied zwischen NO-exponierten Kulturen und Kontrollen. Bei beiden Inokula (10µl und 100µl) war das


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bakterielle Wachstum bei 120ppm signifikant verringert (p<0.01; Abbildung 11).

3.1.4 NO-Exposition von E. coli

Abbildung 12: Wachstum von E. coli bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20)

Das bakterielle Wachstum war bei 40ppm und 80ppm zwischen NO-exponierten- und Kontrollkulturen vergleichbar. Lediglich bei 120ppm war ein statistisch nicht signifikant vermehrtes Wachstum der NO-Kulturen nachweisbar (Abbildung 12).

3.1.5 NO-Exposition von P. aeruginosa

In beiden Inokulumgruppen war das Wachstum von P. aeruginosa bei allen drei NO-Konzentrationen gleich ausgeprägt (Abbildung 13).

Abbildung 13: Wachstum von P. aeruginosa bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl;n=20)


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3.2 Hyperoxiewirkung auf das Gehirn der unreifen Ratte

3.2.1 Lichtmikroskopische Morphologie


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Abbildung 14: Silberfärbung nach de Olmos im primären motorischen Kortex (MOP) bei
einem 7 Tage alten Kontrolltier mit wenigen braun gefärbten, apoptotischen Neuronen
(oben, Vergrößerung 200x) und im sekundären motorischen Kortex (MOS) nach 24stündiger
Sauerstoffexposition (unten, Vergrößerung 200x) mit deutlich vermehrter Anzahl
apoptotischer Neurone

Apoptotische Veränderungen fanden sich in deutlich vermehrter Anzahl in den Gehirnen sauerstoffexponierter Tiere (siehe Abbildung 14). Dieses Ergebnis entsprach den lichtmikroskopischen Befunden aus der HE-Färbung und war Anlaß nach Mechanismen der proapoptotischen Funktion von Hyperoxie einerseits und der Beteiligung einer vermehrten NO-Synthese andererseits zu suchen.

3.2.2 Immunhistochemische Färbungen

3.2.2.1 iNOS

Kontrolltiere zeigten deutlich geringer ausgeprägte oder keine immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im Vergleich zu den Hyperoxie-exponierten Tieren. Sowohl bei 1, 3 als auch bei 7 Tage alten Tiere konnten ubiquitär iNOS-positive Zellen infolge von Sauerstoffexposition nachgewiesen werden. Die ausgeprägtesten Veränderungen fanden sich bei den 7 Tage alten Tieren, bei 1 und 3 Tage alten Ratten war die Farbintensität für iNOS vergleichbar ausgeprägt und insgesamt geringer vorhanden. Bei iNOS-positiven Zellen handelte es sich morphologisch überwiegend um Mikrogliazellen, aber auch Endothelzellen im Bereich der Gefäße zeigten eine Reaktion. Am deutlichsten betroffen waren die Areale Hippocampus (CA1-Region, Abbildung 16), der primäre motorische Kortex (MOP, Abbildung 15), der sekundäre motorische Kortex (MOS, Abbildung 17) und der retrospleniale Kortex (RSC, Abbildung 18). Weniger stark betroffen, aber auch mit mikroglialer Expression iNOS-positiver Zellen versehen waren der Thalamus (THA, Abbildung 19) und der mediale septale Nucleus (MSN, Abbildung 20).

Abbildung 15: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im primären
motorischen Kortex (MOP) von 7 Tage alten Ratten im Vergleich von Kontrollen (oben,
Vergrößerung 200x) und Hyperoxie-exponierten Tieren (unten, Vergrößerung 400x). Weiße
Pfeile zeigen perivaskulär gelegenen Endothelzellen, schwarze Pfeile Mikrogliazellen


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Abbildung 16: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im Hippocampus
(CA1-Region) von 7 Tage alten Ratten im Vergleich von Kontrollen (oben, Vergrößerung
400x) und Hyperoxie-exponierten Tieren (unten, Vergrößerung 400x). Neben den
perivaskulär gelegenen Endothelzellen (weiße Pfeile) färben sich vor allem Mikrogliazellen
(schwarze Pfeile) an


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Abbildung 17: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im sekundären
motorischen Kortex (MOS) von 3 Tage alten Ratten (Pfeile zeigen spezifische Färbung von
Mikroglia; Vergrößerung 400x)

Abbildung 18: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im retrosplenialen
Kortex (RSC) von 3 Tage alten Ratten (die Pfeile zeigen auf iNOS-positive Mikroglia;
Vergrößerung 400x)


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Abbildung 19: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im Thalamus (THA)
von 3 Tage alten Ratten (Pfeile zeigen spezifische Färbung von Mikroglia; Vergrößerung
400x)

Abbildung 20: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im medialen septalen
Nucleus (MSN) der 7 Tage alten Ratte (die Pfeile zeigen auf iNOS-positive Mikroglia;
Vergrößerung 400x)


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3.2.2.2 Nitrotyrosin

Abbildung 21: Immunhistochemische Färbung mit Nitrotyrosin-Antikörper in der CA3-
Region des Hippocampus nach Hyperoxieexposition der 7 Tage alten Ratte (Vergrößerung
200x). Spezifische Anfärbung für Nitrotyrosin zeigt sich nur in nicht-residenten
Makrophagen, nicht aber in Neuronen, Mikrogliazellen oder perivaskulären Endothelzellen.

In sämtlichen Gehirnregionen ließ sich kein Unterschied zwischen Kontrollen und Hyperoxie-exponierten Tieren finden. Die einzigen Zellen, die sich mit Nitrotyrosin-Antikörper als Ausdruck der Peroxynitritproduktion färben ließen, waren nicht-residente Makrophagen (Abbildung 21).


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3.2.3 iNOS-Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion

Bei 7 Tage alten Tieren zeigte die RT-PCR eine Expression von iNOS-mRNA in Abhängigkeit von der Dauer der Sauerstoffexposition. Während bei den Kontrollen keine Bande für iNOS-mRNA nachweisbar war, konnte nach 12 Stunden bei mehr als 80% Sauerstoff bereits ein deutliches Signal reproduziert werden (Abbildungen 22 und 23). Nach insgesamt 24 Stunden Sauerstoffexposition kam zu einer weiteren Intensitätszunahme des iNOS-mRNA-Signals, während das 'housekeeping gene' gleichmäßig exprimiert wurde.

Abbildung 22: iNOS-mRNA im Vergleich der Konditionen 24h Sauerstoff, Raumluft und
12h Sauerstoffexposition (oberer Abschnitt) und Expression des internen Standardgens ß-
Actin (unterer Abschnitt)


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Abbildung 23: iNOS-mRNA im Vergleich der Konditionen 24h Sauerstoff, Raumluft und
12h Sauerstoffexposition (arbiträre Einheiten bei der Auswertung der optischen Dichte der
PCR-Banden)


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3.3 Sauerstoffkonzentration und Aktivierungsverhalten von Granulozyten

3.3.1 Nabelschnurblut

3.3.1.1 Blutgasparameter

Die Äquilibrierung führte erwartungsgemäß zu deutlich unterschiedlichen Sauerstoffpartialdrucken entsprechend der verwendeten Sauerstoffkonzentration (Abbildung 24). Nach 24stündiger Inkubation war dieser Unterschied nicht mehr vorhanden.

Abbildung 24: Sauerstoffpartialdruck [mmHg] in den Nabelschnurproben vor und
nach Äquilibrierung und nach Inkubation für 24h für die drei Sauerstoffkonzentrationen
0%, 21% und 100% (n=7)

3.3.1.2 L-Selectin

Die Ausgangswerte der L-Selectin-Expression lagen im Nabelschnurblut signifikant unterhalb derer im Erwachsenenblut (p<0.001, Mann-Whitney U-Test). Im Verlauf des Experiments zeigte sich eine kontinuierliche Verminderung der Expression, Sauerstoff verursachte zu allen Zeitpunkten die stärkste Verminderung der Expression von L-Selectin im Nabelschnurblut (p<0.002, Friedman; siehe Abbildung 25).


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Abbildung 25: Nettomedianfluoreszenz [arbiträre Einheit] der L-Selectin-Expression
in Nabelschnurproben zu den Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h für die drei Konditionen
Sauerstoff, Stickstoff und Raumluft (n=7)

3.3.1.3 Propidiumjodid

Der Anteil von Propidiumjodid-positiven Zellen lag zu Beginn der Versuche in den Raumluftproben bei 1.1% und nahm im weiteren Verlauf bis auf 17.56% kontinuierlich zu. Dieser Wert war zwar deutlich höher als der entsprechende Meßwert im Erwachsenenblut, der Unterschied war aber nicht statistisch signifikant. Kein Unterschied bezüglich der Anzahl der avitalen Zellen fand sich im Vergleich der drei Sauerstoffkonzentrationen (Tabelle 2).


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Tabelle 2: Prozentualer Anteil der Propidium-positiven Zellen im Nabelschnurblut zu
den Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h; jeweils Mittelwert und SEM (n=7)

Nabelschnurblut

 

Sauerstoff

Stickstoff

Raumluft

0h

1.43 ± 0.14

1.61 ± 0.35

1.11 ± 0.05

6h

2.1 ± 0.53

2.27 ± 0.43

2.43 ± 0.73

10h

5.83 ± 1.94

4.27 ± 1.79

4.91 ± 1.84

24h

15.61 ± 3.53

19.31 ± 6.13

17.56 ± 4.53

3.3.2 Erwachsenenblut

3.3.2.1 Blutgasparameter

Auch in den Erwachsenenblutproben zeigte sich ein deutlicher Effekt der Äquilibrierung je nach verwendeter Sauerstoffkonzentration. Trotz Verwendung luftdichter Verschlußmaterialien war am Ende der 24stündigen Inkubation kein Unterschied im Sauerstoffpartialdruck mehr nachweisbar (Abbildung 26).

Abbildung 26: Sauerstoffpartialdruck [mmHg] in den Nabelschnurproben vor und nach
Äquilibrierung und nach Inkubation für 24h für die drei Sauerstoffkonzentrationen
0%, 21% und 100% (n=6)


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3.3.2.2 L-Selectin

Erwachsenenblut zeigte signifikant höhere Ausgangswerte der L-Selectin-Expression im Vergleich zum Nabelschnurblut (p<0.001, Mann-Whitney U-Test). Auch im Erwachsenenblut kam es zu einer kontinuierlichen Abnahme der L-Selectin-Expression über die Zeit, hier allerdings war die Äquilibrierung mit Stickstoff (i.e. Hypoxie) der stärkste Stimulus. Nach 24stündiger Inkubation liegen die Nettomedianfluoreszenzen signifikant unterhalb derer der Nabelschnurwerte (p<0.001, Mann-Whitney U-Test, Abbildung 27).

Abbildung 27: Datum Nettomedianfluoreszenz [arbiträre Einheit] der L-Selectin-Expression
in Erwachsenenblutproben zu den Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h für die drei Konditionen
Sauerstoff, Stickstoff und Raumluft (n=6)

3.3.2.3 Propidiumjodid

Von niedrigen Ausgangswerten nahm die Anzahl avitaler Zellen kontinuierlich zu, das Maximum war nach 24h in den Sauerstoff-exponierten Proben erreicht (Tabelle 3). Die verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen unterschieden sich zum gleichen Zeitpunkt nicht bezüglich der Anzahl der Propidiumjodid-positiven Zellen.


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Tabelle 3: Prozentualer Anteil der Propidium-positiven Zellen im Erwachsenenblut zu den
Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h; jeweils Mittelwert und SEM (n=6)

Erwachsenenblut

 

Sauerstoff

Stickstoff

Raumluft

0h

1.85 ± 0.27

1.32 ± 0.14

2.7 ± 0.94

6h

3.12 ± 0.68

3.22 ± 0.63

4.53 ± 1.8

10h

6.45 ± 3.12

3.62 ± 0.83

2.9 ± 0.51

24h

12.03 ± 2.5

8.95 ± 0.97

6.73 ± 1.18


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