Höhn, Thomas: Effekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim Neugeborenen

Kapitel 4. Diskussion

4.1 Bakteriostatischer Effekt von NO

Für zwei der fünf untersuchten Spezies (S. epidermidis und S. agalactiae) liess sich eine signifikante Reduktion der Anzahl von CFU's bei NO-Konzentrationen bis 120ppm nachweisen. Andere Untersucher konnten einen bakteriostatischen Effekt von NO auf S. aureus-Kulturen bereits bei Dosierungen von 1ppm zeigen [Mancinelli 1983]. Diese Wirkung ging bei höheren NO-Konzentrationen (le 1.9ppm) wieder verloren, parallel kam es zu einem Anstieg der NO2-Konzentration. Der Hypothese der Autoren zufolge verhindern höhere NO2-Konzentrationen einen bakteriostatischen Effekt von NO in höheren Konzentrationen. Mancinelli und McKay untersuchten auch den pH-Wert ihres Bakterienmediums und fanden bei NO2-Werten bis 5.5ppm keinerlei Veränderungen des pH. Dies wäre durchaus zu erwarten gewesen, da NO2 und Wasser zu Reaktionsprodukten reagieren, die toxisch für Bakterien sind. Für unsere Untersuchung waren diese Daten insofern von Bedeutung, als unsere maximal gemessene NO2-Konzentration bei exakt diesen 5.5ppm lagen, die bereits von Mancinelli untersucht waren. In unserem experimentellen Design hatten wir darauf geachtet, Höchstwerte für NO2 nicht zu überschreiten. Die Bildung von NO2 ist von der zur Verfügung stehenden Reaktionszeit von NO und


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Sauerstoff abhängig [Weinberger 2001]. Deshalb war es für unsere Untersuchung entscheidend, einerseits dafür zu sorgen mittels eines ausreichenden Gasflusses die NO2-Bildung zu minimieren, andererseits zu verhindern, dass bei hohem Gasfluss die Kulturen austrocknen (für Details siehe Tabelle 1).

NO-Konzentrationen, wie sie in den frühen klinischen Studien beim Neugeborenen verwendet wurden, lagen in einem Bereich von 6 bis 80ppm [Roberts 1997, NINOS 1997]. Der Grund für die Testung von 120ppm NO in unserer Untersuchung war das Ergebnis von Vorversuchen, das signifikante bakteriostatische Effekte im Bereich zwischen 80 und 120ppm erwarten ließ.

Das Wachstum von S. aureus war bei allen drei NO-Konzentrationen (40, 80 und 120ppm) nicht beeinträchtigt. Cunha et al. haben Mausmakrophagen mit formalinbehandelten S. aureus aktiviert und die NOS-Expression und Nitritbildung mit und ohne Zugabe von IFN-gamma gemessen [Cunha 1993a, b]. Dabei zeigte sich eine deutliche Expression von NOS, die durch Zugabe von IFN-gamma noch verstärkt werden konnte. Die endogene Immunabwehr von Körperzellen, die sich einer oxidativen Schädigung mittels hoher iNOS-induzierter Stickstoffmonoxidkonzentrationen bedient, resultiert in NO-Konzentrationen die um den Faktor 103 über denjenigen liegen, die die konstitutiven NOS produzieren [Moncada 1992]. Wir gehen davon aus, dass unsere in-vitro erreichten NO-Konzentrationen nicht hoch genug waren um den in-vivo postulierten Effekt einer massiven oxidativen Schädigung zu erreichen. Möglicherweise existiert auch für S. aureus eine Art von Schutzmechanismus, der den Anstieg des Wachstums in der niedrigen Inokulumgruppe erklärt. Hinweise in der publizierten Literatur fanden sich hierfür allerdings keine.

Von S. epidermidis ist bekannt, dass dieser Erreger vorzugsweise auf der Oberfläche von Fremdkörpern wächst [Rupp 1999]. Diese Bakterienart besitzt eine Schutzschicht aus Glykokalyx, die sowohl die Chemotaxis von Phagozyten, als auch von Phytohämagglutinin, die Proliferation von T-Zellen und den oxidativen Burst verhindert [Ferguson 1992, Eng 1995]. Nach einer Aktivierung von Makrophagen durch die Glykokalyx von S. epidermidis konnte ein Anstieg von TNF-alpha, IL-1alpha und von Prostaglandin E2 gezeigt werden, während erhöhte Nitritkonzentrationen erst nach Zugabe von IFN-gamma nachgewiesen werden konnten [Stout 1994]. Mit hitze-inaktivierten S. epidermidis-Isolaten ließ sich eine


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Basisproduktion von NO in Makrophagen erzielen, die durch die Zugabe von IFN-gamma signifikant gesteigert werden konnte [Goodrum 1994]. Obwohl eine Reihe von Substanzen bekannt sind, die zu einer Hochregulation von iNOS führen [Cunha 1993b, Minc-Golomb 1996, Derrico 1996], so ist doch unklar, zu welchen NO-Konzentrationen die iNOS-induzierte Produktion von Stickstoffmonoxid auf zellulärer Ebene führt. In-vitro fanden wir keinen Effekt bei 40 und 80ppm, dagegen eine signifikante Reduktion des bakteriellen Wachstums von S. epidermidis bei 120ppm. Dieser Effekt ließ sich in beiden Inokula nachweisen und läßt darauf schließen, dass die für S. epidermidis bakteriostatisch wirksame Konzentration von NO zwischen 80 und 120ppm liegt.

S. agalactiae (GBS) ist der am häufigsten isolierte Erreger neonataler Meningitiden, Pneumonien und Septitiden [Bromberger 2000]. Die Aktivierung von Makrophagen mittels hitzeinaktivierter S. agalactiae führte zur Produktion von Nitrat, welches den Abbau von NO nahelegt. Diese Produktion konnte durch den Zusatz von IFN-gamma noch weiter gesteigert werden [Goodrum 1995]. Ein bakteriostatischer Effekt fand sich in unserem in-vitro-Modell bei S. agalactiae nur in der kleineren Inokulumgruppe bei 120ppm NO, auch bei dieser Spezies scheint die zur Reduktion bakteriellen Wachstums wirksame Konzentration zwischen 80 und 120ppm zu liegen.

Die Bakterienwand von E. coli besteht zu einem definierten Teil aus Lipopolysacchariden, die zu den potentesten Aktivatoren von Makrophagen zumindest von Nagetieren zählen [Martin 1995]. Auch bei E coli führt die Zugabe von IFN-gamma zu einer vermehrten Produktion von Stickstoffmonoxid. Bei den niedrigen Konzentrationen von NO (40 und 80ppm) zeigte sich kein Unterschied zwischen NO-Exposition und Raumluftbegasung. In der 120ppm-Population jedoch war das Wachstum in der NO-Gruppe deutlich (aber nicht statistisch signifikant) vermehrt, dies nur im kleineren Inokulum. Möglicherweise ist dieser Effekt Ausdruck eines E. coli-spezifischen antioxidativen Schutzmechanismus auch genannt 'E. coli superoxide stress regulon system' [Nunoshiba 1995, Vasileva 2001]. Dieses System kombiniert antioxidative Mechanismen wie die Superoxiddismutase und ein DNA-Reparaturenzym zur Behebung oxidativer Schädigung und schützt E. coli so vor der Zytotoxizität von NO-produzierenden Makrophagen. Die Produkte dieses 'stress regulon'-Gens sind unter anderen eine


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Mangan-enthaltende Superoxiddismutase, das oxidative DNA-Reparationsenzym Endonuklease IV, Glukose-6-phosphatdehydrogenase, die micF-kodierte antisense RNA [Chou 1993], die Fumarase [Liochev 1992] und die NADPH:Ferredoxinoxidoreduktase [Liochev 1994]. Diese spezifische Protektion vor oxidativer Schädigung könnte für das unveränderte bzw. sogar vermehrte Wachstum von E. coli in unserem Versuchsdesign verantwortlich sein.

Das Wachstum von P. aeruginosa war bei allen NO-Konzentrationen unverändert. Durch Vorbehandlung mit IFN-gamma oder TNF-alpha konnte dosisabhängig in einem Mausmodell sowohl eine vermehrte Aufnahme als auch ein schnelleres Abtöten von P. aeruginosa nachgewiesen werden [Pierangeli 1993]. Für beide Zytokine ist gut belegt, dass sie zu einer vermehrten Expression von iNOS führen und so die intrazelluläre Konzentration von NO erhöhen [Mancinelli 1983]. Bisher existieren keine verläßlichen Angaben zur tatsächlichen Höhe intrazellulärer NO-Konzentrationen. Aufgrund des Wachstumsverhaltens von P. aeruginosa müssen wir jedoch davon ausgehen, dass auch bei 120ppm keine für diese Spezies bakteriostatischen Konzentrationen von NO erreicht wurden.

Aus den vorliegenden Ergebnissen läßt sich ableiten, dass NO einen selektiv bakteriostatischen Effekt auf einige, der am häufigsten aus trachealen Kulturen beatmeter Früh- und Neugeborener, isolierte Erreger besitzt. Dieser Effekt ist dosisabhängig und beginnt in einem Dosierungsbereich (80-120ppm), der heute klinisch nicht mehr zum Einsatz kommt. In den derzeitig verwendeten Dosierungen (le 20ppm bis maximal 40ppm) ist nicht von einem bakteriostatischen Effekt von NO auszugehen. Die Wachstumscharakteristika von Bakterien in-vivo sind möglicherweise weit komplexer und unterscheiden sich durch das Vorliegen Spezies-spezifischer Regulation antioxidativer Schutzmechanismen.

4.2 Sauerstoffinduzierte, zerebrale Schädigung durch iNOS-Hochregulation

Hyperoxie-Exposition führte bei unreifen Ratten im postnatalen Alter von bis zu 7 Tagen zu einer ubiquitären, zerebralen Hochregulation von iNOS. Dieser Effekt war bei den Kontrolltieren nicht nachweisbar. Zu den Gehirnregionen mit der ausgeprägtesten Expression von iNOS gehörten der Hippocampus (CA-1), der


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frontale Kortex (primärer und sekundärer Motorkortex) und der retrospleniale Kortex. In diesen Arealen war die iNOS-Expression auf Mikrogliazellen und perivaskuläre Endothelzellen beschränkt.

Der Nachweis einer konstitutiven NO-Produktion in der CA-1-Region des Hippocampus und im Kortex von adulten Ratten konnte in-vivo mit Hilfe des fluoreszierenden Farbstoffs DAF-2 DA in einem Slicemodell geführt werden [Kojima 1998]. Die zerebrale Synthese von NO durch die induzierbare NOS ist bisher nur für inflammatorische Konditionen gezeigt worden, bei denen es zu einer Ausschüttung von TNF-alpha, IL-1ß bzw. von IFN-gamma kommt [Akama 2000, Wakita 2001]. Die resultierende iNOS-Expression unter inflammatorischen Konditionen wurde sowohl in Astrozyten [Kolker 2001], als auch in aktivierter Mikroglia gezeigt [Heneka 2000].

Die Rolle der iNOS-Expression im Gehirn ist hinsichtlich ihrer Bedeutung als Schutz- oder Schädigungsmechanismus weit von einer Klärung entfernt. So fanden Untersucher in einem Traumamodell der adulten Ratte einen protektiven Effekt endogen produzierten Stickstoffmonoxids, während eine Inhibition von iNOS mittels selektiver Antagonisten oder der Einsatz von iNOS-knock-out-Mäusen (iNOS-/-) zu einer vermehrten histopathologischen Schädigung und einem reduzierten neurologischen Outcome führten [Sinz 1999]. Andere Autoren konnten eine direkte Kaskade von der initialen Hochregulation von iNOS bis zur Caspasen-vermittelten Apoptose der Zielzelle darstellen, wobei das Ausmaß der apoptotischen Veränderungen eine Funktion der beteiligten pro- und antiapoptotischen Metaboliten darstellte [Brüne 1998]. Zusätzlich ist bekannt, dass NO nicht nur proapoptotische Mechanismen in bestimmten Systemen triggern kann [Leist 1997a, Leist 1997b, Bonfoco 1995, Bonfoco 1996], sondern auch Apoptose in Neuronen [Tenneti 1997, Estevez 1998] und in anderen Zellen verhindern kann [Bohlinger 1995, Mannick 1994, Kim 1997]. Dabei sind die Wirkmechanismen von NO in Abhängigkeit vom betroffenen Zelltyp und dem eingeschlagenen Stoffwechselweg des Zelltodes unterschiedlich. In bestimmten Zellen kann Stickstoffmonoxid die Exekution der Apoptose durch Inhibition aktiver Caspasen mittels S-Nitrosylierung verhindern [Tenneti 1997, Kim 1997], in wieder anderen durch Verhinderung der Caspasenaktivierung über eine cGMP-vermittelte Reaktion [Estevez 1998, Kim 1997]. Für die Determinierung der Todesform einer


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Zelle (Apoptose versus Nekrose) scheint nicht nur der akute Triggerreiz eine Rolle zu spielen, sondern auch der aktuelle Energiezustand der Zelle [Nicotera 1999]. Im Falle unseres Tiermodells konnten wir sowohl eine Hochregulation von iNOS als auch eine deutlich über das normale, neonatale Maß hinausgehende Apoptose von Neuronen zeigen. Obwohl damit noch keine Kausalkette etabliert ist, legt es damit den Schluss nahe, dass hohe Konzentrationen von NO (iNOS-vermittelt) eher negative Folgen für unterschiedlichste Zellsysteme haben, während niedrige Stickstoffmonoxidkonzen-trationen (eNOS- oder nNOS-vermittelt) eher protektiv wirken können [Estevez 1998]. Wichtig für die Konzeption zellprotektiver Strategien scheint vor allem zu sein, dass die alleinige Unterbrechung einer Todeskaskade, die für die apoptotische Morphologie verantwortlich ist, nicht unbedingt zu einem Überleben der Zellen führt; häufig wechselt in diesen Fällen lediglich die Natur des Zelltods von der Apoptose zur Nekrose [Leist 1997, Melino 1997, Hirsch 1997, Green 1998].

Im vorliegenden Modell ließ sich die Hypothese, daß als Ausdruck der schädigenden Wirkung großer Mengen freigesetzten Stickstoffmonoxids auch Peroxynitrit entstehen würde, nicht bestätigen. Damit unterscheidet sich unser Modell von dem Inflammationsmodell anderer Untersucher, die bei LPS-Behandlung selbst bei niedrigen iNOS-Konzentrationen bereits die Synthese von Peroxynitrit nachweisen konnten [Javeshghani 2001]. In einem Modell der chronischen Hypoxie führten selbst niedrige, durch endotheliale NOS katalysierte, Mengen von NO zu einem positiven Nachweis von Nitrotyrosin als Marker für Peroxynitrit [Demiryürek 2000]. Wir können aus den vorliegenden Daten nur folgern, daß ausreichende antioxidative Schutzmechanismen vorhanden sein müssen, die eine substantielle Bildung von Peroxynitrit in-vivo verhindern.

4.3 Aktivierungsverhalten von Granulozyten

Die vorliegende Studie zeigt, dass eine Veränderung des Sauerstoffpartialdrucks ausreichend ist, um eine Aktivierung polymorphonukleärer Leukozyten zu erreichen. Das Ausmaß der Aktivierung wurde anhand der Herunterregulation der


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L-Selectin-Expression quantifiziert. Unterschiede ergaben sich im Aktivierungsmuster zwischen Nabelschnurblut-PMN und adulten PMN. Dabei zeigte sich, dass Hypoxie der stärkste Stimulus für die Aktivierung adulter PMN war, während Nabelschnur-PMN am empfindlichsten auf Hyperoxie reagierten. Die Herunterregulation von L-Selectin begann sehr früh nach der Äquilibrierung und war nicht Zelltod-assoziiert. Letzteres ließ sich anhand der Aufnahme von Propidiumjodid zeigen, die erst zu späteren Zeitpunkten zu verzeichnen war. Diese Studie bestätigt die Ergebnisse früherer Untersuchungen, wonach Nabelschnur-PMN reifer Neugeborener eine gegenüber adulten PMN reduzierte L-Selectin-Expression besitzen [Bührer 1994, Anderson 1991, Török 1993, Fortenberry 1994]. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass das Ausmaß des L-Selectin-Shedding beim Neugeborenen-PMN gegenüber dem Erwachsenen-PMN verringert ist. Dies gilt nicht nur für die Reaktion des PMN gegenüber bakteriellen Peptiden und anderen Mediatoren der Inflammation [Rebuck 1995, Koenig 1996], sondern auch für eine Variation des Sauerstoffpartialdrucks. Es wird davon ausgegangen, dass eine niedrige L-Selectin-Expression mit einer Beeinträchtigung der L-Selectin-abhängigen Adhäsion von PMN an immobilisierte Thrombozyten, Leukozyten und an entzündlich verändertes Endothel der Gefäßwand verbunden ist [Anderson 1991, Fortenberry 1994]. Während dies Neugeborene für Infektionen aller Art prädisponieren mag, so legt doch die Konservation der postnatalen L-Selectin-Reduktion einen evolutionstechnischen Vorteil beim Bewältigen der nicht unerheblichen Veränderungen von Temperatur, Gasaustausch und Kreislauf nahe [Anderson 1991, Fortenberry 1994]. Experimentelle Inhibition der L-Selectin-Funktionen durch monoklonale Antikörper oder Selektinchimären führte sowohl zu reduzierter lokaler und entfernter Gewebsschädigung infolge Ischämie und Reperfusion [Seekamp 1994] als auch zu einer Attenuierung Sepsis-induzierter Lungenschädigung [Ridings 1995]. Interessanterweise gleichen die Reaktionsmuster von Nabelschnur-PMN sehr unreifer Frühgeborener wieder denen Erwachsener [Bührer 1994, Smith 1993] und haben demzufolge möglicherweise ein höheres Risiko, aberrante inflammatorische Prozesse aufrecht zu erhalten.

Vor der Geburt sind fetale PMN an niedrige Sauerstoffspannungen adaptiert und sind wahrscheinlich deshalb gegenüber Sauerstoffmangelzuständen unmittelbar nach der Geburt relativ resistent. Dies konnte an Nabelschnur-PMN von


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Neugeborenen gezeigt werden, die perinatal eine Asphyxie durchgemacht hatten [Bührer 1994]. Im Gegensatz hierzu scheint eine Hyperoxie eine inflammatorische Aktivierung von neonatalen PMN zu bewirken. Während bei Frühgeborenen das Risiko einer Retinopathie des Frühgeborenen den allzu sorglosen Umgang mit Sauerstoff restringiert, wird bei reifen Neugeborenen eher großzügig mit Sauerstoff umgegangen. Dies wird durch die Neufassung der Reanimationsrichtlinien für Neugeborene zusätzlich gefördert, da das gerade erschienen Konsensuspapier die Verwendung von 100% Sauerstoff geradezu zwingend vorschreibt [Niermeyer 2000]. Hohe inspiratorische Sauerstoffkonzentrationen können inflammatorische Dysregulationen bei Neugeborenen verstärken. Sowohl bei Kindern, die sich einer extrakorporalen Membranoxygenierung unterziehen mußten als auch bei ehemaligen Frühgeborenen mit chronischer Lungenerkrankung konnte eine vermehrte PMN-Aktivierung anhand einer Zunahme des L-Selectin-Shedding nachgewiesen werden [Fortenberry 1996, Kotecha 1998]. Da PMN frei durch den gesamten Organismus zirkulieren, kann eine PMN-Aktivierung auch andere Organsysteme wie Gehirn oder Darm betreffen [Hirsch 1998, Leviton 1999]. Zusätzlich zum Effekt der PMN-Aktivierung kann Hyperoxie bei Neutrophilen auch eine verstärkte Wasserstoffperoxidproduktion verursachen [Suzuki 1997].

Aus diesen Beobachtungen wird gefolgert, dass hohe Sauerstoffkonzentrationen zu einer Aktivierung von Nabelschnur-PMN führt. Diese Aktivierung könnte auch an entfernten Organsystemen zu schädlichen Veränderungen führen. Im Gegensatz zu Nabelschnur-PMN sind adulte PMN vermehrt durch Hypoxie aktivierbar. Wir spekulieren, dass die Hyperoxie-induzierten unspezifischen Aktivierungsvorgänge von PMN einen restriktiven Umgang mit hohen Sauerstoffkonzentrationen bei Neugeborenen rechtfertigen.


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Thu Dec 5 13:35:52 2002