Höhn, Thomas: Effekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim Neugeborenen


Klinik für Neonatologie, Campus Virchow Klinikum


Effekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim Neugeborenen

Habilitationsschrift
zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach Kinderheilkunde

vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dr. med. Thomas Höhn,
geboren am 3.1.1959 in Göggingen

Präsident: Prof. Dr. rer. nat. J. Mlynek

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. L. Gortner, Giessen
2. Prof. Dr. med. B. Roth, Köln

eingereicht: 28. Januar 2002
Datum der Habilitation: 1. Oktober 2002


Seiten: [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteEffekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim Neugeborenen
Anhang 1 Abkürzungen
1 Einleitung
1.1Historisches/Entdeckung von NO
1.2Pathway der NO-Synthese
1.3NO-Synthetasen
1.4Vorkommen in verschiedenen Zelltypen
1.5Funktion
1.5.1 Signaltransduktion
1.5.2 Vasodilatation
1.5.3 Immunabwehr
1.6Krankheitsbilder mit NO-Dysbalancen
1.7Inhalative NO-Applikation
1.8Indikationen für iNO in der Neonatologie
1.9Hyperoxiewirkung auf das Gehirn
1.10Hyperoxiewirkung auf sonstige Organsysteme
1.11L-Selectin
1.12Interaktion von NO und Sauerstoff
1.13Peroxynitrit
1.14Hypothesen
2 Methoden
2.1NO-Begasung von Bakterienkulturen
2.1.1 Materialgewinnung
2.1.2 NO-Exposition
2.1.3 Auswertung und Statistik
2.2Hyperoxieexposition im Tiermodell
2.2.1Tierhaltung
2.2.2Hyperoxieexposition
2.2.3Perfusion und Aufarbeitung der Gehirne
2.2.4Lichtmikroskopie
2.2.5Immunhistochemie
2.2.6RT-PCR
2.3In-vitro Gasäquilibrierungsmodell
2.3.1 Probengewinnung
2.3.2 Gasäquilibrierung von Vollblutproben
2.3.3 Flowzytometrie (L-Selectin, Propidiumjodid)
2.3.4Statistik
3 Ergebnisse
3.1Tracheale Isolate und NO-Begasung
3.1.1NO-Exposition von S. agalactiae (GBS)
3.1.2NO-Exposition von S. aureus
3.1.3NO-Exposition von S. epidermidis
3.1.4NO-Exposition von E. coli
3.1.5NO-Exposition von P. aeruginosa
3.2Hyperoxiewirkung auf das Gehirn der unreifen Ratte
3.2.1 Lichtmikroskopische Morphologie
3.2.2 Immunhistochemische Färbungen
3.2.2.1 iNOS
3.2.2.2 Nitrotyrosin
3.2.3 iNOS-Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion
3.3Sauerstoffkonzentration und Aktivierungsverhalten von Granulozyten
3.3.1 Nabelschnurblut
3.3.1.1 Blutgasparameter
3.3.1.2 L-Selectin
3.3.1.3 Propidiumjodid
3.3.2 Erwachsenenblut
3.3.2.1 Blutgasparameter
3.3.2.2 L-Selectin
3.3.2.3 Propidiumjodid
4 Diskussion
4.1Bakteriostatischer Effekt von NO
4.2Sauerstoffinduzierte, zerebrale Schädigung durch iNOS-Hochregulation
4.3Aktivierungsverhalten von Granulozyten
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literatur
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Flow von Raumluft und NO (600ppm in N2) und die gemessenen Konzentrationen von NO und NO2
Tabelle 2: Prozentualer Anteil der Propidium-positiven Zellen im Nabelschnurblut zu
den Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h; jeweils Mittelwert und SEM (n=7)
Tabelle 3: Prozentualer Anteil der Propidium-positiven Zellen im Erwachsenenblut zu den
Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h; jeweils Mittelwert und SEM (n=6)

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Synthese von NO in der Endothelzelle und Wirkmechanismus in der glatten
Muskelzelle modifiziert nach: S. Moncada, Biochem Pharmacol 1989)
Abbildung 2: Bildung reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffverbindungen (nach: Forman
& Torres, Mol Aspects Med 2001)
Abbildung 3: NO-Synthese und Diffusion zur glatten Muskelzelle (Durchgezogener
Pfeil: fördernder Effekt; gestrichelter Pfeil: hemmender Effekt; modifiziert nach:
Moncada & Higgs, NEMJ 1993)
Abbildung 4: Reaktionswege von Peroxynitrat mit Kohlendioxid (modifiziert nach: Zhang,
Nitric Oxide 1997)
Abbildung 5: Frontalschnitt des Rattengehirns auf Höhe des motorischen Kortex
(primärer motorischer Kortex [MOP], sekundärer motorischer Kortex [MOS]; aus: Brain
maps: structure of the rat brain, Swanson LW, Elsevier)
Abbildung 6: Frontalschnitt des Rattengehirns auf Höhe des Hippocampus
(Retrosplenialer Kortex [RSC], CA1 und CA3-Regionen des Hippocampus [HIP], Thalamus
[THA], medialer septaler Nucleus [MSN]; aus: Brain maps: structure of the rat brain,
Swanson LW, Elsevier)
Abbildung 7: Äquilibrierungsgerät für die Konditionen Hypoxie, Normoxie und Hyperoxie
(Fa. Witt, Gasetechnik GmbH, Witten)
Abbildung 8: Repräsentative Histogramme der durchflusszytometrischen
Fluoreszenzintensität aufgetragen gegen die Zellzahl von PMN-Zellen aus Nabelschnurblut
und Erwachsenenblut nach 100%, 21% oder 0% Sauerstoffexposition und Inkubation für 6h
(monoclonaler anti-humaner L-Selectinantikörper Leu-8; graue Fläche repräsentiert
Kontrollen, schwarze Kurve zeigt die Fluoreszenzintensität des FITC-markierten Leu-8 als
Marker der L-Selectin-Expression und deren Variation infolge Exposition gegenüber
verschiedenen O2-Konzentrationen).
Abbildung 9 : Wachstum von S. agalactiae (GBS) bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20)
Abbildung 10: Wachstum von S. aureus bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20)
Abbildung 11: Wachstum von S. epidermidis bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20)
Abbildung 12: Wachstum von E. coli bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20)
Abbildung 13: Wachstum von P. aeruginosa bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich
verschiedener Inokula (10µl und 100µl;n=20)
Abbildung 15: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im primären
motorischen Kortex (MOP) von 7 Tage alten Ratten im Vergleich von Kontrollen (oben,
Vergrößerung 200x) und Hyperoxie-exponierten Tieren (unten, Vergrößerung 400x). Weiße
Pfeile zeigen perivaskulär gelegenen Endothelzellen, schwarze Pfeile Mikrogliazellen
Abbildung 16: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im Hippocampus
(CA1-Region) von 7 Tage alten Ratten im Vergleich von Kontrollen (oben, Vergrößerung
400x) und Hyperoxie-exponierten Tieren (unten, Vergrößerung 400x). Neben den
perivaskulär gelegenen Endothelzellen (weiße Pfeile) färben sich vor allem Mikrogliazellen
(schwarze Pfeile) an
Abbildung 17: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im sekundären
motorischen Kortex (MOS) von 3 Tage alten Ratten (Pfeile zeigen spezifische Färbung von
Mikroglia; Vergrößerung 400x)
Abbildung 18: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im retrosplenialen
Kortex (RSC) von 3 Tage alten Ratten (die Pfeile zeigen auf iNOS-positive Mikroglia;
Vergrößerung 400x)
Abbildung 19: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im Thalamus (THA)
von 3 Tage alten Ratten (Pfeile zeigen spezifische Färbung von Mikroglia; Vergrößerung
400x)
Abbildung 20: Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im medialen septalen
Nucleus (MSN) der 7 Tage alten Ratte (die Pfeile zeigen auf iNOS-positive Mikroglia;
Vergrößerung 400x)
Abbildung 21: Immunhistochemische Färbung mit Nitrotyrosin-Antikörper in der CA3-
Region des Hippocampus nach Hyperoxieexposition der 7 Tage alten Ratte (Vergrößerung
200x). Spezifische Anfärbung für Nitrotyrosin zeigt sich nur in nicht-residenten
Makrophagen, nicht aber in Neuronen, Mikrogliazellen oder perivaskulären Endothelzellen.
Abbildung 22: iNOS-mRNA im Vergleich der Konditionen 24h Sauerstoff, Raumluft und
12h Sauerstoffexposition (oberer Abschnitt) und Expression des internen Standardgens ß-
Actin (unterer Abschnitt)
Abbildung 23: iNOS-mRNA im Vergleich der Konditionen 24h Sauerstoff, Raumluft und
12h Sauerstoffexposition (arbiträre Einheiten bei der Auswertung der optischen Dichte der
PCR-Banden)
Abbildung 24: Sauerstoffpartialdruck [mmHg] in den Nabelschnurproben vor und
nach Äquilibrierung und nach Inkubation für 24h für die drei Sauerstoffkonzentrationen
0%, 21% und 100% (n=7)
Abbildung 26: Sauerstoffpartialdruck [mmHg] in den Nabelschnurproben vor und nach
Äquilibrierung und nach Inkubation für 24h für die drei Sauerstoffkonzentrationen
0%, 21% und 100% (n=6)
Abbildung 27: Datum Nettomedianfluoreszenz [arbiträre Einheit] der L-Selectin-Expression
in Erwachsenenblutproben zu den Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h für die drei Konditionen
Sauerstoff, Stickstoff und Raumluft (n=6)

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Thu Dec 5 13:35:52 2002