| Höhn, Thomas: Effekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim Neugeborenen |
Habilitationsschrift
zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach Kinderheilkunde
vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Präsident: Prof. Dr. rer. nat. J. Mlynek
Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. L. Gortner, Giessen
2. Prof. Dr. med. B. Roth, Köln
eingereicht: 28. Januar 2002
Datum der Habilitation: 1. Oktober 2002
| Seiten: | [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] |
Inhaltsverzeichnis | |
| Titelseite | Effekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim Neugeborenen |
| Anhang 1 | Abkürzungen |
| 1 | Einleitung |
| 1.1 | Historisches/Entdeckung von NO |
| 1.2 | Pathway der NO-Synthese |
| 1.3 | NO-Synthetasen |
| 1.4 | Vorkommen in verschiedenen Zelltypen |
| 1.5 | Funktion |
| 1.5.1 | Signaltransduktion |
| 1.5.2 | Vasodilatation |
| 1.5.3 | Immunabwehr |
| 1.6 | Krankheitsbilder mit NO-Dysbalancen |
| 1.7 | Inhalative NO-Applikation |
| 1.8 | Indikationen für iNO in der Neonatologie |
| 1.9 | Hyperoxiewirkung auf das Gehirn |
| 1.10 | Hyperoxiewirkung auf sonstige Organsysteme |
| 1.11 | L-Selectin |
| 1.12 | Interaktion von NO und Sauerstoff |
| 1.13 | Peroxynitrit |
| 1.14 | Hypothesen |
| 2 | Methoden |
| 2.1 | NO-Begasung von Bakterienkulturen |
| 2.1.1 | Materialgewinnung |
| 2.1.2 | NO-Exposition |
| 2.1.3 | Auswertung und Statistik |
| 2.2 | Hyperoxieexposition im Tiermodell |
| 2.2.1 | Tierhaltung |
| 2.2.2 | Hyperoxieexposition |
| 2.2.3 | Perfusion und Aufarbeitung der Gehirne |
| 2.2.4 | Lichtmikroskopie |
| 2.2.5 | Immunhistochemie |
| 2.2.6 | RT-PCR |
| 2.3 | In-vitro Gasäquilibrierungsmodell |
| 2.3.1 | Probengewinnung |
| 2.3.2 | Gasäquilibrierung von Vollblutproben |
| 2.3.3 | Flowzytometrie (L-Selectin, Propidiumjodid) |
| 2.3.4 | Statistik |
| 3 | Ergebnisse |
| 3.1 | Tracheale Isolate und NO-Begasung |
| 3.1.1 | NO-Exposition von S. agalactiae (GBS) |
| 3.1.2 | NO-Exposition von S. aureus |
| 3.1.3 | NO-Exposition von S. epidermidis |
| 3.1.4 | NO-Exposition von E. coli |
| 3.1.5 | NO-Exposition von P. aeruginosa |
| 3.2 | Hyperoxiewirkung auf das Gehirn der unreifen Ratte |
| 3.2.1 | Lichtmikroskopische Morphologie |
| 3.2.2 | Immunhistochemische Färbungen |
| 3.2.2.1 | iNOS |
| 3.2.2.2 | Nitrotyrosin |
| 3.2.3 | iNOS-Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion |
| 3.3 | Sauerstoffkonzentration und Aktivierungsverhalten von Granulozyten |
| 3.3.1 | Nabelschnurblut |
| 3.3.1.1 | Blutgasparameter |
| 3.3.1.2 | L-Selectin |
| 3.3.1.3 | Propidiumjodid |
| 3.3.2 | Erwachsenenblut |
| 3.3.2.1 | Blutgasparameter |
| 3.3.2.2 | L-Selectin |
| 3.3.2.3 | Propidiumjodid |
| 4 | Diskussion |
| 4.1 | Bakteriostatischer Effekt von NO |
| 4.2 | Sauerstoffinduzierte, zerebrale Schädigung durch iNOS-Hochregulation |
| 4.3 | Aktivierungsverhalten von Granulozyten |
| 5 | Zusammenfassung |
| Bibliographie | Literatur |
| Danksagung | |
| Lebenslauf | |
| Selbständigkeitserklärung | |
Tabellenverzeichnis | |
| Tabelle 1: | Flow von Raumluft und NO (600ppm in N2) und die gemessenen Konzentrationen von NO und NO2 |
| Tabelle 2: | Prozentualer Anteil der Propidium-positiven Zellen im Nabelschnurblut zu den Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h; jeweils Mittelwert und SEM (n=7) |
| Tabelle 3: | Prozentualer Anteil der Propidium-positiven Zellen im Erwachsenenblut zu den Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h; jeweils Mittelwert und SEM (n=6) |
Abbildungsverzeichnis | |
| Abbildung 1: | Synthese von NO in der Endothelzelle und Wirkmechanismus in der glatten Muskelzelle modifiziert nach: S. Moncada, Biochem Pharmacol 1989) |
| Abbildung 2: | Bildung reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffverbindungen (nach: Forman & Torres, Mol Aspects Med 2001) |
| Abbildung 3: | NO-Synthese und Diffusion zur glatten Muskelzelle (Durchgezogener Pfeil: fördernder Effekt; gestrichelter Pfeil: hemmender Effekt; modifiziert nach: Moncada & Higgs, NEMJ 1993) |
| Abbildung 4: | Reaktionswege von Peroxynitrat mit Kohlendioxid (modifiziert nach: Zhang, Nitric Oxide 1997) |
| Abbildung 5: | Frontalschnitt des Rattengehirns auf Höhe des motorischen Kortex (primärer motorischer Kortex [MOP], sekundärer motorischer Kortex [MOS]; aus: Brain maps: structure of the rat brain, Swanson LW, Elsevier) |
| Abbildung 6: | Frontalschnitt des Rattengehirns auf Höhe des Hippocampus (Retrosplenialer Kortex [RSC], CA1 und CA3-Regionen des Hippocampus [HIP], Thalamus [THA], medialer septaler Nucleus [MSN]; aus: Brain maps: structure of the rat brain, Swanson LW, Elsevier) |
| Abbildung 7: | Äquilibrierungsgerät für die Konditionen Hypoxie, Normoxie und Hyperoxie (Fa. Witt, Gasetechnik GmbH, Witten) |
| Abbildung 8: | Repräsentative Histogramme der durchflusszytometrischen Fluoreszenzintensität aufgetragen gegen die Zellzahl von PMN-Zellen aus Nabelschnurblut und Erwachsenenblut nach 100%, 21% oder 0% Sauerstoffexposition und Inkubation für 6h (monoclonaler anti-humaner L-Selectinantikörper Leu-8; graue Fläche repräsentiert Kontrollen, schwarze Kurve zeigt die Fluoreszenzintensität des FITC-markierten Leu-8 als Marker der L-Selectin-Expression und deren Variation infolge Exposition gegenüber verschiedenen O2-Konzentrationen). |
| Abbildung 9 : | Wachstum von S. agalactiae (GBS) bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20) |
| Abbildung 10: | Wachstum von S. aureus bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20) |
| Abbildung 11: | Wachstum von S. epidermidis bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20) |
| Abbildung 12: | Wachstum von E. coli bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich verschiedener Inokula (10µl und 100µl; n=20) |
| Abbildung 13: | Wachstum von P. aeruginosa bei 40, 80 und 120ppm NO im Vergleich verschiedener Inokula (10µl und 100µl;n=20) |
| Abbildung 15: | Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im primären motorischen Kortex (MOP) von 7 Tage alten Ratten im Vergleich von Kontrollen (oben, Vergrößerung 200x) und Hyperoxie-exponierten Tieren (unten, Vergrößerung 400x). Weiße Pfeile zeigen perivaskulär gelegenen Endothelzellen, schwarze Pfeile Mikrogliazellen |
| Abbildung 16: | Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im Hippocampus (CA1-Region) von 7 Tage alten Ratten im Vergleich von Kontrollen (oben, Vergrößerung 400x) und Hyperoxie-exponierten Tieren (unten, Vergrößerung 400x). Neben den perivaskulär gelegenen Endothelzellen (weiße Pfeile) färben sich vor allem Mikrogliazellen (schwarze Pfeile) an |
| Abbildung 17: | Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im sekundären motorischen Kortex (MOS) von 3 Tage alten Ratten (Pfeile zeigen spezifische Färbung von Mikroglia; Vergrößerung 400x) |
| Abbildung 18: | Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im retrosplenialen Kortex (RSC) von 3 Tage alten Ratten (die Pfeile zeigen auf iNOS-positive Mikroglia; Vergrößerung 400x) |
| Abbildung 19: | Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im Thalamus (THA) von 3 Tage alten Ratten (Pfeile zeigen spezifische Färbung von Mikroglia; Vergrößerung 400x) |
| Abbildung 20: | Immunhistochemische Färbung mit iNOS-Antikörper im medialen septalen Nucleus (MSN) der 7 Tage alten Ratte (die Pfeile zeigen auf iNOS-positive Mikroglia; Vergrößerung 400x) |
| Abbildung 21: | Immunhistochemische Färbung mit Nitrotyrosin-Antikörper in der CA3- Region des Hippocampus nach Hyperoxieexposition der 7 Tage alten Ratte (Vergrößerung 200x). Spezifische Anfärbung für Nitrotyrosin zeigt sich nur in nicht-residenten Makrophagen, nicht aber in Neuronen, Mikrogliazellen oder perivaskulären Endothelzellen. |
| Abbildung 22: | iNOS-mRNA im Vergleich der Konditionen 24h Sauerstoff, Raumluft und 12h Sauerstoffexposition (oberer Abschnitt) und Expression des internen Standardgens ß- Actin (unterer Abschnitt) |
| Abbildung 23: | iNOS-mRNA im Vergleich der Konditionen 24h Sauerstoff, Raumluft und 12h Sauerstoffexposition (arbiträre Einheiten bei der Auswertung der optischen Dichte der PCR-Banden) |
| Abbildung 24: | Sauerstoffpartialdruck [mmHg] in den Nabelschnurproben vor und nach Äquilibrierung und nach Inkubation für 24h für die drei Sauerstoffkonzentrationen 0%, 21% und 100% (n=7) |
| Abbildung 26: | Sauerstoffpartialdruck [mmHg] in den Nabelschnurproben vor und nach Äquilibrierung und nach Inkubation für 24h für die drei Sauerstoffkonzentrationen 0%, 21% und 100% (n=6) |
| Abbildung 27: | Datum Nettomedianfluoreszenz [arbiträre Einheit] der L-Selectin-Expression in Erwachsenenblutproben zu den Zeitpunkten 0h, 6h, 10h und 24h für die drei Konditionen Sauerstoff, Stickstoff und Raumluft (n=6) |
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HTML - Version erstellt am: Thu Dec 5 13:35:52 2002 |