2  Membranzytoskelett

In den letzten zwei Jahrzehnten hat es sich gezeigt, daß die Verankerung integraler Membranproteine an Komponenten des Zytoskeletts für die Etablierung und Auf­rechterhaltung zellulärer Polarität von entscheidender Bedeutung ist. Die spezifi­sche Interaktion mit dem direkt unter der Membran gelegenen Zytoskelett schränkt die freie laterale Beweglichkeit einzelner Proteine ein und verlängert wahr­schein­lich auch deren Verweildauer in der Membran (Shahbakhti und Gratzer, 1986; Jacobson et al., 1987; Hammerton et al., 1991).

Das Membranzytoskelett der Erythrozyten stellt heutzutage das am intensivsten un­tersuchte und am besten verstandene zytoskelettale System dar und wird deshalb auch als Modell für das Verständnis des zytoskelettalen Aufbaus in nicht-erythro­zytären Zellen herangezogen.

In Erythrozyten wird das Membranzytoskelett aus Spectrin und Actin aufgebaut, dabei bilden α,β-Spectrintetramere zusammen mit kurzen Actinfilamenten und wei­teren akzessorischen Proteinen ein zweidimensionales Netzwerk, das mit itegralen Membranproteinen der Lipiddoppelschicht verknüpft ist. Das submembranäre Zytoskelett verleiht den Erythrozyten offensichtlich über einen längeren Zeitraum hinweg (beim Menschen etwa 120 Tage) ihre ungewöhnlichen biophysikalischen Eigenschaften. Diese sind durch hohe Flexibilität und Elastizität bei gleichzeitiger ausgeprägter Rigidität gekennzeichnet. So ausgestattet können die Erythrozyten den hohen Scherbelastungen, die während der Zirkulation im Gefäßsystem auftre­ten, widerstehen.

	Abb. 2 a Das Membranzytoskelett der Erythrozyten in stark vereinfachter Form schematisch darge­stellt. In den Knotenpunkten sind Spectrintetramere, die die Hauptkompo Aufbau ent­spricht hier in vielen Merkmalen dem des erythrozytären Membranzytoskeletts. Die Verknüpfung des zytoske­let­talen Netzwerkes mit der Plasmamembran erfolgt auch i nente des zytoskeletta­len Netzwerkes darstellen, mit kurzen Actinfilamenten und weiteren zytoskelettalen Protei­nen ver­knüpft (genauere Beschreibung siehe im Text). Über die Membranproteine Glycophorin C und AE1 wird das submembranäre Netzwerk in der Plasmamembran der Erythrozyten verankert. Vermittelt wird diese Verknüpfung über die Adaptorproteine Protein4.1 (P4.1) und Ankyrin. b  Dargestellt ist eine ausdifferenzierte Epithelzelle. Das Membranzytoskelett ist exemplarisch für die laterale und basale Membrandomäne eingezeichnet. Der zytoskelettale n den Epithelzellen über Adaptorpro­teine. Dargestellt ist die Bindung von Ankyrin an die Na+,K+-ATPase und an RenAE1 (RenAE1 kommt in den Schaltzellen der Niere vor (siehe S. 25).

Inzwischen wurden auch in zahlreichen nicht-erythrozytären Zellen Isoformen der erythrozytären Zytoskelettproteine identifiziert. Es stellte sich heraus, daß in Epithel­zellen das Membranzytoskelett insbesondere der lateralen Domäne der Plasma­membran viele Eigenschaften des erythrozytären Membranzytoskeletts besitzt.

Im Folgenden werden diejenigen Proteine des erythrozytären Membranzytoske­letts genauer beschrieben, die für das Verständnis des zytoskelettalen Systems von genereller Bedeutung sind.

Der Name Spectrin kommt vom lateinischen spectrum, Erscheinung und beschreibt die schattenhafte Erscheinung der lysierten hämoglobinfreien Erythrozyten („Gei­ster“), deren Hauptprotein Spectrin ist. Außer dem erythrozytären Spectrin sind in den letzten Jahren verschiedene andere Spectrinisoformen identifiziert worden (Ta­belle 1 S. 13). Die in der Tabelle eingeführte Namengebung für die Spectrine ent­spricht der neuen einheitlichen Nomenklatur (Morrow, 1999).

Im Erythrozyten kommt Spectrin in zwei Untereinheiten von 280 kDa und 246 kDa vor. Es handelt sich um elongierte, flexible Moleküle, die in antiparalleler Anord­nung Heterodimere bilden, die sich zu den in Erythrozyten hauptsächlich vorkom­menden Tetrameren zusammenlagern.

Die αIΣ1,βIΣ1-Spectrintetramere bilden durch Verknüpfung mit weiteren zytoske­lettalen Proteinen, unter anderen Actin und Adducin, ein unmittelbar unterhalb der Plasmamembran befindliches zweidimensionales Netzwerk. Es besteht aus pen­tago­nalen und hexagonalen Strukturen, die über Ankyrin und Protein4.1 mit der zytoplasmatischen Domäne des Anionenaustauschers 1 (AE1) verbunden sind. Zusätzlich wird das zytoskelettale Netztwerk über die Bindung von Protein4.1 an die zytoplasmatische Domäne des integralen Membranproteins Glycophorin C mit der Zellmembran der Erythrozyten verankert.

Für die Proteininteraktionen, die Spectrin im Erythrozyten und in anderen Zellen eingeht, spielen zum einen der C- und N-terminale Molekülbereich und zum ande­ren repetitive Domänen eine wichtige Rolle. Die homologen, repetitiven Struktur­motive bestehen aus 106 Aminosäuren, die in einer dreifachen α-helikalen Anord­nung vorliegen. Die homologen Einheiten werden durch nicht homologe Abschnitte unterteilt. Die einzelnen repetitiven Einheiten variieren untereinander in ihrer Pep­tidsequenz (Sequenzidentität von einer zur nächsten Motivwiederholung beträgt 10 - 30%) und bilden so für sich allein oder auch in Kombination mitein­ander Bin­dungsstellen für verschiedene Proteine (Hartwig, 1994; Li und Bennett, 1996). Spectrin-Repeats kommen auch auf weiteren mit Spectrin verwandten zytoskelet­talen Proteinen wie α-Actinin, Dystrophin und Utrophin vor (Hartwig, 1994).

Neben den Bindungsstellen für die verschiedenen zytoskelettalen Proteine, deren Interaktion mit Spectrin im weiteren noch genauer beschrieben wird, besitzt αIΣ1-Spectrin zwischen dem 11. und 12. Repeat Bindungsstellen für die Ca2+-binden­den Proteine Calmodulin und Calpain (Seubert et al., 1987; Harris und Morrow, 1990). Zusätzlich verfügt αIΣ1-Spectrin im C-terminalen Proteinabschnitt über zwei Ca2+-bindende, als „EF-hand“ bezeichnete „helix-loop-helix“-Motive und verfügt da­mit selbst über die Möglichkeit, Ca2+-Ionen zu binden (Strynadka und James, 1989; [Seite 14↓]Lundberg et al., 1997). Veränderungen in der Ca2+-Konzentration könnten so direkt, nämlich durch Bindung von Ca2+ an Spectrin Konformationsänderungen bewirken.

Die damit im Zusammenhang stehenden möglichen Veränderungen von Bin

dungsaffinitäten zu anderen zytoskelettalen Proteinen könnte die Stabilität des Netzwerkes beeinflussen (Seubert et al., 1987; Harris und Morrow, 1990; Lundberg et al., 1997).

Tabelle 1 Spectrin

Im Erythrozten gehört Actin mit 400.000 bis 500.000 Molekülen pro Zelle zu den Hauptproteinen des Membranzytoskeletts. Darüber hinaus gehört Actin zu den häu­figsten Proteinen von Eukaryonten. Es ist neben Myosin Hauptbestandteil des kon­traktilen Apparats der Muskulatur. Nahezu alle Zellen besitzen ein Actinfilamentsy­stem. Actinfilamente (F-Actin) entstehen durch Polimerisation von Actinmonomeren (G-Actin). Unterhalb der Zellmembran bilden die 7nm dicken α-helikal gewundenen Actinfilamente Netzwerke aus. Parallel angeordnete Bündel von gleichsinniger Ori­entierung bilden das Grundgerüst der Mikrovilli des Bürstensaums (Drenckhahn und Dermietzel, 1988). In periodischer Anordnung mit Myosinfilamenten bilden Atin­[Seite 15↓]filamente in der Skelett- und Herzmuskulatur die kontraktilen Myofibrillen und in vie­len nichtmuskulären Zellen kontraktile Streßfasern. Streßfa­sern sind besonders in Endothelzellen entwickelt, die hohen hydrodynami­schen Belastungen ausgesetzt sind. Streßfasern, wie alle Organisationsformen von Actinfilamenten, sind dynami­sche Strukturen, welche minutenschnell durch Depolymerisation verschwinden können, um sich an anderer Stelle wieder neu zu bilden (Drenckhahn, 1988).

Anders als die meisten Zellen enthalten Erythrozyten fast ausschließlich β-Actin. Ob aus dem Vorhandensein nur einer Actinisoform auf eine spezielle Funktion von Actin im Erythrozyten geschlossen werden kann, konnte noch nicht nachgewiesen werden. Für verschiedene Epithelzellen, wie Parietalzellen (siehe S. 38), ist be­kannt, daß Actinisoformen in polarer Verteilung vorhanden sind und sich durch spe­zifische Interaktion mit anderen Proteinen an der Ausbildung und Aufrechter­haltung zellulärer Subdomänen und Oberflächenstrukturen beteiligen (Publikation 3; Yao et al., 1996).

Im Erythrozyten ist Actin auf sehr kurze Filamente beschränkt, die zusammen mit Protein4.1, Adducin und und weiteren Proteinen die Knotenpunkte innerhalb des Spectrinnetzwerkes bilden. Fast sämtliche Actinmoleküle sind so mit dem Spectrin­filamentsystem verbunden und bilden damit eine Hauptkomponente des erythro­zytären zytoskelettalen Netzwerkes. Freies Actin liegt knapp unterhalb der kritischen Konzentration für die Polymerisa­tion zu Actinfilamenten vor (Pinder und Gratzer, 1983). Isoliertes erythrozytäres Actin polimerisiert bei Konzentrationen >0,2μM (~8μg/ml) ebenso wie Actin von anderen Zellen in vitro zu langen Filamen­ten aus und aktiviert die Myosin-ATPase (Tilney und Detmers, 1975; Sheetz et al., 1976). In Erythrozyten liegt Actin in Gestalt von 33-37nm langen Filamenten vor, die 12-14 G-Actinmonomere enthalten (Lin und Lin, 1978; Brenner und Korn, 1980; Bennett, 1990). Drei Actin-bindende Proteine kontrollieren die Filamentlänge: Das ~35nm lange Tropomyosin stabilisiert die Filamente und dient als Schablone, die die Länge festlegt. An den beiden Enden der Filamente sitzen zwei unterschiedli­che Kappenproteine; am Polymerisationsende (Plusende) Adducin, ein Protein, das auch als Verknüpfungsmolekül zwischen Spectrin und Actin dient; am Minusende Tropomodulin, welches die Depolymerisation der Actinfilamente verhindert (Fowler, 1996).

Die Adducinfamilie besteht aus α-, β- und γ-Adducin, für die drei eng miteinander verwandte Gene kodieren. (Gardner und Bennett, 1986; Joshi et al., 1991 Dong et al., 1995). In reifen Erythrozyten kommen α, β-Adducin-Oligomere vor, die an den Spectrin-Actin-Bindungsstellen lokalisiert sind. Während der Erythropoese tritt Ad­ducin bereits im Normoblasten-Stadium und damit relativ früh in der Entwicklung auf (Nehls et al., 1991). Adducin bindet, wie im vorangegangenen Kapitel erwähnt, an die schnell wachsenden Enden der Actinfilamente und hat die Funktion eines Actin-bündelnden Kappenproteins. Es verknüpft zwei αIΣ1,βIΣ1-Spectrintetramere mit den kurzen Actinfilamenten (siehe S. 12) und ist so an der Entstehung des Membranzytoskeletts entscheidend beteiligt (Matsuoka et al., 1996; Li et al., 1998).

Adducin bindet auch an das erythrozytäre integrale Membranprotein Stomatin und dient dadurch neben Protein4.1 und Ankyrin (siehe S. 17 und S. 19) als Adaptor­protein zwischen dem zytoskelettalen Netzwerk und der Plasmamembran. Stomatin besitzt wahrscheinlich eine inhibitorischen Wirkung auf Ionenkanäle. Bei der auto­somal dominant vererbten hämolytischen Anämie Stomatozytose ist Stomatin in den Erythrozyten nicht nachweisbar. Die Membranen der betroffenen Erythrozyten weisen eine abnormal gesteigerte Permeabilität für Na+-Ionen auf und können so eine osmotische Hämolyse begünstigen (Delaunay et al., 1999; Innes et al., 1999).

In der Niere scheint Adducin neben Ankyrin (siehe S. 28) für die Verknüpfung der Na+,K+-ATPase mit dem kortikalen Spectrin-Actin-Membranzytoskeletts von Bedeu­tung zu sein und bindet möglicherweise direkt an die α-Untereinheit der ATPase (Manunta et al., 1998). In hypertensiven Milan-Ratten wurde ein Polimor­phismus von α-Adducin festgestellt, der in direktem Zusammenhang mit der für diese Tiere typischen Blut­druckerhöhung zu stehen scheint. Diese Beobachtung deutet auf eine regulatori­sche Funktion von Adducin für die Na+,K+-ATPase in den Nierenzelle hin (Manunta et al., 1998; Manunta et al., 1999).

Für die Steuerung der verschiedenen Adducinfunktionen spielen sowohl die in­trazelluläre Ca2+-Konzentration als auch der Phosphorylierungsgrad eine wichtige Rolle, wobei das Wechselspiel zwischen den beiden Regulationsmechanismen noch nicht ganz verstanden ist. Von den Adducinen besitzt β-Adducin die höchste Affinität zu Ca2+/Calmodulin. Durch die Ca2+/Calmodulin-Bindung verliert β-Adducin seine Funktion als Actin-Kappenprotein, und die zwischen Spectrin, F-Actin und Ad­ducin gebildeten Verknüpfungsknoten werden gelöst. Adducin ist sowohl Substrat der Protein-Kinase C (PKC) als auch der Protein-Kinase A (PKA). Phosphorylierung durch beide Kinasen führt zur Inhibition der Calmodulin-Bindung (Matsuoka et al., 1996).

Erythrozytäres Protein4.1 ist der erste Vertreter einer wachsenden Proteinsuperfa­milie, die bisher in fünf Untergruppen aufgeteilt werden kann: die Protein4.1-Fami­lie, Talin, die PTPH1-Familie (Protein-Tyrosin-Phosphatasen), die ERM-Familie (Ez­rin, Radixin, Moesin, Merlin) (genauere Besprechung von Ezrin siehe S. 21) und die NBL4-Familie (novel band4.1-like protein).

Schon vor mehr als 10 Jahren sind zahlreiche immunologisch mit Protein4.1 verwandte Proteine beschrieben worden, deren Molekulargewichte von 30.000 - 210.000 reichen und die in verschiedenen, auch nicht-erythrozytären Geweben ex­primiert werden (Granger und Lazarides, 1984; Granger und Lazarides, 1985; Anderson et al., 1988). Ursprünglich aber wurde Protein4.1 als Bestandteil des Membranzytoskeletts der Erythro­zyten identifiziert. Mit 200.000 Kopien pro Zelle ist Protein4.1 eines der Hauptproteine der Erythrozyten. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung von lysierten hämoglobinfreien Erythrozyten zeigen sich zwei Protein­banden mit einem apparenten Molekulargewicht von 78- bzw. 80kDa. Der Unterschied im Molekulargewicht beruht nicht auf einer unterschiedlichen Länge der Aminosäuresequenz, sondern auf einer posttranslationalen Modifikation im C-terminalen Proteinabschnitt (Bennett, 1990). Für das Verhältnis zwischen der 78- und der 80kDa-Form ist das Alter der Erythrozyten von Bedeutung (Nelson und Veshnock, 1987).

Die ungewöhnliche Heterogenität der zahlreichen Protein4.1-Isoformen wird durch komplexes alternatives Spleißen der prä-mRNA sowie durch posttranslatio­nale Modifikation des Protein4.1-Moleküls erreicht (Discher et al., 1993; Horne et al., 1993; Huang et al., 1993; Baklouti et al., 1997).

Im Erythrozyten werden Protein4.1 zumindest zwei Funktionen zugeschrieben:

1. die Bindung an Glycophorin C und an AE1 und dadurch die Verknüpfung des Membranzytoskeletts mit der Plasmamembran (siehe Abb. 2a S. 10)
2. die Verstärkung der Bindung zwischen Spectrin und Actin.
   Für die Stabilität des Membranzytoskeletts spielt Ca2+/Calmodulin eine wichtige regulatorische Rolle (siehe S. 12 und S. 16). Die Bindungsstelle von Calmodulin auf Protein4.1 befindet sich auf dem C-terminalen 30kDa-Fragment, das nach α-chymotryptischem Verdau erhalten wird und allen Mitgliedern der Protein4.1-Su­perfamilie gemeinsam ist. Dieser Proteinabschnitt enthält auch die Bindungs­stel­len für AE1 und Glycophorin C. Die Bindung zwischen βIΣ1-Spectrin und Actin wird durch den Calmodulin/Protein4.1-Kom­plex verstärkt. Steigende Ca2+-Konzen­tra­tion und die damit verbundende Bindung von Ca2+ an Calmodulin führt anschei­nend zu einer Konformationsänderung im Protein4.1-Molekül wobei sich die Spe­crin/Actin-Bindung lockert. Die Spectrin/Protein4.1-Bindung wird durch die Erhö­hung der Ca2+-Konzentration nicht beeinflußt (Tanaka et al., 1991).

Die Bedeutung von Protein4.1 als Verknüpfungsmolekül zwischen dem Mem­branzytoskelett und der Plasmamembran der Erythrozyten ist in den letzten Jahren in­tensiv untersucht worden. Für die Bindung von Protein4.1 an AE1 ist auf beiden Proteinen ein kurzes Motiv, bestehend aus jeweils fünf Aminosäuren, von Bedeu­tung (Jöns und Drenckhahn, 1992). Auf AE1 besteht dieses Motiv aus drei aufein­ander folgenden Argininen (Aminosäuren mit stark basischen Seitengruppen), die zusammen einen basischen Kern bilden, der N- und C-terminal von einer hydro­phoben Aminosäure flankiert wird. Diesem LRRRY- bzw. IRRRY-Motiv auf AE1 ist das Motiv LEEDY auf Protein4.1 gegenübergestellt. LEEDY hat mit zwei Glutamin­säuren und einer Asparaginsäure einen stark sauren Kern, der ebenfalls von hy­drophoben Aminosäuren flankiert wird. Punktmutationen der einzelnen Aminosäu­ren innerhalb des [Seite 19↓]Bindungsmotivs auf Protein4.1 ergaben, daß die Bindungsaffi­nität von Protein4.1 sowohl durch Austausch der hydrophoben wie auch der sauren Aminosäuren signifikant vermindert wird (Jöns et al. Manuskript in Vorbereitung). Stöchiometrische Analysen zum Bindungsverhältnis zwischen AE1 und Protein4.1 belegen, daß bis zu zwei Moleküle Protein4.1 an einem Molekül AE1 binden kön­nen (Rückmann et al., 1997). Durch Deletion unterschiedlicher Bereiche der zyto­plasmatischen Domäne von AE1 konnte gezeigt werden, daß in vitro die Peptidab­schnitte LRRRY/IRRRY beide eine Bindung mit Protein4.1 eingehen können (Jöns et al. bisher nicht veröffentlicht).

Die auf AE1 identifizierte Bindungssequenz LRRRY/IRRRY findet sich in identi­scher oder in abgewandelter Form auch in einer Anzahl weiterer Proteine (Drenckhahn et al., 1996). Die auf Glycophorin C (YRHKG) und CD44 (SRRRC/-QKKKL) vorhandenen Motivabschnitte scheinen ebenfalls für die Bindung dieser Proteine an Protein4.1 von Bedeutung zu sein (Marfatia et al., 1994; Nunomura et al., 1997).

Welche Funktionen Protein4.1-Isoformen in nicht-erythrozytären Zellen haben, ist bisher noch wenig untersucht worden. Protein4.1 kommt in nicht-erythrozytären Zellen in verschiedenen zellulären Lokalisationen vor und scheint außer mit Spec­trin und Actin auch Interaktionen mit weiteren Proteinen, wie zum Beispiel Tubulin oder Myosin, eingehen zu können (Correas und Avila, 1988; Pasternack und Racusen, 1989). In Endothelzellen ist Protein4.1 strikt membranassoziiert und im Bereich der Adhaerenskontakte angereichert (Cohen et al., 1982; Leto et al., 1986). Neben den Plasmamembran-assoziierten Protein4.1-Isoformen sind in den letzten Jahren verschiedene kernassozierte Isoformen beschrieben worden (Correas, 1991; Krauss et al., 1997a; Krauss et al., 1997b; Lallena und Correas, 1997; Luque et al., 1998).

Ankyrin wurde wie die meisten Proteine, die das Membranzytoskelett aufbauen, ur­sprünglich als peripheres Membranprotein der Erythrozyten entdeckt. Neben der Hauptproteinbande von 206 kDa findet sich nach gelelektrophoretischer Auftren­nung eine Abfolge weiterer Proteinbanden, die Ankyrinisoformen darstellen, ent­standen [Seite 20↓]durch unterschiedliche Prozessierung der prä-mRNA sowie durch proteo­lytischen Abbau von Ankyrin (Steck et al., 1971; Lux et al., 1990a).

Neben dem erythrozytären Ankyrin sind verschiedene Ankyrinisoformen beschrie­ben worden, für die drei Gene kodieren. In Tabelle 2 (S. 20) sind die bekannten Ankyringene, die Genprodukte und deren Vorkommen zusammengestellt.

Alle Ankyrinisoformen verfügen über eine gemeinsame Proteinstruktur, die aus ei­ner N-terminalen Membranbindungsdomäne, einer Spectrin-Bindungsdomäne so­wie einer C-terminalen regulatorischen Domäne bestehen (Bennett, 1992; Lambert und Bennett, 1993; Peters und Lux, 1993).

Im Erythrozyten verankert Ankyrin als Adaptormolekül über die Bindung an Spec­trin und an AE1 das submembranäre Zytoskelett mit der Zellmembran (Bennett und Stenbuck, 1979). In den letzten Jahren sind weitere Membranproteine als Bin­dungspartner sowohl für das erythrozytäre als auch für die anderen Ankyriniso­for­men identifiziert worden. So bindet Ankyrin an die Na+,K+-ATPase, den Na+, Ca2+-Austauscher und an spannungsabhängige Natriumkanäle (Nelson und Veshnock, 1987; Koob et al., 1988; Srinivasan et al., 1988; Smith et al., 1991; Li et al., 1993; Jordan et al., 1995). Die über Ankyrin mit dem Spectrin-Actinzytoskelett verknüpften integralen Membranproteine sind in ihrer lateralen Mobilität eingeschränkt und kön­nen in bestimmten Subdomänen angereichert sein, wie z. B. die Na+,K+-ATPase im Ranvierschen-Schnürring (Bennett, 1990).

Bestimmte Ankyrinisoformen binden an die zur Immunoglobulin-Superfamilie ge­hörenden Zelladhäsionsmoleküle Neurofascin und L1 (Davis und Bennett, 1994). Die durch Ankyrin vermittelte Verknüpfung dieser Zelladhäsionsmoleküle mit dem Spektrin-Actinzytoskelett spielt unter anderem eine wichtige Rolle bei der Entwick­lung des Nervensystems (Davis und Bennett, 1993; Davis et al., 1993; Davis und Bennett, 1994)

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Tabelle 2 Ankyrin

Die Membranbindungsdomäne von Ankyrin 1 besteht aus 24 repetitiven Se­quenzabschnitten, den Ankyrin-Repeats, die jeweils ca. 33 Aminosäuren umfassen (Lambert et al., 1990; Lux et al., 1990b). Jeweils sechs dieser Ankyrin-Repeats or­ganisieren sich zu vier Bindungssubdomänen (Michaely und Bennett, 1993). Ho­mologe der Ankyrin-Repeats sind auch in vielen nicht mit Ankyrin verwandten Pro­teinen beschrieben worden (Bork, 1993; Peters und Lux, 1993). Proteine mit Anky­rin-Repeats sind ubiquitärer verbreitet und kommen auch in Invertebraten, Hefen, Bakterien und Viren vor (Gallagher et al., 1997).

Kombinationen der unterschiedlichen Repeats sowie die unterschiedlichen De­terminanten, die auf einer Repeat-Domäne vorhanden sind, führen zu der großen Diversität der Ankyrin-Membranprotein-Interaktionen (Michaely und Bennett, 1995a; Michaely und Bennett, 1995b).

Protein4.2 und Protein4.9 sind beide als Komponenten des Membranzytoskeletts des Erythrozyten entdeckt (Bennett, 1990; Cohen et al., 1993) und in der Zwischen­zeit auch in verschiedenen nicht-erythrozytären Zellen nachgewiesen worden (Fried-richs [Seite 22↓]et al., 1989). Obwohl beide Proteine, insbesondere Protein4.2, mit 200.000 Kopien pro Zelle (Yu und Steck, 1975; Korsgren und Cohen, 1986), wichtige Kom­ponenten des Membranzytoskeletts zu sein scheinen (hämolytische Anaemie bei Protein4.2-Mangel), konnte deren genaue Funktion noch nicht aufgeklärt werden. Protein4.2 bindet wie auch Protein4.1 und Ankyrin an die zytoplasmatische Domäne von AE1. Die durch diese Bindung bewirkte Konformationsänderung reguliert mög­licherweise die Bindung von Ankyrin an AE1 (Cohen et al., 1993).

Für Protein4.9 ist bekannt, daß es an Actin bindet und Actin-bündelnde Eigen­schaften besitzt. Es besteht aus zwei 48kDa- sowie einer 52kDa-Untereinheit. Die N-terminale 30kDa Domäne der 48kDa-Untereinheit weist Homologien zu Villin auf, einem ebenfalls Actin-bindenden und -bündelnden Protein des Bürstensaums. Bei der Erythrozytenreifung ist die durch Protein4.9 vermittelte Actinbün­delung während der Kernausstoßung der Normoblasten möglicherweise wichtig. (Koury et al., 1989). Interessanterweise haben Protein4.2 und Protein4.9 einen elf Aminosäuren langen identischen Peptidabschnitt, zeigen sonst aber keine Sequenzhomologie. Dieses Motiv enthält eine ATP-Bindungsstelle. Es er­scheint somit denkbar, daß die Protein-Protein-Interaktionen, die Protein4.2 und Protein4.9 eingehen können, über ATP-Bindung reguliert werden (Azim et al., 1996).

Im Folgenden werden mit Ezrin und SAP 97 zwei Proteine beschrieben, die nicht im Erythrozyten, aber in verschiedenen Epithelzellen vorkommen. Beide Proteine bin­den an zytoskelettale Strukturen und haben Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Polarität dieser Zellen.

Ezrin gehört zur Protein4.1-Superfamilie (siehe S. 16) und bildet zusammen mit Ra­dixin und Moesin eine Unterfamilie, die als ERM-Familie be­zeichnet wird (Mangeat et al., 1999; Tsukita et al., 1994).

Die ERM-Proteine sind wie Protein4.1 Membran-Zytoskelett-Verknüpfungspro­teine. Ezrin kommt in verschiedenen Epithelzellen vor, ist dort meist apikal, aber auch basolateral lokalisiert (Publikation 3; Hanzel et al., 1989; Hanzel et al., 1991).

Für die Funktionen von Ezrin spielt die Phosphorylierung einzelner Aminosäuren eine entscheidende Rolle (Nakamura et al., 1996; Matsui et al., 1998). Es besitzt C- und N-terminale-Assoziations-Domänen, welche die Bildung von Dimeren und Oli­gomeren ermöglichen und die für die Bindung an Actin und möglicher­weise auch an weitere Proteine wichtig sind. Im nicht-phosphorylierten Zustand sind die Asso­ziations-Domänen durch Faltung innermolekular maskiert und die Bindung an Actin sowie aneinander ist nicht möglich oder erschwert. Phosphorylierung führt zur Ent­faltung der Assoziations-Domänen und so zur Aktivierung der Ezrinmoleküle. Diese können nun dimerisieren oder auch oligomerisieren; dies scheint eine Vorausset­zung für die Translokation zum apikalen Zellpol zu sein (Chen et al., 1995; Kondo et al., 1997). Durch Phosphorylierung aktiviertes Ezrin bindet an Actin und beteiligt sich an der Ausbildung von Mikrovilli und anderen Membranauffaltungen (Oshiro et al., 1998; Shaw et al., 1998). Darüber hinaus be­sitzt Ezrin Bindungsstel­len für ver­schiedene Membranproteine wie CD44, die Interzellulären Adhäsionsmoleküle (ICAM-1, 2, 3) und die H+,K+-ATPase (Serrador et al., 1997; Tsukita et al., 1997; Heiska et al., 1998; Yonemura et al., 1998). Möglicherweise wird die Bindung von Ezrin an Proteine mit mehreren Transmembrandomänen durch ein weiteres Adap­tormolekül vermittelt. EBP50 (ERM bindendes Phosphoprotein von 50kDa) wurde in Epithelien mit Ezrin kolokalisiert gefunden (Reczek et al., 1997). EBP50 besitzt zwei PDZ-Domänen (siehe S. 23) und verfügt über Bindungsstellen für Ezrin und für zytoplas­matische Domänen verschiedener Membranproteine (Hall et al., 1998a; Hall et al., 1998b), wie den CFTR-Chloridkanal (Short et al., 1998).

Das Synapsen-assozierte-Protein (SAP) 97 gehört zur Familie der MAGUK-Pro­teine, wobei MAGUK für „membrane associated guanylate kinase homologues“ steht. SAP 97 kommt in verschiedenen Regionen im Gehirn vor (hier überwiegend an präsynapti[Seite 24↓]schen Nervenendigungen asymmetrischer Synapsen), ist aber auch in unterschiedlichen peripheren Organen gefunden worden (Müller et al., 1995). Wir konnten zeigen, daß SAP 97 in Parietalzellen vorhanden ist und hier entlang der basolateralen Plasmamembran vorkommt (Publikation 3). Die Funktion der MAGUK-Proteine liegt in der Kopplung extrazellulärer Signale mit intrazellulären Übertragungswegen sowie in der Interaktion mit dem zellulären Zytoskelett.

Die Mitglieder der MAGUK-Familie sind gekennzeichnet durch das gemeinsame Vorkommen von drei charakteristischen Domänen (Cho et al., 1992; Woods and Bryant, 1991): der PDZ-Domäne, der SH3-Domäne und der GUK-Domäne. PDZ leitet sich her von den Anfangsbuchstaben der ersten drei Mitglidern dieser Familie: PSD-95 (protein of postsynaptic density of 95kDa), Dlg (Drosophila lethal discs-large-1 tumor suppressor gene) und ZO-1 (Zonula-Occludens-Protein-1). der SH3 steht für (src homology 3). Die GUK-Domäne weist Homologie zu einem Enzym der Guanylat-Kinase auf.

Die PDZ-Domänen der MAGUK-Proteine sind bisher am besten untersucht und kommen außer bei den MAGUK-Proteinen auch in anderen Proteinen wie zum Bei­spiel in EBP50 vor (siehe S. 22). Eine PDZ-Domäne stellt einen 80-90 Ami­nosäu­ren langen Peptidabschnitt dar und enthält Bindungsstellen für verschiedene Mem­branproteine, die über die letzten drei bis zehn C-terminalen Aminosäuren gebun­den werden. In-vitro-Studien konnten zeigen, daß z.B. der Glutamatrezeptor vom Typ des N-methyl-D-aspartat (NMDA) Rezeptors oder der einwärts rektifizierende Kali­umkanal Kir4.1 so gebun­den und möglicherweise an bestimmten Subdomänen der Plas­mamembran von Nervenzellen angereichert werden (Kim et al., 1995). Wir konnten bei einer Mem­branpräparation aus der Niere die Na+,K+-ATPase und SAP 97 mit den entsprechen­den gegen diese Proteine gerichteten Antikörpern kopräzi­pitieren (Bennai et al., Manuskript in Vorbereitung).

Die Verbindung der MAGUK-Proteine mit dem Zytoskelett kann außer über direkte Bindung an Actin (Fanning et al., 1998) auch über die Adaptorproteine Protein4.1 oder Ezrin erfolgen (siehe S. 38; Publikation 3; Marfatia et al., 1994; Marfatia et al., 1995). In verschiedenen anderen Proteinfamilien, die ebenfalls SH3-Domänen be­[Seite 25↓]sitzen, werden diese für die Bindung an Actin oder an andere Proteine, die in die Si­gnalübertragung eingeschaltet sind, verantwortlich gemacht. Für die MAGUK-Pro­teine ist jedoch bisher außer Actin (Fanning et al., 1998) kein weiterer SH3-Bin­dungspartner identifiziert worden. Die Funktion der GUK-Domäne bei MAGUK-Pro­teinen ist ebenfalls noch ungeklärt. Die ATP-abhängige Phosphorylierung von GMP zu GDP durch MAGUK-Proteine konnte noch nicht nachgewiesen werden. Das Bin­dungsverhalten für die Nukleotide ist zwischen den Familienmitgliedern sehr un­terschiedlich. Erythrozytäres P55 bindet sowohl ATP wie GMP; ZO-1 und ZO-2 bin­den keines von beiden; SAP 90 nur GMP, aber kein ATP und dürfte somit wie die ZO-Proteine keine Enzymaktivität aufweisen. Ob die MAGUK-Proteine an einen G-Protein-abhängigen Signalweg gekoppelt sind und möglicherweise lokal die Nu­kleotidkonzentration beeinflussen, ist nicht geklärt. Alternativ könnte aber auch ein durch die Nukleotidbindung bewirkter allosterischer Effekt die Protein-Protein-Inter­aktionen beeinflussen.