4 Gerichtete Membranfusion in Epithelzellen

Es bestehen prinzipiell zwei Möglichkeiten, wie Membranproteine eine polare Ver­teilung in Epithelzellen erhalten können (Caplan, 1997a):

1. 1.Vektorieller Transport: Die Membranproteine werden im Trans-Golgi-Netzwerk in spezifische apikale bzw. basolaterale Transportvesikel sortiert, die nur mit der api­kalen oder basolateralen Plasmamembran fusionieren können (Simons und Wan­dinger Ness, 1990; Drubin und Nelson, 1996).
2. 2.Transzytotische Steuerung: Die apikalen- und basolateralen Membranproteine werden nicht in unterschiedliche Transportvesikel sortiert, sondern randomisiert in die basolaterale Plasmamembran der Zelle eingebaut. Die nach diesem Zu­fallsprinzip in die falsche Domäne gelangten Proteine werden anschließend durch Transzytose zur korrekten Membrandomäne transportiert oder lysosomal abgebaut (Drubin und Nelson, 1996; Weimbs et al., 1997). Darmepithelien nutzen eine Mi­schung aus beiden Transportwegen, wohingegen in Hepatozyten Trans­zytose der vorherrschende Sortierungsmechanismus zu sein scheint. Die Zymogengranula der exokrinen Pankreasdrüsenzellen werden durch vektoriellen Trans­port nach apikal befördert. Der Inhalt der Vesikel wird dann durch regulierte Exozytose aus­schließlich an dieser Zelloberfläche abgegeben (Gardner und Jensen, 1986).

Die Effizienz des gerichteten Transport zum apikalen Zellpol wird durch das Mi­krotubulus-System entscheidend gesteigert. Mikrotubuli sind in Epithelzellen spezi­fisch ausgerichtet, wobei das polimerisationsinaktive Ende (Minusende) zum api­kalen und das Plusende zum basalen Zellpol weist. Somit ist innerhalb der Epithel­zellen ein gerichtetes Transportsystem ausgebildet. Mit Hilfe von mikrotubulusab­hängigen Motorproteinen können Vesikel entweder zum Minusende (Dynein) oder zum Plusende (Kinesin) transportiert werden. (Achler et al., 1989; Holzbaur und Vallee, 1994; Lafont et al., 1994; Kraemer et al., 1999). Diese Vorstellung wird unter anderem dadurch gestützt, daß Zymogengranula des Pankreas auf ihrer Membran den Dyneinrezeptor [Seite 31↓]und Dynein tragen, nicht jedoch den Kinesinrezeptor und Kine­sin und daher nur an der apikalen Plasmamembran zur Exozytose kommen (Kraemer et al., 1999).

Die Bedeutung der Mikrotubuli für das korrekte Sortieren von Membranproteinen läßt sich durch Gabe von Colchicin oder Vinblastin nachweisen. Diese die Mikrotu­buli zerstören Substanzen haben einen dramatischen Einfluß auf die Verteilung von apikalen Membranproteinen, wie etwa der Sucrose-Isomaltase, der Aminopepti­dase N oder der Alkalischen-Phosphatase. Nach Colchicin- oder Vinblastin-Gabe erscheinen die normalerweise nur apikal lokalisierten Proteine auch basolateral, wohingegen die Verteilung der basolateral lokalisierten Na+,K+-ATPase nicht be­einträchtigt ist (Achler et al., 1989; Eilers et al., 1989). Nach Wegnahme der Alka­loide reorganisiert sich das Mikrotubulus-Systems wieder und die zelluläre Polarität baut sich erneut auf.

Die exozytotische Fusion zwischen intrazellulären Vesikeln und der Plasmamem­bran findet nicht spontan statt, sondern erfordert spezifische Fusionsproteine, die die Lipiddoppelschichten so nahe aneinanderbringen, daß eine Fusion ermöglicht wird. In dieser Modellvorstellung wird postuliert, daß die Paarung von SNARE-Pro­teinen (SNAP-Rezeptor-Proteine) der Vesikel (v-SNARE-Proteine) mit verwand­ten Rezep­torproteinen auf der Ziel (target)-Membran (t-SNARE-Proteine) für die Spezi­fität der Anheftung und damit für den ersten Schritt des Fusi­onsvorgangs ver­ant­wortlich ist (Söllner et al., 1993; Rothman und Warren, 1994).

In den letzten Jahren sind verschiedene Proteine identifiziert worden, die für das Anheften der Vesikel und die Einleitung der anschließenden Fusion von Bedeutung sind (Bennett und Scheller, 1993; Ferro-Novick und Jahn, 1994). Integrale v-SNARE-Proteine sekretorischer Vesikel gehören zur Synaptobrevin-Familie, während an der Plasmamembranseite die t-SNARE-Proteine Syntaxin und SNAP25 vorhanden sind. Diese Proteine haben eine hohe Affinität zueinander und bilden einen initialen Haft­komplex aus (Söllner et al., 1993; Calakos et al., 1994). Für die Ausbildung dieses Komplexes ist ein ungefähr sechzig Aminosäuren langer Proteinabschnitt verant­[Seite 32↓]wortlich, der in allen SNARE-Proteinen vorhanden ist und als SNARE-Motiv bezeich­net wird (Terrian und White, 1997; Weimbs et al., 1997). Kristallographische Unter­suchun­gen haben gezeigt, daß im Zentrum der SNARE-Motive entweder ein Glutamin (Q), z. B. bei den Syntaxinen und bei SNAP25 oder ein Argenin (R), z. B. bei den Synaptobrevinen an exponierter Stelle lokalisiert ist. Diese Entdeckung hat zu einer erweiterten Terminologie der SNARE-Proteine ge­führt. Die neue Q/R-Klassifi­zierung ist der alten Terminologie insofern überlegen, da das Verteilungs­muster von einigen Mitgliedern der SNARE-Familie sich nicht mit der streng nach Vesikel- und Ziel-Membran unterscheidenden v- und t-SNARE-Termi­nologie in Einklang bringen läßt (Jahn und Südhof, 1999).

Der SNARE-Haftkomplex bildet sich spontan in nicht denaturierenden Lösungen und ist ungewöhnlich stabil. Weder Erhitzen auf 90oC noch SDS-Behand­lung füh­ren zur Spaltung des Komplexes. Zellen, in denen Membranfusion durch die Aus­bildung des SNARE-Komplexes initiiert wird, verfügen über spezialisierte Regula­torproteine, deren Aufgabe die Dissoziation der im Haftkomplexkomplex miteinan­der verbundenen SNARE-Proteine ist. Bei diesen Regulatorproteinen handelt es sich um die auch frei im Zytoplasma vorkommenden Proteine NSF (N-ethylmalei­mid-sensitive factor) und die Adaptor-Proteine α, β, γ-SNAP (α, β, γ-soluble NSF at­tachment protein). NSF ist ein Hexamer und hat Eigenschaften einer ATPase (Wilson et al., 1989; Tagaya et al., 1993). NSF alleine ist nicht in der Lage, den SNARE-Komplex zu binden und diesen zu spalten, sondern bedarf der SNAPs. Diese müssen zuerst an den SNARE-Haftkomplex gebunden haben, bevor NSF binden kann. Die Hydrolyse von ATP führt dann zur Dissozia­tion des zuvor gebilde­ten Komplexes, wodurch die eigentliche Fusion der Lipiddoppelmembranen ein­geleitet wird. Die Vorgänge, die zwischen der ATP-Hydrolyse, der Dissoziation des SNARE-Komplexes und der Fusion liegen, sind molekular noch nicht geklärt (Südhof, 1995).

Die SNARE-Proteine wurden ursprünglich sowohl in Hefe als auch in Neuronen identifiziert und sind inzwischen auch in zahlreichen nicht-neuronalen Zellen nach­gewiesen worden. In verschiedenen Epithelzelltypen wie den Hepatozyten (Fujita et al., 1998), den Sammelrohrzellen der Niere (Jo et al., 1995), den Parietalzellen des Magens [Seite 33↓](Publikation 4; Calhoun und Goldenring, 1997; Peng et al., 1997) und den Deckzellen der Harnblase (Born, et al., 1999) konnten Isoformen verschiedener SNARE-Proteine identifiziert werden.

Das subzelluläre Verteilungsmuster der SNARE-Proteine in den verschiedenen Epithelzellen ist sehr heterogen und läßt kein einheitliches Schema erkennen (Gaisano et al., 1996; Delgrossi et al., 1997; Fujita et al., 1998). Einige SNARE-Pro­teine wie das in Epithelzellen verbreitete SNAP23 (ein Homolog von SNAP25), kommt sowohl basolateral vor (Azinuszellen des Pan­kreas), aber auch in einer hauptsächlich apikalen Verteilung (MDCK-Zellen, Low et al., 1998). Außerdem kann es zu einer überlappender Verteilung homologer Mitglieder der SNARE-Familie in­nerhalb einer Zelle kommen (Fujita et al., 1998). Welche Bedeutung diese unein­heitliche Verteilung der SNARE-Proteine für die Epithelzellen hat, kann noch nicht beantwortet werden.

Die SNARE-Proteine selber scheinen nicht den Ort der Exozytose zu spezifizie­ren, sondern nur an der Ausbildung der Haftkomplexe beteiligt zu sein. Dafür spricht unter anderem die Beobachtung, daß Syntaxin 1 und SNAP25 in Neuronen entlang des gesamten Axons gleichmäßig verteilt vorkommen, die Exozytose der synapti­schen Vesikel aber nur an der präsynaptischen Membran stattfindet. Es bedarf also weiterer Proteine, die den Ort der Fusion definieren.

Zum einen wäre es möglich, daß in Subdomänen, in denen die Fusion stattfin­det, die Q-SNARE-Proteine vor der Fusion aktiviert werden, zum Beispiel durch As­so­ziation oder Dissoziation regulatorischer Proteine (Rothman und Söllner, 1997). Alternativ wäre aber auch denkbar, daß die Q-SNARE-Proteine immer aktiviert und kompetent für eine Fusion sind, die Vesikel aber durch Leitstrukturen wie Mikrotu­buli, Actin- oder Septinfilamente an den Ort der Fusion transportiert werden (Adams und Pringle, 1984; Hsu et al., 1998; Xie et al., 1999).

Zu den Proteinen mit einer regulatorischen Funktion für SNARE-Proteine gehört Unc-18 aus Caenorhabditis elegans und dessen Homologe in Säugern, die Munc-18-Isoformen (Hata et al., 1993; Garcia et al., 1994; Pevsner et al., 1994). Diese Proteine weisen eine polare Verteilung in Epithelzellen auf und binden, im Fall von Munc 18 gezeigt, je nach Isoform nur an bestimmte Syntaxinisoformen. Die Bin­dung von Munc [Seite 34↓]18 an Syntaxin verhindert die Bindung von SNAP25 oder Synap­tobrevin, verhindert also die Haftkomplexbildung. Regulatorische Proteine wie die Mints sind über ihre PDZ-Domänen an Plasmamembranproteine gebunden und so in den Abschnitten, in denen Vesikelanheftung und -fusion abläuft, angereichert (Okamoto und Südhof, 1997).

Eine weitere Gruppe von Proteinen, die für das Anheften und für die Fusion der Vesikel mit der Plasmamembran von Bedeutung sind, stellen die Rab-Proteine dar. Diese gehören zur Familie der kleinen GTP-bindenden Proteine. Bisher ist jedoch noch keine präzise Funktion der Rab-Proteine während des Fusionspro­zesses be­kannt (Chavrier et al., 1990; Sogaard et al., 1994; Zahraoui et al., 1994; Rothman und Söllner, 1997), es konnte jedoch durch Einsatz von dominant-negativ-Mutatio­nen gezeigt werden, daß Abwesenheit bestimmter Rab-Proteine zu einer Blockade in unterschiedlichen Stadien der Fusion führt (Tisdale et al., 1992; Holz et al., 1994; Li et al., 1994; Lazzarino et al., 1998; Ren et al., 1998;). Rab-Proteine haben offen­sichtlich keine Bedeutung für einen gerichteten Transport der Vesikel zur Zielmem­bran, möglicherweise aber für die Membranerkennung und die initiale Anheftung (Cao et al., 1998; Ungermann et al., 1998a).

Bei der bisher beschriebenen Modellvorstellung der Fusionsvorgänge handelte es sich um die heterotypische Fusionen, also die Fusion von zwei unterschiedlichen Membranen. Beide Membranen haben mit den aufgeführten R- bzw. Q-SNARE-Proteinen und den Begleitproteinen eine unterschiedliche Proteinbestüc­kung, die eine ortsgebundene und zielgerichtete Fusion ermöglicht. Neben dieser Art der Fu­sion gibt es eine weitere, die homotypische Fusion. Beispiele sind die Fusion der Vakuolen in der Hefe, die Fusion von im endoplasmatischen Retikulum gebildeten Transportvesikeln mit dem Golgikomplex oder die Fusion von Lysosomen unter­einander (Nichols et al., 1997; Nichols und Pelham, 1998). Auch bei den homotypi­schen Fusionsvorgängen sind SNARE-Proteine entscheidend invol­viert. Im Gegen[Seite 35↓]satz zur heterotypischen Fusion finden sich bei der homotypischen Fusion auf den Mem­branen, die miteinander fusionieren, ein jeweils identischer Proteinbesatz aus Q- und aus R-SNARE-Proteinen. So ist es möglich, daß bei der homotypischen Fu­sion jeder Membranabschnitt sowohl als Ziel- wie auch als Vesikelmembran an der Fusion teilnehmen kann. Untersuchungen an Hefe-Vakuolen zeigten, daß die Hefeanaloga von NSF (Sec18p) und von α-SNAP (Sec17p) auch für die homotypi­sche Fusion der Vakuolen von Bedeutung sind. In diesem System haben die Re­gulatorproteine möglicherweise aber eine andere oder zumindest noch eine zu­sätzliche Funktion (Ungermann et al., 1998b). Die bei der homotypi­schen Fusion nebeneinander auf einer Vesikelmembran vorhandenen SNARE-Proteine scheinen ebenfalls in einem Komplex miteinander verbunden sein. Damit die einzelnen SNARE-Proteine für die Ausbildung des initialen Haftkomplexes zwi­schen zwei be­nachbarten Vesikeln zur Verfügung stehen, muß zuerst dieser laterale Komplex gelöst werden. Dafür scheinen sec18p und sec17p verantwortlich zu sein (Ungermann et al., 1998b).