5 Ergebnisse und Diskussion

5.1 Die Parietalzelle als Modell für polare Differenzierung und Membranfusion

Parietalzellen weisen große strukturelle und molekulare Unterschiede zwischen dem basolateralen und apikalen Membrankompartiment auf (Urushidani und Forte, 1997; Urushidani et al., 1997).

Die apikale Plasmamembran der Parietalzellen kann in verschiedene Komparti­mente unterteilt werden:

  1. 1.in die freie apikale Membran, die direkt an das Drü­senlumen grenzt,
  2. 2.in die, von der freien apika­len Membran ausgehende, tiefe in das Zytoplasma der Zellen hineinragende kanälchenartige Invaginationen und
  3. 3.in die unregelmäßig geformten vesikulären Membranen innerhalb der Zelle, die bei Aktivierung der Zellen mit der canaliculären Membran verschmelzen und als prä-apikale Reservemembran angesehen werden können (siehe Abb. 3 S. 35).


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Die Fusion der Tubulovesikel findet unter anderem nach Stimulation der Zellen mit Gastrin, Histamin oder Acetylcholin statt. Als Folge dieser Membranumverteilung vergrößert sich die apikale Membranoberfläche um das Fünf- bis Zehnfache.

Abb. 3 Schematische Darstellung der Membrankompartimente einer ruhenden und einer stimulie­rierten Parietalzelle. Das Zytoplasma der ruhenden Zelle ist angefüllt mit tubulären Vesikeln, die als präapikale Membran angesehen werden können. Nach Stimulation der Zelle fusionieren die Vesi­kel mit der canaliculären Plasmamembran, was zu einer deutlichen Vergrößerung dieser Membran­domäne führt. Die canaliculäre Plasmamembran weist in den stimulierten Zellen Mikrovillus-ähnliche Strukturen auf. An der basolateralen Plasmamembran finden nach Stimulierung der Zellen keine Membranumbauvorgänge statt.

Die stimulationsabhängigen Veränderungen des apikalen Membrankompartiments und die strukturelle Stabilität der basolateralen Plasmamembran werfen eine Reihe von Fragen auf:

  1. 1.Worin bestehen die Unterschiede in der Stabilität bzw. in der Dynamik zwischen dem basolateralen und dem apikalen Zellmembrankompartiment?[Seite 37↓]
  2. 2.Welche Rolle spielen Verankerungen integraler Membranproteine mit dem Mem­branzytoskelett für die strukturelle Stabilität der basolateralen Membrandomäne und für die Dynamik der Apikaldomäne?
  3. 3.Wie wird das stark vergrößerte apikale Membrankompartiment während der Se­kretionsphase stabilisiert?
  4. 4.Wie wird die Fusion der tubulären Vesikel mit der apikalen Plasmamembran nach Stimulation vermittelt?

Wir konnten das für die basolaterale Chloridaufnahme verantwortliche Molekül der Parietalzellen des Menschen identifizieren (Publikation 1). Es handelt sich dabei um den Anionenaustauscher AE2 der Cl--Ionen im Austausch gegen HCO3--Ionen in die Zelle aufnimmt. Die Cl--Ionen werden dann an der apikalen Zellseite durch einen noch nicht identifizierten Cl--Kanal abgegeben. Zusammen mit den durch die H+,K+-ATPase sezernierten H+-Ionen kommt es dadurch zurNettosekretion von HCl. Die apikale HCl-Sekretion und die basale Cl-- Aufnahme sind somit funktionell an­ein­ander ge­koppelt. Die Transportmoleküle weisen aber eine sehr unterschiedli­che Dynamik auf. H+,K+-ATPase-Moleküle werden nach Stimulation der Zellen vom tubulove­sikulären Zellkompartiment durch Fusion in die apikale Plasmamembran einge­baut. AE2-Moleküle verbleiben dagegen unabhängig vom Funktionszustand der Zellen in der basolateralen Plasmamembran und scheinen keinem Endo­zytose/Exozytose-Mechanismus zu unterliegen.

Entlang der basolateralen Plasmamembran der Parietalzellen konnten wir Anky­rin nachweisen (Antikörper gegen die erythrozytären Ankyrinisoform). Ankyrin ist in diesen Zellen mit AE2 kolokalisiert. In einer Bindungsstudie konnte gezeigt wer­den, daß die cytoplasmatische Domäne von AE2 an erythrozytäres Ankyrin bindet (Publi­kation 2). AE2 könnte daher über Ankyrin mit dem aus Spectrin und Actin aufgebauten Membranzytoskelett verbunden und so in der basolateralen Membrandomäne immobilisiert sein (siehe Abb. 4 S.37).


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Abb. 4 Schematische Darstellung einer Parietalzelle. In der freien apikalen und der canaliculären Plasmamembran ist die H+,K+-ATPase über Ezrin an das apikale β-Actin-Filamentsystem gebun­den. Ezrin kommt außerdem an der basolateralen Plasmamembran vor, hier zusammen in einem Komplex mit SAP 97 und γ-Actin. Der Membranbindungspartner für diesen Komplex ist noch nicht be­kannt. Das basolateral vorhandene Ezrin stellt möglicherweise die nicht Actin bindende Ruhe­form des Adaptorproteins dar.
Basolateral ist AE2 über Ankyrin an das Spectrin Membranzytoskelett gebunden.

Actin und Spectrin kommen in Parietalzellen nicht nur entlang der basolateralen Plasmamembran vor, sondern sind auch apikal vorhanden. In den unterschiedli­chen Membrandomänen dieser Zellen ist die Verteilung von Actin- und Spectrin-isoformen [Seite 39↓]jedoch nicht identisch, vielmehr sind apikal und basolateral unter­schiedliche Isoformen dieser Zytoskelettproteine angereichert. Basolateral kommt fast ausschließlich γ-Actin vor (Yao et al., 1995), apikal hauptsächlich β-Actin (Publi­kation 3). Die apikale Plasmamembran der Parietalzellen konnte mit einem gegen αIIΣ-Spectrin (Fodrin) gerichteten Antikörper deutlich dargestellt werden, bei nur schwacher Markierung der basolaterale Membran. Die basolaterale Membrandomäne wurde mit einem gegen αIΣ1/βIΣ1-Spectrin (erythrozytäres Spectrin) gerich­ten Antikörper markiert, der jedoch die apikale Plasmamembran kaum darstellte (Jöns et al. nicht veröffentliche Daten). Welche Funktion eine derartige domänenspezifische Verteilung von Zytoskelettproteinisoformen innerhalb einer Zelle haben könnte, ist noch nicht geklärt. Es ist jedoch denkbar, daß über unterschiedliche Bindungsaffinitäten zu Adaptorproteinen wie Ankyrin oder Ezrin Membranproteine wie AE2 (basolateral) oder die H+,K+-ATPase (apikal) in bestimmten Membrando­mänen verankert werden.

Ezrin kommt in Parietalzellen in apikaler und in basolateraler Verteilung vor (Abb.4 S. 37; Publikation 3; Hanzel et al., 1991). Entlang der freien apikalen und ca­naliculä­ren Plasmamembran ist Ezrin mit β-Actin und der H+,K+-ATPase kolokali­siert. Ez­rin-Antikörper kopräzipitieren sowohl β-Actin wie auch die H+,K+-ATPase (Publika­tion 3). Das läßt auf eine mögliche Funktion von Ezrin als zytoskelettales Adaptor­mole­kül der H+,K+-ATPase schließen.

An der basolateralen Membrandomäne der Parietalzellen konnte mit SAP 97 ein möglicher Bindungspartner von Ezrin identifiziert werden (Publikation 3; Marfatia et al., 1994; Marfatia et al., 1995). Immunopräzipitationen mit Ezrin- und SAP 97-Anti­körpern führen zur Kopräzipitation des jeweils anderen Proteins. Ezrin und SAP 97 könnten somit entweder direkt aneinander binden oder kommen gemeinsam in ei­nem Komplex mit weiteren Proteinen vor. Die Präzipitation mit SAP 97-Antikörpern führt ebenfalls zu Kopräzipitation von Actin, wobei der β-Actinanteil sehr gering ist, da, wie oben erwähnt, β-Actin in Parietalzellen hauptsächlich apikal lokalisiert ist.

Möglicherweise ist Ezrin in ruhenden Parietalzellen basolateral an SAP 97 ge­bunden und hat selber keinen Kontakt zum Actinzytoskelett (Ezrin bindet mit hoher Prä­ferenz nur an β-Actin, Yao et al., 1995). Nach Stimulierung der Parietalzellen [Seite 40↓]könnte Ezrin zum canaliculären Kompartiment transloziert werden und dort während der HCl-Sekretionsphase die vergrößerte apikale Membrandomäne durch Veknüp­fung der H+,K+-ATPase mit dem β-Actinzytoskelett stabilisieren (siehe Abb. 4 S. 37).

Die Fusion der tubulären Vesikel mit der apikalen Plasmamembran ist reguliert und gleicht daher regulierten Membranfusionen, wie sie bei der Exozytose von Neu­rotransmittern vorkommen.

Wir konnten zeigen, daß die Fusion der tubulären Membranvesikel mit der api­kalen Zellmembran durch SNARE-Proteine vermittelt wird (Publikationen 4 und 5). Hiermit weisen die Parietal­zellen Ähnlichkeiten mit anderen Systemen auf. Der in Fettzellen und Muskelfasern vorkommende Glukosetransporter GluT4 und der in Sammel­rohrzellen der Niere enthaltende Was­serkanal Aquaporin 2 AQP-2 sind in ruhen­den Zellen wie die H+,K+-ATPase der Parietalzellen in der Membran zytoplasmatischer Vesikel konzentriert. Auf einen adäquaten Stimulus hin (Insulin für GluT4 und Antidiuretisches Hormon für AQP-2) kommt es zur Fusion der Vesikel mit der Plasmamembran (Cain et al., 1992; Uchida et al., 1994). Für GlutT4-Vesikel ist ge­zeigt worden, daß die R-SNARE-Proteine Synaptobrevin 2 und Cellubrevin auf der Vesi­kelmembran vorkommen und daß an der Plasmamembran von Fettzellen die Q-SNARE-Proteine Syntaxin 2, Syntaxin 4 und SNAP23 vorhanden sind (Cain et al., 1992; Timmers et al., 1996; St-Denis et al., 1999).

Durch enzymatische Spaltung von Synaptobrevin 2 und von Cellubrevin mit Botu­linum-Neurotoxin B oder D konnte die durch Insulin stimulierte Glukoseaufnahme in Fettzellen inhibiert werden (Cheatham et al., 1996; Olson et al., 1997). Synap­tobre­vin 2 wurde auch an der Membran der intrazellulären AQP-2-Vesikel der Sammel­rohrzellen gefunden. In diesen Zellen konnten außerdem Syntaxin 4 und SNAP23 nachgewiesen werden (Nielsen et al., 1995; Mandon et al., 1996).

In der gastrischen Mucosa ließen sich SNARE-Proteine in Parietalzellen und in Enterochromaffin-ähnlichen Zellen nachweisen. In letzteren spielen die SNARE-Proteine bei der Exozytose von Histamin speichernden Sekretvesikeln eine ent­scheidende Rol[Seite 41↓]le (Höhne-Zell et al., 1997). In Parietalzellen konnten verschie­dene Isoformen der SNARE-Proteine identifiziert werden, was möglicherweise auf un­ter­schiedliche Funktionen schließen läßt, an denen diese Proteinen beteiligt sind (Publikationen 4 und 5; Peng et al., 1997). Wir konnten zeigen, daß in Parietalzellen von Ratte und Schwein das R-SNARE-Protein Synaptobrevin 2 und die Q-SNARE-Proteine SNAP25 und Syntaxin 1 vorhanden sind. Darüber hinaus kommen die Re­gulatorproteine NSF und α, β-SNAP sowie das G-Protein Rab3A in diesen Zel­len vor. In Abhängigkeit vom Stimulationszustand der Zellen werden alle Proteine intra­zellulär umverteilt (Publikationen 4 und 5). Ein unerwarteter Befund war, daß die R- und die Q-SNARE-Proteine ein identisches subzelluläres Verteilungsmuster zeig­ten. In Analogie zur neuronalen Fusion der synaptischen Vesikel mit der präsynapti­schen Membran hätte man erwarten können, daß Synaptobrevin auf der Membran der tubulären Vesikel nachzuweisen wäre und Syntaxin und SNAP25 entlang der apikalen und canaliculären Membran. Im Gegen­satz zu dieser Vorstel­lung waren die SNARE-Proteine sowohl in ruhenden wie in stimulierten Zellen immer mit der H+,K+-ATPase kolokalisiert. Die H+,K+-ATPase und die drei SNARE-Proteine kom­men in ruhenden Zellen hauptsächlich an der Membran der tubulären Vesikel (im ganzen Zytoplasma verteilt) vor. Nach Stimulation befinden sich alle vier Moleküle an der freien apikalen und der canaliculären Membran der Zellen. Die Erklärung für die Gleichverteilung aller SNARE-Proteine in Parietalzellen könnte in der ganz ande­ren Zielvorgabe liegen, die hier durch die Fusion erreicht werden soll. In Neuronen fusionieren nur solche Vesikel mit der Plasmamembran, die sich in unmittelbarer Nähe zur präsynaptische Membran be­finden. Nach erfolgter Fusion wird die Vesi­kelmembran sofort durch Endozytose wieder in die Zelle zurück­genommen, die Fusion der synaptischen Vesikel führt somit zu keiner Vergröße­rung der Oberfläche der präsynaptischen Membran. In Parietalzellen befinden sich die tubulären Vesikel in der ganzen Zelle verteilt und haben nur zum Teil unmit­telbarem Kontakt mit der canaliculären Membran. Eine schnelle und stabile Vergrößerung der Membrano­berfläche, die hier erreicht wer­den soll, ist nur möglich, wenn alle Vesikel unterein­ander, also nach dem Modell der homotypischen Fusion, fusionieren können (siehe S. 33). Die tubulären Vesikel befinden sich innerhalb der [Seite 42↓]Zelle in unmittelbarer Nähe zueinander, so daß es überall zur Fusion kommen kann. Die Fusion canaliculusnaher Vesikel mit der in­vaginierten apikalen Membrandomäne eröffnet dann auch allen bereits miteinan­der verschmolzenen Vesikeln den Zugang zum Drüsenlumen.

Wir konnten durch Immunopräzipitation zeigen, daß der für eine SNARE-Protein- vermittelte Fusion notwendige Haftkomplex, bestehend aus Synaptobrevin, Syntaxin und SNAP25, in Parietalzellen ausgebildet wird (Publikation 4). Darüber hinaus konnten wir zeigen, daß das Parietalzell-Synaptobrevin genauso wie die neuronale Isoform ein Substrat des clostridialen Neurotoxins TeNt ist. Wenn SNARE-Proteine für die stimulationsbedingte Fusion der tubulären Vesikel mit der apikalen Mem­bran von Bedeutung sind, sollte die enzymatische Spaltung von Synaptobrevin durch TeNt in diesen Zellen die Fusion und damit auch eine gesteigerte Salzsäu­resekretion inhibieren. Da TeNt von nicht-neuronalen-Zellen nicht aufgenommen wird, war es notwendig, die Plasmamembran dieser Zellen zu permeabilisieren. Be­handlung der Parietalzellen mit Streptolysin O (SLO) gewährleistete eine ausrei­chende Zugänglichkeit für das Toxin, ohne die Stimulierbarkeit der Zellen mit cAMP zu beeinträchtigen (Publikation 5). Inkubation der SLO-permeabilisierten Zellen mit TeNt führte im Vergleich mit der nicht toxinbehandelten aber auch permeabilisier­ten Kontrolle zu einer kompletten Inhibition der stimulationsbedingten Steigerung der Salzsäuresekretion (Publikation 5).

Wir konnten somit eindeutig zeigen, daß die Fusion der tubulären Vesikel und die daran gekoppelte Steigerung der HCl-Sekretion der Parietalzellen über einen Me­chanismus abläuft, der als essentiellen Bestandteil SNARE-Proteine beinhaltet.


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Abb. 5a Ausschnit des apikalen Membrankompartiments einer ruhenden Parietalzelle. Auf der ca­naliclären und auf der Vesikel Membran sind Q- und R-SNARE-Proteine vorhanden. Die Proteine sind zum Teil in einem lateralen Komplex miteinander verbunden oder kommen einzeln auf der Membran vor. Die komplexierten SNARE-Proteine sind in Assoziation mit α, β-SNAPs und NSF dar­gestellt, die möglicherweise für die Dissoziation dieses Komplexes verantwortlich sind.


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Abb. 5b Nach Aktivierung der Parietalzelle durch Stimulation kommt es zur Fusion der tubulären Vesikel untereinander und mit der canaliculären Membran.

Die Kombination von homotypischer und heterotypischer Fusion macht es möglich, daß auch die­jenigen Vesikel direkten Zugang zum Drüsenlumen erhalten, die sich während der Ruhephase der Zellen nicht in unmittelbarer Nähe zur canaliculären Membran befunden haben.


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11.01.2005