6  Zusammenfassung

Die in der vorliegenden Habilitationsschrift zusammengefaßten Publikationen stel-len Untersuchungen zu zwei Themenschwerpunkten dar:

1. 1.Verankerungsmechanismen von Membranproteinen der basolateralen und der apikalen Plasmamembrandomäne der Parietalzellen mit dem Membranzytoske­lett und
2. 2.die regulierte Fusion von zytoplasmatischen Vesikeln mit der apikalen Plasmamembran dieser Zellen.

An den Salzsäure sezernierenden Parietalzellen des Magens sollten die struktu­rell und molekular sehr unterschiedlich gestaltete apikale und basolaterale Mem­brandomäne der Parietalzellen funktionell charakterisiert und Mechanismen der Membranumbauvorgänge aufgeklärt werden, die nach Aktivierung der Zellen im apikalen Membrankompartiment ablaufen.

Die Sekretion von HCl in das Drüsenlumen ist an eine basolaterale Cl--Auf­nahme funktionell gekoppelt, welche durch den Anionenaustauscher 2 (AE2) si­chergestellt wird (Publikation 1).

Für die strukturelle Stabilität der basolateralen Domäne spielt wahrscheinlich die Verankerung von AE2 über das Verknüpfungsprotein Ankyrin mit dem Membran­zytoskelett eine wichtige Rolle. Ankyrin ist in Parietalzellen mit AE2 kolokalisiert und bindet an dessen zytoplasmatische Domäne (Publikation 2).

Die apikale Membrandomäne der Parietalzellen kann in drei Kompartimente un­terteilt werden:

1. 1.die freie apikale Plasmamembran, die direkt an das Drüsenlumen grenzt,
2. 2.kanälchenartige Invaginationen der apikalen Plasmamembran, die tief in das Zytoplasma hineinragen und
3. 3.intrazelluläre tubuläre Vesikel „prä-apikale Membranen“, die nach Aktivierung der Zellen mit der canaliculären Membran fusionieren können. Durch diesen Fusionsvorgang vergrößert sich die apikale Membrandomäne, zusätzliche H+,K+-ATPase Moleküle erhalten Zugang zum Drüsenlumen, und es kommt zu einer Steigerung der Salzsäuresekretion.

Entlang der freien apikalen und der canaliculären Plasmamembran kommen wie auf der basolateralen Seite die Zytoskelett-Proteine Actin und Spectrin vor, aller­dings sind apikal andere Isoformen vorhanden als basolateral (Publikation 3). Nach unseren Untersuchungen könnte es während der Sekretionsphase zu einer temporären Verbindung von H+,K+-ATPase Molekülen mit dem Membranzytoskelett kommen. Wahrscheinlich werden die nach der Membranfusion im canali­culären Kompartiment vorhandenen H+,K+-ATPasen durch das Verknüpfungspro­tein Ezrin mit β-Aktin­filamenten verbunden (Publikation 3).

In Parietalzellen kommt Ezrin nicht nur apikal, sondern auch an der basolatera­len Plasmamembran vor wo es möglicherweise in einer nicht-Aktin-bindenden Ru­heform über das MAGUK-Protein SAP 97 mit der Plasmamembran verbunden ist (Publikation 3).

Der Mechanismus des Fusionsvorgangs der tubulären Vesikel mit der canali­culären Membran war bisher nicht bekannt. In Parietalzellen konnten die neurona­len SNARE-Proteine Synaptobrevin 2, Syntaxin 1 und SNAP25 sowie das zur Familie der kleinen G-Proteine gehörende Protein Rab3A und die Regulatorproteine NSF und α, β-SNAP nachgewiesen werden. Das Vorhandensein dieser Proteine in Pa­rietalzellen legt einen Fusionsmechanismus nahe, der in Neuronen der Fusion synaptischer Vesikel mit der präsynaptischen Membran zugrunde liegt (Publikatio­nen 4 und 5). Im Unterschied zu Neuronen kommen diese Proteine jedoch in Pa­rietalzellen alle in einer jeweils identischen subzellulären Verteilung vor; in ruhen­den Zellen befinden sie sich hauptsächlich im tubulovesikulären Kompartiment und verteilen sich nach Stimulation in das canaliculäre (Publikationen 4 und 5).

Das in Parietalzellen gefundene Verteilungsmuster der SNARE-Proteine ent­spricht somit nicht der klassischen Vorstellung einer heterotypischen Membranfu­sion (Q-SNARE-Proteine wie Syntaxin und SNAP25 auf der Zielmembran und R-SNARE-Proteine wie Synaptobrevin auf der Vesikelmembran). Vielmehr entspricht diese Verteilung einer homotypischen Fusion, wie sie für Vakuolen in Hefezellen beschrieben wurde. In Parietalzellen laufen während der Stimulation daher eine Kombination von homotypischen und heterotypischen Fusionen ab. Verschiedene tubuläre Vesikel fu[Seite 47↓]sionieren untereinander nach dem Modell der homotypi­schen Fusion. Einzelne heterotypische Fusionsereignisse mit der canaliculären Plas­mamembran ermöglichen dann den Zugang zum Drüsenlumen.

Die Bedeutung der SNARE-Proteine für die Fusion der tubulären Vesikel mit der canaliculären Membran und damit für die Steigerung der HCl-Sekretion konnte durch Inkubation Streptolysin-O-permeabilisierter Parietalzellen mit Tetanus Neu­rotoxin (TeNt) gezeigt werden (nicht permeabilisierte Zellen nehmen das Toxin nicht auf). Als Protease spaltet TeNt hochselektiv Synaptobrevin, führt aber zu keiner weiteren Beeinträchtigung der behandelten Zellen. Das Fehlen von Synaptobrevin verhindert die Ausbildung des SNARE-Haftkomplexes, der für die eigentlichen Fusion unerläßlich ist. Die Behandlung der Parietalzellen mit TeNt führte zum vollständ-igen Ausbleiben der, nach Stimulation mit cAMP bei Kontrollzellen beobachteten Erhöhung, der Säuresekretion (Publikation 5).