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1  Einleitung

1.1 Grundlagen des Asthma bronchiale

Asthma bronchiale gehört wegen seiner hohen Prävalenz zu den Volkskrankheiten der westlichen Welt. In Deutschland leiden ca. 6-8% der erwachsenen Bevölkerung an Asthma während bei Kindern die Häufigkeit mit über 10% eingeschätzt wird (1). Dadurch kommt der Erkrankung erhebliche gesundheitspolitische und folglich volkswirtschaftliche Bedeutung zu. Asthma bronchiale ist eine entzündliche Atemwegserkrankung, die durch bronchiale Hyperreaktivität, überschießende Bronchokonstriktion, Bronchialwandödem und Hypersekretion charakterisiert ist. Klinisch manifestiert sich Asthma mit anfallsweiser Luftnot, Husten, Giemen und Thoraxenge. Diese Symptome treten vor allem nachts und in den frühen Morgenstunden auf. Nach Häufigkeit der Beschwerden wird die Erkrankung in intermittierendes und persistierendes (chronisches) Asthma unterteilt. Die Genese ist im wesentlichen allergisch (extrinsisches Asthma) oder nicht-allergisch (intrinsisches Asthma).

Der Schweregrad und der Verlauf werden durch das Ausmaß der Atemwegsentzündung, das Vorliegen einer allergischen Prädisposition und durch genetische Faktoren bestimmt (1). Die Therapie der Erkrankung richtet sich nach den Schweregraden und zielt auf die Minderung der Atemwegsentzündung und die Relaxation der Bronchialmuskulatur. Dafür stehen eine Reihe von Medikamenten zur Verfügung von denen in der Hauptsache Glukokortikoide die antientzündliche und β2-Sympathomimetika die antiobstruktive Basismedikation darstellen (1).


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1.2  Pathogenese des Asthma bronchiale

Die zugrundeliegende Atemwegsentzündung ist ein komplexer humoraler und zellulärer immunologischer Prozeß, welcher der Aufrechterhaltung und Wiederherstellung der Gewebshomöostase der Atemwege dient (1).

Die Erkrankung ist auf zellulärer Ebene durch submucöse Infiltration mit Immuneffektorzellen wie aktivierten Monozyten, Makrophagen, Eosinophilen, Neutrophilen und T-Lymphozyten (2, 3) charakterisiert. Sowohl infiltrierende Entzündungszellen als auch gewebsständige Zellen wie Atemwegsepithel-, -endothelzellen und Bronchialmyozyten steigern die Expression und Freisetzung von Mediatoren wie Zytokine und Prostanoide, die das Ausmaß und den Verlauf der Atemwegsentzündung beeinflussen (4).

Genetische Prädispositionen oder Umweltfaktoren führen zur Produktion von IgE, welches zur Auslösung der Entzündungskaskade führt. Die Bindung an hoch und niedrig affine IgE Rezeptoren (FCeRI und FCeRII) führt zur Degranulation von Mastzellen mit Sekretion von Histamin, Leukotrienen und Prostaglandinen, welche die als asthmatische Frühreaktion bezeichneten Veränderungen der Atemwege wie Bronchialwandödem, Dyskrinie und Muskelkontraktion vermitteln. Parallel dazu kommt es zur präferentiellen Differenzierung von Th-0 Vorläuferzellen zu Th-2 Lymphozyten, deren spezifische Zytokine IL-4, 5, 10, 13, und IFNγEosinophile, Alveolarmakrophagen und T-Lymphozyten aktivieren. Diese zweite Welle der Entzündung führt zur Verstärkung der Muskelkontraktion, Ödembildung sowie Dyskrinie und bildet die asthmatische Spätreaktion. Im Folgenden wird durch die migrierten Entzündungszellen eine Vielzahl von Mediatoren (Zytokine, Prostanoide, ECP, MBP) freigesetzt, welche die Entzündungsreaktion aufrechterhalten und so strukturelle Veränderungen der Atemwege wie Epithelschädigung, Zunahme der Bronchialmuskulatur und Drüsenhypertrophie bedingen. Die chronische Entzündung führt im weiteren zum Umbau der Atemwege mit Bronchialwandverdickung (Atemwegsremodelling) und therapeutisch schwer beeinflußbarer Atemwegsobstruktion (5, 6).


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1.3  Immuneffektorzellen der asthmatischen Entzündung

1.3.1 Mastzellen

Mastzellen sind die am längsten bekannten Effektorzellen der asthmatischen Entzündung. Die IgE vermittelte Degranulation bedingt die Freisetzung von Histamin, Prostaglandin D2 und der Leukotriene C4, D4 und E4, welche in präformierten Vesikeln gespeichert werden. Neben der Bronchokonstriktion führen diese Mediatoren zur vaskulären Permeabilitätssteigerung und zur Rekrutierung von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten. Weiterhin exprimieren aktivierte Mastzellen Zytokine wie IL-5, IL-8, GM-CSF und TNFα, welche den entzündlichen Prozeß prolongieren und so die asthmatische Spätreaktion triggern. Die pathophysiologische Rolle der Mastzelle ist lediglich auf die asthmatische Frühreaktion beschränkt. Der weitere Verlauf der Entzündung wird auf zellulärer Ebene vor allem durch Eosinophile, Makrophagen, Monozyten und T-Lymphozyten bestimmt (7).

1.3.2 Makrophagen und Monozyten

Monozyten und Alveolarmakrophagen regulieren die Immunantwort und die Entzündungsreaktion (8). Alveolarmakrophagen sind aus Monozyten differenziert, kontrollieren die T-Zell Proliferation, haben Bedeutung für die Aufrechterhaltung der pulmonalen Gewebshomöostase und sind an der Antigenpräsentation beteiligt (9). Makrophagen finden sich vermehrt in der Atemwegsmukosa von Asthmatikern. Sie exprimieren verschiedene Oberflächenmarker wie CD23, CD68, CD14, den MHC Klasse II Rezeptor und Zytokinrezeptoren. Zusammen mit T-Lymphozyten bilden Makrophagen die erste immunologische Verteidigungslinie gegen inhalierte Pathogene. Allergenkontakt aktiviert Monozyten und Makrophagen gleichermaßen, wodurch sich das Profil der freigesetzten Mediatoren hin zu proinflammatorischen Zytokinen verschiebt (10). Im Rahmen der asthmatischen Entzündungsreaktion sezernieren Alveolarmakrophagen stimulierende [Seite 9↓]Zytokine wie IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6 und GM-CSF, wohingegen die Expression antiinflammatorischer Zytokine wie IL-10 vermindert ist. (5, 11-14).

1.3.3 Eosinophile

Die Infiltration der Atemwegsmukosa mit Eosinophilen ist ein spezifisches Charakteristikum der asthmatischen Entzündungsreaktion. Aber auch in der BAL Flüssigkeit und im peripheren Blut finden sich bei Asthmatikern vermehrt eosinophile Granulozyten. Eosinophile exprimieren verschiedene Klassen von Entzündungsmediatoren, die einerseits als präformierte und andererseits als de-novo- synthetisierte Sekretionsprodukte vorliegen. Hierbei handelt es sich um Lipidmediatoren (Prostanoide), Zytokine (GM-CSF, IL-3, IL-5), basische Proteine (MBP, ECP), Enzyme (Metalloproteinasen, Kollagenasen) und Sauerstoffmetabolite (H2O2). Hervorzuheben ist die hohe Konzentration der präformierten und in Vesikeln gespeicherten basischen Proteine. Ihre Funktion umfasst in erster Linie die zytotoxische Wirkung auf Parasiten, Tumorzellen und Bronchialepithelzellen. Dadurch sind eosinophile Granulozyten entscheidend an der entzündlichen Zerstörung des Bronchialepithels beteiligt. Die Freisetzung von IL-5 führt im Sinne eines autokrinen Feedbackmechanismus zur Verhinderung der eigenen Apoptose und damit zur Verlängerung der Eosinophilenüberlebenszeit, so daß der entzündliche Prozeß prolongiert wird. Die vielfältigen Wirkungen der eosinophilen Granulozyten, die durch das breite Spektrum der freigesetzten Mediatoren bedingt sind, verleihen dieser Zelle eine Schlüsselstellung in der Pathogenese des Asthma bronchiale (15-17).

1.3.4 T-Lymphozyten

In der BAL und Schleimhautbiopsien von Asthmatikern finden sich charakteristischerweise vermehrt T-Lymphozyten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen. Durch die Freisetzung spezifischer Zytokine, welche die Differenzierung und Aktivierung von Eosinophilen und [Seite 10↓]Mastzellen sowie die Rekrutierung von Entzündungszellen regulieren, sind T-Lymphozyten in die Aufrechterhaltung der chronischen Entzündung involviert. In dieser Funktion sind sie auch an der Allergenerkennung und der Regulation des Entzündungsablaufes beteiligt. Beim allergischen Asthma kommt es zur präferentiellen Differenziereung von CD4+ Lymphozyten zum Th-2 Subtyp, der durch die Sekretion der Asthma spezifischen Zytokine IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 wesentlichen Einfluß auf die IgE Synthese in B-Lymphozyten und die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen hat und somit die allergische Reaktion prolongiert (18, 19).

1.3.5 Atemwegsepithelzellen

Das Atemwegsepithel stellt ähnlich wie das Darmepithel die Grenzfläche zwischen der Außenwelt und dem organspezifischem Gewebe dar. In dieser Eigenschaft ist das Atemwegsepithel von entscheidender Bedeutung für die Gewebshomöostase. Bei Asthmatikern zeigt sich unabhängig vom Schweregrad eine Schädigung der Epithelschicht und damit eine Unterbrechung der physiologischen Barriere zwischen Umwelt und Organismus. Durch die Freisetzung von Mediatoren und die Expression von Adhäsionsmolekülen triggern Epithelzellen die Rekrutierung und Aktivierung von Entzündungszellen wie Eosinophile, Makrophagen und T-Lymphozyten. Dieses erklärt die immunmodulatorische Funktion der Atemwegsepithelzellen (20, 21).

1.3.6 Atemwegsmyozyten

Die Rolle der glatten Muskulatur in der Pathogenese des Asthma bronchiale ist bisher nicht hinreichend charakterisiert. Unstrittig ist die kontraktile Funktion der glatten Muskelzelle. Morphometrische Studien kleiner Atemwege von Asthmapatienten zeigten eine Zunahme der glatten Muskulatur der Bronchialwände (22, 23), die nach weiterer histologischer Charakterisierung zur Einteilung der Patienten in zwei Typen führte. Bei Typ I Asthmatikern [Seite 11↓]ist die Zunahme der Muskelmasse der Bronchien durch Hyperplasie verursacht und bleibt auf die großen Atemwege beschränkt. Im Unterschied dazu besteht bei Typ II Asthmatikern eine Hypertrophie der glatten Muskulatur im gesamten Bronchialsystem (24).

Die Äthiopathogenese von Hyperplasie und Hypertrophie ist trotz nachgewiesener proliferationsfördernder Wirkungen von Mediatoren wie PDGF, Histamin und Endothelin nicht umfassend geklärt (24).

Der Nachweis der Expression und Freisetzung von Zytokinen (RANTES, IL-8, GM-CSF) belegt das synthetische Potential glatter Muskelzellen der Atemwege (25-27). In der Zellkultur konnte durch den Einfluß proinflammatorischer Zytokine ein Wechsel von der Kontraktilität zur Synthese nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen führten zur Hypothese der Phänotypplastizität von Bronchialmyozyten, d.h. der reversible Übergang der Muskelzelle vom kontraktilen in den synthetischen Aktivitätszustand (4, 28). Dieser Pathomechanismus erklärt den Umbau der Atemwege (Atemwegsremodelling) mit Bronchialwandverdickung und klinisch progredienter Atemwegsobstruktion (6).

1.4 Zytokine

1.4.1 Zytokine und Zytokinnetzwerk

Zytokine sind Proteine, welche die interzelluläre Signalübertragung vermitteln. Sie werden in verschiedenen Zelltypen exprimiert und entfalten ihre Wirkung über spezifische Rezeptoren an der Zelloberfläche. Zytokine vermitteln die Signaltransduktion vorrangig parakrin, also zwischen benachbarten Zellen. Aber auch entfernt liegende Zellen können durch Zytokine beeinflußt werden, denen damit auch eine endokrine Funktion zukommt. Sie sind aber auch in der Lage, im Rahmen eines autokrinen Mechanismus ihre eigene Produktion in den Quellzellen zu regulieren.

Zytokine vermitteln auf verschiedenen Ebenen die Zell-Zell Kommunikation und umfassen die Gruppe der Wachstumsfaktoren, der Chemotaxine und Interleukine. Durch sie werden [Seite 12↓]weitreichende zelluläre Funktionen wie Aktivierung, Proliferation, Chemotaxis, Immunmodulation, Mediatorfreisetzung, Wachstum, Zelldifferenzierung und Apoptose reguliert. Es gilt als sicher, dass verschiedene Zytokine simultan freigesetzt werden und sich in ihrer Wirkung überlappen. Dadurch entsteht ein Zytokinnetzwerk, welches die individuellen Funktionen einzelner Zytokine nur schwer abschätzbar macht.

Der inflammatorische Prozeß führt in den Atemwegen zur Aktivierung von Mastzelllen, Eosinophilen, Makrophagen und T-Lymphozyten mit Freisetzung einer Vielzahl von Asthma spezifischen Zytokinen. Dazu zählen die aus Th-2 Lymphozyten freigesetzten Interleukine 3, 4, 5, 10, 13 und der Wachstumsfaktor GM-CSF. Weitere wichtige Zytokine sind die aus Makrophagen freigesetzten C-C Chemokine RANTES, MIP-1α, MCP-1 und MCP-2, welche die Rekrutierung von Entzündungszellen steuern. Zytokine spielen auch bei der Antigenpräsentation eine wesentliche Rolle, indem sie zur Funktionssteigerung der Alveolarmakrophagen als Antigen präsentierende Zellen führen. Die Regulation der Expression von Adhäsionsmolekülen auf residenten Zellen (Endothel-, Epithelzellen) und migrierten Entzündungszellen wird durch Zytokine ebenfalls maßgeblich gesteuert. So erhöht IL-4 die Expression von VCAM-1 auf Endothel- und Epithelzellen und steigert damit die Adhäsion von Eosinophilen und Lymphozyten. IL-1β und TNFα stimulieren die Expression von ICAM-1 auf residenten Zellen der Atemwege (10, 29, 30).

1.4.2 Antiinflammatorische Zytokine

Neben den gut untersuchten proinflammatorischen Mechanismen der asthmatischen Entzündung existiert eine Reihe von bisher weniger beachteten endogenen Gegenregulationsmechanismen wie die Expression antiinflammatorischer Zytokine, die den Schweregrad und den Verlauf der Entzündungsreaktion wesentlich mit beeinflussen. Bedeutsam sind dabei die Th-2 Zytokine IL-10 und IL-13.


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Interleukin-10 ist ein 18KDa Polypeptid, welches ursprünglich als ”Cytokine Synthesis Inhibitor” als Produkt von Th-2 Zellen beschrieben wurde und besitzt vielfältige antiinflammatorische Effekte, die für die Regulation der Entzündungsantwort von Bedeutung sind. IL-10 wird neben Th-2 Zellen von CD8+ T Zellen, Monozyten, Makrophagen und aktivierten B Zellen exprimiert und freigesetzt (31). IL-10 vermittelt als Zytokin Signaltransduktionsmechanismen vor allem zwischen Lymphozyten aber auch zwischen Monozyten und Makrophagen. Die Funktion von IL-10 liegt in der Inhibition der Funktion von Monozyten/Makrophagen, T Zellen und NK Zellen (32-34). Im Monozyten/Makrophagen System inhibiert IL-10 die Expression von Adhäsionsmolekülen (HLA-DR, CD16, CD32, CD64). Weiterhin hemmt IL-10 auf transkriptioneller Ebene die Produktion von Zytokinen wie IL-1, IL-5, IL-6, IL-8, TNFα und GM-CSF (35, 36). Dabei wird durch IL-10 der Transkriptionsfaktor NFκB geblockt, der die Gentranskription der proinflammatorischen Zytokine heraufreguliert (37). Im Tiermodell der Maus wurde eine protektive Wirkung von IL-10 gegenüber einer letalen Endotoxindosis beschrieben (38). Durch die späte Expression (24h nach Stimulation) und die Fähigkeit zur Autoregulation spielt IL-10 eine Schlüsselrolle in der Regulation der Entzündungsantwort im Monozyten/Makrophagen System (32). Darüberhinaus stimuliert IL-10 die Expression des IL-1 Rezeptorantagonisten und komplettiert somit die antiinflammatorische Wirkung.

Interleukin-13 wird von Th-1 und Th-2 Lymphozyten exprimiert und gilt als wichtiger Modulator der Monozyten- und B Zellfunktion. Es beeinflußt die Monozytenmorphologie, die Antigenexpression, die Antikörper vermittelte Zelltoxizität und die Zytokinsynthese (39, 40). Ähnlich wie IL-4 stimuliert IL-13 die Expression von B1- Integrin, VCAM-1 und die Produktion von IL-6 und MCP-1 in pulmonalen Fibroblasten (41). Weiterhin inhibiert IL-13 die RANTES und IL-8 Produktion in humanen Bronchialmyozyten (25, 26) und vermindert die Transkription von IFN-γ und IL-12 (42-44). Dadurch führt IL-13 über die IL-12 vermittelte Inhibition der Th-1 Zellen zur Asthma spezifischen Th-2 Differenzierung. Dieses [Seite 14↓]erklärt auch die Heraufregulation von IL-13 in der Atemwegsmukosa von Asthmatikern (45) und die Korrelation zur Eosinophilie in der broncho-alveolären Lavage nach segmentaler Allergenprovokation (16).

1.5 Zielstellung der Arbeit

Nach dem Kenntnisstand zu Beginn der experimentellen Untersuchungen für diese Arbeit triggern proinflammatorische Mediatoren die Atemwegsentzündung und führen zur Induktion der Zellproliferation. Das zum damaligen Zeitpunkt neu entdeckte proinflammatorische C-C Chemokin MIP-1α aktiviert T Lymphozyten, induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Epithelzellen und triggert auf diese Weise die entzündliche Reaktion. MIP-1α wird in Makrophagen und Monozyten exprimiert und scheint in der Pathogenese des Asthma bronchiale Bedeutung zu haben. Unter der Annahme, dass antiinflammatorische Zytokine die MIP-1α Expression regulieren und eine Imbalance zwischen pro- und antiinflammatorischen Zytokinen als zusätzlicher Mechanismus in der Pathogenese des Asthma bronchiale bedeutsam ist, bestand die Zielstellung der Arbeit darin, am Beispiel von MIP-1α die Wirkungsweise antiinflammatorischer Zytokine (IL-10, IL-13) auf die Expression proinflammatorischer Zytokine im Monozyten/Makrophagen System zu untersuchen.

Folgende Fragen sollten dabei beantwortet werden.

  1. Inhibieren IL-10 und IL-13 die Expression proinflammatorischer Schlüsselzytokine wie MIP-1α in ex vivo kultivierten Monozyten und Alveolarmakrophagen?
  2. Liegt eine Störung der Interleukin-10 Expression in Alveolarmakrophagen bei Asthmatikern vor?
  3. Ist die Il-10 Expression durch inhalative Steroide zu beeinflussen? Wie reagieren klinische Parameter der Atemwegsentzündung?
  4. Ist IL-10 an der Regulation der asthmatischen Spätreaktion beteiligt?


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In eigenen immunhistochemischen Untersuchungen an Bronchialbiopsien von Asthmatikern zeigte sich im Bereich der glatten Muskulatur eine positive Färbung für das Chemokin RANTES (Abb. 1). Gegenstand dieser Untersuchungen war der Entzündungsprozeß in der Bronchialwand.

Abb. 1 RANTES –Immunfärbung im Bereich der glatten Muskulatur in der Bronchialbiopsie eines Asthmatikers.

Diese Beobachtung führte zu der Hypothese, dass Bronchialmyozyten im Rahmen des chronisch entzündlichen Prozesses der Atemwege in der Lage sind, Chemokine wie RANTES zu exprimieren. Daraufhin untersuchten wir an der zum damaligen Zeitpunkt neu etablierten Bronchialmyozytenkultur den Effekt der Asthma spezifischen Zytokine TNF-α, IFN-γ, IL-1β sowie der antiinflammatorischen Zytokine IL-4, IL-10 und IL-13 auf die Expression und Freisetzung der Chemokine RANTES und IL-8. Dabei sollte folgende weitere Frage beantwortet werden.


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05.01.2005