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8  Diskussion

8.1 Antiinflammatorische Zytokine

Interleukin-10 vermittelt immunsuppressive und antiinflammatorische Effekte. Dazu gehören die Synthesehemmung proinflammatorischer Zytokine und Chemokine wie IL-1β, TNF-α, MIP-1α, RANTES und IL-8. Weiterhin reguliert IL-10 die Proliferation von CD4+ Lymphozyten über die Inhibition der IL-2 Freisetzung. Neben der Zytokinsynthesehemmung hat IL-13 zusätzlich stimulatorische Effekte im Rahmen der asthmatischen Entzündung. Dazu gehören die Induktion der B-Zell vermittelten IgE Synthese und der Eosinophilenmigration sowie die Verstärkung der bronchialen Hyperreaktivität.

Die Ergebnisse tragen zur Beantwortung der gestellten Hypothese bei, dass IL-10 und IL-13 die Expression des proinflammatiorischen Zytokins MIP-1α in Blutmonozyten und Alveolarmakrophagen auf Protein- und Genebene inhibieren.

Auf molekularer Ebene wird dabei eine Beteiligung der Transkriptionsfaktoren Stat-1 und Stat-3 an der IL-10 Rezeptor vermittelten Signalübertragung angenommen. Obwohl es gelungen ist, die genetische Struktur des IL-10 Rezeptors weitgehend aufzudecken und den Rezeptor zu klonen, sind die einzelnen Signaltransduktionsmechanismen nicht hinreichend klar. Unstrittig dagegen ist die IL-10 vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB (37, 49). Dennoch trägt dieses Phänomen nicht vollständig zur Erklärung der inhibitorischen Potenz bei. So hemmt IL-10 die IL-5 Synthese, obwohl diese von NFκB unabhängig reguliert wird. Die Blockade von endogenem IL-10 durch die Zugabe eines anti IL-10 Antikörpers führte zu einer Steigerung der Synthese proinflammatorischer Zytokine in Makrophagen und Monozyten (34). Daraus wurde die Hypothese der IL-10 Autoregulation entwickelt. Durch die späte Expression (24 h nach Allergenkontakt oder Stimulation) stellt IL-10 einen endogenen Gegenregulationsmechanismus des entzündlichen Prozesses dar. Diese Hypothese wird durch die vorliegenden Ergebnisse der klinischen Studie zum Einfluss der Allergenprovokation auf [Seite 24↓]die IL-10 Expression in Monozyten bei Asthma bronchiale untermauert. Es konnte gezeigt werden, dass Asthmapatienten mit allergischer Spätreaktion nach inhalativer Allergenprovokation eine signifikant erhöhte IL-10 Expression aufweisen. Im Gefolge der erhöhten MIP-1α Produktion ist diese IL-10 Erhöhung Ausdruck eines Autoregulationsmechanismus zur Kontrolle der entzündlichen Reaktion.

Die Ergebnisse der durchgeführten klinischen Studie zur Effektivität von inhalativem Budesonid zeigen, dass die IL-10 Genexpression und Proteinfreisetzung in Alveolarmakrophagen beim Asthma bronchiale herabreguliert ist. Die dadurch verminderte autoregulatorische Entzündungskontrolle bedingt eine vermehrte Produktion proinflammatorischer Zytokine, welche die Atemwegsentzündung prolongieren.

Außerdem konnte demonstriert werden, dass inhalative Steroide, neben den bekannten antiinflammatorischen Effekten, zu einer Heraufregulierung der IL-10 Synthese führen. Dieser Mechanismus war bisher unbekannt und komplettiert die entzündungshemmenden Effekte der Steroide. In derselben Studie konnte zusätzlich eine signifikante Reduktion der Atemwegshyperreagibilität, des exhalierten NO und der Eosinophilenzahl im Reizsputum sowie ein Anstieg der FEV1 unter Therapie mit inhalativem Budesonid demonstriert werden. Diese Parameter reflektieren den Grad der Atemwegsentzündung und sind daher gut als klinische Marker zur Therapiekontrolle des Asthma bronchiale geeignet.

Die Ursache der defizitären IL-10 Produktion beim Asthma bronchiale liegt möglicherweise auf genetischer Ebene. Kürzlich konnten Lim et al. einen IL-10 Genpolymorphismus bei Asthmatikern nachweisen, der für die verminderte IL-10 Expression verantwortlich zu sein scheint scheint (50).

Dies deutet auf eine zentrale Rolle von IL-10 in der Pathogenese des Asthma bronchiale hin. Die antiinflammatorischen Effekte von IL-10 implizieren einen therapeutischen Ansatzpunkt zur Therapie allergischer pulmonaler Erkrankungen. Erste vorliegende klinische Ergebnisse zeigten eine verminderte Expression von IL-1β und TNF-α in Blutzellen nach subkutaner [Seite 25↓]Applikation von rekombinantem IL-10 bei gesunden Probanden (51). Weitere Versuche erfolgten in der Therapie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen, wobei IL-10 zu einer Verbesserung der klinischen Situation beim steroidresistenten M. Crohn führte (52). Es bestehen zur Zeit jedoch keine Erfahrungen in der Langzeittherapie mit IL-10. Hinzu kommt, dass die Wirkung von IL-10 nicht losgelöst von den konzertanten Effekten des gesamten Zytokinnetzwerkes, welches den pulmonalen Entzündungsprozeß reguliert, betrachtet werden kann.

Weitere klinische Studien und molekularbiologische Untersuchungen zu Mechanismen der Signaltransduktion des IL-10 Rezeptors müssen erfolgen, um den therapeutischen Einsatz von IL-10 zu evaluieren.

Bezüglich der Rezeptor vermittelten Signaltransduktionsmechanismen von IL-13 ist bisher wenig bekannt, weshalb diese derzeit Gegenstand intensiver Forschung sind.

8.2 Die immunmodulatorische Funktion humaner Bronchialmyozyten

RANTES und IL-8 waren die ersten chemotaktischen Zytokine, deren Produktion durch Bronchialmyozyten gezeigt werden konnte. Weitere für die Pathogenese des Asthma bronchiale wesentliche Zytokine wie GM-CSF (27), IL-6 und IL-11 (53) wurden ebenfalls in Atemwegsmyozyten nachgewiesen. Hirst et al. konnten zeigen, dass humane Bronchialmyozyten durch IL-1β stimulierte Produktion von GM-CSF die Überlebenszeit der Eosinophilen erhöhen (11).

Der Nachweis der sekretorischen Rolle dieser Zellen erweitert den Blick in der Bewertung der glatten Muskulatur als Immuneffektorzelle in der Pathogenese des Asthma bronchiale.

Die Expression und Freisetzung von Chemokinen nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen belegen, dass Bronchialmyozyten integraler Bestandteil des Netzwerkes aus Zytokinen und Entzündungszellen sind und somit den Entzündungsprozeß aktiv beeinflussen (Abb. 2).


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Bekannt ist in diesem Zusammenhang weiterhin der proliferationsfördernde Einfluß der proinflammatorischen Zytokine TNFα, IL-1 und IL-6 auf Atemwegsmyozyten (54-57), was für das Atemwegsremodelling Bedeutung hat.

Abb. 2 Mechanismus der Chemokin-Freisetzung aus glatten Muskelzellen der Atemwege im Rahmen der asthmatischen Entzündungsreaktion. Die nach proinflammatorischer Stimulation aus Myozyten freigesetzten Chemokine führen über die Rekrutierung von Entzündungszellen zur Aufrechterhaltung des inflammatorischen Prozesses

Vor diesem Hintergrund wurde die Hypothese von der Myozyten-Phänotypplastizität entwickelt. Die Phänotypplastizität der Bronchialmyozyten bezeichnet deren Eigenschaft, reversibel vom kontraktilen in den synthetischen Phänotyp zu wechseln (Abb. 3).

Die Funktion des kontraktilen Phänotyps liegt in der Konstriktion und Aufrechthaltung der Wandspannung. Der synthetische Phänotyp spiegelt sich in der Synthese von Proteinen wie Zytokinen und Wachstumsfaktoren sowie der Deposition extrazellulärer Matrix wider (28).

Primär galt die Phänotypplastizität als ein Artefakt der Zellkultur, da die Kontraktilität kultivierter glatter Muskelzellen ebenso wie die Reversibilität der Phänotypänderungen wesentlich von den Kulturbedingungen beeinflußt wird (28). Der morphologisch [Seite 27↓]nachgewiesene Umbau der Bronchialwände mit Hyperplasie und Hypertrophie der glatten Muskulatur (Atemwegsremodelling) beim Asthma bronchiale sowie der Nachweis der synthetischen Funktion der Bronchialmyozyten widerlegen jedoch die These des Kulturartefakts.

Die pathophysiologische Rolle der Phänotypplastizität glatter Muskelzellen für das Asthma bronchiale ist zur Zeit Forschungsgegenstand und ein wichtiger Ansatzpunkt zum weiteren Verständnis der Mechanismen des Atemwegsremodellings sowie den daraus resultierenden klinischen Konsequenzen (28, 58-60). Kultivierte Bronchialmyozyten bieten dabei ein effektives Modell zum Studium des Einflusses pharmakologischer Substanzen auf die Proliferation und Syntheseleistung dieser Zellen. Die in vitro Kultivierung glatter Muskelzellen eröffnet hierbei neue Wege, um deren Rolle als Target -und Effektorzelle des chronisch inflammatorischen Prozesses auf molekularer Ebene zu untersuchen.

Abb. 3 Pathomechanismus der Phänotypplastizität von Bronchialmyozyten mit reversiblem
Übergang vom kontraktilen in den synthetischen Typ mit Freisetzung von Mediatoren zur
Regulation der asthmatischen Entzündungsreaktion.


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Im Folgenden werden kurz die Methodik und Möglichkeiten der Bronchialmyozytenkultur diskutiert.

Die Entwicklung der Langzeitkultur von Bronchialmyozyten schaffte die wesentlichen Voraussetzungen zur Untersuchung der Entzündungsantwort auf Protein- und Genebene. Dabei wurden die Expression und Kopplung von Rezeptoren, Wege der intrazellulären Signaltransduktion, die Desensibilisierung der Rezeptorantwort und Ionenkanal-vermittelte Immunreaktionen sowie die Regulation der Expression von Enzymen und Muskelproteinen untersucht (61-64). Zusätzlich bietet die Langzeit-Bronchialmyozytenkultur die Möglichkeit eines in-vitro Test-Systems antiinflammatorischer Substanzen (65).

Eine effektive und damit häufig angewandte Methode zur Gewinnung von Myozyten-Primärkulturen ist die enzymatische Dissoziation von Myozyten der Trachea oder der Hauptbronchien.

Die erfolgreiche Anzucht von Bronchialmyozyten hängt im wesentlichen vom Zeitintervall zwischen der Explantation und der Kultivierung sowie der sauberen Dissektion von der Matrix und dem umliegendem Gewebe ab. Humane Atemwegsresektate sind von Transplantatempfängern, von Lungenresektionen sowie Sektionen zu erhalten. Dabei weisen die Kulturergebnisse von Lungenresektaten die besten Erfolgsaussichten auf.

Lichtmikroskopisch imponieren kultivierte Bronchialmyozyten als Monolayer mit der typischen „Berg und Tal Konfiguration“ (66). Bei konfluentem Wachstum erscheinen die Zellen schleifen- bis spindelförmig mit zentralem ovalen Kern sowie dendritischen Fortsätzen (28). Elektronenmikroskopische Analysen haben das Vorhandensein von Myofilamenten für Myozyten im kontraktilen Status belegt. Bei proliferierenden Zellen sind diese nicht oder nur gering nachweisbar.

Immunhistochemisch wurden bei konfluenten Bronchialmyozyten nach Primärkultivierung und während der ersten drei Passagen wichtige Proteine für die Regulation der Kontraktilität (Myosin-Schwerketten, Desmin, Myosin-Leichtketten-Kinase, Caldesmin, Calponin) [Seite 29↓]nachgewiesen (67, 68). Die Expression von alpha-Actin und anderen Markern der Kontraktion vermindert sich mit zunehmender Passage im Rahmen der Subkultivierung. Das spricht für eine verminderte Kontraktilität und reflektiert die Tendenz zum irreversibel synthetischen Phänotyp bei jeder weiteren Zellpassage (28, 69).

Zu der Vielzahl von funktionell gekoppelten Rezeptoren bei Bronchialmyozyten- Primärkulturen (66) gehören die G-Protein vermittelten Rezeptoren für Endothelin (70), TNF-α (p55, p75) (71) und Histamin. Weiterhin exprimieren Bronchialmyozyten funktionell gekoppelte β2 , muscarinerge M2 und M3 sowie Bradykinin B2 Rezeptoren (66). Kürzlich wurde an Atemwegsmyozyten im Hundemodell eine reziproke Phänotypregulation von funktionell gekoppelten B2 und M3 Rezeptoren beobachtet. Dabei wiesen kontraktile Zellen gekoppelte M3 Rezeptoren auf, synthetische Zellen vorwiegend B2 Rezeptoren (72). In Trachealmyozytenkulturen von Meerschweinchen wurden zusätzlich H2 Rezeptoren gefunden (73).

Das Phänomen des Rezeptorenverlustes bei der Primärkultivierung sowie eine abnehmende Rezeptordichte während weiterer Subkultivierungen (28, 74-76) ist für die Interpretation rezeptorpharmakologischer Untersuchungen von Bedeutung.

In Analogie zur Membranrezeptorexpression kann die Bronchialmyozytenkultur hervorragend für Langzeituntersuchungen zur Expression von Ionenkanälen genutzt werden (77-79). Dies gilt zum Beispiel für die Kopplung von muskarinergen Rezeptoren mit spannungsabhängigen Kalziumkanälen (63).

Kürzlich konnte die Expression des pro-apoptotischen Fas Rezeptors auf der Bronchialmyozytenmembran nachgewiesen werden (80). Das macht neben der Rezeptor vermittelten Kontraktilität und Proliferation auch eine Rezeptor regulierte Apoptose der glatten Muskelzelle wahrscheinlich.


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05.01.2005