Kalache, Karim Djaffar: Die Fetale intratracheale Lungenflüssigkeitsdynamik Eine Doppler-sonographische Studie der Atembewegungen beim menschlichen Fetus und im Tierexperiment

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Kapitel 3. Material und Methode

3.1 Untersuchungen am menschlichen Fetus

3.1.1 Patienten

Die Doppler-sonographische Studie wurde in einem Zeitraum von 2,5 Jahren (Januar 1996-Juni 1998) durchgeführt. Es wurde versucht, Ventilationsmessungen bei 300 Feten mit einem errechneten Gestationsalter zwischen der 20. SSW und dem Termin durchzuführen, bei denen FAB mittels Real-Time-Sonographie zu beobachten waren. Es handelte sich hierbei um schwangere Patientinnen, die im Rahmen der Schwangerschaftsvorsorge in die Abteilung Pränatale Medizin der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe des Universitätsklinikums Charité der Medizinischen Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin, Campus Charité Mitte überwiesen wurden. Das Gestationsalter der Patientinnen wurde anamnestisch nach Naegel´scher Regel geprüft. Es wurde bei Verdacht auf Terminunsicherheit durch eine Ultraschalluntersuchung mit Messung der gängigen biometrischen Parameter wie Kopfumfang, Abdomenumfang und Femurlänge gesichert. Maternale Erkrankungen, die das fetale Wachstum beeinflussen, wie beispielsweise eine schwangerschaftsinduzierte Hypertonie oder ein Diabetes mellitus, wurden ausgeschlossen. Keine der Schwangeren fand sich zum Untersuchungszeitpunkt unter der Geburt. Das Rauchen oder die Einnahme von Medikamenten, die die FAB beeinflussen, wie zum Beispiel ß-Mimetika oder Neuroleptika, schloß die Patientinnen ebenfalls von der Studie aus. Da die Studie eine Querschnittsstudie vorsah, wurde jede Patientin nur einmal untersucht.


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Abbildung 5. Frontalschnitt der fetalen Halsregion in der 36. SSW. Die Trachea stellt sich als eine flüssigkeitsgefüllte Säule in der langen Achse des fetalen Halses dar. PH: Pharynx; LA: Larynx; T: Trachea; TBC: Truncus brachiocephalicus.


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3.1.2 Datenerhebung

Alle Untersuchungen wurden am Vormittag durchgeführt. Die Patientinnen lagen dazu in Rückenlage mit leicht erhöhtem Kopf. Die Untersuchung dauerte zwischen 20 und 40 min, abhängig von der erfolgreichen Ableitung repräsentativer Doppler-Kurven. Die Untersuchung erfolgte mittels eines HDI-3000-Ultraschallgerätes der Firma ATL (Advanced Technology Laboratory, Solingen, Deutschland) mit Farb- und Spektral-Doppler-Option. Entsprechend dem maternalen Habitus und der Entfernung des Feten von den Bauchdecken wurde der Schallkopf von entweder 4-7 oder 2-4 MHz gewählt.

Abbildung 6. Frontalschnitt der fetalen Halsregion in der 36. SSW. Der exspiratorische Trachealfluß (rotes Signal) läßt sich im Farb-Doppler leicht vom Blutfluß in den Halsgefäßen (blaue Signale) unterscheiden. PH: Pharynx; LA: Larynx.

Abbildung 7. Ableitung der intratrachealen Flußgeschwindigkeiten bei einem Fetus in der 24. SSW. Das Sample Volume (SV) wird auf das intratracheale Farb-Doppler-Signal gelegt. Das entsprechende Doppler-Spektrum stellt sich als positive (Exspiration) und negative (Inspiration) Signale dar.

Sobald in der Übersichtsvergrößerung im Real-Time-Mode FAB als rhythmische Kontraktionen des Zwerchfells feststellbar waren, wurde die fetale Halsregion im Frontalschnitt eingestellt (Abbildung 5). Die fetale Trachea war bei geeigneter Vergrößerung in dieser Einstellung für den Zweck der Studie am besten beurteilbar. Sie stellte sich als


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flüssigkeitsgefüllte Säule in der langen Achse des fetalen Halses dar. Der Larynx befand sich dabei proximal des SV.

Nach optimaler Einstellung wurde der Farb-Doppler aktiviert, um den Trachealfluß nachzuweisen (Abbildung 6). Die initiale maximale Geschwindigkeit war auf 25 cm/s eingestellt und wurde entsprechend der maximalen Geschwindigkeit der abgeleiteten korrigiert. Die Nulllinie wurde so gewählt, daß sowohl die positiven maximalen Geschwindigkeiten als auch die negativen maximalen Geschwindigkeiten darstellbar waren. Der Hochpaßfilter wurde auf ein Minimum eingestellt. Der Trachealfluß stellte sich in Abhängigkeit von der Strömungsrichtung alternierend in rot (zum Schallkopf hin) oder in blau (vom Schallkopf weg) dar und konnte damit leicht vom einheitlichen Blutfluß in den Halsgefäßen unterschieden werden.

Es wurde dann der SV über die Farbfläche der Trachea direkt unterhalb des Larynx positioniert (Abbildung 7). Die Breite des SV wurde so gewählt, daß er den Durchmesser der Trachea überdeckte und betrug 3 mm bis 5 mm. Es wurde versucht, einen möglichst kleinen Einschaltwinkel (kleiner 60°) einzuhalten. Eine Winkelkorrektur wurde in allen Fällen durchgeführt Die Ableitungen wurden im Duplexverfahren mit simultaner Darstellung von B-Bild- und Doppler-Spektren durchgeführt. Dadurch konnte jederzeit eine Korrektur des Einfallswinkels oder eine Positionierung des SV vorgenommen werden. Durch diese Technik ließ sich ein klares Bild der Doppler-Spektren darstellen. Entsprechend den Atemphasen zeigte sich ein sinusoidales Flußbild mit positiven Spektren während der Exspiration und negativen Spektren während der Inspiration.

In 5 Fällen befand sich der Larynx distal des SV und es mußte eine Invertierung des Flußbildes durchgeführt werden, um eine einheitliche Darstellung mit Exspiration oberhalb und Inspiration unterhalb der Nullinie zu erhalten. In jedem Falle wurde versucht, die maximal mögliche Anzahl von aufeinanderfolgenden Atemzyklen abzuleiten. Die Ableitung wurde mit der niedrigsten Durchlaufgeschwindigkeit durchgeführt. Die Untersuchung wurde auf einem S-VHS-Videorekorder (Panasonic AG 7350) aufgenommen.

Anschließend wurde der innere Durchmesser der Trachea in Höhe des SV On-Line ausgemessen. Dazu wurde mittels Cine-Loop-Technik ein geeignetes Bild der Trachea ausgewählt und mit der Zoom-Funktion in eine geeignete Vergrößerung zur exakten Positionierung der Meßpunkte gebracht.


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3.1.3 Datenanalyse

Die auf Video aufgezeichneten Doppler-Spektren wurden im Slow-Motion-Mode betrachtet. Mit Hilfe dieser Technik konnte eine Vorauswahl der Atemperioden getroffen werden. Die Bilder der Doppler-Kurven wurden in digital speicherbare Einzelbilder zerlegt. Die Speicherung erfolgte in einem klinisch orientierten Datenspeicherprogramm PIA (Professional Image Achiving, Deutschland). Nach Komprimierung der in Einzelbilder zerlegten Atemschleifen in einem TIF (tagged image file)-Format wurden diese in das Bildverarbeitungsprogramm Adobe Photoshop® (Version 4.0) transferiert. Die Doppler-Kurven wurden dann entsprechend aus dem gespeicherten Duplex-Ultraschallbild herausgeschnitten. In einem letzten Schritt wurden in dem Präsentationssprogramm Microsoft® PowerPoint® (Version 7.0) diese digital kalibrierten Einzelbilder maßstabsgerecht zu den mit Video aufgenommenen originalen Atemepisoden wieder zusammengesetzt. Durch die Länge der Atemepisoden war es jedoch nicht möglich, diese Kurven in ihrer Gesamtheit auf dem Bildschirm zu betrachten. Dem wurde abgeholfen, indem die unvollständig zusammengesetzten Atemabschnitte ausgedruckt wurden, und daraus ein Papierstreifen entsprechend der Länge der Atemepisode hergestellt werden konnte. Auf diese Weise standen nun die Atemperioden als Ganzes dem Betrachter zur Verfügung.

Abbildung 8. Doppler-Spektren während der unterschiedlichen Atemperioden.

(A) Regelmäßig symmetrisch.

(B) Regelmäßig asymmetrisch.

(C) Unregelmäßig.


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Nach visueller Betrachtung dieser als Papierstreifen vorliegenden Atemperioden fiel auf, daß zwischen einem regelmäßigen und einem unregelmäßigen Atemmuster eindeutig unterschieden werden konnte (Abbildung 8). Die unregelmäßigen Atemmuster stellten sich asymmetrisch mit variabler Amplitude und Dauer der einzelnen Atemzyklen dar, während wir bei regelmäßiger Atmung mehrere aufeinanderfolgende symmetrische Atemzyklen beobachten konnten. Wir definierten eine regelmäßige Atemepisode, wenn mindestens fünf oder mehr hintereinander ununterbrochene symmetrische Atemzyklen vorkamen. Die entsprechende Sequenz wurde für die Analyse der fetalen Ventilation gewählt.

3.1.4 Ventilationsparameter

Die Analyse der ausgewählten Atemzyklen erfolgte Off-Line mit Hilfe des Computer-Analyse-Systems Image Vue DCR (Nova Microsonics, Mahweh, New Jersey, USA). Dazu wurden die regelmäßigen Atemphasen auf dem Video aufgesucht und auf dieses Programm überspielt, die Zeit- und Geschwindigkeitsskalen wurden kalibriert.

Aus den fünf ausgewählten Kurven wurden jeweils folgende Parameter bestimmt: (1) Dauer der Inspiration (Ti) gemessen vom Beginn der Inspiration bis zum Beginn der Exspiration, (2) Dauer der Exspiration (Te) gemessen vom Beginn der Exspiration bis zum Beginn der folgenden Inspiration, (3) die über die Dauer der Inspiration integrierte intensitätsgewichtete maximale Geschwindigkeit (TVIi), und (4) die über die Dauer der Exspiration integrierte intensitätsgewichtete maximale Geschwindigkeit (TVIe).

Das fetale Atemzugsvolumen (Vol) läßt sich bei Annahme, daß die Trachea zylinderförmig ist, mit folgender Formel berechnen:

Vol = pi . (TD/2) 2 . TVI.

Folgende Faktoren sind außerdem bestimmend: (1) Der TD verändert sich während der Ventilation unwesentlich. (2) Die Lungenflüssigkeit im Gegenteil zum Blut beinhaltet keine oder nur wenige Partikel, das Strömungsprofil während der FAB ist dementsprechend flach und die maximale Geschwindigkeit über den gesamten Querschnitt der Trachea gleichermaßen verteilt.


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3.1.5 Statistische Auswertung

Die Daten wurden in fünf Gruppen unterteilt entsprechend dem Gestationsalter zum Zeitpunkt der Untersuchung und die Ergebnisse als Gruppenmediane angegeben. Die Daten waren zum Teil unregelmäßigen Verteilt. Es mußte daher von einer Mittelwertberechnung pro Gruppe mit Angabe der Standardabweichung abgesehen werden. Es wurden für jede Datengruppe die Quartile geliefert. Die Werte sind in minimaler, unterer Quartil (0,25-Quantil), Median (0,5-Quantil), oberer Quartil (0,75-Quantil) und maximaler Wert angegeben. Die Kruskal-Wallis einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA=analysis of variance) für nicht parametrische Daten wurde für den Gruppenvergleich verwendet. Die Stichproben wurde dann paarweise mit dem Dunn’s Test verglichen. Ein Korrelationskoeffizient p le 0,05 wurde als signifikant betrachtet. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Statistikprogramm SigmaStat, Version 2,0.

Alle Untersuchungen wurden vom selben Untersucher durchgeführt (KDK). Das Studienprotokoll des Forschungsvorhabens "Untersuchung der Grundlagen der fetalen Lungenentwicklung und Reifung" als Teilvorhaben des BMBF-Forschungsprojektes "Perinatale Lunge" wurde der Ethikkommission der Humbolt-Universität zu Berlin der Charité vorgelegt und genehmigt.

3.2 Tierexperimentelle Untersuchungen

Die tierexperimentellen Untersuchungen wurden im Tierlabor der University College London Medical School in Zusammenarbeit mit dem Fetal and Neonatal Research Group des Department of Obstetrics and Gynaecology durchgeführt. Die Studie wurde in einem Zeitraum von 6 Monaten (Januar 1999 bis Juni 1999) erstellt. Es wurden die Feten von 20 Schafen des 66. bis 74. (Mittelwert, 70; SA, 2) errechneten Trächtigkeitstages (Termin 148 Tage) untersucht. Dieser Zeitraum entspricht etwa einer 18.-20. SSW beim menschlichen Fetus.


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3.2.1 Erhebung und Analyse der Daten

Alle Ultraschalluntersuchungen wurden ohne Gabe von Narkosemittel an die Mutter zur Beruhigung durchgeführt. Die trächtigen Muttertiere wurden einige Tage vor dem Beginn der Untersuchung in das Laboratorium gebracht, so daß sie sich der neuen Umgebung völlig anpassen konnten und so eine ungewöhnliche Streßsituation für die Tiere ausgeschlossen wurde. Jedes Tier wurde in die Rückenlage versetzt und in dieser für ca. 15 min durch einen Helfer festgehalten. Während dessen wurde ihm die Wolle im Bereich des unteren Abdomens entfernt. Danach führten wir mit einer fettlösenden Substanz eine Reinigung der freigescherten Region durch. Das Tier wurde dann von dieser Position befreit und nach ca. 10 min ein zweites Mal in die Rückenlage versetzt. Diese Prozedur ließ in der Regel eine Ultraschalluntersuchung von ca. 30 min zu. Danach wurden die Tiere unruhig und empfindlich, was in den meisten Fällen zur abrupten Beendigung der Untersuchung zwang.

Zum Aufsuchen der Trachea wurde zuerst der fetale Thorax eingestellt und kranialwärts verfolgt bis die fetale Halsregion sich im Querschnitt darstellte. Die Trachea stellte sich in dieser Schnittebene als die einzige echoleere Struktur in der vorderen Halsregion dar. Aus dieser Einstellung wurde dann in eine Längseinstellung übergegangen (Abbildung 9). Der innere Durchmesser der Trachea wurde in einer Einstellung gemessen, in der die Trachea parallel zum Schallkopf verlief. Es wurde darauf geachtet, daß die Messungen ca. 1 cm distal vom Larynx durchgeführt wurden. Zur Messung wurde das Bild mit dem breitesten Durchmesser gewählt. Dazu wurde per Cine-Loop-Mode ein geeignetes Bild der Trachea ausgewählt und mit der Zoom-Funktion in eine geeignete Vergrößerung zur exakten Positionierung der Meßpunkte gebracht. Es wurden jeweils 3 Bilder für die Off-Line-Messungen digital gespeichert.

Die Tiere wurden ca. 24 Stunden später mittels einer Überdosis Pentobarbitone getötet. Danach wurden die Feten per laparotomiam aus dem Uterus entnommen und die Nabelschnur durchtrennt. Die Trachea wurde nach vorderer Thorakotomie vorsichtig abpräpariert, von der Lunge getrennt und in einer physiologischen Lösung fixiert. Die Messungen unter dem Stereomikroskop wurden in der folgenden Stunde durchgeführt. Es wurde vorsichtig unter mikroskopischer Sicht in einer transversalen Ebene eine dünne Scheibe isoliert. Der Trachealring wurde ca. 1 cm distal vom Larynx entsprechend der Höhe, bei der die Ultraschallmessung


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durchgeführt worden ist, geschnitten. Der innere Durchmesser wurde in mehreren Ebenen abgefaßt und ein Mittelwert aus mindestens 3 Messungen gebildet.

Abbildung 9. Längseinstellungen der Halsregion bei einem Schafsfetus am 69. Tag mit Darstellung der Trachea. Der innere Trachealdurchmesser wurde in einer Einstellung gemessen, in der die Trachea parallel zum Schallkopf verlief (A).

3.2.2 Geräte

Für die Untersuchungen am Schafsfeten wurde ein Vingmed CFM 800 (Vingmed Sound, Horten, Norway) hochauflösendes Ultraschallgerät mit Zoom-, Cine-Loop-Funktion sowie Spektral- und Farb-Doppler, eingesetzt. Es wurde ein mechanischer 5 MHz- Schallkopf mit einer vom Hersteller angegebenen axialen Auflösung von weniger als 0,6 mm verwendet. Alle Meßwerte (B-Bild- und Doppler-Spektren) wurden auf ein S-VHS-Video (Panasonic AG 7350) aufgenommen. Die Daten wurden nachträglich mit dem Doppler-Spektrum-Analyse-Programm Echodisp analysiert.

Die postmortalen Messungen wurden mittels eines Stereomikroskops (Kyowa, Tokyo, Japan) mit einer 10fachen Vergrößerung


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sowie mit einem Mikrometer mit einer 3fachen Vergrößerung (Ealing Electro-Optics, Ealing, UK) durchgeführt.

3.2.3 Statistische Auswertung

Es wurde die Korrelation der sonographischen Daten mit den stereomikroskopischen Messungen berechnet. Die Übereinstimmung der stereomikroskopischen und sonographischen Messungen wurde mittels der sogenannten Bland-Altmann-Methode (1986) verglichen. Diese Methode ermöglicht die Überprüfung der Abweichungen der mittels verschiedener Messungen erhaltenen Ergebnisse. Es kann von einer guten Übereinstimmung ausgegangen werden, wenn der Mittelwert beider Messungen zwischen der Differenz von 2 Standardabweichungen der mikroskopischen und der sonographischen Messungen liegt. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS, Version 7.5.

Alle sonographischen sowie stereomikroskopischen Untersuchungen wurden von dem selben Untersucher durchgeführt. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der lokalen Richtlinie für tierexperimentelle Untersuchungen, die UK Home Office regulations and the Guidance for the Operation of Animals (Science Procedures) Act (1986) erstellt.


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