Kamradt, Thomas: Aktivierung und Differenzierung von T-Lymphozyten durch Infektion und Autoimmunität

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Aktivierung von Th-Zellen bei Infektion und Autoimmunität

3.1.1 Lyme Arthritis

3.1.1.1 B. Lengl-Janßen, et al., J. Exp. Med. 180, 2069-2078 (1994).

Die Hypothese, derzufolge die Th-Zellantwort auf B. burgdorferi zur Pathogenese der therapieresistenten Verlaufsform der Lyme Arthritis beiträgt, macht die überprüfbare Voraussage, dass Patienten mit einer akuten, durch Antibiotika heilbaren Lyme Arthritis und Patienten mit einer therapieresisten Lyme-Arthritis unterschiedliche Th-Zellantwort auf B. burgdorferi ausbilden. In der im folgenden abgedruckten Arbeit Lengl-Janßen, Strauss, Steere, &Kamradt, 1994 prüften wir diese Hypothese. Dazu wurden 313 verschiedene B. burgdorferi-spezifische T-Helferzellinien aus dem Blut oder der Synovialflüssigkeit von 5 Patienten mit therapieresistenter Lyme-Arthritis und 4 Patienten mit akuter Lyme-Arthritis angelegt. 87 T-Zellinien von Patienten mit akuter Lyme Arthritis und 112 T-Zellinien von Patienten mit therapieresistenter Lyme Arthritis wurden auf die Erkennung von fünf verschiedenen rekombinanten B. burgdorferi-Proteinen geprüft. Drei der untersuchten Antigene (OspC, p39 und p93) wurden jeweils nur von einem geringen Prozentsatz der untersuchten TZL erkannt. Ein weiteres der B. burgdorferi-Antigene, outer surface Protein B (OspB) sehr häufig von den untersuchten TZL beider Patientengruppen erkannt: 40% der TZL von Patienten mit akuter Lyme Arthritis und 53% der TZL von Patienten mit therapieresistenter Lyme Arthritis erkannten OspB. Ein entscheidender Unterschied ergab sich für die Erkennung des fünften B. burgdorferi-Antigens, outer surface Protein A (OspA). Sechs Prozent der TZL von Patienten mit akuter Lyme-Arthritis erkannten OspA. Im Gegensatz dazu erkannten 60% der TZL von Patienten mit therapieresistenter Lyme-Arthritis OspA. Dieser Unterschied war statistisch hochsignifikant (odds ratio 28,4; 95% Konfidenzintervall 9,2 - 87,8; p <0.005). Dieser Befund ist gut mit der Hypothese einer unterschiedlichen T-Zellantwort auf B. burgdorferi in den beiden Patientengruppen zu vereinbaren.


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3.1.1.2 T. Kamradt, et al., Infect. Immun. 64, 1284-1289 (1996).

Der oben dargestellte Befund: kein Unterschied in der Erkennung von OspB, aber signifikante Unterschiede in der Erkennung von OspA im Vergleich der beiden Patientengruppen, war umso erstaunlicher, als OspA und OspB eine hohe Sequenzhomologie aufweisen: 56% Sequenzidentität mit Abschnitten von bis zu 13 identischen Aminosäuren. Die dominante Erkennung eines möglicherweise arthritogenen OspA-Epitopes ist ein Pathomechanismus, der zur therapieresistenten Lyme-Arthritis führen könnte. Ausgehend von diesen Vorbefunden stellten wir die Hypothese auf, dass die TZL von Patienten mit therapieresistenter Lyme Arthritis eines oder wenige OspA-Epitope dominant erkennen und dass diese immundominanten OspA-Epitope möglicherweise einem Selbstantigen so sehr ähneln, dass die für dieses Epitop spezifischen Th-Zellen auch ein Selbstantigen erkennen können. Der erste Schritt diese Hypothese zu testen bestand darin, die OspA-Epitope, die von 31 OspA-spezifischen T-Zellinien und 5 OspA-spezifischen T-Zellklonen von drei verschiedenen Patienten mit therapieresistenter Lyme Arthritis erkannt wurden, zu bestimmen. Dies haben wir in der im folgenden abgedruckten Arbeit unternommen. Dazu wurden die T-Zellen mit einem Set von 35 synthetischen Peptiden auf die Erkennung von OspA-Epitopen überprüft. Bei den Peptiden handelte es sich um 20mere, die jeweils um 10 Aminosäuren überlappten (z.B. 24-43, 34-53, 44-63 etc.) und die gesamte Sequenz des natürlich vorkommenden OspAs (OspA17-373, die ersten 16 Aminosäuren der 373 Aminosäuren umfassenden OspA-Sequenz sind das Signalpeptid, das nicht mit untersucht wurde) umfaßten. Jeder der drei Patienten hatte ein individuelles Muster von erkannten OspA-Epitopen. Allerdings gab es auch klar erkennbare Gemeinsamkeiten. In jedem Fall wurde mindestens ein C-terminales OspA-Epitop (OspA214-233, oder OspA244-263) dominant erkannt. Darüber hinaus war das Epitop OspA84-113 als immundominant für die untersuchten T-Zellinien und Klone aller drei Patienten.


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3.1.1.3 B. Maier, et al., Eur. J. Immunol. 30, 448-457 (2000)

Ziel der im folgenden abgedruckten Arbeit war es, Selbstantigene zu finden, die von kreuzreaktiven OspA-spezifischen Th-Zellen erkannt werden. Dabei sollten keinerlei Vorannahmen (z.B. Sequenzhomologie) gemacht werden. Da die therapieresistente Verlaufsform der Lyme-Arthritis gehäuft bei HLA-DR4 positiven Patienten auftritt Steere, Dwyer, 1990 reduzierten wir unsere Untersuchungen auf HLA-DR4 restringierte T-Zellen. Da humane T-Zellinien und T-Zellklone in vitro eine begrenzte Lebensdauer haben und auch nicht auszuschließen ist, dass durch monatelange in vitro Kultur bestimmte Klone, die möglicherweise nicht repräsentativ für das T-Zellrepertoire in vivo sind, präferentiell expandiert werden, nutzten wir für diese Studien ein „humanisiertes“ transgenes Mausmodell. Die von uns eingesetzten Mäuse sind transgen für HLA-DRA*0101/HLA-DRB*0401 (im folgenden „DR4“). Darüber hinaus sind diese Mäuse transgen für das humane CD4 Fugger, Michie, Rulifson, Lock, &Sønderstrup McDevitt, 1994 . Diese Mäuse exprimieren keine murinen MHC-Klasse II Moleküle. Es ist wichtig, die Expression des murinen MHC-II „auszuschalten“, da nur dann gewährleistet ist, dass die untersuchten T-Zellen wirklich HLA-DR4 restringiert sind. In verschiedenen vergleichenden Untersuchungen hat sich gezeigt, dass HLA-transgene Mäuse ein geeignetes Modellsystem sind um die menschliche Immunantwort zu studieren, d.h. die in den Mäusen erhobenen Befunde waren im Menschen reproduzierbar (Übersichten in [Taneja, 1998; Parry, 1998]. Wir immunisierten die DR4 transgenen Mäuse mit B. burgdorferi OspA und gewannen aus verschiedenen Fusionen insgesamt 982 OspA-spezifische T-Zell Hybridome. Diese Hybridome wurden zunächst dazu genutzt um mit überlappenden Peptiden, gefolgt von Trunkationsanalysen vier immundominante Epitope zu definieren. Zwei dieser Epitope wurden auf Kreuzreaktivität untersucht. Dabei setzten wir eine neue Strategie ein, die keinerlei Vorannahmen über die Sequenz möglicher „Mimikry-Peptide“ benötigt: Die Epitope von jeweils 12 Aminosäuren Länge wurden einer kompletten „Substitutionsanalyse“ unterzogen. Das bedeutet, dass jede einzelne Aminosäure eines Epitopes durch jede einzelne der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren ersetzt wurde. Mit den resultierenden 240 Peptiden 14 OspA-spezifische T-Zell Hybridome getestet. Der Einsatz einer so großen Zahl von Peptiden wurde möglich durch eine von unseren Kollaborationspartnern entwickelte Technik der Peptidsynthese auf Zellulose-Filtern (Übersicht in Kramer &Schneider-Mergener, 1998 ). Durch die Substitutionsanalyse konnten wir für jedes der untersuchten T-Zell Hybridome ein individuelles „Supertop“ definieren, d.h. exakt festlegen, welche Aminosäurensubstitutionen an welchen Positionen des Peptides „erlaubt“ waren, d.h. die T-Zellaktivierung nicht beeinträchtigten, und welche Substitutionen zum Verlust der T-Zellaktivierung führten (s. Fig. 2 und Tab. 1 der nachfolgend abgedruckten Arbeit).

Diese individuellen Supertope wurden zurDantenbanksuche verwendet. Es wurde nach murinen oder humanen Peptiden gesucht, die die strukturellen Bedingungen der jeweiligen Supertope erfüllten. Insgesamt wurden so 856 Peptide identifiziert und auf Erkennung durch die T-Zell Hybridome getestet. 28 der 856 Peptide induzierten eine IL-2 Produktion, die derjenigen, die mit dem jeweiligen OspA-Epitope erzielten IL-2 Produktion ähnelte. Insgesamt zeigte diese Arbeit also ein bislang noch nicht demonstriertes Ausmaß an Kreuzreaktivität zwischen mikrobiellen und Selbstpeptiden.


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3.1.2 Experimentell autoimmune Enzephalitis

3.1.2.1 J. L. Grogan, et al., J. Immunol. 163, 3764-3770 (1999)

In den oben beschriebenen Arbeiten sind wir von einem definierten bakteriellen Antigen (B. burgdorferi OspA) ausgegangen und haben nach kreuzreaktiven Selbst-Antigenen gesucht. Komplementär dazu haben wir in der nachfolgend abgedruckten Arbeit nach mikrobiellen oder viralen Peptiden, die von enzephalitogenen MBP-spezifischen T-Zellen erkannt werden, gesucht. In Mäusen mit dem MHC-Klasse II Haplotyp H-2u kann eine experimentell autoimmune Enzephalitis (EAE) induziert werden. Die enzephalitogenen T-Zellen erkennen die N-terminalen 11 Aminosäuren des murinen MBP (MBPAc1-11) Zamvil, Mitchell, 1986 . Für unsere Untersuchungen setzten wir Mäuse ein, die transgen für einen MBPAc1-11-spezifischen T-Zellrezeptor sind Lafaille, Nagashima, 1994 . Um experimentelle Einflüsse anderer, nicht MBPAc1-11-spezifischer T-Zellrezeptoren auszuschließen, verwendeten wir TZR-transgene Mäuse, die mit Mäusen gekreuzt wurden, die keine endogenen alphabeta T-Zellen produzieren (TCR Calpha-/- Mäuse) Olivares-Villagomez, Wang, 1998 . Deshalb haben die von uns verwendeten Mäuse keine anderen alphabeta T-Zellen außer den transgenen T-Zellen. Diese Mäuse werden im weiteren als T+alpha- Mäuse bezeichnet.

Analog zu unseren zuvor beschriebenen Arbeiten Maieret.al, 2000 haben wir mit einer Substitutionsanalyse des MBPAc1-11 Epitopes begonnen. Das so definierte „Supertop“ haben wir als Motiv für eine Datenbanksuche verwendet. Diese Suche ergab 832 mikrobielle Peptide, die den strukturellen Kriterien des Supertopes entsprachen. Alle diese Peptide wurden auf Erkennung durch die MBPAc1-11-spezifischen T-Zellen geprüft und 61 der 832 aktivierten die T-Zellen ähnlich gut wie das MBPAc1-11 Peptid. Zwei dieser 61 mikrobiellen Peptide wurden nicht nur in vitro, sondern auch in vivo getestet. Immunisierung mit diesen Peptiden induzierte EAE mit der gleichen Kinetik und dem gleichen klinischen Schweregrad wie Immunisierung mit dem MBP-Peptid. Es folgt, dass bakterielle Peptide mit relativ geringer Sequenzhomologie zum Selbstpeptid (MBPAc1-11), in der Lage sind eine autoimmune Enzephalitis zu induzieren.


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3.2 Differenzierung von Th Zellen bei Infektion und Autoimmunität

3.2.1 Lyme Arthritis

3.2.1.1 C. Infante-Duarte, T. Kamradt, Infect. Immun. 65, 4094-4099 (1997).

In der nachfolgend abgedruckten Arbeit haben wir untersucht, ob B. burgdorferi in der Lage ist bei Th-Zellen, die nicht B. burgdorferi Antigene erkennen die Entwicklung eines proinflammatorischen Th1 Phänotypes zu induzieren. Zur Beantwortung dieser Frage haben wir T-Zellrezeptor transgene Th Zellen untersucht. Dieses System bietet die folgenden Vorteile: 1) TZR-transgene T-Zellen können ohne vorherige in vivo-Immunisierung, in vitro aktiviert werden. 2) Durch Zugabe der geeigneten Zytokine (vgl. Abb. 2) kann wahlweise die Entwicklung eines Th1 oder eines Th2 Phänotypes induziert werden. Die von uns untersuchten Th Zellen waren transgen für einen TZR, der ein Ovalbuminpeptid gebunden an H-2d erkennt Murphy, Heimberger, &Loh, 1990 . Wir konnten zeigen, dass B. burgdorferi die Entwicklung eines Th1-Phänotypes in den ovalbuminspezifischen Th Zellen, die keine B. burgdorferi Antigene kreuzreaktiv erkannten, induzierte. Synthetische Lipopeptide, abgeleitet von der Sequenz des B. burgdorferi OspA oder OspB, waren ebenso wie Lysate von B. burgdorferi in der Lage die Th1 Phänotypentwicklung zu induzieren. Neutralisierende Antikörper gegen IL-12 verhinderten teilweise, aber nicht vollständig, die durch B. burgdorferi induzierte Th1-Phänotypentwicklung. Insgesamt wurde mit dieser Arbeit also gezeigt, dass B. burgdorferi vermittels seiner Lipoproteine in der Lage ist, auch solche Th-Zellen, die für andere Antigene als B. burgdorferi spezifisch sind, zur Produktion von IFN-gamma anzuregen. Diese von B. burgdorferi antigenunspezifisch induzierte IFN-gamma Produktion könnte wesentlich zum Erhalt chronischer Entzündungen, wie z.B. der therapieresistenten Lyme Arthritis, beitragen.


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3.2.2 Detektion und Modulation der Th-Differenzierung in vivo

3.2.2.1 M. Löhning, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6930-6935 (1998)

Abgesehen von ihrer Zytokinproduktion unterscheiden sich die Th-Subpopulationen auch in ihrer transienten Expression von Chemokinen und Chemokinrezeptoren Sallusto, Lenig, 1998 und hinsichtlich des Gebrauches von Signaltransduktionswegen und Transkriptionsfaktoren Murphy, Ouyang, 2000 . Zur genaueren in vivo Analyse der unterschiedlichen Th-Subpopulationen braucht man stabile „Marker“, die an der Oberfläche der Th1- oder Th2- Zellen exprimiert werden. Die mit uns kooperierende Arbeitsgruppe um Doug Levinson (Milllennium Pharmaceuticals, Cambridge, MA, U.S.A.) hat versucht Moleküle, die spezifisch von Th1 oder Th2 Zellen exprimiert werden, zu identifizieren. Dazu wurden DO11.10 TZR transgene T-Zellen in vitro zu Th1 oder Th2 Zellen differenziert wie oben beschrieben Infante-Duarte &Kamradt, 1997 . Anschließend wurde eine representational difference analysis (RDA) durchgeführt. Eine cDNA, die in Th2, nicht aber Th1 Zellen gefunden wurde, wurde weiter analysiert. Dieselbe cDNA war schon 1989 von zwei verschiedenen Gruppen aus Fibroblasten kloniert worden und als T1 Klemenz, Hoffmann, &Werenskiold, 1989 oder ST2 Tominaga, 1989 bezeichnet worden. Im folgenden bezeichnen wir das Protein als T1/ST2. T1/ST2 ist ein Orphan-Rezeptor, der dem IL-1 Rezeptor (Typ1) ähnelt (ca. 25% Sequenzhomologie) Tominaga, 1989 . Dennoch bindet T1/ST2 weder IL-1alpha, noch IL-1beta oder IL-1RA und sein natürlicher Ligand ist derzeit noch unbekannt [Kumar, 1995].


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3.2.2.2 M. Löhning, et al., J. Immunol. 162, 3882-3889 (1999)

Unsere Untersuchung Löhning, Stroehmann, 1998 hatte gezeigt, dass T1/ST2 in vitro und ex vivo präferentiell auf Th2 Zellen exprimiert wird. Darauf aufbauend untersuchten wir als nächstes die Korrelation der T1/ST2 Expression mit Th2-Immunantworten in vivo. Als Modell wählten wir die Immunantwort auf Schistosoma mansoni. Dieses Modell ist deshalb geeignet, weil die murine Immunantwort auf Schistosomen eine „gemischte“ Th1/Th2 Immunantwort mit deutlichem Überwiegen der Th2 Komponente ist. Wir haben dieses Modell weiterhin dazu genutzt um die Plastizität der Th2-Differenzierung in vivo zu untersuchen.

Der erste wesentliche Befund dieser Arbeit ist, dass T1/ST2 auch in vivo präferentiell auf Th2-Zellen exprimiert wird. Wie wir gezeigt haben, ko-lokalisiert die T1/ST2-Expression auf Th-Zellen mit der Th2 Immunantwort in vivo. Der zweite wesentliche Befund betrifft die Koexpression von Typ 1 und Typ 2 Zytokinen. Mit durchflußzytometrischen Untersuchungen der Zytokinproduktion individueller Th-Zellen haben wir gezeigt, dass Th Zellen in unterschiedlichem Ausmaß auf die Produktion von Typ 1 oder Typ 2 Zytokinen „festgelegt“ sein können. Die Frage bei solchen Koexpressions-Analysen ist, ob zwei untersuchte Parameter stochastisch oder koordiniert miteinander koexprimiert werden. Wir fanden, dass unterschiedliche Populationen von Th-Zellen unterschiedlich flexible Programme der Zytokinexpression haben. Th-Zellen, die nur ein Typ 1 oder Typ 2 Zytokin exprimieren, exprimieren häufig auch „gegensätzliche“ Zytokine (also Typ 1 und Typ 2 gleichzeitig). Die Wahrscheinlichkeit einer solchen Koexpression von Typ 1 und Typ 2 Zytokinen wird durch zwei Ereignisse drastisch gemindert: 1) die Koexpression zweier Typ 2 Zytokine macht die gleichzeitige Expression eines Typ 1 Zytokines in der betreffenden Zelle unwahrscheinlicher und vice versa für die Koexpression zweier Typ 1 Zytokine. 2) Die Expression von T1/ST2 auf der Zelloberfläche verringert ebenfalls die Wahrscheinlichkeit der Koexpression von Typ 1 und Typ 2 Zytokinen. Die Expression von T1/ST2 zeigt also eine fortgeschrittene „Festlegung“ der betreffenden Th-Zelle auf einen Th2 Phänotyp an.


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Thu Sep 19 16:10:00 2002