Kamradt, Thomas: Aktivierung und Differenzierung von T-Lymphozyten durch Infektion und Autoimmunität

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Aktivierung von Th-Zellen bei Infektion und Autoimmunität: Molekulare Mimikry als Ursache für Autoimmunität?

Ausgangspunkt unserer Arbeiten zur Bedeutung der molekularen Mimikry für die Pathogenese der therapieresistenten Lyme-Arthritis waren verschiedene experimentelle, klinische und epidemiologische Daten, die die Vermutung nahelegten, dass die Immunantwort des Wirtes auf B. burgdorferi an der Pathogenese der therapieresistenten Lyme Arthritis beteiligt sein könnte. Unsere Hypothese war, dass B. burgdorferi-spezifische T-Zellen genetisch prädisponierter Patienten durch Kreuzerkennung eines Selbst-Antigens arthritogen werden könnten. Wir haben zunächst festgestellt, dass T-Zellininen von Patienten mit therapieresistenter Lyme-Arthritis, nicht jedoch T-Zellininen von Patienten mit akuter Lyme Arthritis, häufig ein bestimmtes Borrelien-Antigen erkennen: outer surface protein A (OspA) Lengl-Janßen, Strauss, 1994 . Darauf aufbauend haben wir die OspA-Epitope, die von OspA-spezifischen T-Zellen von Patienten mit therapieresistenter Lyme-Arthritis erkannt werden, definiert und in öffentlich zugänglichen Protein-Datenbanken nach Selbst-Antigenen, die eine hohe Sequenzhomologie mit einem der gefundenen Epitope aufweisen, untersucht. Dabei fanden wir keine „vielversprechenden“ Selbstantigene Kamradt, Lengl-Janßen, Strauss, Bansal, &Steere, 1996 .

Zum Zeitpunkt der zitierten Untersuchungen Lengl-Janßen, Strauss, 1994, Kamradt, Lengl-Janßen, 1996 galt die Antigenerkennung durch T-Zellrezeptoren als äußerst spezifisch. Es galt als sicher, dass allenfalls minimale, konservative Änderungen der spezifischen Peptidsequenz „erlaubt“ sein dürften um die Antigenerkennung durch den T-Zellrezeptor nicht zu zerstören Germain, 1994 . Bei der Suche nach Kreuzreaktivität wurde also nach möglichst ausgeprägter Sequenzhomologie oder, besser, Sequenzidentität, zweier Peptide gesucht Fujinami &Oldstone, 1985, Jahnke, Fischer, 1985, Tian, Lehmann, &Kaufmann, 1994 . Diese Vorgehensweise ist in der folgenden Abb. 3. schematisch dargestellt.


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Abb. 3 Molekulare Mimikry: Kreuzreaktivität durch Sequenzhomologie? Die herkömmliche Vorgehensweise sucht nach möglichst großen Abschnitten von Sequenzidentiät oder Sequenzhomologie zwischen einem Selbstprotein (hier beispielhaft dargestellt eine Sequenz aus dem basischen Myelinprotein, dem Zielantigen autoaggressiver Th-Zellen bei der multiplen Sklerose) und einem mikrobiellen Protein.

Seit Mitte der 1990er Jahre häuften sich aber die Hinweise aus verschiedenen experimentellen Ansätzen, dass die Antigenerkennung durch T-Zellrezeptoren möglicherweise doch weitaus flexibler ist, als bis dahin angenommen (Übersicht in Mason, 1998 ). Zusammenfassend seien die folgenden wesentlichen Punkte genannt:

  1. Allen und Mitarbeiter entdeckten, dass T-Zellaktivierung nicht nach dem „Alles-oder-nichts-Prinzip“ erfolgt. Bestimmte Veränderungen in der Aminosäuresequenz eines antigenen Peptides können zum Verlust einiger Aktivierungsparameter (z.B. T-Zellproliferation) bei gleichzeitiger Erhaltung anderer Aktivierungsparameter (z.B. Zytokinproduktion). Die Peptid/MHC Liganden des T-Zellrezeptors lassen sich also in Agonisten, partielle Agonisten und Antagonisten einteilen (Übersicht in Kersh &Allen, 1996 ).
  2. Die Analyse einzelner T-Zellklone zeigte, dass bestimmte Aminosäuren des antigenen Peptides essentiell für die Erkennung durch den TZR oder die Bindung an das antigenpräsentierende MHC Molekül sind. An diesen Positionen waren wenige oder gar keine Substitutionen möglich. An anderen Positionen, die anscheinend weniger essentiell für die Antigenerkennung sind, waren verschiedene Substitutionen möglich (z.B. Wucherpfennig &Strominger, 1995

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  3. Experimente mit transgenen Mäusen zeigten, dass ein funktionsfähiges T-Zellrepertoire auch dann selektioniert werden kann, wenn im Thymus nur ein einziges Peptid präsentiert wird Ignatowicz, Kappler, &Marrack, 1996 .
  4. Strukturelle Analysen der trimolekularen Peptid/MHC-TZR Interaktion demonstrierten ebenfalls die Möglichkeit, dass ein einzelner TZR mit verschiedenen p/MHC interagieren kann (Übersicht in Garboczi &Biddison, 1999 ).

Diese Befunde liessen es sinnvoll erscheinen, die Hypothese der molekularen Mimikry mit neuen Methoden zu untersuchen. Offenkundig ist die Suche nach Sequenzhomologien nicht optimal geeignet um kreuzreaktive Peptide zu identifizieren. Wir entwickelten eine alternative Strategie, indem wir für OspA-spezifische Th-Zellen „Supertope“ bestimmten, die wir zur Suche nach kreuzreaktiven Liganden einsetzten Maier, Molinger, 2000 . Darüber hinaus setzten wir diese Methode im EAE-Modell dazu ein mikrobielle Liganden, die von einem autoreaktiven TZR erkannt werden, zu definieren Groganet.al, 1999 .

Die beiden wesentlichen Erkenntnisse aus unserer systematischen Analyse der Kreuzreaktivität von Th-Zellen lauten:

  1. Strukturelle Kriterien und nicht Sequenzhomologie der potenziell erkannten Peptide sind entscheidend für die Kreuzreaktivität von T-Zellen.
  2. Kreuzreaktivität von Th-Zellen ist häufig.

4.1.1 Strukturelle Kriterien und nicht Sequenzhomologie der potenzielle erkannten Peptide sind entscheidend für die Kreuzreaktivität von T-Zellen.

Wir haben in zwei verschiedenen Systemen: OspA/HLA-DR4 und MBPAc1-11/I-Au eine Vielzahl kreuzreaktiver Peptide identifizieren können, die allenfalls nur sehr geringe Sequenzhomologien zum jeweiligen „Originalpeptid“ aufwiesen Maier, Molinger, 2000, Grogan, Kramer, 1999 . Einige der Selbstpeptide, die von OspA-spezifischen T-Zellen erkannt wurden, hatten nicht eine einzige Aminosäure aus dem OspA Peptid konserviert. Keines dieser Peptide wäre in einer Suche nach Sequenzhomologien identifiziert worden. Im MBP-Modell identifizierten wir 6 Peptide, die nur zwei Aminosäuren aus dem MBPAc1-11 Peptid konserviert hatten. In diesem Modell korrelierte die Zahl der konservierten Aminosäuren nicht mit der Agonisten-Funktion der jeweiligen Peptide. Diese Befunde stehen im Widerspruch zu der herrkömmlichen Auffassung, dass T-Zellrezeptoren „ihr“ Antigen mit einer exquisiten Spezifität erkennen. Unsere Befunde passen stattdessen zu einer ganzen Reihe ähnlicher in den letzten Jahren publizierter Befunde. Die Aufklärung der Kristallstrukturen muriner und humaner MHC Moleküle Bjorkmanet.al, 1987, Madden, Gorga, Strominger, &Wiley, 1992, Brownet.al, 1993 , sowie die biochemische Analyse der Selbstpeptide, die physiologischerweise an MHC-Moleküle gebunden sind Falk, Rötzschke, Stevanovïc, Jung, &Rammensee, 1991, Jardetzky, Lane, Robinson, Madden, &Wiley, 1991 erlaubten die Definition von „Bindungsmotiven“ welche die Bindung von Peptiden an bestimmte MHC-Moleküle begünstigen (Übersicht in Rammensee, Friede, &Stevanovic, 1995 ). Davis und Mitarbeiter waren die ersten, die diese Erkenntnisse nutzten und ein antigenes Peptid, das von einem transgenen T-Zellrezeptor erkannt wird, systematisch veränderten mit dem Ziel diejenigen Positionen, die entweder für die Peptidbindung an das präsentierende MHC-Molekül, oder für die Bindung an den T-Zellrezeptor kritisch sind, zu identifizieren Reay, Kantor, &Davis, 1994 . Wucherpfennig und Strominger waren die


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ersten, die einen ähnlichen Ansatz auf die Analyse der molekularen Mimikry übertrugen: zunächst bestimmten sie für einige HLA-DR2 restringierte MBP-spezifische T-Zellklone diejenigen Positionen des Peptides, die entweder für die Bindung an HLA-DR2 oder die Erkennung durch den T-Zellrezeptor von Bedeutung waren. In der nachfolgenden Datenbanksuche erlaubten sie Aminosäuresubstitutionen ausschließlich an den „unwichtigen“ Positionen. Von 129 mikrobiellen Peptiden, die auf diese Weise identifiziert wurden, waren 7 in der Lage zumindest jeweils einen der 5 untersuchten T-Zellklone zu aktivieren. Nur eines der 7 gefundenen Peptide wäre auch durch eine Suche nach Sequenzhomologie identifiziert worden Wucherpfennig &Strominger, 1995 .

Sowohl bei den Ergebnissen von Wucherpfennig und Strominger Wucherpfennig &Strominger, 1995 als auch bei unseren eigenen Ergebnissen Maier, Molinger, 2000, Grogan, Kramer, 1999 fällt auf, dass die Zahl der „vorhergesagten“ Peptide die Zahl derjenigen Peptide, die wirklich die untersuchten T-Zellen aktivieren, um ein Vielfaches übertrifft. Unsere Untersuchungen an den OspA-spezifischen T-Zellhybridomen liefern eine Erklärung dafür. 387 Selbstantigene entsprachen dem Supertop für mindestens eines der 7 untersuchten OspA164-175-spezifischen Hybridome. 469 Selbstantigene entsprachen dem Supertop für mindestens eines der 7 untersuchten OspA235-246-spezifischen Hybridome. Erkannt wurden aber nur 13 bzw. 15 Peptide. Betrachtet man die Peptide, die tatsächlich in der Lage waren die T-Zellen zu aktivieren, so stellt man fest, daß z.B. ein Peptid, dass dem Supertop eines bestimmten Hybridoms entsprach, zwar nicht von diesem, wohl aber von einem anderen Hybridom erkannt wurde. Die naheliegenste Erklärung für dieses Phänomen ist, dass zwei individuell „verbotene“ Substitutionen in Kombination erlaubt sein können, d.h. die Antigenerkennung durch den T-Zellrezeptor rekonstituieren. Für diese Annahme spricht auch die Tatsache, dass wir vergleichend zu unserer Supertopanalyse auch eine konventionelle Suche nach Sequenzhomologien durchgeführt haben. Diese Suche brachte 88 „Kandidatenpeptide“ für OspA164-175 und 63 „Kandidatenpeptide“ für OspA235-246. Keines der 63 Peptide, die Sequenzhomologie zum OspA235-246 aufwiesen, konnte die OspA235-246 -spezifischen T-Zellen aktivieren. Im Gegensatz dazu waren unter den 63 OspA164-175 Homologen 3 Peptide, die, obwohl sie keinem der von uns definierten Supertope entsprachen, in der Lage waren mindestens eines der OspA164-175-spezifischen Hybridome zu aktivieren. Auch bei diesen Peptiden stellte sich also eine Kombination individuell nicht erkannter Substitutionen als T-Zell-aktivierend heraus. Im Umkehrschluß ist es einsichtig, dass Kombinationen individuell „erlaubter“ Aminosäuresubstitutionen ein Peptid ergeben können, das vom T-Zellrezeptor nicht mehr erkannt wird.

Hinweise auf solche „kombinatorischen Effekte“ kommen auch von zwei anderen Arbeitsgruppen: Reay et al. hatten nach Definition der MHC- und TZR-Kontaktresiduen eines antigenen Peptides gefunden, das auch Aminosäuresubstitutionen in den „unwichtigen“ Abschnitten des Peptides, an Positionen also, die scheinbar weder an MHC, noch an den TZR binden, dramatische Auswirkungen auf die Erkennung des Peptides durch den untersuchten T-Zellrezeptor haben konnten Reay, Kantor, 1994 . Die Arbeitsgruppe um Martin und Houghten hat in den letzten Jahren randomisierter Peptidbibliotheken eingesetzt um die Kreuzreaktivität von T-Zellen systematisch zu untersuchen (Übersicht in Hemmer, Vergelli, Pinilla, Houghten, &Martin, 1998 ). Auch diese Arbeitsgruppe findet Mimikry-Peptide, die keine einzige Aminosäure mit dem Originalpeptid gemeinsam haben. Weiterhin konnten sie mit ihrer Methode ebenfalls zeigen, das eine Aminosäurensubstitution,


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die für sich genommen die Antigenerkennung zerstört, durch eine benachbarte „positive“ Substitution ausgeglichen werden kann Hemmeret.al, 1998 .

Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass aus den Ergebnissen verschiedener Arbeitsgruppen, darunter unserer eigenen, in den letzten Jahren klargeworden ist, dass T-Zellen Antigen weitaus flexibler erkennen als bislang angenommen. Die Kreuzreaktivität läßt sich nicht durch Kenntnis der Aminosäuresequenz eines Peptides vorhersagen, sondern beruht auf strukturellen Charakteristika. Allerdings ist es derzeit weder mit der von uns eingesetzten Technik der Substitutionsanalyse, noch mit den von der Arbeitsgruppe um Martin und Houghten eingesetzten Peptidbibliotheken möglich, aus einer Liste von „Kandidatenpeptiden“ korrekt zu prognostizieren, welche die untersuchten T-Zellen wirklich aktivieren. Die Entwicklung von Algorithmen, die dies vielleicht doch ermöglichen können ist derzeit Gegenstand intensiver Bemühungen in verschiedenen Labors.

4.1.2 Kreuzreaktivität von Th-Zellen ist häufig....

Der zweite wesentliche Befund aus unseren Arbeiten zur molekularen Mimikry ist, dass Kreuzreaktivität von Th-Zellen häufig ist. Dies steht im Gegensatz zur ursprünglichen Annahme, nach der die Kreuzreaktivität von T-Zellen ein seltenes Ereignis ist. Aus dem vorangegangenen Abschnitt geht hervor, dass unsere Methode der Substitutionsanalyse die Zahl der von einem T-Zellrezeptor erkannten Peptide mit Sicherheit unterschätzt. Bei Anlegen strengster Kriterien („Stimulationsindex“ > 50) haben wir für einen autoreaktiven T-Zellrezeptor 61 kreuzreaktive mikrobielle Peptide Grogan, Kramer, 1999 und 36 kreuzreaktive Selbstpeptide (unveröffentlicht) identifiziert. Ähnliche Daten haben wir für die OspA-spezifischen T-Zellen erhoben Maier, Molinger, 2000 . Die Daten, die von anderen Arbeitsgruppen in verschiedenen experimentellen Systemen erhoben worden sind, unterstützen unsere Befunde. So kann in der Maus ein einziges im Thymus präsentiertes Peptid ein funktionsfähiges T-Zellrepertoire selektionieren Ignatowiczet.al, 1997 . Auch mit anderen als den von uns eingesetzten Methoden kann für autoreaktive T-Zellrezeptoren eine Vielzahl von mikrobiellen Liganden identifiziert werden Hemmer, Vergelli, 1998 . Unlängst wurde sogar eine Untersuchung veröffentlicht, die darauf schließen läßt, das ein einziger T-Zellklon zumindest einige hundert verschiedene Peptide erkennen kann Hemmeret.al, 1999

4.1.3 aber zumeist ohne pathologische Konsequenzen

Die vielleicht wichtigste Konsequenz aus unseren Befunden ist, dass von einer auf Peptidebene definierten Kreuzreaktivität zwischen einem Selbstantigen und einem mikrobiellen Antigen keinesfalls auf einen pathogenetischen Zusammenhang geschlossen werden darf. Angesichts der Tatsache, dass die Kreuzerkennung von mikrobiellen und Selbstpeptiden eher die Regel als die Ausnahme darstellt, kann dem alleinigen Nachweis einer Kreuzreaktivität auf Peptidebene keine Relevanz zugemessen werden. In einigen Fällen konnte durch die Immunisierung mit dem mikrobiellen Mimikry-Peptid die untersuchte Autoimmunkrankheit induziert werden Grogan, Kramer, 1999, van Edenet.al, 1985 . Dabei waren jedoch zumeist Inzidenz und Schweregrad der Erkrankung drastisch reduziert Garza &Tung, 1995, Bachmaieret.al, 1999 oder es waren zur Krankheitsinduktion im Vergleich zum Selbstpeptid erheblich höhere Mengen des mikrobiellen Peptides notwendig Singh, Yamaki, Donoso, &Shinohara, 1989 . Zur Induktion von Autoimmunität durch kreuzreaktive mikrobielle Peptide müssen eine Reihe von Voraussetzungen erfüllt sein, die in vivo offensichtlich in den seltensten Fällen gegeben sind (ausführliche Diskussion in [Grogan, 1999; Maier, 2000;


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Kamradt, 2000]): die Peptide müssen aus von den antigenpräsentierenden Zellen prozessiert und präsentiert werden, die Konzentrationen sowohl des mikrobiellen als auch des Selbstpeptides müssen hoch genug sein um potenziell autoreaktive T-Zellen zu aktivieren, es müssen hinreichend viele autoreaktive T-Zellen aktiviert werden, diese müssen an den Ort gelangen, an dem das Selbstantigen physiologischerweise vorhanden ist, die „richtigen“, in den jeweiligen Umständen pathogenen Zytokine produzieren, und schließlich die immunologischen Regulationsmechanismen (Zelltod, Anergie, regulatorische Zellen) überwinden, die normalerweise das Auftreten von Autoimmunität verhindern. Es muß also eine Vielzahl von pathogenen Faktoren gleichzeitig zusammenkommen, damit molekulare Mimikry möglicherweise zur Induktion einer Autoimmunkrankheit führt.

4.1.4 „Bystander Aktivierung“?

Könnten antigen-unspezifische Pathomechanismen von der Infektion zur Autoimmunität führen? CD8+ Lymphozyten können durch IFN-alpha unabhängig von der Spezifität ihres TZRs aktiviert werden. In Mausmodellen wurde deshalb im Rahmen von Virusinfektionen eine massive Proliferation auch solcher CD8+ Lymphozyten beobachtet, die nicht für das jeweilige Virus spezifisch waren Tough, Borrow, 1996, Ehl, Hombach, 1997 . Beobachtungen im murinen Modell des Typ I Diabetes Horwitzet.al, 1998 , sowie in zwei Enzephalitis-Modellen [Evans, 1996; Miller, 1997] lassen vermuten, dass ähnliche Mechanismen auch bei CD4+ Th Zellen wirksam sein können. Auch die Tatsache, dass alleine die Überexpression pro-inflammatorischer Zytokine oder das Fehlen anti-inflammatorischer Zytokine ausreichend sind um verschiedene Tiermodelle von Autoimmunität zu induzieren Keffer, Probert, 1991, Kühn, Lohler, Rennick, Rajewsky, &Müller, 1993, Green &Flavell, 2000 , spricht dafür, dass antigen-unspezifische Mechanismen zur Pathogenese von Autoimmunität nach Infektionskrankheiten beitragen können.

Der Befund, dass B. burgdorferi die Produktion von IFN-gamma in Th-Zellen, die nicht spezifisch für ein B. burgdorferi Antigen sind drastisch verstärken kann Infante-Duarte &Kamradt, 1997 spricht dafür, dass auch B. burgdorferi Bystander Effekte ausüben kann, die eine chronische Entzündung und letztlich Autoimmunität begünstigen. In einer neueren Arbeit Infante-Duarte, Horton, 2000 haben wir diesen Befund weiter verfolgt. In Kollaboration mit „Genetics Institute“ in Cambridge, MA, U.S.A. haben wir die Induktion von 250 verschiedenen immunologisch relevanten mRNAs in Ovalbumin-spezifischen Th Zellen untersucht, die entweder durch Zugabe von IL-12 oder von B. burgdorferi zu „Th1“Zellen differenziert worden waren. Es zeigte sich, dass die Expression einiger mRNAs nur durch B. burgdorferi, nicht aber durch IL-12 verstärkt wurde. Eine solche mRNA war die für IL-17 kodierende. Da über IL-17 bis dahin einerseits noch fast nichts bekannt war, IL-17 aber andererseits in verschiedenen chronisch entzündlichen Erkrankungen wie z.B. rheumatoide Arthritis Chabaudet.al, 1999, Ziolkowskaet.al, 2000 oder multiple Sklerose Matuseviciuset.al, 1999 vermehrt nachgewiesen werden konnte, haben wir die Expression und Regulation dieses Zytokines näher untersucht. Mit ELISA und durchflußzytometrischen Untersuchungen konnten wir nachweisen, dass die Produktion von IL-17 in Th-Zellen von B. burgdorferi verstärkt wird. Dieser Befund ist nicht exklusiv für B. burgdorferi, Lysate von M. tuberculosis hatten einen vergleichbaren Effekt. Praktisch alle IL-17 produzierenden Th-Zellen produzierten gleichzeitig IFN-gamma Infante-Duarte, Horton, 2000 . Diese Daten, in Kombination mit der Tatsache, dass IL-17 in chronisch inflammatorischen Läsionen nachgewiesen werden kann Chabaud, Durand, 1999, Matusevicius, Kivisakk, 1999 legen die Vermutung nahe, dass B. burgdorferi antigenunspezifisch eine Population von Th-Zellen


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induziert, die durch die Koexpression von IL-17 und TNF-alpha starke inflammatorische Kapazität hat.

Auch im EAE-Modell finden wir Hinweise auf „Bystander-Aktivierung autoreaktiver Th-Zellen. Die Injektion von LPS kann in den T+alpha- Mäusen EAE induzieren (unveröffentlichte Beobachtungen). Die genauen Mechanismen dieser EAE-Induktion werden zur Zeit noch untersucht.

Zusammenfassend läßt sich festhalten, dass im Verlauf der letzten Jahre in verschiedenen Labors, darunter unserem eigenen, vermehrt Hinweise darauf gefunden wurden, dass Infektionserreger in der Lage sind die Immunantwort so zu modulieren, das antigen-unspezifisch starke proinflammatorische Effekte entstehen, die durchaus am Zustandekommen von Autoimmunität beteiligt sein können.

4.1.5 Konsequenzen für die Molekulare Mimikry Hypothese

Was bedeuten die in den letzten Jahren erhobenen Daten über die Kreuzreaktivität von T-Zellen für die Molekulare Mimikry Hypothese? Zum einen ist klar geworden, dass die in der Abbildung 3 dieser Arbeit dargestellte konventionelle Vorgehensweise bei der Suche nach Kreuzreaktivitäten, die Datenbanksuche nach Sequenzhomologien, inadäquat ist. Zur Identifizierung der von einem T-Zellrezeptor erkannten Liganden müssen strukturelle Kriterien die Grundlage der Suche sein. Hier ergibt sich ein praktisches Problem durch die Tatsache, dass die derzeit verfügbaren Methoden, Substitutionsanalyse oder randomisierte Peptidbibliotheken für T-Zellklone, nicht aber für T-Zellpopulationen praktikabel sind. Bedingt durch die Tatsache, das jeder einzelne der vielen verschiedenen Klone, die ein bestimmtes Peptid erkennen, sein individuelles Muster von Kreuzreaktivität hat, ergäbe die Untersuchung eine polyklonalen T-Zellpopulation mit einer dieser beiden Methoden, dass an jeder Position des Epitopes alle Aminosäurensubstitutionen erlaubt sind und damit ein sinnloses Ergebnis. Es ergibt sich, dass mit heutiger Technik das Ausmaß der Kreuzreaktivität einer polyklonalen T-Zellpopulation zwangsläufig immer unterschätzt wird. Entweder man sucht nach Sequenzhomologien. In diesem Fall kann man die Erkennung der gefundenen Peptide durch die polyklonale T-Zellpopulation testen, hat aber nur einen Bruchteil der tatsächlich vorhandenen Kreuzreaktivitäten erfaßt. Oder man untersucht T-Zellklone mit einer der beiden moderneren Techniken (Substitutionsanalyse/Peptidbibliotheken). In diesem Fall kann man nur einen kleinen Bruchteil der antigenspezifischen Klone untersuchen. Ein Beispiel liefern unserer Untersuchungen an den OspA-spezifischen T-Zellen. Eine andere Arbeitsgruppe hat ebenso wie wir OspA164-175 als immundominant für HLA-DR4 restringierte T-Zellen erkannt Grosset.al, 1998 . In einer Sequenzhomologie-Suche fand diese Gruppe ein Epitop des humanen LFA-1 Moleküls, dass eine starke Homologie mit dem OspA164-175 Peptid aufweist. In verschiedenen in vitro assays wurden kreuzreaktive T-Zellen, die sowohl OspA164-175 als auch das korrespondierende LFA-1 Peptid erkennen, nachgewiesen Gross, Forsthuber, 1998 . Im Gegensatz dazu erkannte keines der von uns untersuchten 7 OspA164-175-spezifischen Hybridome dieses Peptid Maier, Molinger, 2000 . Diese Befunde illustrieren, die Tatsache, dass individuelle T-Zellklone unterschiedliche Muster von Kreuzreaktivität aufweisen. Die ideale Methode zum möglichst umfassenden Nachweis der individuellen Kreuzreaktivitäten innerhalb einer polyklonalen T-Zellpopulation ist also noch nicht entwickelt.


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Angesichts der Tatsache, dass die Kreuzerkennung von mikrobiellen und Selbstpeptiden eher die Regel als die Ausnahme darstellt, ist es nicht verwunderlich, dass trotz der Plausibilität und der Attraktivität der Hypothese der molekularen Mimikry bislang noch niemals in vivo gezeigt werden konnte, das molekulare Mimikry tatsächlich Autoimmunkrankheiten induziert. Selbstverständlich bleibt festzuhalten, dass weder unsere eigenen, noch andere bislang publizierte Arbeiten molekulare Mimikry als Pathomechanismus in der Genese von Autoimmunkrankheiten ausschließen.

Welche Rolle könnte der molekularen Mimikry in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten zukommen? Mehrere Pathomechanismen, die molekulare Mimikry involvieren sind vorstellbar:

  1. Rezidivierende oder chronische Infektionen könnten durch wiederholte oder kontinuierliche Stimulation und Expansion kreuzreaktiver T-Zellklone dazu beitragen, dass im Laufe von Jahren die Zahl der kreuzreaktiven T-Zellen, die sowohl das mikrobielle Antigen, als auch ein bestimmtes Selbstantigen erkennen, eine bestimmte kritische Schwelle überschreitet. Bei Vorhandensein von einer ausreichend hohen Anzahl autoreaktiver T-Zellen könnte Kreuzreaktivität schließlich die Entwicklung von Autoimmunität begünstigen. Die Suszeptibilität hierfür könnte genetisch determiniert sein. Zwei Mausstämmen, die MHC-identisch sind und beide das gleiche enzephalitogene Epitop eines ZNS-Autoantigenes erkennen, unterscheiden sich in ihrer Suszeptibilität für EAE. Während die Immunisierung mit dem Autoantigen im einen Stamm (SJL) EAE induziert, ist das im anderen Stamm (B10.S) nicht der Fall. Vergleichende Untersuchungen haben gezeigt, dass SJL Mäuse im naiven Repertoire eine erheblich höhere Zahl von Th-Zellen, die das Autoantigen erkennen, haben Andersonet.al, 2000 .
  2. Eine Variante der o.a. Akkumulation autoreaktiver Zellen durch kreuzreaktive mikrobielle Antigene ist, dass verschiedene Infektionserreger Kreuzreaktivität mit dem gleichen Autoantigen hervorrufen können. In unserem Enzephalitis-Modell, z.B. wurde eine Vielzahl von Peptiden, die von verschiedenen Bakterien stammten, von den enzephalitogenen T-Zellen erkannt Grogan, Kramer, 1999 . Vorstellbar ist also ein Szenario, in dem durch aufeinanderfolgende Infektionen, in unserem Modell z.B. mit M. tuberculosis und S. typhimurium, T-Zellen aktiviert und expandiert werden, die das gleiche Autoantigen erkennen können. Durch die wiederholten Infektionen könnte dann eine kritische Zahl dieser T-Zellen überschritten werden. In solch einem Falle, in dem möglicherweise viele verschiedene Infektionserreger zur molekularen Mimikry beitragen wird es schwierig, wenn nicht unmöglich sein, einen Erreger, der mit der in Frage stehenden Autoimmunkrankheit assoziiert ist, zu definieren.
  3. Die Mechanismen der molekularen Mimikry und der „Bystander Aktivierung“ schließen sich gegenseitig nicht aus, sondern können sich sogar ergänzen. So ist vorstellbar, dass genetische Prädisposition und molekulare Mimikry dafür sorgen, dass eine „kritische Zahl“ autoreaktiver Zellen vorhanden ist, die durch „Bystander Aktivierung“ aktiviert werden kann.

Im Laufe der letzten Jahre ist allerdings auch klar geworden, dass immunologische Kreuzreaktivität nicht notwendigerweise pathogen sein muß sondern höchstwahrscheinlich ein notwendiger Bestandteil der normalen Homöostase des Immunsystems ist.

  1. Werden T-Zellen in Mäuse transferiert, die keine MHC - Moleküle exprimieren, sterben diese T-Zellen innerhalb kurzer Zeit Kirberg, Berns, &von Boehmer, 1997, Witherdenet.al, 2000 . Die wahrscheinlichste Erklärung für

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    diesen Befund lautet, dass naive T-Zellen der unterschwelligen Stimulation bedürfen um im Organismus zu überleben. In Abwesenheit von MHC-Molekülen, können keine kreuzreaktiven Peptide präsentiert werden, was den Untergang der T-Zellen zur Folge hat.
  2. Theoretische Erwägungen deuten darauf hin, dass ein funktionierendes T-Zellrepertoire mit „monospezifischen“ T-Zellen nicht realisierbar ist, und ein gewisses Ausmaß an Kreuzreaktivität deshalb notwendig ist Mason, 1998 .
  3. In jüngerer Zeit gibt es Hinweise darauf, dass autoreaktive T-Zellen, die durch molekulare Mimikry aktiviert werden könnten nicht notwendigerweise pathogen sein müssen, sondern protektive Funktionen haben können Kerschensteineret.al, 1999, Ruizet.al, 1999 .

4.1.6 Konsequenzen für die Pathogenese der therapieresistenten Lyme Arthritis

Folgende Schlußfolgerungen ergeben sich aus dem unerwartet hohen Ausmaß der Kreuzreaktivität für die Pathogenese der Lyme-Arthritis:

  1. Es ist klar geworden, dass die bloße Kreuzreaktivität auf Peptid-Ebene nicht hinreichend ist um einen pathogenen Zusammenhang zwischen der T-Zellreaktivität mit einem gegebenen mikrobiellen Antigen (z.B. OspA) und einem bestimmten Selbstantigen zu postulieren. Für viele Infektions- und Autoimmunkrankheiten, auch für die Lyme-Borreliose Gross, Forsthuber, 1998, Fikriget.al, 1993 sind Arbeiten publiziert worden, die über Sequenzhomologien zwischen mikrobiellen und Autoantigenen berichten und zeigen, dass Antikörper oder T-Zellen, die für das eine Peptid spezifisch sind, auch das andere erkennen. Wenn - ohne weitere Daten - aus solchen Befunden ein kausaler Zusammenhang zwischen der in frage stehenden Infektionskrankheit und Autoimmunität abgeleitet wird, sind solche Schlußfolgerungen nach heutigem Stand als unbegründet zurückzuweisen.
  2. Selbstverständlich schließt keiner unserer hier und unter 2.1.2 dargestellten Befunde die Möglichkeit aus, dass unter bestimmten experimentellen oder klinischen Bedingungen molekulare Mimikry für die Induktion von Autoimmunität verantwortlich sein könnte (s. 2.1.2.3). Insofern bleiben die Hinweise auf eine mögliche Immunpathogenese der therapieresistenten Lyme-Arthritis und die Tatsache, dass OspA bevorzugt von Patienten mit therapiersistenter Lyme Arthritis erkannt wird interessant. Dies insbesondere mit Hinblick auf die Tatsache, dass rekombinantes OspA in den U.S.A. als Impfstoff gegen die Lyme-Borreliose zugelassen ist.

Um die Kreuzreaktivität bei Patienten mit Lyme-Arthritis zu untersuchen, ohne den „Umweg“ über das Anlegen von T-Zellinien oder Klonen zu gehen, sind wir dabei HLA-DR4/OspA-Peptid Tetramere herzustellen. Im HLA-DR4-transgenen untersuchen wir die Frage unter welchen Bedingungen Kreuzreaktivität zwischen mikrobiellen und Selbstantigenen möglicherweise pathologische Konsequenzen hat. Eine Schwierigkeit dieser Untersuchungen besteht darin, dass bei der Vielzahl der verschiedenen erkannten Selbstantigene nicht immer auf der Hand liegt welche pathologischen Konsequenzen durch eine Autoreaktivität gegen ein bestimmtes dieser Antigene zu erwarten wären (z. B. Apolipoprotein B-100 Precursor). In anderen Fällen, z.B. der Kreuzreaktivität zwischen OspA und dem humanen Pro-Insulin wird ein pathologischer Zusammenhang schon allein dadurch unwahrscheinlich, dass keine Assoziation zwischen einer Infektion mit B. burgdorferi und Typ I Diabetes mellitus bekannt ist. Wieder andere kreuzreaktiv erkannte Selbstantigene (z.B.


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Myosin) „passen“ zum Spektrum der von B. burgdorferi verursachten Pathologien. Allerdings haben jüngste Befunde in einem Mausmodell autoimmuner Arthritis drastisch klar gemacht, das organspezifische Autoimmunkrankheiten auch durch Autoimmunität gegen ubiquitär exprimierte Selbstantigene (im vorliegenden Fall Glukose-6-Phosphat-Isomerase) verursacht werden können Matsumoto, Staub, Benoist, &Mathis, 1999 . Deshalb sind auch die von uns identifizierten ubiquitär exprimierten Selbstantigene, die von OspA-spezifischen Th-Zellen erkannt werden, nicht a priori außer acht zu lassen.

4.2 Ex vivo Detektion der Th-Differenzierung bei Infektion und Autoimmunität: Möglichkeit zur spezifischen Immunmodulation?

Chronische Infektionen, Autoimmunkrankheiten und allergische Erkrankungen sind oftmals durch das Überwiegen einer Th-Subpopulation charakterisiert (Übersichten in Kamradt &Burmester, 1998, Infante Duarte &Kamradt, 1999 ). Zum besseren Verständnis der Immunregulation und als möglicher Ansatzpunkt für therapeutische Interventionen wären daher „Marker“ anhand derer sich Th-Subpopulationen ex vivo identifizieren und möglichst auch modulieren lassen, von größtem Wert. In den oben abgedruckten Arbeiten Löhning, Grogan, 1999, Löhning, Stroehmann, 1998 konnte wir zeigen, dass T1/ST2, ein zur IL-1 Rezeptorfamilie gehörender Orphan-Rezeptor, in vitro und in vivo präferentiell auf Th2 Zellen exprimiert wird. Dieser Befund wurde ebenso von einer anderen Arbeitsgruppe erhoben Xu, Chan, 1998 . In vivo korreliert die Expression von T1/ST2 auf CD4+ Zellen mit der Lokalisation von Typ 2 Immunantworten Löhning, Grogan, 1999 . Wichtiger als diese reine „Markerfunktion“ ist die Tatsache, dass T1/ST2 für die Effektorfunktion der Th2 Zellen wichtig ist. In einem Mausmodell bronchialer Hyperreaktivität haben wir gezeigt, dass Th2-Effektorfunktionen in vivo sowohl durch Injektion des löslichen T1/ST2 Moleküls, als auch durch Injektion eines monoklonalen Antikörpers gegen T1/ST2 spezifisch inhibiert werden können Löhning, Stroehmann, 1998, Coyle, Lloyd, 1999, Lambrechtet.al, 2000 . Aus der Tatsache, dass sowohl rekombinantes T1/ST2, als auch der monoklonale Antikörper die Th2 Effektorfunktion modulierten, kann geschlossen werden, dass dieser Effekt durch die Inhibition von T1/ST2 mit seinem derzeit noch unbekannten Liganden und nicht durch Depletion der T1/ST2+ Zellen erzielt wird. Diese Vermutung wird weiter durch unsere Untersuchungen gestützt, die gezeigt haben, das die Kreuzvernetzung von T1/ST2 Rezeptoren auf der Zelloberfläche mittels plattengebundener Antikörper in vitro in Th2 Zellen Proliferation sowie die Produktion von IL-4 und IL-5 induziert Meisel, Bonhagen, .

Insgesamt kann also vermutet werden, dass T1/ST2 ein Th2-spezifischer ko-stimulatorischer Rezeptor ist. Wie werden Th2 Zellen wird normalerweise in vivo durch T1/ST2 aktiviert? Wir haben in Kollaboration mit L. O‘Neill und seiner Arbeitsgruppe (Dept. Biochemistry, Trinity College, Dublin, Irland) begonnen die Signaltransduktionskaskade, die durch Kreuzvernetzung von T1/ST2 induziert wird, zu untersuchen. Obwohl T1/ST2 ein Mitglied der IL-1R Familie ist, wird durch seine Kreuzvernetzung keine NF_B Translokation induziert (unveröffentlichte Beobachtungen). Insofern unterscheidet sich die Signaltransduktion nach Ligation von T1/ST2 schon von der Signaltransduktion nach Ligation anderer Mitglieder der IL-1R Familie; die genauen Mechanismen sind Gegenstand unserer laufenden Untersuchungen. Wie wird die Signaltransduktion durch T1/ST2 physiologischerweise initiiert? Bis heute ist der physiologische Ligand für T1/ST2 unbekannt. Die Suche nach dem T1/ST2 Liganden sollte nicht nur unser Verständnis der Funktion dieses Th2-spezifischen Oberflächenmoleküles vertiefen, sondern auch neue Möglichkeiten zur


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Immunmodulation eröffnen und wird derzeit in verschiedenen Laboren, darunter unserem eigenen, intensiv verfolgt.

Ein humanes Homolog für T1/ST2 ist bekannt Tominagaet.al, 1992 . Ist T1/ST2 also geeignet zur Modulation pathogener Th2-Antworten im Menschen? Diese Frage kann zur Zeit noch nicht beantwortet werden, da es weder uns, noch einer anderen Arbeitsgruppe, bisher gelungen ist, die Expression des humanen T1/ST2 Proteins auf T-Zellen durchflußzytometrisch nachzuweisen. Dies ist umso erstaunlicher, als wir humane T-Zellinien untersucht haben, in denen wir mit der PCR mRNA sowohl für die lösliche, als auch für die membrangebundene Form des T1/ST2 nachweisen konnten. Dennoch gelang mit den derzeit zur Verfügung stehenden monoklonalen Antikörpern der Nachweis von T1/ST2 weder auf der Zelloberfläche, noch intrazellulär. In Anbetracht der funktionellen Bedeutung von T1/ST2 für Th2-Effektorfunktionen im Mausmodell bleibt der Versuch entsprechende Reagenzien für Untersuchungen der Expression und der funktionellen Bedeutung des humanen T1/ST2 ein Arbeitsschwerpunkt in verschiedenen Labors, unter anderem unserem eigenen.

Th2 Zellen können durch ihre Expression von T1/ST2 identifiziert werden. Ein Molekül, das die Identifikation lebender Th1 Zellen ex vivo erlaubt ist bislang noch nicht beschrieben worden, der IL-18 Rezeptor kann aber diesbezüglich als „Kandidat“ gelten Xuet.al, 1998 . Da Autoimmunerkrankungen häufig durch eine Überwiegen von Th1 Zellen charakterisiert sind, wäre es sehr wünschenswert Membranproteine zu definieren, die präferentiell von Th1 Zellen exprimiert werden und es möglicherweise erlauben die Funktion von Th1 Zellen spezifisch zu modulieren. In der oben erwähnten representational difference analysis Löhning, Stroehmann, 1998 wurde auch eine mRNA identifiziert, deren Expression Th1-spezifisch zu sein scheint. Im Labor von J.-C. Gutierrez-Ramos (Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, MA, U.S.A.) wurde das von dieser mRNA kodierte Protein rekombinant hergestellt und Rattenantikörper dagegen produziert. Die ersten in unserem Labor durchgeführten durchflußzytometrischen Expressionsanalysen deuten darauf hin, dass auch das Protein präferentiell auf der Zellmembran von Th1, nicht aber Th2 Lymphozyten exprimiert wird.

4.2.1 Ex vivo Detektion der Th-Differenzierung bei Infektion und Autoimmunität: wie häufig sind Th1 und Th2 Zellen in vivo?

Dass Th-Zellen sich anhand ihrer Zytokinproduktion in unterschiedliche Subklassen kategorisieren lassen, wurde bei der Analyse der Zytokinproduktion muriner T-Zellklone entdeckt Mosmann, Cherwinski, Bond, Gledlin, &Coffman, 1986 . In vivo lassen sich „Th1-dominierte“ oder „Th2- dominierte“ Immunantworten in chronischen Infektionen Infante Duarte &Kamradt, 1999, Heinzel, Sadick, Holaday, Coffman, &Locksley, 1989, Yamamuraet.al, 1991 , Autoimmunkrankheiten Kamradt &Burmester, 1998, Liblau, Singer, &McDevitt, 1995 oder allergischen Erkrankungen nachweise Coyle, Lloyd, 1999, Donovan &Finn, 1999 . Bis vor kurzem war allerdings noch recht wenig über die Zytokinproduktion einzelner Th-Zellen in vivo bekannt, da die meisten Untersuchungen an Populationen durchgeführt worden waren. In einer der oben abgedruckten Arbeiten haben wir deshalb erstmals die Zytokinproduktion einer großen Zahl individueller Zellen ex vivo durchflußzytometrisch untersucht Löhning, Grogan, 1999 . Diese Untersuchungen haben wir im murinen Infektionsmodell mit Schistosoma mansoni durchgeführt. Initial ist die Immunantwort gegen S. mansoni durch ein Überwiegen von Typ1 Zytokinen gekennzeichnet, in den späteren Stadien überwiegt dann die Produktion von Typ 2 Zytokinen Infante Duarte &Kamradt, 1999, Löhning, Grogan, 1999 . Diese Plastizität der Immunantwort und die Tatsache, dass sich die antigenspezifischen Th Zellen in diesem Modell räumlich und zeitlich gut lokalisieren lassen Löhning, Grogan, 1999 machen S. mansoni zu einem


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geeigneten Modell zur Untersuchung der Zytokinproduktion individueller Th Zellen. In unseren Untersuchungen haben wir gleichzeitig die intrazelluläre Expression von jeweils drei verschiedenen Zytokinen und die Oberflächenexpression von T1/ST2 untersucht. Das wichtigste Ergebnis dieser Untersuchungen war dass individuelle Th-Zellen in vivo häufig Typ 1 und Typ 2 Zytokine koexprimieren. Das gemeinhin als Typ 1 Zytokin angesehene IL-2 z.B. wurde häufig von Th-Zellen, die IL-4 oder IL-5 produzierten, koexprimiert. Anders als bei unseren initialen Untersuchungen an Th-Zellen aus unimmunisierten gesunden Mäusen Löhning, Stroehmann, 1998 produzierte im Schistosomen-Infektionsmodell auch die Mehrzahl der T1/ST2+ Th Zellen IL-2. Die genauere Analyse der Koexpression verschiedener Zytokine in individuellen Th Zellen zeigte allerdings, dass diese Plastizität nicht in allen Zellen gleichermaßen vorhanden ist. Unsere Analyse aller CD4+ Zellen aus Schistosomen-induzierten Granulomen zeigte, dass in individuellen Th Zellen die Expression von IFN-gamma statistisch signifikant positiv mit der Expression von IL-4 assoziiert war. Diese positive Assoziation von IFN-gamma war nicht mehr vorhanden, wenn Zellen untersucht wurden, die entweder zwei Typ 1 Zytokine (z.B. IFN-gamma und IL-2), oder zwei Typ 2 Zytokine (z.B. IL-4 und IL-5) produzierten. Auch die Expression von T1/ST2 auf der Zelloberfläche machte die Co-Expression von IFN-gamma und IL-4 unwahrscheinlich Löhning, Stroehmann, 1998 . Diese Befunde sind gut mit der Vorstellung vereinbar, dass die Zytokin-Expression individuelle Th-Zellen zunächst plastisch und noch nicht auf ein Th1 oder Th2 Muster festgelegt ist. Die Ko-Expression zweier Typ2 Zytokine oder eines Typ2 Zytokines gemeinsam mit T1/ST2 sind diesem Modell zufolge Zeichen einer fortgeschrittenen Th2-Differenzierung.

Die meisten der ex vivo aus Schistosomen-induzierten Granulomen isolierten Th-Zellen produzierten sowohl Typ1, als auch Typ 2 Zytokine, entsprachen also nicht den typischen Th1 oder Th2 Mustern. Für diesen Befund gibt es mindestens drei verschiedene Erklärungsmöglichkeiten.

  1. Vielleicht gibt es in vivo überhaupt keine „klassischen“ Th1 oder Th2 Zellen, die ein „Set“ von Zytokinen (Typ 1 oder Typ2), nicht aber das andere „Set von Zytokinen exprimieren? Die ausgeprägte Th1 oder Th2 Polarisierung, die sich in vitro erzielen läßt, beruht zumindest teilweise auf der gegenseitigen Inhibition der beiden Th subsets und darauf, dass der IL-12 Signaltransduktionsweg in Th2 Zellen „abgeschaltet“ wird wohingegen der IL-4 Signaltransduktionsweg in Th1 Zellen „abgeschaltet“ wird (Übersicht in Murphy, Ouyang, 2000 ). Schon die Gegenwart geringer Konzentrationen von IFN-gamma reicht aus, um auch in Th2 Zellen den IL-12 Signaltransduktionsweg zu erhalten. Während Th2 Zellen in vitro durch Zugabe von IL-4, anti-IL-12 und häufig auch alpha-IFN-gamma polarisiert werden und nicht mehr zur Produktion von Th1 Zytokinen angeregt werden können, ist leicht vorstellbar, dass die zur Aufrechterhaltung der IL-12 Signaltransduktion notwendigen IFN-gamma Konzentrationen in vivo zumeist gegeben sein werden. In den „Th2-dominierten“ Schistosomen-induzierten Granulomen waren jedenfalls zu allen von uns untersuchten Zeitpunkten immer auch IFN-gamma produzierende Th-Zellen nachweisbar Löhning, Grogan, 1999 . Es ist also anzunehmen, das Th-Zellen in vivo eine größere Plastizität aufweisen als in vitro differenzierte Th Zellen.
  2. Möglicherweise ist die von uns beobachtete Plastizität eine Besonderheit der Immunantwort auf S. mansoni. Die von uns gefundene Koexpression von IL-4 oder IL-5 mit IL-2 wird in Th2 Zellen, die in vitro differenziert wurden, nicht beobachtet. Allerdings ist schon früher im Modell der S. mansoni Infektion beschrieben worden, dass IL-2 sowohl für

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    die IL-5 Produktion, als auch für die Formation von Granulomen von entscheidender Bedeutung ist Cheeveret.al, 1992 . Um diese Möglichkeit zu testen, untersuchten wir die Zytokin Koexpression in Mäusen, die mit Nippostrongylus brasiliensis infiziert waren. Die N. brasiliensis Infektion ist ein klassisches Modell für Th2-Immunantworten. In Th-Zellen aus dem Darm infizierter Mäuse fanden wir, wie im S. mansoni Infektionsmodell, eine statistisch signifikante positive Korrelation zwischen der Expression von IL-2 mit IL-4 und mit IL-5 (K. Bonhagen & T. Kamradt, unveröffentlichte Beobachtungen). Diese Korrelation ist also kein Spezifikum des S. mansoni Infektionsmodelles.
  3. Schließlich ist es möglich, dass die extreme Polarisierung nach Th1 oder Th2, die man in vitro beobachten kann auch in vivo erst nach längeren Zeiträumen auftritt. Im Schistosomenmodell haben wir die Mäuse 7 Wochen nach der Injektion von S. mansoni Eiern untersucht Löhning, Grogan, 1999 und die Immunantwort nach Infektion mit N. brasiliensis wurde 2 Wochen nach Infektion untersucht.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass sich die Dynamik und Plastizität der Th-Differenzierung in vivo mit Hilfe Populationsspezifischer Membranproteine wie T1/ST2 sehr viel genauer erfassen lassen, als das bislang der Fall war. Unsere hier vorgestellten Daten sind ein Beispiel für solche Untersuchungen und zeigen, dass die Zytokin-Koexpression von Th-Zellen in vivo sich auf teilweise unerwartete Weise von den in vitro bekannten Th1/Th2 Mustern unterscheidet.


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Thu Sep 19 16:10:00 2002