Kaufmann, Olaf: Immunhistochemisch gestützte Tumordiagnostik unter besonderer Berücksichtigung von Metastasen bei unbekanntem Primärtumor

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Untersuchtes Tumormaterial

Die untersuchten Tumoren stammen ganz überwiegend aus dem Archiv des Instituts für Pathologie (“Rudolf-Virchow-Haus“) des Universitätsklinikums Charitè der Humboldt-Universität zu Berlin und wurden mittels EDV recherchiert. Der größere Teil der untersuchten Melanome wurde von Dr. H. Audring, Abteilung Histopathologie der Klinik für Dermatologie der Charité, zur Verfügung gestellt. Einen weiteren kleineren Teil von Tumoren erhielten wir aus dem Institut für Pathologie des Humaine-Klinikums Bad-Saarow (Chefarzt: PD Dr. S. Koch).

Alle Tumorproben waren in 10% igem (ca. 4% Gasgehalt) gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet worden. Alle Gewebsproben (Tumoren und Metastasen) wurden von zwei Pathologen unabhängig von einander nachbefundet. Dabei wurde ausnahmslos die WHO-Klassifikation maligner Tumoren (Blauer Faszikel) angewendet. Pro Fall wurde ein repräsentativer Block für die durchzuführenden Untersuchungen ausgewählt. Bis auf die Studie zum Nachweis von CD56 in Karzinomen verwendeten wir keine kleinen Biopsien (insbesondere keine Stanzbiopsien), da nur in größeren Tumorregionen die Verteilung der Immunfärbungen (homogen versus heterogen) beurteilbar war. Es wurden nur solche Tumoren ausgewählt, bei denen der Primärtumor mit hoher Wahrscheinlichkeit bestimmt werden konnte. Insbesondere bei den untersuchten Metastasen wurde darauf geachtet, dass außer dem bekannten Primärtumor keine weiteren als Primärtumor in Frage kommenden Tumormanifestationen bekannt waren.


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3.2 Immunhistochemie

3.2.1 Konventionelle Immunhistochemie

Die Schnitte wurden in Xylol entparaffiniert, rehydriert und bei Verwendung von Peroxidase als Reporter-Enzym mit 3% H2O2 in A.dest. für 10 min zur Blockierung der endogenen Peroxidase inkubiert.

Je nach Antikörper erfolgte dann die Vorbehandlung durch Enzymandauung oder hitzeinduzierte Epitopdemaskierung.

Andauung: Die Schnitte wurden für 10 min (Cytokeratin 20: 20 min) mit 0,1% Pronase (Merck) in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) bei Raumtemperatur inkubiert.

Epitopdemaskierung: Die Schnitte wurden in einem handelsüblichen Schnellkochtopf entweder in einem 10 mM Natriumcitrat-Puffer, pH6,07, oder in einer 1mM EDTA-Lösung, pH 8,0, erhitzt8 und nach Öffnung des Druckventils für 5 min gekocht. Nach Druckausgleich und Öffnung des Deckels wurden Topf und Inhalt langsam (ca. 20 min) unter fließendem Wasser abgekühlt.

Bei Verwendung von EDTA schloß sich eine Blockierung von endogenem Biotin entsprechend der Methode von Miller und Kubier an9. Dieser Schritt war notwendig, da die höhere Demaskierungspotenz von EDTA auch zu einer stärkeren unspezifischen Färbung durch Bindung des Enzym-Streptavidinkonjugates (s.u.) an endogenes Biotin in einer Reihe von Tumoren führte. Bei Verwendung des Citratpuffers war eine Biotin-Blockierung in der Regel nicht notwendig, in fraglichen Fällen (insbesondere bei Nierenzellkarzinomen und hepatozellulären Karzinomen) wurde die Immunfärbung mit entsprechender Blockierung wiederholt.


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Die Inkubationen mit den primären Antikörpern erfolgten bei Raumtemperatur für 1 Stunde in einer feuchten Kammer (Lipshaw/Shandon, Frankfurt/M.). Die Konzentrationen der Antikörper wurden entsprechend den Ergebnissen vorab durchgeführter Testreihen gewählt.

Zur Detektion der gebundenen Primärantikörper wurde ein kommerziell verfügbarer Kit (Super Sensitive System, BioGenex, Hamburg) auf der Basis der gebräuchlichen Labeled-Streptavidin-Biotin (LSAB)-Methode verwendet. Nach Inkubation der Schnitte mit den biotinylierten Sekundärantikörpern und dem Streptavidin/Enzym-Konjugat erfolgte die Substratentwicklung. Bei Verwendung von Alkalischer Phosphatase als Reporterenzym wurden Neufuchsin als Chromogen und Napthol-As-Bi-Phosphat als Substrat benutzt. Bei Verwendung von Peroxidase griffen wir auf eine gebrauchsfertige AEC-Lösung (DAKO, Hamburg) zurück. Nach der Substratentwicklung wurden die Schnitte in Mayers Hämalaun gegengefärbt und eingedeckt.

In jedem Färbegang wurden Positivkontrollen, Negativkontrollen und Sensitivitätskontrollen mitgeführt.

Positivkontrollen waren Gewebe, von denen bekannt war, dass sie die interessierenden Antigene enthielten. Als Negativkontrollen wurden ausgewählte Fälle doppelt gefärbt, und zwar mit Ersatz des regulären Primärantikörpers auf jeweils einem der Schnitte durch einen non-immunen Antikörper derselben Spezies (DAKO, Hamburg), wobei bei monoklonalen Primärantikörpern auch auf Isotypen-Gleichheit geachtet wurde. Als Sensitivitätskontrollen wurden Tonsillengewebe zum Nachweis von CD3 (polyklonales Kaninchenserum) und ein Mammakarzinom zum Nachweis von Östrogenrezeptoren (zuerst Klon 1D5, später Klon 6F11) verwendet. Die Primärantikörper wurden dabei so titriert (1:5000 für CD3, 1:1000 für Östrogenrezeptoren), dass bei regelhafter Sensitivität der Detektion ein schwaches bis


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mäßig starkes Färbesignal nachweisbar bzw. bei suboptimaler Sensitivität keine Immunreaktivität auszumachen war.

3.2.2 Catalytic Staining Amplification (CSA)

Die hochsensitive CSA-Methode beruht prinzipiell auf der peroxidatisch induzierten kovalenten Bindung von Tyramin-Konjugaten (üblicherweise Tyramin-Biotin) in der Umgebung des gebundenen Primärantikörpers. Im Gegensatz zu den konventionellen immunhistologischen Detektionstechniken auf (Strept-)Avidin/ Biotin-Basis werden durch die nicht-stöchiometrische CSA-Methode auch bei kleinen Antigenkonzentrationen viele Biotinmoleküle in der Umgebung des zu detektierenden Antigens für einen Avidin-Biotin-Complex (ABC) oder ein Streptavidin/Enzym-Konjugat verfügbar. Im Vergleich zur LSAB-Methode steigt mit der CSA die Sensitivität mindestens um den Faktor 10010. Mit der CSA können prinzipiell 2 Ziele verfolgt werden:

  1. Die Verdünnung von teuren, aber auch gut mit konventionellen Detektionstechniken verwendbaren Primärantikörpern kann deutlich erhöht werden.
  2. Mit der CSA gelingt der Nachweis von Antigen, deren Gewebekonzentrationen unterhalb der Nachweisschwelle konventioneller Detektionssysteme liegen.

Für uns war lediglich die zweite Zielstellung von Interesse. Zur Durchführung der CSA-Methode wurden die Schnitte wie für die konventionelle Immunhistologie vorbereitet. Danach erfolgten konsekutive Inkubationsschritte mit dem Primärantikörper, dem biotinylierten Sekundärantikörper und einem ABC mit Peroxidase als Reporterenzym ebenfalls wie bei einer konventionell-immunhistochemischen Methode. Der sich daran anschließende eigentliche Amplifikationsschritt besteht aus der kovalenten Bindung von biotinyliertem Tyramin im umgebenden Gewebe durch die gebundene Peroxidase. Das neu gebundene Biotin wurde dann durch ein Streptavidin/Alkalische Phosphatase-Konjugat wie unter 3.2.1. detektiert.


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Die hohe Sensitivität der CSA stellt erhöhte Anforderungen an das immunhistochemische Procedere, da auch geringfügige und in der konventionellen Immunhistologie noch tolerable cytoplasmatische aber auch nukleäre Hintergrundfärbungen ebenfalls amplifiziert werden und eine Auswertung unmöglich machen können. Daher müssen die meisten Antikörper bei Verwendung der CSA-Methode relativ stark verdünnt werden, wodurch ein Teil der durch die CSA gewonnenen Sensitivitätssteigerung jedoch wieder verloren wird.

Polyklonale Antikörper fanden wir prinzipiell ungeeignet für die Amplifikation.

Da unserer Erfahrung nach geringfügige Hintergrundfärbungen aber nicht nur von der Wahl des Primärantikörpers, der Vorbehandlung der Schnitte (Enzyme vs. hitzeinduzierter Epitopdemaskierung) und den gewählten Komponenten des konventionellen Detektionssystems, sondern auch vom untersuchten Gewebe abhängen, wurde bei CSA-Färbungen für jeden Schnitt eine Negativkontrolle mit Ersatz des Primärantikörpers durch einen isotypspezifischen, nicht-immunen Mausantikörper mitgeführt.

3.2.3 Auswertung

In den meisten der durchgeführten Untersuchungen wurde ein mindestens mäßig starkes Färbesignal in mindestens 10% der Tumorzellen als Kriterium für ein positives Ergebnis angesetzt. Durch diese Vorgabe wurde verhindert, dass fragliche schwache Immunfärbungen in wenigen Tumorzellen - die im Einzelfall von unspezifischem Hintergrund nicht sicher abgrenzbar sein können - als positive Immunreaktivität gewertet wurden.

Weiterhin wurde das Ausmaß des Färbesignals semiquantitativ erfaßt, wobei positive Fälle entweder in 2 Gruppen mit 10-50% und > als 50% gefärbten Tumorzellen, oder in 4 Gruppen mit 1-25%, 26-50%, 51-75% und >75% gefärbten Tumorzellen11 eingeordnet


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wurden. Außerdem wurde vermerkt, ob das Färbesignal homogen/diffus oder heterogen/fleckförmig verteilt war.

Für die untersuchten Marker wurden Spezifität und Sensitivität berechnet:

(1) Spezifität = richtig Negative / richtig Negative + falsch Positive

(2) Sensitivität = richtig Positive / richtig Positive + falsch Negative

Die Bewertungen falsch und richtig bezogen sich dabei auf das vorab erwartete Färbeergebnis mit den jeweiligen Markern.

3.2.4 Statistik

Die Abhängigkeit der Immunreaktivität bestimmter Marker insbesondere vom Differenzierungsgrad der Karzinome wurde durch non-parametrische Teste (Fisher´s exakter Test und chi2 -Test) unter Zuhilfenahme eines Computerprogramms (NCSS, Dr. J.L. Hintze, Kayesville, USA) statistisch untersucht.


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Mon Sep 9 16:22:31 2002