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Aktivitätsabhängige Regulation adulter hippocampaler Neuro­genese

2.1 Vorbemerkung und Übersicht

Die im folgenden gewählte Darstellung der Untersuchungsergebnisse zur aktivitätsabhängigen Regulation adulter hippocampaler Neurogenese, faßt die jeweilige (im Anhang im Original wiedergegebene) Publikation in einer dem Kontext und dem gegenwärtigen Wissensstand Rechnung tragenden und daher relativ freien Übersetzung zusammen. Das bedeutet, daß redundante einfüh­rende Abschnitte weggelassen worden sind, die Interpretation und Diskussion enger auf den in Rede stehenden Aspekt eingeschränkt wurden und offene Fragen bzw. zum betreffenden Zeitpunkt als “zukünftig” zu untersuchende Aspekte in Bezug auf die heute bereits vorliegenden eigenen und fremden Ar­beiten diskutiert werden. Material und Methoden werden in der Übersetzung nur kursorisch zusammengefaßt, sofern dies für das Verständnis des betreffen­den Experimentes notwendig ist. Für experimentelle Details sei grundsätzlich auf die Originalpublikation verwiesen. Die Verweise auf Abbildungen und Ta­bellen in den Übersetzungen (2.2 bis 2.7), die dort mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet sind, beziehen sich jeweils auf die Abbildung im gleichen Ka­pitel bzw. auf die Originalabbildungen im Anhang. Auslassungen und zusam­menfassende Anmerkungen sind durch eckige Klammern gekennzeichnet.

Entsprechend der klassischen Theorie der Entwicklungsbiologie und –psychologie, daß das Gehirn und seine Leistungen Produkt von Genen und Umwelt sind, untersuchten wir zunächst, inwieweit die Regulation erwachsener Neurogenese von genetischen Faktoren bestimmt wird (2.2; [93]). Dazu unter­suchten wir Neurogenese in verschiedenen ingezüchteten Mausstämmen. Die Inzucht führt zu genetischer Homogenität, und der Versuch war damit das tierexperimentelle Äquivalent zu einer Zwillingsstudie. Es zeigte sich, daß in Bezug auf adulte Neurogenese drastische Stammesunterschiede bestehen, die auf verschiedenen Stufen neurogener Regulation wie der Proliferation der Vorläuferzellen, Überleben und Differenzierung unterschiedlich ausfallen. Dies konnte als Hinweis darauf verstanden werden, daß erstens erwachsene Neuro­genese genetischer Disposition unterliegt und zweitens diese genetische Dispo­sition sich auf verschiedene regulativ wirksame Gene erstreckt.

Die folgenden Arbeiten beschäftigen sich mit der Umwelt- und Aktivitäts­komponente in der Regulation adulter Neurogenese. Trotz der bahnbrechen­den Arbeiten von Fernando Nottebohm in den 80er Jahren über mit Lernver­halten korrelierender Neurogenese in Singvögeln [6, 7, 58] wurde Neurogenese im Hippocampus von Säugetieren lange als eine Art Atavismus oder Kuriosität betrachtet. Unsere Arbeiten waren die ersten, die zeigten, daß Neurogenese im erwachsenen Gehirn von Säugetieren durch Umweltreize stimulierbar ist und das Ausmaß erwachsener Neurogenese ebenfalls mit Lernparametern korreliert (2.3; [94]). In diesen Experimenten wurden Mäuse einer reizreichen Umgebung ausgesetzt, die mehr Platz und Laufräder zur höherer physischer Aktivität, wechselnde Objekte und Tunnelsystemen zur Exploration und durch Leben in [Seite 28↓]größeren Gruppen Möglichkeit zur stärkeren sozialen Interaktion bot. Es zeigte sich, daß Mäuse, die unter den Bedingungen dieses enriched environment lebten, nicht nur den Test des Wasserlabyrinths nach Morris, als einen Test für hippocampale Funktion in Nagern, besser lernten, wie dies auch zuvor schon gezeigt worden war [133, 179], sondern auch, daß die Neurogenese im Hippo­campus um 60% gegenüber Tieren in normalen Käfigen gesteigert war. Inter­essanterweise war der Effekt auf die erwachsene Neurogenese in dem hier un­tersuchten Mausstamm C57BL/6 nicht auf eine gesteigerte Proliferation der Vorläuferzellen im Gyrus dentatus zurückzuführen. Es war vielmehr ein Effekt im Sinne eines verbesserten Überlebens der neugeborenen Zellen festzustellen. Dies konnte als eine Art Selektionsmechanismus, wie er auch bei der Gehir­nentwicklung während der Embryogenese anzutreffen ist, verstanden werden.

Der stimulierende, umweltabhängige oder expositionsabhängige Effekt ließ sich in einem zweiten Experiment, auch in alten Mäusen nachweisen (2.4; [95]). Dieses Resultat zeigte, daß zumindest in Mäusen auch im höheren Alter noch eine aktivitäts- und erfahrungsabhängige Regulation von neuronalen Vorläuferzellen besteht und damit eine zelluläre Plastizität möglich ist.

Der Mausstamm 129/SvJ, der im Vergleich der verschiedenen Maus­stämme die geringste Neurogenese gezeigt hatte und zudem als “schlechter Lerner” betrachtet wird [190], wurde in einem weiteren Experiment einer reizreichen Lebensumgebung analog zum beschriebenen Versuch mit C57BL/6 ausgesetzt (2.5; [91]). Hier zeigte sich nicht nur, daß die als „gene­tisch schlechten Lerner“ eingestuften Tiere nach Stimulation in der reizreichen Umgebung im Morris Wasserlabyrinth gutes Lernen zeigten, sondern auch, daß der korrelierende Effekt auf die Neurogenese im erwachsenen Hippocam­pus sogar etwas größer war als in C57BL/6. Was die Ergebnisse aber beson­ders interessant machte, war die Tatsache, daß in 129/SvJ Mäusen der Net­toeffekt auf die Neurogenese nicht allein auf einen überlebensfördernden Se­lektionsprozess wie in C57BL/6 zurückzuführen war, sondern auch auf eine auf das doppelte gesteigerte Proliferation der Vorläuferzellen im Gyrus denta­tus. Dies wies nicht nur auf ein größeres Potential von “stummen”, aber po­tentiell rekrutierbaren Vorläuferzellen im Gyrus dentatus hin, sondern auch darauf, daß sich genetische Disposition auch auf das Wie der erfahrungsindu­zierten Regulation erstreckt.

Als wir C57BL/6 Mäuse in der reizreichen Umgebung hielten, danach aber für drei Monate in den Standardlaborkäfig zurückkehren ließen, zeigten diese Tiere auf Entzug der komplexen Stimuli hin überraschenderweise eine Zunahme der proliferierenden Zellen im Hippocampus gegenüber Kontrolltie­ren und Tieren, die für sechs Monate in der reizreichen Umgewbung gelebt hatten (2.6; [92]). Dieses Ergebnis kann so interpretiert werden, daß der über­lebensfördernde Effekt während der früheren Stimulationsphase nicht nur auf potentielle neue Nervenzellen wirkte, sondern auch auf die verbleibenden Vorläuferzellen selbst. Es stand somit auch drei Monate nach der Beendigung der Stimulationsphase weiterhin ein erhöhtes Potential für gesteigerte Neuro­genese zur Verfügung. Das Potential allerdings lag brach — vermutlich da [Seite 29↓]keine neue Komplexität der Umwelt die Rekrutierung neuer Nervenzellen för­derte. Diese Arbeit legte nahe, daß ein erfahrungsabhängiger überlebensför­dernder Effekt auch auf die Vorläuferzellpopulation selbst wirken und somit das Potential zur Neurogenese im erwachsenen Gehirn frühzeitig steigerbar sein könnte.

Da eine reizreiche Umgebung aus einer komplexen Mischung sehr ver­schiedener Reize besteht, stellte sich die wichtige Frage, welche dieser Reize für die Auslösung des stimulierenden Effektes auf die Neurogenese im erwachse­nen Gehirn die entscheidenden sind. Wir zeigten hierzu, daß körperliche Akti­vität in der Lage ist, eine gesteigerte Neurogenese hervorzurufen (2.7; [178]). Mäuse die unbegrenzten und zwanglosen Zugang zu einem Laufrad in ihrem anderweitig nicht besonders ausgestatteten Käfig hatten, zeigten eine Verdop­pelung in der Zahl der proliferierenden Vorläuferzellen im Hippocampus und hierdurch eine gesteigerte Neurogenese. Dieses Resultat belegte wiederum, daß die Regulation der Neurogenese im erwachsenen Hippocampus auf verschie­denen Ebenen erfolgt und darüberhinaus, daß verschiedene Reize auch auf verschiedene Aspekte der Regulation Einfluß nehmen.

2.2  Allgemeine genetische Determinanten adulter hippocampaler Neurogenese

Kempermann G, Kuhn HG, Gage FH. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 94 (1997) 10409-10414.

Zusammenfassung: Um den Einfluß des genetischen Hintergrundes auf adulte hippo­campale Neurogenese in erwachsenen Mäusen zu identifizieren, haben wir in C57BL/6, BALB/c, CD1(ICR) und 129 Sv/J Mäusen die Zellproliferation, das Überleben der neugeborenen Zellen und ihre Differenzierung untersucht. Die Zellproliferation im Gyrus dentatus war am höchsten in C57BL/6; die Überlebensrate war am höchsten in CD1. In allen Stämmen nahmen ungefähr 60% der neugeborenen Zellen einen neuronalen Phänotyp an, aber 129 Sv/J produzierten mehr neue Astrozyten als die anderen Stämme. Über einen Zeitraum von sechs Tagen produzierten C57BL/6 0.36% ihrer absoluten Körnerzellzahl von 239 000 als neue Nervenzellen, BALB/c 0.30% von 242 000, CD1 (ICR) 0.32% von 351 000 und 129 Sv/J 0.16% von 280 000. Diese Ergebnisse zeigten, daß unter­schiedliche Stufen der Regulation adulter hippocampaler Neurogenese unterschiedlicher Beein­flussung durch den genetischen Hintergrund unterliegen.

[Ziel dieser Arbeit war, erste Anhaltspunkte über die genetischen Deter­minanten der Regulation adulter hippocampaler Neurogenese zu gewinnen. Es waren zu diesem Zeitpunkt bereits einige Faktoren bekannt, die adulte Neuro­genese beeinflussen. Dazu gehörten insbesondere E. Goulds Arbeiten über die Rolle, die Steroidhormone und excitatorische Afferenzen spielen. Beide Fakto­ren wirken als negative Regulatoren. Nachdem wir zeigen konnten, daß adulte hippocampale Neurogenese durch Umweltreize positiv reguliert wird, lag es [Seite 30↓]nahe zu prüfen, wie diese funktionelle Regulation genetischen Determinanten unterliegt.]

Dazu wählten wir als ersten Schritt den Vergleich von vier ingezüchteten Mausstämmen, die unter identischen Bedingungen gehalten wurden, um den Umwelteinfluß zu minimieren.

Die Proliferation der Stamm- und Vorläuferzellen in der subgranulären Zone wurde durch Markierung mit BrdU und anschließender Immunhisto­chemie untersucht. Die Überlebensrate wurde abgeschätzt, indem die Zahl BrdU-positiver Zellen einen Tag nach der letzten von sechs BrdU-Injektionen (eine pro Tag) mit dem Wert vier Wochen später verglichen wurde. Die Zellzahlen wurden stereologisch bestimmt. Die phänotypische Differenzierung wurde mittels Immunhistochemie und konfokaler Mikroskopie mit Antikör­pern gegen BrdU, den Körnerzellmarker Calbindin D28k und den Astro­zytenmarker GFAP untersucht. [Für die Details der Methoden sei auf die Ori­ginalpublikation verwiesen.]

Ergebnisse

Proliferation. In allen vier untersuchten Mausstämmen konnten proliferie­rende Zellen in der subgranulären Zone des Gyrus dentatus nachgewiesen werden (Abb. *1). Außerdem waren BrdU-positive Zellen in der Hilusregion (CA4) und in der Molekularschicht zu finden; Zellgenese, jedoch keine Neuro­genese ist in diesen Regionen beschrieben worden [27, 94, 100]. Die Dichte der Proliferation in der Molekularschicht hob sich nicht deutlich von der sehr niedrigen allgemeinen Zellproliferation ab, wie sie überall im Gehirn gefunden werden kann. Eine Quantifizierung erwies, daß sich die Proliferation in C57BL/6 signifikant von der in den anderen Stämmen unterschied und etwa 1.5-fach höher war (Abb. *2A und Tabelle *2.


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Tab. 2 : Statistische Analysen: Signifikanzniveaus

 

C57

vs. BALB/c

C57

vs.

CD1

C57

vs.

129/Sv

BALB/c

vs.

CD1

BALB/c

vs

129/Sv

CD1

vs.

129/Sv

       

Proliferation - 1 Tag nach der letzten BrdU-Injektion (siehe Abb. 2a)

F-Wert: 3.311; P-Wert: 0.0470

0.0162

0.0164

0.0381

n/s

n/s

n/s

       

Überlebende Zellen - 4 Wochen nach der letzten BrdU-Injektion (siehe Abb. 2b)

F-Wert: 7.696; P-Wert: 0.0021

n/s

n/s

0.0158

0.0114

n/s

(0.0789)

0.0002

       

Neuronale Differenzierung - 4 Wochen nach der letzten BrdU-Injektion (siehe Abb. 3)

F-Wert: 0.392; P-Wert: 0.7609

n/s

n/s

n/s

n/s

n/s

n/s

       

Gliale Differenzierung - 4 Wochen nach der letzten BrdU-Injektion (siehe Abb. 3)

F-Wert: 2.767; P-Wert: 0.0781

n/s

n/s

(0.0440)

n/s

(0.0332)

(0.0288)

       

Volumen der Körnerzellschicht

(siehe Tab. 2)

F-Wert: 8.570; P-Wert: 0.0013

n/s

0.0003

n/s

0.0007

n/s

0.0047

       

Gesamtkörnerzellzahl

(siehe Tab. 2)

F-Wert: 16.664; P-Wert: <0.0001

n/s

<0.0001

0.0344

<0.0001

n/s

(0.0526)

0.0012

       

Neuronale Dichte

(siehe Tab. 2)

F-Wert: 0.815; P-Wert: 0.5042

n/s

n/s

n/s

n/s

n/s

n/s

       

BrdU-positive Zellen in Prozent der Ge­samtkörnerzellzahl (siehe Resultate)

F-Wert: 3.386; P-Wert: 0.0441

n/s

n/s

0.0083

n/s

n/s

(0.0521)

0.0323

Statistische Analysen wurden mit ANOVA und Fisher post-hoc-Test durchge­führt. Ein P-Wert ≤ 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen. P-Werte zwi­schen 0.05 und 0.1 und P-Werte unter 0.05 in den Fällen, in denen der ANOVA P-Wert keine Signifikanz ergab sind in Klammern angegeben. Signifikante Vergleiche sind unterlegt. Die erste Spalte listet die F-Werte und P-Werte der ANOVA auf. N ist 5 in allen Gruppen. “n/s” steht für “nicht signifikant”.

Überlebensrate. Vier Wochen nach der letzten Injektion von BrdU wurde die Überlebensrate der neugeborenen Zellen abgeschätzt (Abb. *1B). Abb. *2B und Tabelle *2 zeigen die Quantifizierung dieser Untersuchungen. 129/SvJ hatten durchschnittlich nur etwa halb soviele überlebende neugeborene Zellen wie die anderen untersuchten Stämme und unterschieden sich signifikant von CD1 und relativ deutlich (P = 0.0864) von C57/BL6. Die Ratio der Zahl BrdU-positiven Zellen vier Wochen nach der letzten Injektion gegenüber der Zahl am 1. Tag nach Injektion verdeutlicht dieses Muster: 129/SvJ hatten eine Vierwochenüberlebensrate von nur 1 aus 4, während C57BL/6 eine Rate von 1 aus 3 hatten, BALB/c von 1 aus 2 und CD1 von ungefähr 1 aus 1.3.


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Differenzierung. Die Kolokalisation von BrdU-Immunreaktivität mit einer Immunreaktion von Antikörpern gegen den Körnerzellmarker Calbindin D28k und den Astrozytenmarker GFAP wurde untersucht, um den Phänotyp der neugeborenen Zellen vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion zu unter­suchen. Die Abb. *1G bis I zeigen konfokale Mikroskopbilder von drei­fachmarkierten neugeborenen Zellen. In allen vier Stämmen konnte sowohl eine neuronale (Abb. *1G) als auch eine gliale (Abb. *1H) Differenzierung festgestellt werden. Ungefähr ein Drittel der überlebenden neugeborenen Zel­len wies keine Doppelmarkierungen auf, was entweder darauf schließen läßt, daß es sich um eine undifferenzierte Vorläuferzelle oder aber um eine differen­zierte Zelle, deren Phänotyp hier nicht erfaßt wurde, handelt. Neugeborene Astrozyten wurden nahezu ausschließlich in der subgranulären Zone gefunden. 129/SvJ zeigten einen Trend (p = 0.0781) zu mehr neuen Gliazellen als die anderen Stämme (Tabelle *2).

Neue Nervenzellen im Gyrus dentatus erwachsener Mäuse. Alle vorgestellten Da­ten beziehen sich auf die stereologisch gewonnene Abschätzung des Volumens des Gyrus dentatus (Tabelle *2). CD1-Mäuse hatten einen signifikant größeren Gyrus dentatus als die anderen Stämme. Auch die absolute Körnerzellzahl zeigte signifikante Unterschiede zwischen den Stämmen: CD1 hatten signifkant mehr Körnerzellen als die anderen Stämme, 129/SvJ hatten signifikant weniger (außer für den Vergleich mit BALB/c, für den der P-Wert 0.0526 war). Die Packdichte der Körnerzellen war annähernd gleich in den vier untersuchten Stämmen (Tabelle *2, Abb. *1C bis F).

Die Zahl der BrdU-positiven Zellen vier Wochen nach der letzten Injekti­on kann als Prozentwert der absoluten Zahl an vorhandenen Körnerzellen ausgedrückt werden. Die Werte sind (Mittelwert +/- Standardfehler): 0.58 +/- 0.29% in C57BL/6, 0.48 +/- 0.07% in BALB/c, 0.51 +/- 0.12% in CD1 und 0.27 +/- 0.03% in 129/SvJ. 129/SvJ unterschied sich von den anderen Stäm­men durch eine signifikant niedrigere Ratio (nur der Vergleich BALB/c und 129/SvJ ist mit P = 0.0521 knapp nicht signifikant; vgl. Tabelle *2).


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Tab. 3 : Stereologische Kennzahlen des Gyrus dentatus

 

C57

BALB/c

CD1 (ICR)

129/SvJ

     

Volumen der Kör­nerzellschicht (µm3)

2.63 x 108

± 0.16 x 108

2.71 x 108

± 0.34 x 108

3.57 x 108

± 0.27 x 108

2.90 x 108

± 0.45 x 108

     

Gesamtzahl der Körnerzellen

2.39 x 105

± 0.25 x 105

2.42 x 105

± 0.30 x 105

3.51 x 105

± 0.27 x 105

2.80 x 105

± 0.32 x 105

     

Neuronale Dichte in der Körnerzell­schicht (Zellen pro Proben- volumen)

8.14 ± 0.18

9.19 ± 0.77

8.86 ± 0.18

8.77 ± 0.21

Stereologische Daten des Gyrus dentatus: Volumen, Gesamtkörnerzellzahl und Neuronale Dichte. Alle Zahlen sind Mittelwerte ± Standardfehler. N ist 5. Probenvolumen: 9000 µm3. Statistische Angaben in Tab. 2.

Durch Multiplikation dieser Werte mit der Prozentzahl der BrdU-/Calbindin-positiven Zellen (Abb. *2B) kann die Zahl der neugebildeten Neu­rone relativ zur Gesamtzahl der vorhandenen Körnerzellen abeschätzt werden. In der sechstägigen Periode der BrdU-Injektionen produzierten C57BL/6 mindestens 0.36% ihrer Körnerzellpopulation als neue calbindinpositive Ner­venzellen in der Körnerzellschicht, BALB/c 0.30%, CD1 0.32% und 129/SvJ nur 0.16%.

Diskussion

In diesem Experiment wurde in vier Mausstämmen die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen, das Überleben ihrer Tochterzellen und deren phä­notypische Differenzierung untersucht. Adulte hippocampale Neurogenese konnte in allen vier untersuchten Stämmen nachgewiesen werden. Stammes­unterschiede wurden im Hinblick auf die Proliferation, das Überleben, die Dif­ferenzierung, die absoluten Zellzahlen im Gyrus dentatus und das Volumen des Gyrus dentatus festgestellt.

Stammesunterschiede in der Zahl der BrdU-positiven Zellen einen Tag nach der letzten BrdU-Injektion, die hier als Maßzahl für “Proliferation” her­angezogen werden, reflektieren nicht notgedrungen analoge Unterschiede in der Größe der Vorläuferzellpopulation in der subgranulären Zone, da der Ein­bau von BrdU in die sich replizierende DNA auch von Zellzyklusparametern beeinflußt wird. Da BrdU nur in der S-Phase der Mitose inkorporiert wird und die Bioverfügbarkeit mit ungefähr zwei Stunden angegeben wird [173], könnte eine einzige Injektion pro Tag nicht alle Zellen, die sich während dieser 24 Stunden teilen, treffen. Andererseits kann dieses Injektionsschema nicht zu Überschätzungen führen. Trotzdem beinhaltet die gewonnene Zahl BrdU-po­sitiver Zellen auch die Tochterzellen, die aus Zellteilungen markierter Zellen nach Beendigung der Injektionen hervorgegangen sind. Obwohl auch diese [Seite 34↓]Zellen “neugeboren” sind, beeinflußt diese Tatsache Aussagen über den exak­ten Geburtszeitpunkt der markierten Zellen. Der Grund dafür, die Injektionen über einen Zeitraum von sechs Tagen auszudehnen, ist der Wunsch, den quantitativen Einfluß der fortgesetzten Teilungen markierter Zellen in der Ab­wesenheit von systemischem BrdU zu minimieren.

Für C57BL/6 wird die Zellzyklusdauer am Tag P20 mit ca. 16 Stunden angegeben, wovon ca. 8 Stunden auf die S-Phase entfallen [131]. Andere Studi­en haben gezeigt, daß sich die Zellzyklusdauer mit steigendem Alter verlängert [24]. Daraus kann für die hier erhobenen Ergebnisse gefolgert werden, daß C57BL/6 entweder einen schnelleren Zellzyklus oder eine größere Population proliferierender Vorläuferzellen als die anderen Stämme haben oder eine Kombination von beidem. Unabhängig davon ergibt sich als das Nettoergeb­nis, daß C57BL/6 mehr neugeborene Zellen aufweisen als die anderen Stämme.

Durch Vergleich der Zahl der BrdU-positiven Zellen einen Tag und vier Wochen nach der Injektion von BrdU wird eine dramatische Abnahme der Zellzahl deutlich, die in 129/SvJ mit 75% am ausgeprägtesten war und mit 23% in CD1 am geringsten ausfiel. Dabei ist die Erklärung, daß ein Teil der Zellen durch massive fortgesetzte Teilungsaktivität die BrdU-Markierung in ihrem Genom unter die immunhistochemische Nachweisgrenze verdünnt ha­ben könnte, in Betracht zu ziehen; sie kann aber nicht den gesamten Effekt erklären. [...]

Eine Abnahme der Zahl BrdU-positiver Zellen durch Verdünnung impli­zierte, daß sich die große Mehrheit der Stamm- und Vorläuferzellen symme­trisch teilte. Da die BrdU-Injektionen über sechs Tage verteilt wurden, würden Zellen, die den Zellzyklus zumindest in den ersten Tagen bei asymmetrischen Teilungen verließen, als BrdU-positive Zellen nachweisbar bleiben. Symmetri­sche Teilungen in derartigem verdünnend wirksamem Ausmaß würden da­durch eine enorme Zahl undifferenzierter Zellen in der subgranulären Zone generieren; was jedoch nicht geschieht. Auf der anderen Seite könnte z.B. apoptotischer Zelltod diesen Effekt ausbalancieren.

Während der embryonalen Entwicklung spielt apoptotischer Zelltod eine herausragende Rolle in der Regulation der endgültigen Zellzahl. [Das Auftreten von Apoptose, das für die proliferativen Regionen des sich enwickelnden Ge­hirns beschrieben wurde, war zum Zeitpunkt der Veröffenlichung dieser Ar­beit für die neurogenen Regionen des erwachsenen Gehirns noch nicht unter­sucht. Mittlerweile gibt es Studien, die eine analoge Beziehung auch im erwach­senen Gehirn nachweisen [13]. Daher spricht viel dafür, daß diejenigen Zellen, die in den vier Wochen zwischen den beiden Untersuchungszeitpunkten “ver­schwinden”, durch Apoptose eliminiert werden.]

Unabhängig von dieser Reduktion differenziert eine gewisse Anzahl der überlebenden Zellen, was post hoc belegt, daß asymmetrische Zellteilungen auf­getreten sein müssen. Sollte durch einen hypothetisch kürzeren Zellzyklus und durch Verdünnungseffekte die Proliferation in 129/SvJ unterschätzt worden sein, so würde dies zu einer Nettoüberlebensrate sogar unter der angegebenen [Seite 35↓]1:4 ergeben. Es sollte aus diesem Grund hier aber die Existenz eindeutiger Stammesunterschiede stärker betont werden als ihre exakte quantitative Aus­prägung.

Vier Wochen nach der letzten Injektion waren neuronal und glial differen­zierte BrdU-positive Zellen in allen vier untersuchten Stämmen nachweisbar. [...] Daraus kann nicht unmittelbar geschlossen werden, daß die in situ nach­weisbaren Stamm- und Vorläuferzellen (Abb. *1A, B, G) “identisch” mit den in der Zellkultur als multipotent ausgewiesenen Stammzellen sind. Daraus folgt auch, daß nicht sicher ausgesagt werden kann, ob die im Experiment nachge­wiesenen differenzierten (calbindin- bzw. GFAP-positiven) Zellen aus einer multipotenten Vorläuferzelle stammen oder aus zwei unterschiedlichen, in ihrer Differenzierungslinie festgelegten Blastenpopulationen.

Das Ergebnis, daß sich 129Sv/J von den anderen drei Stämmen in der Zahl der Zellen, die in Astrozyten differenzierten, unterschied, legt deshalb zwei Interpretationen nahe: (1.) in 129/SvJ-Mäusen tendiert die Entscheidung zur Differenzierung eher zur glialen Linie oder (2.) in 129/SvJ sind Glioblasten empfänglicher für eine Stimulation zur Differenzierung.

Unsere Ergebnisse bezüglich der absoluten Körnerzellzahl fallen in den durch andere Publikationen gesteckten Rahmen und bestätigen, daß beachtli­che Stammesunterschiede für diesen Parameter bestehen [183, 187-189]. So hatten 129/SvJ nicht weniger Körnerzellen als andere Stämme, aber sie produ­zierten deutlich weniger neue Körnerzellen im Erwachsenenalter. Es ist, gerade auch im Lichte der Daten zur Apoptose in den neurogenen Regionen nicht mit allerletzter Sicherheit geklärt, inwieweit adulte hippocampale Neurogenese kontinuierlich neue Nervenzellen der Körnerzellschicht hinzufügt oder Teil eines Austauschprozesses ist, in dem alte Körnerzellen ersetzt werden. Wimer et al. haben den Hippocampus von Mäusen bis zum Tag P84 untersucht und haben einen Zuwachs der Körnerzellschicht gesehen [188]. Sowohl für adulte Neurogenese in Ratten [37] als auch in alten Mäusen, wie die diesbezüglichen, weiter unten dargestellten Ergebnisse zur erfahrungsabhängigen Regulation adulter Neurogenese und die dabei erhobenen stereologischen Daten zeigen, lassen sich mittlerweile jedoch starke Argumente dafür ins Feld führen, daß die Gesamtkörnerzellzahl über die ersten 12 Lebensmonate ansteigt und etwa um diese Zeit (bei dann deutlich reduzierter adulter hippocampaler Neurogenese) ein Plateau erreicht [9]. [...]

Der ausgeprägteste Stammesunterschied in adulter hippocampaler Neuro­genese wurde zwischen C57BL/6 und 129/SvJ nachgewiesen. Ausgerechnet diese beiden Stämme werden in Experimenten mit transgenen oder nullmu­tanten Tieren sehr häufig gekreuzt. Bei der Interpretation von Daten zur adul­ten hippocampalen Neurogenese in Tieren mit gezielten Mutationen muß dies berücksichtigt werden, da flankierende Hintergrundgene das Resultat beein­trächtigen könnten [39, 57, 105].

Das Muster der im vorliegenden Experiment gefundenen Stammesunter­schiede war nicht einheitlich bezüglich der verschiedenen untersuchten Para­meter (vgl. Tabelle 1). So differenzierten beispielsweise in 129/SvJ, die die [Seite 36↓]niedrigste Zahl überlebender BrdU-positiver Zellen hatten, die gleiche relative Anzahl hiervon in Neurone wie in den anderen Stämmen. CD1-Mäuse hatten bezogen auf das Volumen einen größeren Hippocampus als die anderen Stämme, aber zeigten keine proportionale Steigerung in adulter hippocampaler Neurogenese. Grundsätzlich zeigte sich, daß die Gesamtzahl an Körnerzellen kein guter Indikator für das Ausmaß an adulter hippocampaler Neurogenese ist. 129/SvJ, die einen durchschnittlich großen Hippocampus haben, produ­zierten mit Abstand die niedrigste Zahl neuer Körnerzellen (lediglich 0.16% der absoluten Körnerzellzahl über den Injektionszeitraum von sechs Tagen hinweg). [...]

Die genetische und umweltabhängige Kontrolle von Nervenzellzahlen ist beispielsweise auch für die Retina untersucht worden, wo sich zeigte, daß ver­erbbare Faktoren etwa 75% der sichtbaren Unterschiede erklären [185]. [...]

Obwohl unsere Daten andeuten, daß der genetische Hintergrund adulte hippocampale Neurogenese stark beeinflußt, bedeutet dies nicht, daß die rele­vanten Gene nur diejenigen sind, die unmittelbar in der Regulation adulter hippocampaler Neurogenese involviert sind. Eine Vielzahl von Genen die Sy­steme beeinflussen, die ihrerseits Effekte auf die Regulation adulter hippocam­paler Neurogenese haben (z.B. der Hormonstatus) könnten indirekt für die Stammesunterschiede verantwortlich sein.

Mit Ausnahme von 129/SvJ, die nur die Hälfte der durchschnittlichen Rate der anderen Stämme erreichten, produzierten die hier untersuchten Stämme über einen Zeitraum von nur sechs Tagen mehr als 0.30% ihrer Ge­samtkörnerzellzahl als neue Nervenzellen. Dies entspricht einem neuen Neu­ron auf ca. 2000 bestehende Körnerzellen. Diese Neurogeneserate ist überra­schend hoch. Adulte hippocampale Neurogenese ist daher kein quantitativ zu vernachlässigendes Phänomen. Es ist aber offen, inwieweit die Körnerzellzahl und die Rate adulter hippocampaler Neurogenese mit hippocampaler Funktion korreliert.


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2.3  Aktivitätsabhängige Regulation adulter hippocampaler Neuro­genese

Kempermann G, Kuhn HG, Gage FH. More hippocampal neurons in mice living in an enriched environment. Nature 386 (1997) 493-495

Zusammenfassung: Neurogenese im Gyrus dentatus findet über die gesamte Lebens­spanne hinweg statt. Die Funktion der neugeborenen Neurone und die Mechanismen, die ihre Geburt regulieren, sind jedoch noch unbekannt. Hier zeigen wir, daß signifikant mehr neue Nervenzellen im Gyrus dentatus von Mäusen zu finden sind, die einer reizreichen Le­bensumgebung ausgesetzt wurden, als in Kontrolltieren in Standardkäfigen. Wir zeigen au­ßerdem durch die Anwendung von stereologischen Techniken, daß die reizreich lebenden Mäuse eine vom Volumen her größere Körnerzellschicht und um 15% mehr Körnerzellen besitzen.

Seit langem ist bekannt, daß im erwachsenen Gehirn eine erfahrungsab­hängige Plastizität neuroanatomischer Strukturen zu finden ist [2, 41, 72, 118, 154]. Eine reizreiche Lebensumgebung (“Enriched environment”), die sich durch die “Kombination von komplexer unbelebter und sozialer Stimulati­on”[153] gestaltet, wird dabei eingesetzt, um erfahrungsabhängige Neuroplasti­zität zu induzieren. Im Hippocampus nachweisbare Veränderungen umfassen eine vermehrte “Dicke” des Hippocampus [150, 181], Zunahme dendritischer Verzweigungen und der Zahl der Gliazellen. Reizreichtum besteht dabei nor­malerweise im Vergleich mit der Standardlaborhaltung, auch wenn Art und Ausmaß dieses Reizreichtums, wie er auch in dieser Studie angewandt wurde, noch eindeutig eine Reizarmut gegenüber Wildbedingungen darstellen [40]. Das im Folgenden dargestellte Experiment sollte zeigen, ob die Exposition gegenüber einer reizreicheren Umgebung zu einer erhöhten Nervenzellzahl im Gyrus dentatus führen könnte.

Dazu wurden 21 Tage alte Mäuse des Stammes C57BL/6 zufällig auf zwei Gruppen aufgeteilt und wuchsen entweder unter Standardbedingungen oder reizreichen Bedingungen für 40 weitere Tage heran (Abb. *1). Während der letzten zwölf Tage dieser 40 Tage erhielten sie eine tägliche intraperitoneale Injektion (50 mg pro Kilogramm Körpergewicht) BrdU. Einen Tag nach der letzten Injektion wurden fünf Mäuse aus jeder Gruppe mit 4%iger Paraformal­dehydlösung perfundiert. Die verbleibenden Tiere wurden für fünf Tage im Wasserlabyrinth nach Morris untersucht und lebten während dieser Zeit und für 23 weitere Tage in der jeweilig zugewiesenen Umgebung.

Vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion wurden die verbliebenen Mäuse perfundiert. Gehirnschnitte wurden mit Immunhistochemie untersucht, und die Zahl der BrdU-positiven Zellen wurde mit stereologischen Methoden bestimmt. Es fand sich kein statistisch signifikanter Unterschied in der Zahl der BrdU-positiven Zellen zwischen den beiden Gruppen am Tag 1 nach der letzten BrdU-Injektion. Dieses Resultat legte nahe, daß reizreiche Bedingungen [Seite 38↓]keinen oder nur geringen Einfluß auf die Teilungsaktivität der Vorläuferzellen im Gyrus dentatus haben (Es zeigte sich in folgenden Experimenten, daß be­züglich dieses Punktes Stammesunterschiede bestehen und sich z.B. in 129/SvJ Mäusen unter identischen experimentellen Bedingungen ein massiver Effekt auf die Proliferation in der subgranulären Zone feststellen läßt — siehe 2.5).

Vier Wochen später jedoch fand sich ein hochsignifikanter Unterschied in der Zahl der überlebenden BrdU-positiven Zellen (Abb. *2A und *3A und B). Reizreich lebende Tiere hatten 57% mehr markierte Zellen pro Gyrus dentatus als Kontrollen. Dies legt nahe, daß reizreiche Lebensumgebung einen überle­bensfördernden Effekt auf die sich teilenden neuronalen Vorläuferzellen (bzw. ihre Tochterzellen) im Gyrus dentatus hat.

Dreifachmarkierungen für BrdU, den Körnerzellmarker Calbindin D28k und saures Gliafaserprotein (GFAP) als Marker für Astrozyten wurden durch­geführt und zum Vierwochenzeitpunkt mittels konfokaler Fluoreszenzmikro­skopie eingesetzt, um den Phänotyp der BrdU-positiven Zellen zu bestimmen (Abb. *3C). Die relative Verteilung der Phänotypen zeigte zwischen den Gruppen keine Unterschiede: 61% in den reizreich lebenden Tieren und 57% in Kontrollen der BrdU-positiven Zellen waren auch calbindinpositiv und zeigten somit einen neuronaler Phänotyp mit Körnerzelldifferenzierung. Die Multiplikation der Zahl der BrdU-positiven Zellen mit der entsprechenden Rate neuronaler Differenzierung führte zu der Schlußfolgerung, daß von den während der zwölf Tage der Injektionen geborenen Zellen pro Gyrus dentatus durchschnittlich mindestens 2490 neue Neurone überlebten —im Vergleich zu nur 1330 in Kontrolltieren.

Im Gyrus dentatus der Kontrolltiere, waren 16% der BrdU-positiven Zel­len auch GFAP-positiv, während 27% weder calbindin- noch GFAP-positiv waren. Die entsprechenden Zahlen für die reizreich lebende Gruppe waren: 11% und 29%. Reizreich lebende Tiere zeigten somit durchschnittlich unge­fähr 450 überlebende neue Astrozyten im Gyrus dentatus gegenüber ungefähr 380 in den Kontrollen. Dieses Resultat ist in Übereinstimmung mit den frühe­ren Berichten von einer gesteigerten Gliazellzahl in reizreich lebenden Tieren [2, 181].

Ältere Arbeiten haben berichtet, daß reizreiche Haltung zu einer Zunahme der hippocampalen “Tiefe” (depth) führt [150]. Wir haben das absolute Volu­men der Körnerzellschicht stereologisch bestimmt und fanden einen statistisch signifikanten Zuwachs in der reizreich lebenden Gruppe (Abb. *2B). Diese Veränderung in der hippocampalen Morphologie war zuvor mit einer ver­stärkten Verzweigung der Dendriten, einer Zunahme der Kerngröße und mehr Gliazellen erklärt worden. Eine Zunahme der Nervenzellzahl könnte jedoch ebenfalls zu der Volumenvergrößerung beitragen. Als wir die absolute Körner­zellzahl stereologisch bestimmten, fanden wir, daß reizreich lebende Tiere durchschnittlich mehr als 310 000 Körnerzellen besaßen, im Gegensatz zu 270 000 in Kontrollen (Abb. *2C). Dies stellt eine Zunahme um mehr als 40 000 Neurone bzw. mindestens 15% dar. Obwohl keine entsprechenden, stereolo­[Seite 39↓]gisch erhobenen Vordaten für C57BL/6 Mäuse existieren, befindet sich die Ausgangszahl in der Spanne, die für andere Stämme angegeben wurde [189].

Wir schließen aus diesen Ergebnissen, daß Erfahrung einer reizreichen Umgebung einen überlebensfördernden Effekt auf die Tochterzellen der neu­ronalen Stamm- und Vorläuferzellen im Hippocampus von erwachsenen Mäu­sen hat und daß diese neuen Neurone zu einem erhöhten hippocampalen Vo­lumen und einer gesteigerten Körnerzellzahl in diesen Tieren beitragen. Da die Stimulation durch Umweltreize theoretisch einen ähnlichen Effekt auf ruhende Stammzellen in anderen Regionen des Hippocampus haben könnte, unter­suchten wir die CA-Regionen, fanden jedoch keine BrdU-positiven Zahlen in Maßen, die über den sehr niedrigen und verstreuten Hintergrund sich teilender Zellen, wie er überall im Hippocampus zu finden ist, hinausgeht (Abb. *3D bis G). Die Hilusregion (CA4) ist insofern eine Ausnahme, als daß eine gewisse Rate an Zellproduktion, wenn auch keine Neurogenese, in dieser Region be­kannt ist [27, 100]. Vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion fanden sich (Mittelwert +/- Standardfehler) 824 +/- 105 BrdU-positive Hiluszellen in Kontrollen im Vergleich zu 886 +/- 119 in reizreich lebenden Tieren (p > 0.7; t-Test). Das Volumen des Hilus veränderte sich ebenfalls nicht und lag bei 0.43 +/- 0.02 mm3 in Kontrollen und 0.47 +/- 0.03 mm3 in reizreich lebenden Tie­ren (p > 0.69; t-Test). Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Wirkung auf die neugeborenen Nervenzellen und Astrozyten in der subgranulären Zone relativ spezifisch ist.

Die regulatorischen Mechanismen, die adulte hippocampale Neurogenese steuern, sind weitgehend unbekannt. Sowohl Studien über adulte hippocam­pale Neurogenese als auch über erfahrungsabhängige Neuroplastizität unter­stützen die These, daß Steroidhormone eine Rolle in dieser Regulation spielen könnten, möglicherweise über Signalwege, die die Aktivierung glutamaterger Rezeptoren beinhalten.

Aus in vitro und in vivo Studien ist bekannt, daß trophische Faktoren, inklu­sive Epidermal Growth Factor und Fibroblast Growth Factor 2, das Schicksal von neuronalen Vorläuferzellen beeinflussen können [35, 135, 147]. Daten über die erfahrungsabhängige Regulation dieser Faktoren fehlen bislang. Es ist auch anzunehmen, daß eine präzise zeitliche und räumliche Kontrolle verschiedener Parameter erforderlich ist, um das Überleben und die Differenzierung der en­dogenen neuronalen Vorläuferzellen zu gewährleisten.

Um darzustellen, daß der hier angewandte Reizreichtum der Umgebung ausreichte, um die Verbesserung der Leistung in Bezug auf räumliches Lernen, wie bereits von anderen berichtet [133, 179], hervorzurufen, testeten wir unse­re Tiere im Wasserlabyrinth nach Morris und fanden eine moderate, jedoch signifikante Verbesserung in den reizreich lebenden Tieren (Abb. *2D). Hie­raus kann man nicht schließen, daß die größere Zahl an Neuronen im Gyrus dentatus diese Verbesserung im Verhaltenstest bewirkte. Es ist jedoch wahr­scheinlich, daß eine Kombination von mehr Nervenzellen, Synapsen und Dendriten sowie Faktoren, die noch unbekannt sind, zu der verbesserten Lei­stung, die durch die reizreiche Umgebung induziert wurde, beiträgt.


[Seite 40↓]

2.4  Aktivitätsabhängige Regulation adulter Neurogenese im altern­den Hippocampus

Kempermann G, Kuhn HG, Gage FH. Experience-induced neurogenesis in the senes­cent dentate gyrus. Journal of Neuroscience 18 (1998) 3206-3212

Zusammenfassung: Wir zeigen hier, daß unter physiologischen Bedingungen auch im Hippocampus von sehr alten Mäusen noch Neurogenese vorkommt und durch Leben in einer reizreichen Umgebung stimulierbar ist. Die Neurogenese verminderte sich mit steigendem Alter. Ein Wechsel aus der Standardunterbringung in eine reizreiche Lebensumgebung mit Möglichkeiten zur sozialen Interaktion, Exploration und körperlichen Aktivität für einen Zeitraum von 68 Tagen führte zu einem verbesserten Überleben BrdU-markierter Zellen. Phänotypische Analyse enthüllte, daß in reizreich lebenden Tieren relativ mehr Zellen zu Nervenzellen differenzierten, was zu einer Nettoverdreifachung der Zahl BrdU-markierter Neurone in zwanzig Monate alten Mäusen (105 gegenüber 32 Zellen) und einer Verdop­pelung (684 gegenüber 285 Zellen) in acht Monate alten Mäusen im Vergleich zu gleichalt­rigen Tieren in Standardkäfigen führte. Entsprechende Zahlen für BrdU-positive Astro­zyten und BrdU-positive Zellen, die keine Doppelmarkierung mit den neuronalen oder glia­len Markern zeigte, blieben unbeeinflusst. Der Effekt auf die relative Verteilung der Phä­notypen kann als eine überlebensfördernde Wirkung mit einer Selektivität für Neurone in­terpretiert werden. Die Proliferation der Vorläuferzellen blieb von der Stimulation durch Umweltreize unbeeinflusst.

[...] Der alternde Hippocampus wird von einer Anzahl struktureller und funktioneller Veränderungen heimgesucht. Hierzu gehören beispielsweise auch ein neuronaler Zellverlust in den CA-Regionen und im Hilus [184], eine ver­minderte Synapsendichte [156] und eine verminderte Expression von Wachs­tumsfaktor- und Steroidhormonrezeptoren [12]. Neurogenese ist über das ge­samte Leben einer Ratte hinweg nachweisbar [3, 27, 89, 100], aber läßt mit zunehmendem Alter nach [100]. Das Ausmaß, in dem die verbleibende Neuro­genese im Gyrus dentatus reguliert wird und funktionelle Konsequenzen hat, ist noch unklar.

Wir haben das experimentelle Paradigma der reizreichen Lebensumgebung [152, 154] benutzt, um zu zeigen, daß eine erfahrungsabhängige Plastizität der Neuronenzahl im Gyrus dentatus besteht. Dieser Befund stellte adulte Neuro­genese im Gyrus dentatus in einen funktionellen Kontext und erhob die Frage, ob funktionsabhängige Neuroplastizität auch im alten Gehirn noch möglich ist.

In der hier vorgestellten Studie haben wir die Wirkung des Lebens in reizreicher Umgebung auf die Neurogenese im Gyrus dentatus von C57BL/6 Mäusen im Alter von 6 und 18 Monaten untersucht. Die vier Gruppen des Experimentes werden mit folgenden Abkürzungen bezeichnet: Ctr-6 für sechs Monate alte Kontrolltiere, Ctr-18 für 18 Monate alte Kontrolltiere, Enr-6 für sechs Monate alte Tiere in reizreicher Umgebung (“enriched environment”) und Enr-18 für 18 Monate alte Tiere in reizreicher Umgebung. Diese Alterstufen entsprechen ungefähr einem mittleren Lebensabschnitt und dem Greisenalter, [Seite 41↓]wenn man sich vergegenwärtigt, daß die durchschnittliche Lebensdauer einer C57BL/6 Maus 26 Monate beträgt und daß die Menopause der weiblichen Mäuse bei rund 13 Monaten liegt [166]. Vor der Experimentalphase, die 40 oder 68 Tage dauerte, wurden alle Tiere unter Standardbedingungen gehalten. [Die weitere Untersuchung erfolgte in Analogie zum oben beschriebenen er­sten Experiment an jüngeren Tieren; Kapitel 2.3]

Ergebnisse

Neurogenese, definiert als die Geburt einer neuen Nervenzelle, besteht aus einer Serie distinkter Entwicklungsschritte, von denen drei separat unter­sucht werden können: Proliferation, Überleben und Differenzierung.

Proliferation einer Vorläuferzelle in der subgranulären Zone wurde durch Markierung mit dem Proliferationsmarker BrdU und immunhistochemische Untersuchung einen Tag nach der letzten Injektion von BrdU untersucht. Zu diesem Zeitpunkt sahen wir keine signifikante Wirkung der reizreichen Le­bensumgebung auf die Zellproliferation im Gyrus dentatus (Abb. *3A). Es fiel jedoch auf, daß die Teilungsaktivität der Stamm- und Vorläuferzellen mit stei­gendem Alter nachließ, denn greise Mäuse (Ctr-18) hatten signifikant weniger BrdU-positive Zellen im Vergleich zu Mäusen im mittleren Lebensalter (Ctr-6; P < 0.0001).

Die Überlebensrate der Nachkommenschaft der sich teilenden Vorläufer­zellen kann untersucht werden, indem vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion mit Antikörpern gegen BrdU gefärbt wird und das Resultat mit den Werten, die einen Tag nach der letzten Injektion gewonnen wurden, verglichen wird (Abb. *3A). Wir stellten fest, daß die Gesamtzahl der überlebenden BrdU-positiven Zellen vier Wochen nach BrdU in den älteren Tieren (Ctr-18) im Vergleich zu den jüngeren signifikant reduziert war (P = 0.0081). Leben in reizreicher Umgebung erhöhte die Zahl der überlebenden markierten Zellen um 68% gegenüber Kontrolltieren im Alter von 6 Monaten (P = 0.0025) und um 32% in 18 Monate alten Mäusen (P > 0.05; Abb. *3A). Wenn man die Zahl der überlebenden Zellen in Prozent der markierten Zellen einen Tag nach der letzten BrdU-Injektion ausdrückt, zeigte sich, daß Alter allein keinen überle­bensfördernden Effekt hat. In Ctr-6 waren durchschnittlich 42.7 +/- 1.8% der am ersten Tag detektierbaren Zellen zum Vierwochentermin nachweisbar, während 60.7 +/- 7.3% in Ctr-18 gefunden werden konnten (P = 0.1540; alle Werte Mittelwert +/- Standardfehler).

Die phänotypische Differenzierung der überlebenden BrdU-positiven Zellen wurde (wie oben beschrieben) mit konfokaler Mikroskopie untersucht, wobei in der Dreifachmarkierung neben Antikörpern gegen BrdU diesmal als neuronaler Marker NeuN und als glialer Marker S100ß eingesetzt wurde (Abb. *4). In Enr-18 machten Neurone (NeuN-positive Zellen) 28.6 +/- 8.6% der überlebenden BrdU-positiven Zellen gegenüber 12.6 +/- 7.3% in Ctr-18 aus (P = 0.0002). In Enr-6 fanden wir 58.0 +/- 6.8% Neurone gegenüber 40.8 +/- 4.7% in Ctr-6 (P < 0.0001; Abb. *3B und C).


[Seite 42↓]

Enr-18 Mäuse produzierten damit während der zwölftägigen Injektions­phase durchschnittlich insgesamt 105 +/- 18 BrdU-markierte Neurone pro Gyrus dentatus gegenüber lediglich 32 +/- 7 in Ctr-18: eine dreifache Zunah­me (P = 0.0035; Abb. *3D). Im Vergleich dazu produzierten Enr-6 684 +/- 104 BrdU-markierte Neurone und Ctr-6 285 +/- 22, was einer Verdoppelung entspricht (P = 0.0109). Der Gesamteffekt war also absolut gesehen größer im Alter von 6 Monaten, aber relativ gesehen im Alter von 18 Monaten.

Vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion machten Astrozyten (S100ß-positive Zellen) 19.7 +/- 3.2% der überlebenden BrdU-positiven Zel­len in Ctr-6, 15.5 +/- 1.7% in Enr-6, 32.9 +/- 2.0% in Ctr-18 und 26.6 +/- 1.8% in Enr-18 aus. Es fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen Ctr-6 und Enr-6 (P = 0.1864) und Ctr-18 und Enr-18 (P = 0.0553). In absoluten Zahlen gemessen, fanden sich 133 +/- 20 BrdU-markierte Astrozyten in Ctr-6, 185 +/- 38 in Enr-6, 92 +/- 13 in Ctr-18 und 99 +/- 16 in Enr-18. Auch hier bestand kein signifikanter Unterschied zwischen Ctr-6 und Enr-6 (P = 0.1516) und Ctr-18 und Enr-18 (P = 0.8389).

BrdU-positive Zellen, die keine Kolokalisation mit NeuN oder S100ß zeigten, kamen auf 39.4 +/- 2.4% in Ctr-6 (absolute Werte: 275 +/- 23), 26.5 +/- 2.8% in Enr-6 (299 +/- 49), 56.0 +/- 1.6% in Ctr-18 (154 +/- 20) und 44.8 +/- 9.3% in Enr-18 (160 +/- 22). Statistische Analyse zeigte, daß die rela­tiven Werte in beiden Altersstufen signifikant voneinander verschieden waren (P = 0.0027 für Ctr-6 und Enr-6; P = 0.0079 für Ctr-18 und Enr-18), nicht aber die absoluten Zahlen (P = 0.6099 bzw. P = 0.8965).

Die Auswirkung der reizinduzierten Neurogenese auf die Gesamtzahl der Körnerzellen wurde durch stereologische Techniken untersucht (Tabelle *1). Jedoch war die interindividuelle Varianz in diesen Vergleichen von zellulären Populationen sehr unterschiedlicher Größe verhältnismäßig größer als der zu erwartende Zuwachs in neuen Nervenzellen, so daß keine signfikanten Unter­schiede in der Körnerzellzahl zwischen den vier Gruppen nachweisbar waren. Auch fand sich kein Unterschied in der Neuronendichte oder im Volumen der Körnerzellschicht.


[Seite 43↓]

Tab. 4 : Stereologische Daten

 

Ctr-6

Enr-6

Ctr-18

Enr-18

     

Volume of the granule cell layer (mm3)

0.356

± 0.009

0.373

± 0.008

0.336

± 0.010

0.365

± 0.013

     

Neuronal density

9.91 ± 0.37

9.47 ± 0.23

9.55 ± 0.40

9.21 ± 0.16

     

Absolute number of granule cells

3.90 x 105

± 0.13 x 105

3.91 x 105

± 0.08 x 105

3.57 x 105

± 0.18 x 105

3.74 x 105

± 0.16 x 105

Ctr-6: 6 Monate alte Mäuse in Standardlaborkäfigen. Ctr-18: 18 Monate alte Mäuse in Standardlaborkäfigen. Enr-6: 6 Monate alte Mäuse in reizreichen Käfigen. Enr-18: 18 Monate alte Mäuse in reizreichen Käfigen. Probenvolumen: 9000 µm3. Alle Werte sind Mittelwert ± Standardfehler. Statistische Auswertung dieser Daten (ANOVA) ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen.

Es ist berichtet worden, daß alte Mäuse die Aufgabe des Wasserlabyrinths lernen [71]. Gesamtanalyse des Tests im Wasserlabyrinth wies in Enr-18 ge­genüber Ctr-18 (P = 0.0422; Abb. *5A) und Enr-6 gegenüber Ctr-6 (P = 0.0248) signifikant kürzere Zeiten nach, die die Tiere der entsprechenden Gruppe brauchten, um die Fluchtplattform zu erreichen. Da auch eine signifi­kante Erhöhung der Schwimmgeschwindigkeit in Enr-18 gegenüber Ctr-18 (P = 0.0307; Abb. *5B) und in Enr-6 gegenüber Ctr-6 (P = 0.0040) bestand, ließ sich kein Unterschied in der jeweiligen Länge der Schwimmstrecke bis zur Plattform nachweisen.

Diskussion

Der Begriff “Neurogenese” als der Geburt neuer Nervenzellen wird oft im eingeschränkten Sinne der Zellproliferation, die zu einem neuen Neuron führt, zugeschrieben, aber weitergefaßte Definitionen sind im Gebrauch [28, 162]. Die erwachsene Hippocampusformation enthält multipotente Stammzel­len, die in vitro sowohl in Neurone als auch in Gliazellen differenzieren können [134]. Es ist daher uneindeutig, die Definition von Neurogenese auf einen Pro­zess zu stützen, der auch in Gliogenese münden könnte. Im Gegensatz zur sehr präzisen zeitlichen und räumlichen Verteilung neurogener Ereignisse wäh­rend der Entwicklung [28] enthalten die neurogenen Regionen des Erwachse­nenalters Zellen in allen Entwicklungsstufen. Als Konsequenz hieraus ist es im Erwachsenenalter weniger genau, die Zellteilung zur Basis der Definition von Neurogenese zu wählen, als es dies während der Embryogenese ist. Im Ver­gleich der Zahlen BrdU-positiver Zellen einen Tag und vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion wird klar, daß das Ausmaß der Zellproliferation kein Indikator für die letztlich resultierende Nettoanzahl neuer Neurone ist (2.2; siehe auch 2.6). Wir benutzen daher eine weitgefaßtere Definition von Neuro­genese, die Proliferation, Überleben und Differenzierung beinhaltet.


[Seite 44↓]

Neurogenese im alten Gyrus dentatus. Neurogenese persistiert im Hippocampus auch alter Mäuse. In allen vier untersuchten Gruppen konnten sich teilende Zellen (Abb. *4A) in der subgranulären Zone nachgewiesen werden; differen­zierende Zellen migrierten in die Körnerzellschicht und exprimierten nach vier Wochen den neuronalen Marker NeuN (Abb. *4B bis D).

Die Abnahme adulter Neurogenese in der alternden Maus bestätigt frühe­re Berichte aus Ratten [100]. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied in der Gesamtkörnerzellzahl zwischen den beiden Altersstufen, was darauf hin­weisen könnte, daß im hohen Alter Neurogenese keine die Gesamtzahl mehr beeinflussende Zahl neuer Nervenzellen in nachweisbarem Rahmen beisteuert. Der Vergleich mit Zahlen aus unserer früheren Studie weist einen Zuwachs in der Gesamtkörnerzellzahl zwischen zwei und sechs Monaten um rund 40 000 Zellen auf (Vgl. 2.3). Vergleichbare Zuwächse sind für Ratten beschrieben worden [9].

Zur Frage der Rolle, die Apoptose einerseits und Zellzyklusparameter an­derseits auf die Interpretation der Zahlen haben könnten, siehe 2.2 und [13].

Schon früh ist das experimentelle Modell der reizreichen Lebensumge­bung [154] auf die Untersuchung von Umwelteinflüssen auf Zellproliferation im erwachsenen Gehirn angewandt worden [2]. Unsere hier vorgestellten Da­ten weisen nach, daß erfahrungsabhängige Regulation von adulter hippocam­paler Neurogenese nicht nur im jung-erwachsenen Mausgehirn, sondern auch im hohen Alter noch stattfindet. Wie in den jüngeren Mäusen wurde auch in den alten das Überleben neugeborener Zellen gefördert. Dem könnte eine In­teraktion mit der Regulation apoptotischen Zelltods zumindest teilweise zu­grundeliegen [wofür mittlerweile neue experimentelle Daten sprechen [13, 193]].

Zusätzlich entdeckten wir, daß in beiden Altersstufen in den reizreich le­benden Tieren relativ mehr BrdU-positive Zellen eine Doppelmarkierung für den neuronalen Marker NeuN zeigten, ein Effekt der in den jüngeren Tieren der vorangegangenen Studie nicht aufgetreten war. Dies kann als ein überle­bensfördernder Effekt auf Zellen der neuronalen Entwicklungslinie gedeutet werden. Die absoluten Zahlen sowohl BrdU-markierter Astrozyten als auch BrdU-positiver Zellen ohne Doppelmarkierung für NeuN oder S100ß waren unbeeinflußt von der Umweltstimulation — ein Befund, der diese Hypothese stützt.

Als Alternativhypothese verbleibt jedoch zu prüfen, ob Umweltreize eine Wirkung auf das Differenzierungsverhalten der Tochterzellen der sich teilen­den Stamm- und Vorläuferzellen haben könnten, indem sie direkt oder indirekt auf Mechanismen, die die Entscheidung für eine bestimmte Entwicklungslinie bestimmen, wirken könnten.

Die Bedingungen der zellulären Mikroumgebung und ihre erfahrungsab­hängigen Veränderungen, die das Überleben von Zellen, die den Zellzyklus verlassen haben, fördern und diese zur Differenzierung führen, bleiben weiter­hin unbekannt. Obwohl Gliogenese in den alten Tieren nicht signifikant durch [Seite 45↓]Erfahrung stimulierbar war, ist es trotzdem möglich, daß Umwelteinflüsse auf Astrozyten zu dem Gesamteffekt beitragen.

Daß in unserem Experiment kein Unterschied in der Zellproliferation zwischen Kontrollen und reizreich lebenden Mäusen nachweisbar war, erlaubt keine Schlußfolgerung über die Größe der Vorläuferzellpopulation. Grund­sätzlich sind die erhobenen Befunde zur Zellproliferation in den reizreich le­benden Tieren sowohl mit einer kleineren Population mit kürzerem Zellzyklus als auch mit einer größeren Population mit längerem Zellzyklus vereinbar. Das Nettoergebnis, daß vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion signifikant mehr BrdU-markierte Neurone in den reizreich lebenden Mäusen präsent wa­ren, ist von dieser Betrachtung unabhängig. Spätere Experimente werden un­tersuchen müssen, wie Zellzyklusparameter durch Alter und Umweltreize be­einflusst werden.

Die tägliche Stimulation von jungen Ratten in der Zeit zwischen Geburt und Entwöhnung von der Mutter (“neonatal handling” oder “preweaning enrich­ment”) verhindert im Alter der Versuchstiere einen Zellverlust in den Regionen CA1 und CA3 und Defizite im räumlichen Lernen [118]. Der hypothetisch zugrundeliegende Mechanismus involviert die Herabregulation von Glucocor­ticoidausschüttungen. Glucocorticoide können auch Neurogenese im erwach­senen Gyrus dentatus inhibieren [65]. Ob daraus geschlossen werden kann, daß Glucocorticoide maßgeblich an der Regulation der Neurogenese im hier be­sprochenen Experiment beteiligt sind, muß offenbleiben. [“Preweaning en­richment” jedenfalls hat keinen Effekt auf adulte hippocampale Neurogenese, was auf einen unterschiedlichen Mechanismus schließen läßt (Kohl et al., Pre­weaning enrichment has no lasting effects on size of the dentate gyrus and on adult hippocam­pal neurogenesis in four-month old mice, zur Veröffentlichung eingereicht).]

Es bleibt gegenwärtig unklar, inwieweit Verbesserungen im räumlichen Lernen zu den Auswirkungen auf das Abschneiden im Lerntest in den hier untersuchten Tieren beigetragen haben. Immerhin jedoch haben die Versuchs­tiere nach sechs oder 18 Monaten unter Standardlaborbedingungen nach Ex­position gegenüber reizreicher Umgebung innerhalb von weniger als 68 Tagen ein verbessertes oder zumindest verändertes Abschneiden im Wasserlaby­rinthtest gezeigt. Diese Wirkung beweist keinen kausalen Zusammenhang mit den morphologischen Ergebnissen, aber sie positioniert adulte hippocampale Neurogenese in einen funktionellen Kontext.

Auch wenn die Ergebnisse nahelegen, daß die neuen Neurone für hippo­campale Funktionen rekrutiert werden, sind weitere Untersuchungen notwen­dig, um zu zeigen, inwieweit die im Erwachsenenalter produzierten neuen Nervenzellen funktionell in die neuronale Verschaltung des Hippocampus in­tegriert werden. Anatomisch gesehen entsenden die neuen Neurone ein Axon zur Region CA3, wie dies auch die älteren Körnerzellen tun [115, 169].

Eine funktionelle Interpretation adulter hippocampaler Neurogenese wird durch Forschungsergebnisse an Chickadees unterstützt, in denen Neurogenese im erwachsenen Gyrus dentatus mit den Jahreszeiten korreliert, in denen die [Seite 46↓]Vögel größere Territorien bewohnen und sich an den Ort von mehr Futterver­stecken erinnern müssen [6, 7].

Die Gesamtzahl neuer Neurone, die im Hippocampus greiser Mäuse pro­duziert werden kann, ist gering, und es ist von großer Bedeutung festzustellen, ob diese relativ wenigen Zellen zu den erfahrungsabhängigen funktionellen Effekten, wie sie hier (und in der vorherigen Studie) erhoben wurden, beitra­gen können. Verschiedene andere hippocampale Parameter sind durch eine reizreiche Lebensumgebung induzierbar [88]. Einige dieser Veränderungen, so beispielsweise die Plastizität synaptischer Eigenschaften [76], synaptischer Dichte [156] und dendritischer Verzweigung [75] treten auch im höheren Alter auf und tragen höchstwahrscheinlich zu den funktionellen Effekten bei. Jedoch spricht die Tatsache, daß im alternden Gehirn der komplexe regulatorische Apparat zur Neurogenese erhalten bleibt, dafür daß diese Plastizität funktio­nelle Vorteile bringt.

2.5  2.5 Genetischer Einfluß auf die aktivitätsabhängige Regulation adulter Neurogenese

Kempermann G, Brandon EP, Gage FH. Environmental stimulation of 129/SvJ mice results in increased cell proliferation and neurogenesis in the adult dentate gyrus. Current Biology 8 (1998) 939-942

Zusammenfassung: Mäuse des Stammes 129/SvJ haben signifikant weniger adulte hippo­campale Neurogenese als andere ingezüchtete Linien (siehe 2.5). Außerdem zeigen sie schlechte Leistungen in Lerntests. In diesem Experiment haben wir die Auswirkungen von Umweltreizen in reizreicher Umgebung auf die Hirnplastizität von 129/SvJ im Erwach­senenalter untersucht. Im Gegensatz zu den früheren Berichten über Mäuse des Stammes C57BL/6, die in Lerntests sehr gut abschneiden und bei denen die erfahrungsabhängige Regulation von adulter hippocampaler Neurogenese keinen Einfluß auf die Zellproliferation hatte, zeigten reizreich lebende 129/SvJ Mäuse eine Verdoppelung der proliferierenden Zel­len im Gyrus dentatus im Vergleich zu Kontrolltieren. Umweltabhängige Stimulation för­derte das Überleben der neugeborenen Zellen in 129/SvJ, wie es auch in C57BL/6 gesehen worden war. Phänotypische Analyse der überlebenden Zellen wies auf, daß Stimulation durch Umweltreize zu 67% mehr neuen Neuronen führte. In Zusammenschau mit unseren früheren Ergebnissen legen diese Ergebnisse nahe, daß erbliche Faktoren einen differenzierten Einfluß auf die umweltabhängige Regulation adulter hippocampaler Neurogenese haben. Zusätzlich beobachteten wir eine Wirkung auf das Abschneiden in Verhaltenstests in den stimulierten Tieren.

129/SvJ Mäuse verbrachten 40 Tage in einer reizreichen Umgebung und er­hielten während der letzten zwölf Tage dieser Periode tägliche Injektionen mit dem Proliferationsmarker BrdU (50µg pro g Körpergewicht). Die Gehirne von 5 Tieren der experimentellen Gruppe (Enr-129) und von 5 Tieren der Kon­trollgruppe (Ctr-129), die in regulären Laborkäfigen gehalten wurden, wurden immunhistochemisch untersucht. Im Gegensatz zu C57BL/6 Mäusen, [Seite 47↓]die keine Veränderung in der Zellproliferation der subgranulären Zone zeigten (Vgl. 2.4 und 2.5), hatten die Enr-129 Tiere eine signifikant höhere Zahl BrdU-positiver Zellen im Gyrus dentatus als Ctr-129 (Abb. *1A und 2; P = 0.0017). Dieses Ergebnis einer “erhöhten proliferativen Aktivität” kann (1.) als eine erhöhte Anzahl sich teilender Zellen interpretiert werden, (2.) als eine höhere Rate von Zellteilungen oder (3.) eine Kombination von beidem interpretiert werden.

Vier Wochen nach der letzten Injektion von BrdU, wenn die Gehirne der ver­bleibenden Mäuse untersucht wurden, fanden sich signifikant mehr BrdU-po­sitive Zellen in Enr-129 als in Ctr-129 (Abb. *1A und 2; P = 0.0186). Dies im­pliziert, daß das Nettoüberleben neugeborener Zellen in Enr-129 erhöht war. Relativ gesehen jedoch war das Überleben der neuen Zellen in Enr-129 mit 29% niedriger als in Ctr-129 mit 40%. Dies steht im Gegensatz zu unseren früheren Ergebnissen mit C57BL/6, in denen der erfahrungsabhängige Net­toeffekt auf adulte hippocampale Neurogenese auf eine überlebensfördernde Wirkung auf die neugebildeten Zellen in der subgranulären Zone zurückzufüh­ren war.

Stereologische Untersuchung des Gyrus dentatus vier Wochen nach der letzten Injektion von BrdU wies nach, daß Enr-129 eine höhere Zelldichte in der Körnerzellschicht hatten. Die durchschnittliche Zahl an Körnerzellen pro 9000 µm3 Probenvolumen war 9.2 +/- 0.2 in Ctr-129 (Mittelwert +/- Stan­dardfeh­ler) und 10.0 +/- 0.2 in Enr-129 (p = 0.0210). Es ließ sich kein Unter­schied am absoluten Volumen der Körnerzellschicht nachweisen (0.34 +/- 0.01 mm3 in Ctr-129 und 0.32 +/- 0.02 mm3 in Enr-129; P = 0.5051). Daraus resultierte eine durchschnittliche Gesamtkörnerzellzahl von 3.44 +/- 0.11 x 105 in Ctr-129 und 3.56 +/- 0.24 x 105 in Enr-129 (P = 0.6827) pro Hippocampus. In durch Umweltreize stimulierten C57BL/6 hatten wir eine statistisch signifi­kante Zunahme des Volumens der Körnerzellschicht und eine Zunahme der Körnerzellzahl um 15% gefunden (2.4). Wurden im jetzigen Experiment die gemessenen Volumina vom 1. Tag nach der letzten Gabe von BrdU vergli­chen, um eine zweite Schätzung des Volumens der Körnerzellschicht zu er­halten, so zeigte sich ein Volumen von 0.29 +/- 0.02 mm3 in Ctr-129 und von 0.37 +/- 0.03 mm3 in Enr-129 (P = 0.0497). Eine vorsichtige Interpretation könnte dahingehen, daß die volumetrischen Daten mit einem meßbaren Effekt auf die Gesamtkörnerzellzahl vereinbar sind, aber hier durch biologische Va­riabilität (Varianz) verschleiert werden.

In der Untersuchung der BrdU-markierten Zellen mittels dreifacher Im­munhi­stochemie wiesen die prozentualen Anteile der Zellen, die Kolokalisa­tionen für den neuronalen Marker NeuN oder den astrozytären Marker S100ß zeigten, keinen Unterschied zwischen Enr-129 und Ctr-129 auf. Der Prozent­satz von BrdU-positiven Zellen, die weder NeuN noch S100ß exprimierten, war jedoch signifikant niedriger in Enr-129 als in Ctr-129 (Abb. *1B; P = 0.0247). Um die absolute Anzahl neugebildeter Neurone (BrdU+/NeuN+) und Astrozyten (BrdU+/S100ß+) abzuschätzen, wurde der prozentuale Anteil des jeweiligen Phänotyps mit der absoluten Zahl BrdU-markierter Zellen vier [Seite 48↓]Wochen nach der letzten BrdU-Injektion multipliziert. Das Ergebnis waren 1573 +/- 191 neue Neurone in Enr-129 gegenüber 943 +/- 104 in Ctr-129 (Abb. *1C; P = 0.0158), was eine Nettozunahme adulter hippocampaler Neu­rogenese in Enr-129 von 67% bedeutet.

Obwohl umweltabhängige Stimulation von 129/SvJ Mäusen eine genauso starke neurogene Wirkung hatte wie zuvor für C57BL/6 berichtet (2.4), ergab eine detailiertere Analyse, daß der ähnliche Nettoeffekt in den 129/SvJ anders als in C57BL/6 auf eine Steigerung der Zellproliferation zurückzuführen war. Daraus folgt, daß Stammesunterschiede nicht nur die Ausgangsrate adulter hippocampaler Neurogenese (2.3), sondern auch die Art, auf die adulte hippo­campale Neurogenese durch Umweltreize reguliert wird, beeinflussen. Prolife­ration, Überleben und Differenzierung der Vorläuferzellen und ihrer Tochter­zellen sind jeweils separat durch vererbte Faktoren beeinflusst und werden als Antwort auf eine Stimulation durch Umweltreize nicht uniform heraufreguliert (2.2 und 2.3).

Das Ausmaß, in dem adulte hippocampale Neurogenese in 129/SvJ sti­muliert werden konnte, war angesichts der niedrigen Ausgangsraten adulter Neuroge­nese in diesem Stamm nicht vorhersehbar (2.3). Da der relative Zu­wachs an proliferierenden Zellen einen Tag nach der letzten Injektion größer als die Zu­nahme in der Zahl BrdU-markierter Zellen vier Wochen später war, wurde das neurogene Potential des Hippocampus der 129/SvJ offenbar noch nicht er­schöpft. Es bleibt zu klären, ob eine erhöhte Proliferation in der sub­granulären Zone in der Tat ein vergrößertes Angebot an Zellen schafft, aus denen sogar noch mehr neue Neurone generiert werden könnten, wenn andere oder kom­plexere Stimulationen durch Umweltreize eingesetzt würden als im hier vorge­stellten Versuch.

Ex vivo Experimente haben gezeigt, daß multipotente Vorläuferzellen aus dem Hippocampus adulter Ratten isoliert werden können [136, 146]. In vivo ist Mul­tipotentialität bislang nicht explizit nachgewiesen worden, aber Zellproli­fera­tion, Neurogenese und Astrogenese im Gyrus dentatus erwachsener Säu­getiere sind seit den frühen 1960er Jahren bekannt [3]. Proliferation in der sub­granulä­ren Zone kann experimentell durch eine Vielzahl beeinflusst werden, darunter Glukocorticoidspiegel [65], glutamaterge Deafferentierung [26], Ex­zitotoxizität [138, 139] und (möglicherweise durch ein Zusammenspiel dieser Faktoren) durch Stress [66]. Die Wirkung dieser Faktoren auf die neuronale Entwicklung jenseits der Zellproliferation bleibt jedoch noch zu untersuchen.

Es sind erste Hypothesen zur funktionellen Relevanz adulter hippocam­paler Neurogenese aufgestellt worden [6, 7, 66, 139, 178]. Da der Hippocam­pus als eine Struktur bekannt ist, die kritisch für verschiedene Formen von Gedächtnis ist [47], könnte die Produktion neuer Neurone im erwachsenen Hippocampus cognitive Bedeutung haben. Korrelationen zwischen Neuroge­nese und mess­barer hippocampaler Funktion können Einblicke in die Regula­tion und die funktionelle Relevanz adulter hippocampaler Neurogenese erlau­ben.


[Seite 49↓]

Im Unterschied zu C57BL/6 Mäusen zeigen Mäuse des Stammes 129 schlechte Leistungen in diversen Verhaltenstests (siehe [57]), darunter Aufga­ben, die das räumliche Lernen untersuchen [132, 190]. Hinzukommt, daß es bei beim Stamm 129 eine Vielzahl von mitunter schlecht abgegrenzten Unter­stämmen gibt, die beachtliche Unterschiede zueinander aufweisen und die als “typisch” für Stamm 129 angesehenen Merkmale besitzen oder nicht [167]. Ungeachtet dieser Probleme sind Stamm 129 Mäuse im weitverbreiteten Ein­satz bei Experimenten mit gezielter Genmanipulation (“Knockout”) [36], die auf eine Aufklärung der molekularen Grundlagen von cognitivem Verhalten und dessen Verhältnis zu Morphologie und Physiologie abzielen [18, 29, 116]

Wie in unseren früheren Studien (2.4 und 2.5) verwendeten wir das Was­serla­byrinth nach Morris [124], um die Wirkung von Umweltreizen auf cogni­tive Funktionen, die vom Hippocampus vermittelt werden, zu untersuchen. Ge­samtanalyse der Leistung im Wasserlabyrinth zeigte, daß Enr-129 die ver­bor­gene Plattform in signifikant kürzerer Zeit erreichten als Ctr-129 (Abb. *3A; p = 0.0026), dabei eine kürzere Strecke zurücklegten (528 +/- 41 cm ge­genüber 640 +/- 40 cm; p = 0.0294) und dabei auch signifikant schneller schwammen als Ctr-129 Mäuse (26.9 +/- cm/s gegenüber 22.9 +/- 0.7 cm/s; p = 0.0172). In der darauffolgenden Probe, in der die rettende Plattform aus dem Becken entfernt wurde, hielten sich Enr-129 Mäuse durchschnittlich 28.1 +/- 3.6 s von 60 s (ungefähr 47%) im Zielquadranten des Beckens auf, wäh­rend Ctr-129 auf 17.1 +/- 3.6 s (ungefähr 29%) kamen (Abb. *3B; p = 0.0482). Ctr-129 schwammen 465.9 +/- 98.0 cm im Zielquadranten und Enr-129 748 +/- 93.4 cm (p = 0.0574). Die durchschnittliche Entfernung zum Zielpunkt betrug da­bei 38.4 +/- 3.1 cm in Enr-129 und 49.1 +/- 5.0 cm in Ctr-129 Mäusen (p = 0.0813). Eine Analyse der Interaktion für Quadranten und Grup­pen zeigte ein p = 0.0410. Obwohl nicht-cognitive Faktoren wahrscheinlich zu diesen Ergeb­nissen beitragen, sind diese Resultate mit einer Verbesserung in der cognitiven Funktion vereinbar [109]. Die parallele erfahrungsabhängige Steigerung von adulter hippocampaler Neurogenese und allgemeiner Verbesse­rung in einem Lerntest legt eine Verbindung zwischen den beiden Beobach­tungen nahe, aber gegenwärtig ist diese Beziehung korrelativ.

In der Kammer zur Aktvititätsmessung wiesen Enr-129 signifikant weni­ger spontane motorische Aktivität während der einstündigen Testphase auf als Ctr-129 (Abb. *3C; p = 0.0219). Enr-129 Mäuse waren auch in der Lage sich fast doppelt solange auf dem mit 20 UpM beschleunigenden Rotarod zu halten wie Ctr-129 (Abb. *3D; p = 0.0013). Diese zusätzlichen erfahrungsabhängigen Wirkungen lassen vermuten, daß die Effekte einer Stimulation durch Umwelt­reize breit angelegt sind und nicht auf den Hippocampus beschränkt sind. Dies bedeutet auch, daß die als genetisch angesehenen Hemmnisse, die scheinbar die Leistung von 129/SvJ in Verhaltenstest behindern, zum Teil von den Be­dingungen der Tierhaltung abhängen.

Es ist deshalb problematisch, Stämme als “schlechte Lerner” oder als ge­nerell behindert in der Leistung in Lerntests zu kategorisieren, genausowenig wie anatomische Parameter als genetisch fixiert betrachtet werden sollten. Zu [Seite 50↓]ei­nem gewissen Grad reflektiert das, was als genetisch bestimmte Ausgangs­lage angesehen wird, bereits eine spezifische Antwort auf die Umgebung. In Expe­rimenten, die Stammesunterschiede oder Knockout-Tiere untersuchen, werden “normalisierte” Ausgangswerte unter identischen Umweltbedingungen für alle beteiligten Stämme ermittelt. Für jeden einzelnen Stamm könnten diese Bedin­gungen aber gerade die nicht opitmalen sein, um komplexe physiologi­sche Prozesse zu untersuchen. Unsere Ergebnisse bedeuten, daß vererbbare Fakto­ren diese “normalisierten” Muster von Morphologie und Funktion be­einflus­sen sowie auch die dynamischen Veränderungen, die in diesen Syste­men auf­treten.

2.6  2.6 Wirkung von Langzeitreizen und Reizentzug in der aktivitätsab­hängigen Regulation adulter Neurogenese

Kempermann G, Gage FH. Experience-dependent regulation of adult hippocampal neurogenesis: effects of long-term stimulation and stimulus withdrawal. Hippocampus 9 (1999) 321-332

Zusammenfassung: In dieser Studie untersuchten wir, wie die erfahrungsabhängige Re­gulation adulter hippocampaler Neurogenese in C57BL/6 Mäusen unter den Bedingungen einer Langzeitexposition oder dem Entzug nach erlebter reizreicher Umgebung moduliert wird. Wir stellten fest, daß eine Gruppe von Tieren, die Entzug nach Stimulation in der reizreichen Umgebung drei Monate vor der Untersuchung erleben mußte, mehr als doppelt so viele proliferierende Zellen in der subgranulären Zone hatte wie Kontrolltiere und Tiere unter Langzeitstimulation. Wir vermuten, daß die größere Anzahl an proliferierenden Zellen nach dem Entzug Hinweis auf einen überlebensfördernden Effekt auf die neuronalen Stamm- oder Vorläuferzellen während der früheren Stimulationsperiode sind. Es wurden keine Unter­schiede bezüglich der überlebenden Tochterzellen oder ihrer Phänotypen festgestellt. Die Exi­stenz von mehr teilenden Zellen in der Entzugsgruppe führte also ohne fortgesetzte Stimula­tion nicht zu einem Nettoanstieg an Neurogenese. Auch die Gruppe, die eine Langzeitexpo­sition der reizreichen Umgebung erlebte, zeigte keinen klaren Vorteil gegenüber Kontrollen, was als eine verminderte Effizienz fortgesetzter Umweltreize im Bewirken einer neurogenen Antwort gedeutet werden kann. Wir schlagen deshalb als Arbeitshypothese vor, daß (1) eine Stimulation in jungem Lebensalter ein neurogenes Potential im Gyrus dentatus erhalten könnte und (2) die Neuartigkeit der komplexen Reize und nicht allein die reine Fortsetzung komplexer Reize für die umweltabhängige Wirkung auf adulte hippocampale Neurogenese verantwortlich sind.

Der Gyrus dentatus antwortet auf Umweltreize mit verschiedenen plasti­schen Veränderungen, anhand derer sich funktionelle und morphologische Adaptationen feststellen lassen. Diese erfahrungsabhängigen Modifikationen im neuronalen Netzwerk sind nicht auf das Neuropil beschränkt sondern be­inhalten auch eine Vermehrung der Nervenzellzahl durch eine Stimulation der Neurogenese im Gyrus dentatus (2.3, 2.4 und 2.5). Erfahrungsabhängige Pla­stizität der Körnerzellzahl stellt eine physiologische und funktionelle Regula­[Seite 51↓]tion der Aktivität neuronaler Stamm- und Vorläuferzellen im erwachsenen Gehirn dar. [...]

Die Tatsache, daß das erwachsene Gehirn die komplexen Mechanismen aufrechterhält, die für eine erfahrungsabhängige Regulation adulter Neuroge­nese notwendig sind, legt nahe, daß die neuen Körnerzellen funktionell rele­vant sind. Ein kausaler Bezug zwischen adulter hippocampaler Neurogenese und hippocampaler Funktion ist jedoch nicht bewiesen.

Das Abschneiden in Verhaltenstests, inklusive Tests von Lernen und Ge­dächtnis, korreliert nicht mit der absoluten Körnerzellzahl [189]. Eher als die Gesamtzahl der existierenden Körnerzellen könnten die Rate und das Ausmaß neuronaler Plastizität, die adulte Neurogenese miteinschließt, die Leistung im Verhaltenstest bestimmen.

Derartige Überlegungen führten zur folgenden experimentellen Fragen: Wie wird adulte hippocampale Neurogenese beeinflusst, wenn die Umweltreize (1) für länger als 68 Tage fortgesetzt werden oder (2) nach den initialen 68 Ta­gen abgebrochen werden?

Um diesen Fragen nachzugehen, haben wir an drei Gruppen von C57BL/6 Mäusen im Alter der Entwöhnung von der Mutter (P21) das fol­gende experimentelle Paradigma angewandt (Abb. *1). Eine Gruppe diente als Kontrollgruppe und lebte unter Standardlaborbedingungen für die Gesamtzeit der Experimentalperiode von sechs Monaten, eine Gruppe lebte in reizreicher Umgebung für 68 Tage und kehrte danach zu Standardkäfigbedingungen zu­rück (“Enr-WD”, wobei das “WD” für englisch withdrawal steht) und ein Gruppe lebte für sechs Monate in der reizreichen Umgebung (“Enr-LT”, wo­bei “LT” für englisch long-term steht). Am Ende der sechs Monate wurden die proliferierenden Vorläuferzellen mit Bromodesoxyuridin (BrdU) markiert und mittels BrdU-Immunhistochemie identifiziert. Die Hälfte jeder Gruppe über­lebte vier weitere Wochen. Es wurde dann die Zahl der überlebenden BrdU-positiven Zellen vier Wochen nach der Markierung bestimmt. Die Phänotypen der neugeborenen Zellen wurden wiederum durch Immunfluoreszenz mit Dreifachmarkierungen von BrdU, dem neuronalen Marker NeuN und dem glialen Marker S100ß bestimmt. Mäuse aller Gruppen wurden in einer Aktivi­tätsmesskammer, auf dem Rotarod und im Wasserlabyrinth mit versteckter Plattform getestet.

Ergebnisse

Funktionelle Effekte

Exposition gegenüber einer reizreichen Umgebung bewirkt eine komplexe Reakion des Tieres, die zu Veränderungen in zahlreichen anatomischen und physiologischen Messgrößen führt. Im Mittelpunkt dieser Untersuchung stan­den die Auswirkungen auf adulte hippocampale Neurogenese. Um jedoch den funktionellen Kontext und die allgemeinen Bedingungen, innerhalb derer diese morphologischen Veränderungen stattfinden, besser zu verstehen und um ein allgemeines Maß für die allgemeine Antwort des Tieres auf die jeweilige expe­[Seite 52↓]rimentelle Umgebung zu geben, haben wir das Körpergewicht der Tiere ver­folgt und sie Verhaltenstests unterzogen.

Zu Beginn des Experimentes bestand kein Unterschied im Körpergewicht zwischen den Gruppen, da die Tiere zufällig den Versuchsgruppen zugeteilt worden waren. Abb. *2A zeigt, daß das Körpergewicht der Kontrolltiere stieg von 13.6 g im Alter von 21 Tagen auf 25.3 g am Ende des Experimentes (6 Monate). Der entsprechende Anstieg war signifikant geringer in Enr-LT, die mit 14.3 g anfingen, aber mit nur 22.7 g endeten. Enr-WD Mäuse dagegen unterschieden sich nach 3 Monaten, dem Ende der 68 Tage in der reizreichen Umgebung, nicht von Enr-LT (21.5 g bzw. 21.6 g), was auf eine vergleichbare allgemeine Wirkung in den beiden reizreich lebenden Gruppen hinweist. Mit einem Körpergewicht von 24.2 g näherten sich Enr-WD dem Gewicht der Kontrollen am Ende der sechs Monate an (Statistische Auswertung in Tab. *1). Es gab keinen signifikanten Unterschied im Hirngewicht zwischen den drei Gruppen. Die Hirngewichte waren 514 +/- 6 mg in Kontrollen, 504 +/- 7 mg in Enr-WD und 517 +/- 6 mg in Enr-LT.

Während einer Stunde in der Aktivitätsmesskammer waren Enr-LT signi­fikant weniger aktiv als Kontrollen und Enr-WD (Abb. *2B; ANOVA: p = 0.0006), was als eine schnellere Gewöhnung von Enr-LT an eine neue Umge­bung interpretiert wird. Auf dem Rotarod hielten sich Enr-LT signfikant länger als die anderen zwei Gruppen auf dem rotierenden Rundstab (Abb. *2C; ANOVA: p = 0.0015). Im Vergleich der Werte am ersten Tag mit denen des vierten Tages (paarweiser t-Test) zeigten nur Enr-LT einen Trainingseffekt oder prozedurales Lernen (p = 0.0103).

Testergebnisse im Wasserlabyrinth, die allgemein als Ausdruck hippocam­paler Funktionen angesehen werden, waren im Kontext dieser Untersuchung adulter hippocampaler Neurogense von besonderem Interesse. Unsere drei früheren Versuche mit kurzzeitigerer Exposition gegenüber der reizreichen Umgebung (2.3 bis 2.5) hatten signifikante Verbesserungen in den Leistungen im Wasserlabyrinth in den reizreich lebenden Tieren gezeigt. In diesem Lang­zeitexperiment jedoch konnten keine Unterschiede zwischen den drei Gruppen bezüglich der benötigten Zeit, um die Plattform zu finden, und der Länge der dazu benötigten Schwimmstrecke festgestellt wurde (Abb. *2D und E). Enr-LT jedoch schwammen im Durchschnitt signifikant schneller (Daten nicht gezeigt; ANOVA: p = 0.0020). In der Probe, als die Plattform aus dem Becken entfernt wurde, um als Maß räumlichen Lernens die Perseveration der Tiere zu messen, die Plattform an der antrainierten Stelle zu finden, konnte kein Unter­schied zwischen den Gruppen gefunden werden (Daten nicht gezeigt).

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse funktioneller Untersu­chungen, daß (1) Langzeitexposition gegenüber einer reizreichen Umgebung im Hinblick auf einige Maßzahlen (Körpergewicht, Habituierung, Lokomotion, Schwimmgeschwindigkeit) signifikante Auswirkungen hatte, (2) die Langzeit­reizung keine anhaltenden Verbesserungen im räumlichen Lernen, wie sie in den früheren Experimenten aufgefallen waren, hervorzurufen scheinen und (3) Tiere, die im jugendlichen Erwachsenenalter eine Kurzzeitexposition der [Seite 53↓]reizreichen Umgebung und einen folgenden Reizentzug durchmachen mussten (Enr-WD), sich von den Kontrollen in keinem der hier untersuchten Parame­ter unterschieden.

Auswirkungen auf adulte hippocampale Neurogenese

Unsere vorausgehenden Studien hatten gezeigt, daß eine kürzer anhal­tende Exposition von C57BL/6 Mäusen gegenüber reizreicher Umgebung (68 Tage) die Zahl der BrdU-positiven Zellen einen Tag nach der letzten BrdU-Injektion als Maß der Zahl der Zellen, die während der 12-tägigen Injektions­periode in Zellteilung waren, nicht beinflusste. Die erfahrungsabhängige Net­tostimulation von adulter hippocampaler Neurogenese beruhte auf einem er­höhten Überleben der markierten Zellen, d.h. eine größere Anzahl BrdU-mar­kierter Zellen vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion. Für eine grund­sätzliche Diskussion von Daten auf BrdU-Basis siehe 2.2 [131, 173].

Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen zeigte die gegenwärtige Studie, daß einen Tag nach der letzten BrdU-Injektion in den Enr-WD signifikant mehr BrdU-positive Zellen nachgewiesen werden konnten als in Kontrollen und in Enr-LT (Abb. *3A, schraffierte Balken, und Abb. *4A-C). Enr-WD wiesen zweieinhalbfach soviele BrdU-positive Zellen in der Subgranulärschicht und in der Körnerzellschicht auf als Kontrollen. Die Zahl der BrdU-positiven Zellen in Enr-LT wich nicht signifikant von der in Kontrollen ab.

Vier Wochen später hatte die Zahl der BrdU-positiven Zellen in allen drei Gruppen abgenommen (Abb. *3A, offene Balken). Obwohl deskriptiv der Durchschnitt der überlebenden Zellen in Enr-WD und Enr-LT um rund 60% höher lag als in Kontrollen, ließ sich wegen sehr hoher Varianz innerhalb der Gruppen kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen nachweisen (ANOVA: p = 0.3660). Die Abnahme der durchschnittlichen Zahl der BrdU-positiven Zellen zwischen einem Tag und vier Wochen nach der letzten Injektion war mit 66% in Enr-WD am größten und lag bei 45% in Enr-LT und den Kontrollen.

Bei der Untersuchung der relativen Verteilung der Phänotypen unter den BrdU-positiven Zellen vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion (Abb. *3 und *4D, Tab. *5), lag der Prozentsatz der BrdU/NeuN doppeltmarkierten Zellen (“neue Neurone”) bei 58% in Enr-LT gegenüber 43% in sowohl Kon­trollen als auch Enr-WD (p = 0.0650). BrdU/S100ß doppeltmarkierte Zellen (“neue Astrozyten”) machten 17% der BrdU-positiven Zellen in Kontrollen, 13% in Enr-WD und 13% in Enr-LT aus. Die Gruppe von Zellen, die weder eine Kolokalisation von BrdU mit NeuN oder S100ß (daher hier in den Abb. neither, “weder noch” benannt) ist höchstwahrscheinlich heterogen und bein­haltet Zellen, deren Phänotyp nicht bestimmt wurde oder die undifferenziert blieben. Letztere müssten zu einem nicht bekannten Anteil auch die selbstre­plizierenden Vorläuferzellen beeinhalten. Es fand sich kein signifikanter Unter­schied zwischen den relativen Schätzungen der „Wedernoch“-Zellen in den drei Gruppen (p = 0.0970), obwohl der Unterschied der Mittelwerte zwischen Enr-LT und Enr-WD bei 16 Prozentpunkten lag und zwischen Enr-LT und [Seite 54↓]Kontrollen bei 11 Prozentpunkten, was auf einen starken Einfluß der Stan­dardabweichung von rund 13%-Punkten in allen drei Gruppen spricht.

Die Gesamtzahl der neuen Neurone und neuen Astrozyten wurde durch die Multiplikation der Anzahl BrdU-positiver Zellen vier Wochen nach der letzten Injektion mit der Ratio für den jeweiligen Phänotyp bestimmt. Die durchschnittliche Zahl neuer Neurone war 2.5fach höher in Enr-LT im Ver­gleich zu Kontrolltieren, aber der Unterschied war nich statistisch signifikant (Tabelle *1). Es fand sich eine extreme Variabilität in Enr-LT. Das 95%-Kon­fidenzintervall reichte von knapp 200 bis 1300 neuen Neuronen. Der Varianz­koeffizient (VK% = Standardabweichung / arithmetisches Mittel x 100) war 77.2 in Enr-LT gegenüber 33.9% in Kontrollen und 42.7% in Enr-WD. Eine mögliche biologische Bedeutung dieser immensen Variabilität wird weiter un­ten diskutiert.

Es fand sich auch kein statistisch signifikanter Unterschied in der Gesamt­zahl neuer Astrozyten oder neuer Zellen, die weder NeuN oder S100ß expri­mierten (Abb. *3C, und Tabelle *5).

Die Gesamtzahl an Körnerzellen wurde durch Anwendung stereologi­scher Quantifizierungsprinzipien abgeschätzt (Tab. *6). Rein deskriptiv war die durchschnittliche Körnerzellzahl in Enr-LT um etwa 45 000 Zellen höher als in den anderen Gruppen (aber p = 0.9567 im Vergleich Enr-LT/Enr-WD und p = 0.0881 im Vergleich Enr-LT / Kontrolle; Tab. *5). Im Hinblick auf die neuronale Zelldichte in der Körnerzellschicht hatte Enr-LT signifikant mehr Körnerzellen pro Probenvolumen als Enr-WD (p = 0.0026), aber nicht signifi­kant mehr als die Kontrolltiere (p = 0.0879).

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse unserer Untersuchung der Wir­kung von Umweltreizen auf adulte hippocampale Neurogenese in einem Para­digma mit Langzeitexposition einerseits und einem Reizentzug andererseits ein sehr komplexes Muster, das vor allem von hoher interindividueller Variabilität geprägt ist. Dies steht einem offenkundigen Gegensatz zu den vorausgegange­nen Experimenten, die klarere Unterschiede zwischen den für kürzere Zeit reizexponierten Tieren verschiedenen Alters oder genetischen Hintergrundes zu den jeweiligen Kontrollen gezeigt hatten.


[Seite 55↓]

Tab. 5 : Statistische Auswertung der Vergleiche zwischen den Gruppen

 

Kontrollen

vs. Enr-WD

Kontrollen

vs. Enr-LT

Enr-WD

vs. Enr-LT

    

Körpergewicht: 2 Monate

(F[2,35] = 6.099; p = 0.0053; see Fig. 2)

0.0036

0.0055

n/s

Körpergewicht: 6 Monate

(F[2,35] = 4.926; p = 0.0130; see Fig. 2 A)

n/s

0.0036

(0.0922)

Proliferation (“1 Tag”)

(F[2,12] = 4.711; p = 0.0309; see Fig. 3 A)

0.0101

n/s

(0.0921)

Überleben (“4 Wochen”)

(F[2,15] = 1.076; p = 0.3660; see Fig. 3 A)

n/s

n/s

n/s

% Phänotypen: Neurone

(F[2,15] = 3.298; p = 0.0650; see Fig. 3 B)

n/s

(0.0551)

(0.0386)

% Phänotypen: Astrocyten

(F[2,15] =0.992; p = 0.3939; see Fig. 3 B)

n/s

n/s

n/s

% Phänotypen: “neither”

(F[2,15] = 2.736; p = 0.0970; see Fig. 3 B)

n/s

n/s

(0.0379)

Neue Neurone

(F[2,15] = 1.903; p = 0.18346; see Fig. 3 C)

n/s

(0.0719)

n/s

Neue Astrocyten

(F[2,15] =0.322; p = 0.7299; see Fig. 3 C)

n/s

n/s

n/s

“Neither” Zellen

(F[2,15] = 1.430; p = 0.2700; see Fig. 3 C)

n/s

n/s

n/s

Neuronale Dichte

(F[2,20] = 5.974; p = 0.0092)

n/s

(0.0879)

0.0026

Absolutes Volumen der Körnerzellschicht

(F[2,20] = 0.483; p = 0.6246)

n/s

n/s

n/s

Zahl der Körnerzellen

(F[2,20] = 2.521; p = 0.1069)

n/s

(0.0881)

(0.0567)

Enr-LT, Mäuse für 6 Monate in reizreicher Umgebung; Enr-WT, Mäuse für 68 Tage in reizreicher Umgebung und anschließendem Entzug bis zum Endpunkt des Experimentes nach 6 Monaten (Vgl. Abb. *1). Die statistische Auswertung der ste­reologischen Daten wurde mittels ANOVA und Bonferroni-Dunn post hoc Test durchgeführt. Für ANOVA wurde ein p = 0.05 als statistisch signifikant angesehen. F und p der ANOVA finden sich in der ersten Spalte. Für den Bonferroni-Dunn post hoc Test lag die Signifikanzgrenze level bei p ≤ 0.0167. Signifikante Unterschiede sind unterlegt. Bei p zwischen 0.0167 und 0.1 und bei p < 0.05, wenn p der ANOVA nicht keine Signifikanz anzeigte, sind die Werte in Klammern angegeben. n/s, nicht signifi­kant.


[Seite 56↓]

Tab. 6 : Stereologische Ergebnisse

 

Kontrollen

Enr-WD

Enr-LT

    

Neuronale Dichte

(Zellen / Probenvol.)

9.34

± 0.33

8.58

± 0.49

10.16

± 0.17

Absolutes Volumen der Körner­zellschicht (mm3)

0.335

± 0.007

0.367

± 0.033

0.351

± 0.020

Absolute Anzahl der Körnerzel­len

3.47 x 105

± 0.14

3.42 x 105

± 0.19

3.93 x 105

± 0.20

Stereologische Untersuchung des Gyrus dentatus: Neuronale Dichte, absolutes Volumen der Körnerzellschicht und Gesamtkörnerzellzahl. Alle Werte sind Mittel­werte ± Standardfehler. Probenvolumen: 9000 µm3.

Diskussion

Interpretation der morphologischen Befunde

Stimulation durch Umweltreize mit nachfolgendem Reizentzug (Enr-WD) resultierte in einer signifikant größeren Anzahl BrdU-positiver Zellen einen Tag nach der letzten BrdU-Injektion. Dieser Befund stand in scheinbarem Widerspruch zu unseren früheren Studien mit C57BL/6 Mäusen [94, 95]. In diesen Versuchen (siehe 2.3 und 2.4) war die Rate der “Proliferation”, wie sie durch die Zahl der BrdU-positiven Zellen unmittelbar nach Ende der Markie­rungsphase mit BrdU abgeschätzt werden kann, nicht durch die Stimulation durch Umweltreize beeinflusst worden. Der Nettoeffekt auf adulte Neuroge­nese in diesen Experimenten basierten auf einer überlebensfördernden Wir­kung auf die Tochterzellen der proliferierenden Zellen der subgranulären Zone.

Theoretisch könnte die höhere Zahl BrdU-positiver Zellen einen direkten mitogenen Effekt auf die neuronale Vorläuferzellpopulation in der subgranulä­ren Zone oder aber die Rekrutierung von mehr teilungsfähigen Zellen aus ei­nem hypothetischen Reservoir an ruhenden neuralen Vorläuferzellen in der subgranulären Zone haben. In diesen Fällen wäre es jedoch sehr schwierig zu erklären, warum diese Wirkung nur nach dem Entzug der reizreichen Umge­bung (Enr-WD) auftrat, nicht aber unter fortdauernder Stimulation (Enr-LT).

Interessanerweise jedoch führten 40 Tage Exposition gegenüber einer reizreichen Umgebung in 129/SvJ Mäusen (vgl. 2.5) zu einer signifikanten Steigerung der proliferativen Aktivität in der subgranulären Zone am ersten Tag nach der letzten Injektion von BrdU [91]. Wir haben diese Ergebnisse im Kontext der Resultate an C57BL/6 Mäusen als einen differentiellen Einfluß des genetischen Hintergrunds auf die umweltabhängige Regulation adulter hippocampaler Neurogenese interpretiert.

Wie unter 2.7 dargestellt, stimuliert körperliche Aktivität (Laufen) adulte hippocampale Neurogenese und hat auch eine starke Auswirkung auf die Zell­proliferation im Gyrus dentatus von C57BL/6 Mäusen [178].


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Diese Resultate zeigen deutlich, daß die Regulation der Zellproliferation in Mäusen möglich ist, aber sie bieten keine Lösung für die Frage, warum solch eine Effekt hier nur nach 97 Tagen Reizentzug sichtbar wurde.

Der Gesamteindruck in der vorliegenden Studie war, daß sowohl die Langzeitstimulation als auch der Reizentzug weniger klare Effekte als eine akute Reizwirkung von 68 Tagen, unmittelbar gefolgt von der Untersuchung, hatten. Nach 6 Monaten waren Kontrollen und Enr-LT nicht so verschieden voneinander wie man bei einer linearen Extrapolation der Resultate von 3 Mo­nate alten Mäusen (siehe 2.3) hätte vermuten können. Trotzdem waren Enr-WD und Enr-LT wohl unterschiedlich genug um schlußfolgern zu können, daß fortgeführte Stimulation zumindest den früheren akuten Trend aufrecht­erhält.

Dieser Eindruck bestätigt sich, wenn man Enr-LT mit den kurzzeitig sti­mulierten, 6 Monate alten Tieren der unter 2.4 dargestellten Studie (dort mit “Enr-6” bezeichnet) vergleicht [95], auch wenn ein solcher Vergleich von zwei unterschiedlichen Versuchen nur mit größter Vorsicht geschehen sollte. Der Vergleich zeigt jedoch, daß Enr-LT signifikant mehr neue Nervenzellen (p = 0.0112) als die Kontrollen der anderen Studie (dort mit “Ctr-6” bezeichnet) hatten, aber nicht signifikant von der akut stimulierten Gruppe Enr-6 ver­schieden war (p = 0.1988). Analoge Vergleiche zwischen den Kontrollgruppen der beiden Versuche wiesen eine Differenz der Mittelwerte von nur 24.5 Zel­len bei einem p von 0.8992 (ANOVA: p = 0.0420) auf.

Hinsichtlich vieler untersuchter Parameter waren Enr-WD den Kontrollen ähnlicher als Enr-LT, was darauf hinweisen könnte, daß viele Effekte von reizreicher Lebensumgebung nicht aufrechterhalten wurden, als die Exposition nicht fortgeführt wurde. Eine bemerkenswerte Ausnahme hiervon, die weitere und genauere Untersuchungen erfordert, ist die Zahl der BrdU-positiven Zel­len vier Wochen nach der letzten Injektion von BrdU.

Deskriptiv lag die Differenz zwischen Enr-WD und Enr-LT bei nur 18 Zellen (von rund 1230), aber in beiden Gruppen war der Mittelwert ungefähr 60% höher als in Kontrollen (Abb. *3). Im Gegensatz dazu legte die resultie­rende Nettoneurogenese in Enr-WD eine sehr viel geringere Differenz zu den Kontrollen nahe (Abb. *3C). Beide Vergleiche waren im vorliegenden Experi­ment jedoch nicht signifikant. Trotzdem kann daraus eine Arbeitshypothese abgeleitet werden (Abb. *5).

In den jungen C57BL/6 Mäusen führten Umweltreize für 68 Tage nicht nur zu einem Anstieg in der Zahl neuer Nervenzellen, sondern auch zu einem ähnlichen Anstieg in der Zahl der BrdU-markierten Zellen, die weder einen neuronalen noch astrozytären Phänotyp aufwiesen (Vgl. 2.3). Dieser Anteil an Zellen beinhaltet auch die undifferenzierten, selbstreplizierenden Stamm- oder Vorläuferzellen. Komplexe Umweltreize für 68 Tage hatten daher höchstwahr­scheinlich auch einen überlebensfördernden Effekt auf die Vorläuferzellen selbst, auch wenn ohne spezifische Marker dieser Effekt nicht quantifizierbar ist. Wenn nach 68 Tagen, dem Ende der Reizperiode für Enr-WD, sowohl Enr-WD als auch Enr-LT mehr überlebende Vorläuferzellen in der subgranu­[Seite 58↓]lären Zone hatten, könnte die Differenz zwischen Enr-WD und Enr-LT nach sechs Monaten eine fortgesetzt erhöhte Rate an Vorläuferzellproliferation in Enr-WD widerspiegeln, ohne daß es dort, wie in Enr-LT, zu einer neuronalen Differenzierung der Tochterzellen gekommen wäre (Abb. 3). Dieses größere Reservoir an sich teilenden Zellen der subgranulären Zone kann demnach so­gar noch drei Monate nach Reizentzug festgestellt werden. Anders als in Enr-LT wurden in Enr-WD jedoch ohne eine Herausforderung durch Umgebungs­reize weniger Tochterzellen zur Differenzierung in Neurone aus diesem grö­ßeren Reservoir rekrutiert (Abb. *3 und Abb. *5). Eine Stimulation in Jugend- und frühem Erwachsenenalter könnte daher selbst im Falle des Reizentzuges zu einem erhöhten Potential für Neurogenese führen. Weitere Experimente sind notwendig, um diese Theorie eindeutig im Hinblick auf statistische Signi­fikanz zu bestätigen und ein erhöhtes neurogenes Potential der erhöhten An­zahl proliferierender Zellen in Enr-WD beispielsweise bei einer Wiederauf­nahme der Reizexposition zu bestätigen.

Sogenanntes neonatales Handling als ein Beispiel für eine sogar noch frü­her ansetzende Manipulation der unmittelbaren Umgebung hat lebenslange Auswirkungen auf das Gehirn und kann altersabhängigen Veränderungen wie z.B. Zellverlusten in den Regionen CA3 und Defizite im räumlichen Lernen entgegenwirken [118]. Der vermutete dem zugrundeliegende Mechanismus soll zumindest teilweis in einer verminderten Sekretion von Glukokorticoiden lie­gen [118, 121]. Glucocorticoide ihrerseits wirken inhibitorisch auf adulte hip­pocampale Neurogenese [62, 117]. Die kurz- und langfristigen Effekte auf adulte hippocampale Neurogenese jedoch müssen noch untersucht werden.

Obwohl die Zahlen im vorliegenden Experiment dazu tendierten eine re­lativ hohe Varianz aufzuweisen, ist das Ausmaß der Varianz im Falle der Neu­rogenese in Enr-LT besonders augenfällig. Hier bestand ein 95%-Konfidenz­intervall von 200 bis 1300 neuen Nervenzellen. Die Power bezüglich des Ver­gleiches von Enr-LT mit den Kontrollen in diesem Experiment lag bei nur 23% für eine angenommene Mittelwertdifferenz von 400 neuen Nervenzellen (wobei der wirkliche gemessene Wert 450 war), 50% für eine Differenz von 600 und 86% für eine Differenz von 900. Auch wenn diese große Varianz in erfahrungsinduzierter Neurogenese die Power im Vergleich zur Kontrolle vermindert, könnte sie doch auch selbst ein bedeutungsvolles Ergebnis dar­stellen. Sowohl genetischer Hintergrund als auch Umgebungsstimuli beeinflus­sen die unterschiedlichen Ebenen der Regulation und damit die Nettoauswir­kungen auf adulte hippocampale Neurogenese. Außerdem ist gezeigt worden, daß Stress die Proliferationsrate in der subgranulären Zone senkt [66, 69]. Die große Varianz adulter Neurogenese in Enr-LT könnte daher das Spektrum der Erfahrungen und unterschiedlichen Reaktionen individueller Mäuse auf die Langzeitexposition reizreicher Umgebung darstellen. Man könnte sagen, daß während der 6 Monate komplexer Stimulation durch die Umgebung die fortge­setzte Reaktion auf diese Herausforderung die dem homogenen genetischen Hintergrund zuschreibbare Regulation überspielt hat und subtile individuelle Differenzen enthüllt hat.


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Funktionelle Kontexte, in denen die erfahrungsabhängige Regulation adulter hippocam­paler Neurogenese auftritt

[…] Die Auseinandersetzung mit der komplexen Umgebung führt zu ei­ner messbaren Wirkung in nahezu allen Organen. Die hier berichteten Unter­schiede im Körpergewicht (Abb. *2A) deuten darauf hin, daß das Leben in reizreicher Umgebung ähnliche Wirkungen auf Enr-WD und Enr-LT hatte. Nach 68 Tagen in der reizreichen Umgebung unterschieden sich Enr-WD und Enr-LT nicht bezüglich ihres Körpergewichtes; am Ende des Experimentes, drei Monate nach Reizentzug, hatten sich Enr-WD wieder dem Niveau der Kontrolltiere angenähert. Daß Tiere in reizreicher Umgebung ein niedrigeres Körpergewicht haben, wurde bereits früher berichtet [38, 108].

Mehrere andere Verhaltensdaten zeigten ebenfalls Unterschiede zwischen Enr-LT und den anderen beiden Gruppen, was auf messbare allgemeinere Effekte der Langzeitstimulation schließen läßt. Enr-LT habituierten nicht nur schneller an eine neue Umgebung in der Aktivitätsmesskammer, sie zeigten auch bessere Leistung auf dem Rotarod und waren die einzige Gruppe, die einen signifikanten prozeduralen Lerneffekt auf dem rotierenden Rundstab zeigte. Es gibt keinen älteren Bericht über erfahrungsinduzierte Rotarodlei­stungen, obwohl ein ähnlicher Effekt für Ratten, die einen rotierenden Stab längs traversieren mussten, beschrieben worden ist [86].

Im Wasserlabyrinth jedoch konnte in der vorliegenden Studie kein Unter­schied im räumlichen Lernen festgestellt werden. In den früheren Versuchen hatten wir einen geringen, aber signifikanten Unterschied in der Leistung im Wasserlabyrinth zwischen Kontrollen und den Tieren in der reizreichen Um­gebung festgestellt [91, 94, 95], was in Übereinstimmung mit älteren Berichten war [133, 179]. Die Wirkung von reizreicher Umgebung auf Lernleistungen war in 129/SvJ sogar klarer und mit signifikanten Unterschieden in der Probe, was auf eine spezifischere Verbesserung im räumlichen Lernen hinweisen könnte [91]. In 6 Monate alten C57BL/6 Mäusen führte die reizreiche Umge­bung zu signifikanten Unterschieden sowohl in Bezug auf die Zeit zum Errei­chen der Plattform als auch in der Schwimmgeschwindigkeit [95]. In der vor­liegenden Studie fanden sich signifikante Ergebnisse nur bezüglich der Schwimmgeschwindigkeit. Im Lichte der Befunde am Rotarod und in der Ak­tivitätsmesskammer, könnte die erhöhte Schwimmgeschwindigkeit mit größe­rer Wahrscheinlichkeit körperliches Training lediglich als reine Hyperaktivität darstellen.

[…] Interessanterweise basiert bereits eine der älteren Theorien, die vorge­schlagen wurden, um die Wirkung der individuellen Erfahrung auf Hirnpara­meter zu erklären, auf Lernen und Gedächtnisvorgängen als Mediatoren [73, 151].

Aus alledem kann man die Hypothese ableiten, daß die funktionelle Rele­vanz adulter hippocampaler Neurogenese in einer relativ akuten Reaktion auf eine herausfordernde Umgebung, die Lernen erfordert, besteht. Neuartigkeit des Stimulus könnte dann der Auslöser für die neurogene Antwort sein, nicht [Seite 60↓]die Komplexität der Umgebung per se. Deshalb könnten Wechsel in der Umge­bung eher als die Fortführung eines erhöhten Niveaus externer Stimuli für die erfahrungsinduzierte Hochregulation adulter hippocampaler Neurogenese.

Das vorliegende Experiment war nicht dahingehend ausgelegt, um ab­schließende Schlußfolgerungen über “Neuartigkeit” zu erlauben, da sich auch während der 68 Tage der Stimulationsphase jeder neuartige Stimulus abnutzt. Wie unter 2.7 diskutiert werden wird, fanden wir, daß auch eine nur insgesamt 43-tägigen Exposition gegenüber reizreicher Umgebung ausreichte, die be­schriebenen Effekte hervorzurufen [178]. Gould et al. haben gezeigt, daß be­reits kurze Lernstimuli zu einer Steigerung in adulter hippocampaler Neuroge­nese führen, was nahelegt, daß bereits sehr kurze Stimulation ausreicht, um zu einer neurogenen Antwort zu führen [64].

Diese auf Neuartigkeit des Reizes basierende Theorie wirft die Frage auf, welche Faktoren einer reizreichen Umgebung es sind, die diese Neuartigkeit oder generell die entscheidenden Variablen ausmachen. In der klassischen Form des Enriched Environment erlauben die Komplexität der Stimulation und ihre potentiellen Variabilität nicht zu diskriminieren, welchen Beitrag zur Ge­samtwirkung einzelne Faktoren, die zusammen die Komplexität ausmachen, leisten. Dementsprechend ist es auch nicht möglich, in diesen Experimenten festzustellen, ob ein einzelner Reiztypus ausreichend gewesen wäre, die beob­achteten Wirkungen auszulösen. In großem Maße bleiben die unabhängigen Variablen in Experimenten mit reizreicher Umgebung eine black box. Dennoch wurde in einer Vielzahl von Experimenten versucht, den Beitrag einzelner Va­riablen zum Gesamteffekt zu eruieren. Dazu gehörten beispielsweise soziale Interaktion und körperliche Aktivität [59, 121, 153]. Stress könnte eine weitere wichtige Variable sein, aber zur Zeit ist nicht bekannt, inwieweit eine reizreiche Umgebung Tiere stresste, und wenn dies der Fall wäre, wo “guter Stress” auf­hörte und schädigender Stress begänne. Wie im folgenden besprochen (2.7), haben wir zeigen können, daß körperliche Aktivität allein ausreichend ist, um adulte hippocampale Neurogenese zu stimulieren [178], aber dies besagt nicht, daß nicht andere Faktoren zu den hier beobachteten Wirkungen mit beitragen.

Versuche, einzelne Faktoren der reizreichen Umgebung zu isolieren, könnten auch zu einer zu engen Fokussierung führen, denn die Antwort des Tieres umfaßt Veränderungen in verschiedenen Organsystemen, von denen viele, insbesondere im endokrinen System und im Nervensystem, weitrei­chende Auswirkungen auf andere System haben können. Im Falle der erfah­rungsabhängigen Regulation adulter hippocampaler Neurogenese könnte eine sehr komplexe systemische Antwort, die endokrine und metabolische, aber auch kognitive und emotionale Faktoren umfassen würde, zu den Änderungen im Mikromilieu der subgranulären Zone führen, die die neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen stimulierten und zu adulter Neurogenese führten. Auch wenn bekannt ist, daß beispielsweise Nerve growth factor (NGF) und seine Re­zeptoren [122] sowie auch Kortikoid- [121] und Neurotransmitterrezeptoren [145] im Hippocampus von Tieren in reizreicher Umgebung reguliert werden, bleibt es doch gegenwärtig noch schwierig, im Ganzen zu verstehen, wie der [Seite 61↓]Weg der Signaltransduktion von einem identifizierten Reiz zu einem neuroge­nen Signal an einer Vorläuferzellen in der subgranulären Zone führt. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die erfahrungsab­hängige Regulation adulter hippocampale Neurogenese über die Lebenszeit des Versuchstieres hinweg zu untersuchen, da frühe Erfahrung späte neurogene Antworten durch Veränderung der Ausgangslage beeinflussen könnte.

Es erscheint auch möglich und in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Enr-LT, daß eine fortgesetzte Stimulation mit einer sich steigernden Komplexität der Umwelt adulte Neurogenese bis zu einer Grenze stimulieren könnte, und die erfahrungsabhängige Regulation demnach erschöpfbar sein könnte. Bedenkt man in diesem Zusammenhang, daß die reizreichen Bedin­gungen unserer Versuche im Vergleich zur Wildnis deprivierte Verhältnisse darstellen [40], könnten die beobachteten Auswirkungen unter Laborbedin­gungen robuster ausfallen als unter Wildbedingungen. Auch wenn diese Über­legung die generelle funktionelle Einordnung adulter hippocampaler Neuroge­nese beeinflusst, so wird doch das Prinzip, daß Erfahrung auf neuronale Vor­läuferzellen im erwachsenen Gehirn wirken kann und dies möglicherweise mit langanhaltendem Effekt, dadurch nicht geschmälert.


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2.7  2.7 Körperliche Aktivität fördert Zellteilungen und Neurogenese im erwachsenen Gyrus dentatus

Van Praag H, Kempermann G, Gage FH. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature Neuroscience 2 (1999) 266-270

Zusammenfassung: Die Exposition gegenüber einer reizreichen Umgebung erhöht Neu­rogenese im Gyrus dentatus von erwachsenen Nagetieren, aber eine reizreiche Umgebung besteht typischerweise aus sehr vielen verschiedenen Komponenten. Darunter sind z.B. erwei­terte Möglichkeiten zu lernen, verstärkten soziale Interaktion, mehr körperliche Aktivität und mehr Platz. Wir haben in diesem Experiment versucht, einzelne Komponenten separat zu untersuchen, indem wir erwachsene Mäuse verschiedenen experimentellen Bedingungen unterwarfen: Lernen im Wasserlabyrinth (Lerner), Schwimmen für die Zeit, die die Lerner schwammen, aber ohne Gelegenheit, zu lernen (Schwimmer), freiwilliges Laufen im Laufrad (Läufer), reizreiche Umgebung (Reizreich) und Kontrolltiere in Standardkäfigen (Kontrol­len). Weder Training im Wasserlabyrinth noch erzwungenes Schwimmen hatte einen Effekt auf die Zahl BrdU-positiver Zellen. Laufen jedoch verdoppelte die Zahl der überlebenden neugeborenen Zellen in einem Ausmaß, das etwa dem reizreicher Umgebung entsprach. Diese Ergebnisse zeigen, daß freiwillige körperliche Aktivität ausreicht, um eine Steigerung der Neurogenese im Gyrus dentatus der erwachsenen Maus auszulösen.

[…] Es ist nicht bekannt, welche Faktoren, die gemeinsam eine reizreiche Umgebung ausmachen, kritisch für den beobachteten Effekt auf adulte hippo­campale Neurogenese sind. In diesem Experiment haben wir Komponenten von reizreicher Umgebung separat untersucht und ihre Wirkung auf die Zell­proliferation und die Neurogenese im erwachsenen Hippocampus betrachtet.

Die gesteigerte Neurogenese im Hippocampus reizreich lebender Tiere ist mit Verbesserungen in Tests des räumlichen Lernens assoziiert [91, 94, 95]. Umgekehrt könnte Lernen selbst ein spezifischer Stimulus für Neurogenese sein. Training im Labyrinth und Leben in reizreicher Umgebung könnten zu gleichartigen neurochemischen Veränderungen führen [11]. Darüberhinaus korreliert in Vögeln, die Futterverstecke anlegen, diese Erfahrung mit Verände­rungen in der Größe des Hippocampus und mit Neurogenese [6, 7, 141]. Eine wichtige interagierende Variable in Versuchen, den unmittelbaren Effekt von Lernen auf adulte hippocampale Neurogenese abzuschätzen, ist körperliche Aktivität, die Zellproliferation, Überleben oder Differenzierung beeinflussen könnte. In der Tat erleichtert Bewegung die Erholung von neurologischen Erkrankungen wie Schlaganfall [85] und verbessert die kognitive Leistungsfä­higkeit [16, 53]. Außerdem geht körperliche Aktivität mit erhöhten Spiegeln von Neurotrophinen und deren Genexpression einher [129]. Insbesondere wird der Spiegel von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), der für Überleben und Differenzierung von Vorläuferzellen in vitro [146] und in vivo [101, 174] notwendig ist, sowohl durch körperliche Aktivität als auch durch räumliches Lernen erhöht [59, 61]. Wir planten unsere Studie, um die Beiträge [Seite 63↓]der Variablen Lernen und körperliche Aktivität auf die Produktion neuer Kör­nerzellen zu untersuchen. Daher teilten wir die Mäuse in Gruppen ein, die in reizreicher Umgebung lebten, im Wasserlabyrinth mit verborgener Plattform trainierten, erzwungenerweise schwimmen mußten (unfreiwillige körperliche Aktivität), ein Laufrad benutzen durften (freiwillige körperliche Aktivität) oder in Kontrollbedingungen lebten.

Wir zeigen hier, daß weder Training im Wasserlabyrinth noch unfreiwillige körperliche Aktivität einen Effekt auf Zellproliferation oder Neurogenese hat­ten. Exposition gegenüber einer reizreichen Umgebung erhöhte die Zahl der überlebenden neugeborenen Zellen, aber beeinflusste, wie in den Vorgänger­studien (siehe 2.3 und 2.4) nicht die Proliferation der Vorläuferzellen in C57BL/6 Mäusen. Freiwillige körperliche Aktivität in einem Käfiglaufrad je­doch erhöhte die Zellproliferation, das Überleben und die Nettoneurogenese im Hippocampus. Dieser Befund legt nahe, daß körperliche Aktivität ausrei­chend ist, um verschieden Aspekte der Regulation adulter hippocampaler Neu­rogenese zu steigern.

Ergebnisse

Proliferation und Überleben BrdU-markierter Zellen im Gyrus dentatus

Die Teilungsaktivität der Stamm- oder Vorläuferzellen im Gyrus dentatus wurde mit BrdU-Markierung der sich teilenden Zellen über 12 Tage und im­munhistochemischer Untersuchung einen Tag nach der letzten Injektion un­tersucht. Es fand sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen (p < 0.01). Spezifischere Vergleiche zeigten, daß die Läufer mehr Zellproliferation aufwiesen als irgendeine der anderen Gruppen (p < 0.02; Abb. *1A).

Überleben der Tochterzellen der sich teilenden Vorläuferzellen wurde durch Anfärben BrdU-positiver Zellen vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion abgeschätzt. In Kontrollen und Lernern überlebten 42% der sich teilenden Zellen, in Schwimmern 46% und in den Läufern 56%. In den reizreich lebenden Tieren überlebten mit 85% signifikant mehr neue Zellen als in den anderen Gruppen (p < 0.01). Außerdem fanden wir eine hochsignifi­kante Differenz in der Anzahl der überlebenden Zellen zwischen den Gruppen (p < 0.0009). Die Gesamtzahl überlebender Zellen war signifikant höher in Läufern (p < 0.002) und reizreich lebenden Tieren (p < 0.02) als in Kontrollen, Lernern und Schwimmern. Läufer hatten 201% und reizreich Lebende 175% der Kontrollwerte an markierten Zellen pro Gyrus dentatus (Abb. *1B). Das Volumen des Gyrus dentatus unterschied sich nicht zwischen den Gruppen (p > 0.39; Tabelle *7).

Die phänotypische Differenzierung der überlebenden BrdU-positiven Zellen wurde wie immer vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion mittels Immunfluoreszenz und Dreifachmarkierungen von BrdU, NeuN und S100ß analysiert. Läufer und reizreich Lebende unterschieden sich sowohl im Hin­blick auf den Prozentsatz BrdU/NeuN doppeltmarkierter Zellen (p < 0.001) als auch denjenigen der Zellen, die weder Kolokalisation von BrdU mit NeuN [Seite 64↓]oder S100ß zeigten (“other” in Tab. *7; p < 0.0015) signifikant von den Kon­trollen und den Schwimmern. Es fand sich kein signifikanter Unterschied zwi­schen den Gruppen im Hinblick auf den Prozentsatz neugeborener Zellen, die in Glia differenzierten (p > 0.08, Abb. *2, und Tab. *7).

Tab. 7 : Proliferation, Überleben und Phänotypen BrdU-positiver Zellen

 

Kontrollen

Lerner

Schwimmer

Läufer

Reizreich

Proliferation, 1 Tag

4393 ± 607

3637 ± 498

3755 ± 422

6773 ± 971***

3867 ± 617

Überleben, 4 Wochen

1880 ± 251

1528 ± 120

1711 ± 352

3791 ± 715**

3282 ± 265**

Überleben (%), 4 Wochen

43 ± 5.7

42 ± 12.8

46 ± 6

56 ± 10.6

85 ± 6.8***

Phänotypen:

     

Neurone (%)

76.8 ± 3.2

82.5 ± 2.6

73.8 ± 3.6

88.3 ± 1*

88.8 ± 2.7*

Astrozyten (%)

7 ± 3.2

3.8 ± 2.7

6.3 ± 0.8

3.3 ± 0.6

3 ± 1.1

Andere (%)

16.3 ± 1.7

13.8 ± 2.1

20 ± 3

9 ± 1.3

8.3 ± 2*

Volumen (mm3)

0.43 ± 0.02

0.37 ± 0.03

0.34 ± 0.03

0.42 ± 0.02

0.34 ± 0.03

Alle Werte sind Mittelwerte ± Standardfehler. *** bedeutet: signifikant verschie­den von allen anderen Gruppen (p < 0.02). ** steht für: signifikant verschieden von Kontrollen, Lernern und Schwimmern (p < 0.02). * bedeutet: signifikant verschieden von Kontrollen und Schwimmern (p < 0.02).

Training im Wasserlabyrinth

Die Lerner trainierten im Wasserlabyrinth nach Morris, die Fluchtplatt­form zu finden [124]. Wir benutzten Blocks von je zwei Versuchen pro Tier und Tag, damit das Training über die vierwöchige Trainingsphase hinweg eine Herausforderung darstellte. Zunächst wurden 14 Mäuse für 12 Tage trainiert. Während dieser Zeit reduzierte sich die Zeit, die sie benötigten, um die Platt­form zu finden, signifikant (p < 0.0001). Am Tag 13 wurden 6 dieser Tiere perfundiert, um die Zellproliferation zu untersuchen. Die verbleibenden acht Mäuse trainierten für weitere 11 Tage und zeigten eine signifikante Reduktion in der Zeit, die sie benötigten, um die Plattform zu finden (p < 0.0001). Da­nach wurde die Position der Plattform für sieben Tage verändert (“reversal”) . Wiederum verminderte sich die Zeit zum Erreichen der Plattform signifikant (p < 0.0001; Abb. *3). Die Schwimmdauer der Schwimmer entsprach der durch­schnittlichen Schwimmzeit der Lerner an jedem einzelnen Tag. Unsere mor­phologischen Ergebnisse zeigen jedoch, daß weder die Zellproliferation (am Tag 13, einen Tag nach der letzten BrdU-Injektion) noch das Überleben der neuen Zellen (am Tag 43, vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion) in der Lerner- und der Schwimmergruppe beeinflusst war. Diese Ergebnisse legen nahe, daß weder extensives Training dieser Aufgabe zum räumlichen Lernen noch die begrenzte, erzwungene körperliche Aktivität die Zellproliferation oder das Überleben BrdU-positiver Zellen im Gyrus dentatus beeinflussen konnten.


[Seite 65↓]

Diskussion

Diese Studie wurde geplant, um festzustellen, ob körperliche Aktivität in freiwilliger oder unfreiwilliger Form oder in Verbindung mit einer Lernaufgabe in der Steigerung adulter hippocampaler Neurogenese, wie sie in reizreicher Umgebung beobachtbar ist, involviert ist. Die Ergebnisse zeigen, daß die Zell­proliferation nur in den Mäusen gesteigert war, die ungehinderten Zugang zu einem Laufrad hatten (Läufer). Darüberhinaus verdoppelten sowohl reizreiches Leben als auch freiwillige körperliche Aktivität die Gesamtzahl der überleben­den neugeborenen Zellen im Gyrus dentatus. Außerdem wiesen sowohl in den Läufern als auch in den reizreich Lebenden relativ mehr Zellen einen neuro­nalen Phänotyp auf. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die im Wasserlabyrinth trainierten, und die Schwimmer, die eine den Lernern entsprechende Zeit schwimmen mussten, keine Veränderung in der Zahl BrdU-positiver Zellen, was nahelegt, daß diese Art von Lernen bzw. diese Art von Aktivität allein keine adäquaten Stimuli für adulte hippocampale Neurogenese sind. Unsere Ergebnisse erlaubten uns auch, verschiedene andere Faktoren, die neugeborene hippocampale Zellen beeinflussen könnten, auszuschließen. Weder reizreich Lebende noch die Läufer erhielten irgendwelche essbaren Belohnungen wie Äpfel oder Käse, wie wir sie in früheren Studien als Teil des Reizreichtums gegeben hatten [94], so daß Ernährung als mögliche Konfliktvariable ausge­schlossen werden kann. Die Läufer wurden zu dritt oder viert pro Käfig ge­halten, woraus geschlossen werden kann, daß die soziale Interaktion mit einer großen Gruppe nicht notwendig für eine neurogene Antwort ist. Es ist jedoch möglich, daß der soziale Faktor in der relativ höheren Überlebensrate BrdU-positiver Zellen in den reizreich Lebenden gegenüber den Läufern eine Rolle spielt. Schließlich gaben wir in diesem Experiment im Gegensatz zu den frühe­ren Versuchen, in denen die BrdU-Gaben stets nach einem Monat begonnen hatten (s.o.) hier BrdU vom ersten Versuchstag an, was dafür spricht, daß die Auswirkungen auf die Neurogenese relativ rasch zustandekommen.

Reizreiches Leben und Laufradtraining führten zu ungefähr der gleichen Anzahl an überlebenden BrdU-positiven Zellen. Zusätzlichen wurden unter beiden Bedingungen relativ mehr Zellen zu Neuronen als in den Kontrolltie­ren. Hinzu kam, daß der Prozentsatz der Zellen, die weder Marker für einen glialen noch für einen neuronalen Phänotyp aufwiesen, sank. Es ist möglich, daß die in diesem Anteil wahrscheinlich enthaltenen Vorläuferzellen von einem Reservoir multipotenter hippocampaler Stammzellen herrühren [136], deren Schicksal durch reizreiche Umgebung oder körperliche Aktivität in ähnlicher Weise beeinflusst werden könnte. Neurochemische Marker wie Acetylcholin [140] und trophische Faktoren wie Nerve growth factor (NGF) und Brain derived neurotrophic factor (BDNF) werden durch reizreiche Umgebung und körperliche Übung beeinflusst [51, 130]. In der reizreichen Umgebung sind diese Faktoren jedoch nur nach vorheriger Exposition eines Lerntests erhöht [51, 140], was allerdings auf unterschiedliche Mechanismen hinweisen könnte. Außerdem hatte reizreiches Leben keinen Einfluß auf Zellproliferation in C57BL/6 Mäu­sen (2.3 und 2.4), während Laufen die Zahl der BrdU-positiven Zellen einen [Seite 66↓]Tag nach der letzten BrdU-Injektion stark erhöhte. Interessanterweise erhöhte eine reizreiche Lebensumgebung die Zahl BrdU-positiver Zellen in 129/SvJ Mäusen, was eine unterschiedliche genetische Basis für die Zellproliferation und ihrer Regulation nahelegt (2.5). Die gegenwärtige Studie zeigt, daß inner­halb eines gegebenen genetischen Hintergrundes, Zellproliferation und –überleben durch unterschiedliche Manipulation des Verhaltens beeinflußt werden können. So könnte die sehr fokussierte Aktivität des Laufens den Zellzyklus verkürzt haben (Vgl. [131]) oder alternativ bewirkt haben, daß zu­sätzliche, bislang ruhende Zellen in den Zellzyklus eintreten. Darüberhinaus aber hatten Läufer und reizreich lebende Tiere vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion vergleichbare Zahlen an BrdU-positiven Zellen. Relativ ausge­drückt war die Überlebensrate der neugeborenen Zellen in den Läufern niedri­ger (56%) als in den reizreich lebenden (85%), was für unterschiedliche Lang­zeitwirkung der beiden Bedingungen sprechen könnte.

Bewegung korreliert stark mit hippocampalem Thetarhythmus [42]. Mäuse nutzen normalerweise ihr Laufrad heftig und kommen auf rund 20 000 bis 40 000 Umdrehungen pro Tag [176]. Fortgesetzte bewegungsinduzierte synchrone EEG-Aktivität könnte neurochemische Parameter beeinflussen. Veränderun­gen in der Neurotransmitterfunktion ihrerseits könnten subtile aber wichtige Veränderungen im Thetarhythmus auslösen. Beispielsweise kann serotonerge Übertragung Thetarhythmus verstärken [170], Long-term potentiation (LTP) und Gedächtnisleistungen verbessern und auch die Produktion neuer Nervenzellen beeinflussen [20, 21]. Im Gegensatz dazu könnte die Dauer der erzwungenen körperlichen Aktivität in der Gruppe der Schwimmer (zwischen 12 und 40 Sekunden pro Tag) zu kurz für langanhaltende Effekte gewesen sein. Alterna­tiv könnten diese Aufgaben Stress hervorgerufen haben, der die möglichen positiven Wirkungen auf das Überleben BrdU-positiver Zellen ausgeglichen hat.

Labyrinthtraining kann ähnliche neurochemische Veränderungen bewir­ken wie eine reizreiche Umgebung [11]. In unserem Experiment wurden die basalen Raten an Zellproliferation und Neurogenese durch einen Monat Trai­ning im Wasserlabyrinth nicht beeinflusst. Es ist möglich, daß zwei Versuche pro Tag die Tiere nicht genügend herausforderten, um eine Wirkung zu sehen. Kurzzeitiges massives Training, das eine transiente Steigerung in hippocampa­ler mRNA für bFGF induziert [60], könnte daher effektiver sein. In der Tat zeigt eine andere Studie (die parallel mit dieser veröffentlicht wurde), daß Trai­ning im Morris Wasserlabyrinth die Zahl der überlebenden BrdU-positiven Zellen steigerte [64]. Es ist jedoch interessant, daß einige Manipulationen, die eine Wirkung auf adulte Neurogenese zeigen, nicht notwendigerweise mit Ler­nen vereinbar sind. Die Blockierung von NMDA-Rezeptoren zum Beispiel, die normalerweise für Lernen notwendig sind [123], stimuliert adulte hippocam­pale Neurogenese [26]. Auch die Entfernung der Nebennieren beeinträchtigt Gedächtnisleistungen [34], aber ruft eine gesteigerte Zellproliferation im Gyrus dentatus hervor. Daher könnte die Hochregulation adulter hippocampaler [Seite 67↓]Neurogenese ein relativ generelles Phänomen sein, während spezifischere Lernaufgaben mehr auf die existierenden Zellen wirken.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, daß freiwillige körperliche Aktivität in gesteigerter Zellproliferation, erhöhtem Überleben der Tochter­zellen und einer vermehrten neuronalen Differenzierung im Hippocampus erwachsener Mäuse führt.


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08.03.2004