Kern, Florian: Periphere T-Zellen bei Patienten nach Organtransplantation: Die Transplantatschädigung und die Kontrolle der Zytomegalievirusinfektion

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Kapitel 1. Definition einer ‘neuen‘ Effektor/Memory-Subpopulation von CD8-T-Zellen

Die ersten 4 Originalarbeiten sind mit der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von peripheren T-Lymphozyten befasst. Bei Transplantationspatienten gibt die frühzeitige Erkennung einer Aktivierung von T-Zellen einen Hinweis auf das Auftreten immunologischer Komplikationen wie Transplantatschädigung oder Virusinfektion. Die Aktivierung von T-Lymphozyten kann durchflußzytometrisch erfasst werden. Dabei werden Antigene auf der Zelloberfläche oder intrazellulär mit fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Antikörpern markiert. Ausgangspunkt aller 3 Arbeiten war die Beobachtung einer Vielfalt CD4- und CD8-positiver T-Zellpopulationen im Hinblick auf die Expression von verschiedenen Oberflächenmolekülen wie beispielsweise von Aktivierungsantigenen, Adhäsionsmolekülen oder sogenannten Gedächtnis-Markern (Memory-Markern). Ziel der Forschung in Zusammenhang mit dem klinischen Monitoring war die Identifikation von Oberflächenantigenen oder Konstellationen davon, welche gestatteten, Aussagen über die Befindlichkeit des zellulären Immunsystems zu machen, um etwa aussagen zu können, ob es mit einer viralen Infektion oder der Abstoßung des Transplantates beschäftigt war. Dabei spielte die Infektion mit dem Zytomegalievirus (CMV) eine besondere Rolle, da dieses bei Transplantationspatienten sehr häufig zu Komplikationen führt. Unser besonderes Augenmerk galt zunächst dem Marker LFA-1 (Leukozyten-Funktions-Antigen-1, CD11a/CD18), einem Adhäsionsmolekül aus der Gruppe der Integrine . Die Expression dieses Oberflächenmoleküls war sehr auffällig, weil es (insbesondere auf CD8-T-Zellen) nur in genau 2 Ausprägungen vorzukommen schien, nämlich stark (’bright’) oder schwach (’dim’). So zeigten sich in der Durchflußzytometrie in der Histogrammdarstellung von LFA-1 auf CD8-T-Zellen 2 deutlich getrennte Gipfel.

Die Feststellung dieser auffälligen Zweiteilung war Anlass, die Expression weiterer Marker auf den beiden durch die LFA-1-Expression definierten Subpopulationen zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß die Expression der klassischen ’Memory’-Marker CD45RA und CD45RO auf T-Zellen (wiederum insbesondere auf CD8-T-Zellen) deutlich inhomogen war, denn in der LFA-1-bright-Population kamen sowohl CD45RA-stark-positive als auch -negative Zellen vor. Da LFA-1 nach allgemeiner Vorstellung nur auf solchen Zellen stark exprimiert war, welche bereits einmal Antigenkontakt gehabt hatten, also nicht mehr ’naiv’ waren, CD45RA dagegen nur auf solchen Zellen, die noch keinen Antigenkontakt hatten, ergab sich hier ein klarer Widerspruch.

Ähnlich waren die Ergebnisse zu CD28, einem wichtigen kostimulatorischen Molekül auf T-Zellen. Auch hier gab es praktisch nur bei den Zellen mit hoher LFA-1-Expression CD28-positive und CD28-negative, alle CD8-T-Zellen mit schwacher


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LFA-1-Expression waren CD28-positiv. Azuma und Mitarbeiter hatten 1993 beschrieben, daß CD28-negative CD8-T-Zellen eine höhere LFA-1-Expression zeigten als CD28-positive, daß sie zytotoxisches Potential besaßen, ferner ihre Proliferation auf mitogene Reize stark vermindert und auch durch Zugabe von Interleukin-2 nicht zu steigern war . Innerhalb der LFA-1-bright-Fraktion der CD8-T-Zellen gab es also offensichtlich mindestens 2 deutlich unterschiedliche Funktionszustände, die unterschiedlichen Phänotypen entsprachen. Entsprechend unseren Ergebnissen war die im Mittel höhere Expression von LFA-1 auf CD28-negativen T-Zellen dadurch zu erklären, daß diese ausschließlich in der Fraktion mit hoher LFA-1-Expression vorkamen.

Ein weiterer interessanter Marker, CD57, verhielt sich nahezu umgekehrt zu CD28 . Während in der LFA-1-dim-Population der CD8-T-Zellen ausschließlich CD57-negative Zellen zu finden waren, kamen in der LFA-1-bright-Population sowohl CD57-negative als auch -positive Zellen vor. CD57 war von großem Interesse beim Monitoring von Transplantationspatienten, weil eine auffällige Ausbreitung (Expansion) dieses Subsets nach Zytomegalievirusinfektion sowohl bei Gesunden als auch bei Patienten nach Nierentransplantation beschrieben worden war . Ferner war in unserer interdisziplinären Arbeitsgruppe beobachtet worden, daß auch klinisch asymptomatische CMV-Infektionen mit einer Funktionsverschlechterung der transplantierten Niere einhergehen können .

Es lag also nahe, die Expansion von CD57-positiven CD8-T-Zellen mit der Funktionsverschlechterung von Nierentransplantaten in Verbindung zu bringen. Dabei entwickelte sich in der Arbeitsgruppe die Hypothese, daß es sich bei diesen Zellen um aktivierte CD8-T-Zellen handelte, die nicht für den Transplantatspender spezifisch waren (möglicherweise aber für CMV), und, welche aufgrund Ihrer Oberflächenmoleküle (Adhäsionsmoleküle) befähigt waren, in das Transplantat einzuwandern und dort, ohne für dieses Gewebe eigentlich spezifisch zu sein, eine Gewebeschädigung herbeizuführen. Um einer Antwort auf diese Frage näher zu kommen, wurden die Untersuchungen durchgeführt, welche in ‘The enigma of CD57+CD28- T-cell expansion - anergy or activation?‘ beschrieben sind . Zunächst wurde die Expression der Marker CD57 und CD28 im direkten Bezug zueinander auf CD8-T-Zellen untersucht. Durchflußzytometrische Analysen zeigten, dass die gleichzeitige Expression beider Marker auf CD8-T-Zellen nur zu einem sehr kleinen Prozentsatz (3%) vorkam. Nahezu alle CD57-positiven CD8-T-Zellen waren CD28-negativ (33%), während praktisch alle CD28-positiven CD8-T-Zellen CD57-negativ waren (49%). Nur etwa 15% der CD8-T-Zellen waren CD28- und CD57-negativ. Was zur Funktion der CD28-negativen CD8-T-


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Zellen von Azuma bekannt war, sollte auch auf CD57-positive CD8-T-Zellen zutreffen, die im Wesentlichen als Subset der CD28-negativen CD8-T-Zellen zu betrachten sind.

Interessanterweise brachten einige Autoren die Expansion CD57-positiver/CD28-negativer CD8-T-Zellen, insbesondere bei HIV-Patienten, mit der Entwicklung von Anergie in Verbindung . Dies geschah hauptsächlich aufgrund der Beobachtung, daß diese Zellen auf mitogene Reize nicht mehr proliferierten und nach wenigen Tagen in Kultur abstarben.

Um die funktionelle Kapazität dieser Zellen nun näher zu untersuchen, nahmen wir bei Nierentransplantationspatienten mit positivem immunzytologischem Nachweis einer CMV-Antigenämie (also dem Nachweis viraler Proteinsynthese in Zellen des peripheren Blutes) und deutlicher Expansion der CD57-positiven CD8-T-Zellen eine durchflußzytometrische Sortierung (FACS) der CD8-T-Zellen mit starker Expression von LFA-1 (bright) in die jeweiligen durch die Expression von CD28 und CD57 bestimmten Subsets vor. Die so gewonnenen CD28-positiven oder -negativen und CD57-positiven oder -negativen CD8-T-Zellen wurden dann vergleichend mittels einer semiquantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) auf Ihren Gehalt an Messenger-RNA (mRNA) für proinflammatorische Zytokine (Tumor-Nekrose-Faktor-alpha, Interferon-gamma, Interleukin-1-beta) und die Interleukin-2-Rezeptor-Alpha-Kette IL-2Rp55 untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass es keinen wesentlichen Unterschied zwischen den Subsets bezüglich der Genexpression der untersuchten Zytokine gab, wohl aber für IL-2Rp55. Dieses Molekül ist für die Vermittlung der proliferativen Effekte von Interleukin-2 wichtig, war aber nur in CD28-positiven Zellen exprimiert.

Dieses Ergebnis bestätigte also einerseits die Ergebnisse von Azuma (fehlende Proliferation auf mitogene Reize/Interleukin-2), stärkte aber andererseits die Zweifel, daß es sich bei den CD57-positiven/CD28-negativen CD8-T-Zellen um einen anergen Zelltyp handelte. Da auch bei Nierentransplantationspatienten ohne CMV-Antigenämie CD57-positive CD8-


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T-Zellen zu beobachten waren (wenn auch in geringerer Quantität) war es von Interesse, derartige Untersuchungen zur Zytokin-mRNA an Patienten nach Nierentransplantation mit und ohne CMV-Antigenämie zu wiederholen und dabei das Spektrum an untersuchten Zytokinen zu erweitern . Dabei zeigte sich zunächst, daß bei klinisch unauffälligen asymptomatischen Patienten nach Nierentransplantation bei gleicher Methodik in peripheren CD8-T-Zellen keine mRNA für proinflammatorische Zytokine nachzuweisen war. Eine weitere Differenzierung in CD8-T-Zell-Subsets war also hier nicht sinnvoll. Deshalb wurde eine Sortierung der CD8-T-Zellen in CD57-positive und CD57-negative Zellen nur bei Patienten mit positivem CMV-Antigennachweis durchgeführt. Ferner wurde nach der LFA-1-Expression (dim oder bright) sortiert. Zusätzlich zu den früher untersuchten Zytokinen wurde auch die Expression von Granzyme-A untersucht, einem sekretorischen Zytotoxizitätsfaktor, ferner die Expression von Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-8 und Interleukin-10.

Das wichtigste Ergebnis dieser Untersuchungen war, dass Zytokin-mRNA praktisch nur in Zellen mit hoher LFA-1-Expression zu finden war, und dies nur bei Patienten mit CMV-Antigenämie (also im Zustand der Aktivierung). Unterschiede in der Zytokin-Expression zwischen CD57-positiven und CD57-negativen CD8-T-Zellen wurden wie schon zuvor nicht gefunden und die früheren Ergebnisse hinsichtlich der Expression der Interleukin-2-Rezeptor-Alpha-Kette p55 wurden im Prinzip bestätigt. Granzyme-A war in Zellen mit hoher LFA-1-Expression stärker exprimiert als in Zellen mit niedriger LFA-1-Expression und mRNA für Granzyme-A war auch bei gesunden Kontrollprobanden zu finden. Wenn auch die Level von Granzyme-A-mRNA bei den untersuchten Patienten etwas höher waren als bei Gesunden, so war der Unterschied in der Expression zwischen den genannten Subsets (LFA-1-bright und LFA-1-dim) bei den Patienten deutlich geringer.

Daraus entstand die Arbeitshypothese, dass die LFA-1-bright/CD57-positiven (CD28-negativen) CD8-T-Zellen, welche bei Patienten nach Nierentransplantation unter bestimmten Umständen expandieren, zwar einen terminal differenzierten Effektortyp darstellten, aber mit einem (gegenüber


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den CD8-T-Zellen mit geringer LFA-1-Expression) nur marginal gesteigerten zytotoxischen Potential . Im Gegensatz zu den CD57-negativen/CD28-positiven CD8-T-zellen mit hoher LFA-1-Expression zeigte sich keine oder kaum Expression von IL-2Rp55, was die mangelnde Sensitivität dieser Zellen gegenüber IL-2 erklärte. Da die Expression von CD57 im Zusammenhang mit lange andauernder Stimulation bzw. Antigen-Persistenz steht , vermuteten wir, daß diese Zellen, insofern sie für CMV spezifisch waren, das Virus nicht erfolgreich eliminieren konnten, aber infolge der persistierenden Stimulation expandierten.

Zusätzlicher Aufschluß zur Bedeutung der CD57-positiven/CD28-negativen T-Zellen ergab sich aus funktionellen Untersuchungen an CD8-T-Zellen mit hoher LFA-1-Expression und hoher bzw. fehlender Expression von CD45RA (LFA-1-bright/CD45RA-bright bzw. LFA-1-bright/CD45RA-dim) . Dabei wurde gezeigt, daß das CD8-T-Zell-Subset mit hoher Expression von LFA-1 und CD45RA weitgehend mit dem CD57-positiven bzw. dem CD28-negativen Subset überlappt (60% bzw. 70% Überlappung). Untersucht wurde weiter die Expression von CD45RA auf CD8-T-Zellen nach Aktivierung, die Neigung zu aktivierungs-induzierter Apoptose, die Größe und Granularität der Zellen, sowie ihre Perforin und Zytokin-Expression . Es fand sich, daß dieses Subset eine höhere Perforin-Expression aufwies, einen höheren Anteil an CD57-positiven/CD28-negativen CD8-T-Zellen besaß und größer und granulärer war als das Subset mit hoher LFA-1- aber schwacher CD45RA-Expression.

Dies sprach ebenfalls eindeutig für einen aktivierten Effektor-Zell-Typ. Der zwischen der CMV-Infektion und der Expansion von CD57-positiven CD8-T-Zellen hergestellte Zusammenhang konnte aber letztlich nur indirekt belegt bzw. erklärt werden. Es bestand keine technische Möglichkeit, gleichzeitig die Spezifität von CD8-T-Zellen und ihren Phänotyp zu bestimmen, ohne die Zellen zu klonieren, was mit hoher Wahrscheinlichkeit zu kulturbedingten Artefakten und einem veränderten Phänotyp geführt hätte.


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Mon Sep 16 13:54:24 2002