Kern, Florian: Periphere T-Zellen bei Patienten nach Organtransplantation: Die Transplantatschädigung und die Kontrolle der Zytomegalievirusinfektion

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Kapitel 2. Die Entwicklung von Nachweissystemen für CMV-spezifische Effektor-T-Zellen und die durchflußzytometrische Epitopkartierung

Einen Durchbruch im Hinblick auf den Nachweis CMV-spezifischer CD4-T-Zellen erzielte 1997 die Arbeitsgruppe von Louis Picker in Dallas . Ihnen war es gelungen, durch ex vivo-Stimulation von frisch isolierten peripheren mononukleären Zellen (PBMC) mit einem CMV-Lysat (aus infizierten Fibroblasten) und anschließender Detektion von intrazellulär angehäuften Zytokinen CMV-spezifische CD4-T-Zellen im peripheren Blut ‚sichtbar’ zu machen. Dank der Möglichkeiten der modernen Mehrparameter-Durchflußzytometrie gelang es, gleichzeitig den Phänotyp dieser Zellen zu untersuchen.

Diese Publikation war ein echter Meilenstein, letztlich auch für die Untersuchung des Phänotyps CD8-positiver antigenspezifischer T-Zellen. Denn, basierend auf dem gleichen technischen Prinzip gelang es uns 1998, mittels synthetischer Peptide als Stimulanzien CMV-spezifische CD8-T-Zellen in gleicher Weise sichtbar zu machen . Proteine kamen zur direkten CD8-T-Zell-Stimulation deshalb nicht in Frage, weil dazu die Präsentation von Peptiden auf MHC-I-Molekülen erforderlich war, die Phagozytose/Endozytose der zugegebenen Proteine aber im Wesentlichen nur zur Präsentation auf MHC-II-Molekülen führt .

Wir etablierten die neue Methode an einem Modell bestehend aus einem vom CMV-pp65-Protein abgeleiteten 15 Aminosäuren langen Peptid welches ein Epitop enthielt, das zytotoxische CD8-T-Zellen induzieren konnte und auf dem HLA-Molekül HLA-A2*0201 präsentiert wurde. Wir verwendeten ferner periphere mononukläre Zellen (PBMC) einer CMV-seropositiven Blutspenderin, die HLA-A*0201-positiv war. Das eigentliche minimale CD8-T-Zell-Epitop war bekannt und laut Mark Wills in Cambridge 10 AS lang . Da die meisten CD8-T-Zell-Epitope aber 9 AS Länge aufweisen , wurden 7 Peptide von jeweils 9 Aminosäuren Länge synthetisiert, welche mit jeweils 8 Aminosäuren Überlappung zwischen benachbarten Peptiden die gesamte


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Länge von 15 AS abdeckten . M. Wills hatte nicht versucht, das 10 AS lange Epitop weiter zu reduzieren.

Wir stimulierten die PBMC unserer Spenderin sowohl mit allen Peptiden auf einmal als auch mit den einzelnen Peptiden oder dem 15 AS langen Peptid allein. Es zeigte sich, daß die Mischung aus den 7 Peptiden zu einer deutlichen CD8-T-Zell-Stimulation führte, die in Analogie zu der von Waldrop beschriebenen Methode über den Nachweis von intrazellulärem Interferon-gamma erkennbar war. Dies fand sich aber bei nur genau einem der einzelnen Peptide wieder. Das 15 AS lange Peptid führte ebenfalls zur Stimulation. Dies wurde an weiteren geeigneten Probanden bestätigt.

Der gleiche Aufbau wurde für ein HLA-B7-präsentiertes Epitop aus dem gleichen Protein erfolgreich wiederholt. Damit war nicht nur gezeigt, daß diese Methode zur Untersuchung von CMV-spezifischen CD8-T-Zellen geeignet war, sondern darüber hinaus auch zur Identifikation von CD8-T-Zell-Epitopen.

Dieses Verfahren wurde in der nachfolgenden Zeit eingesetzt, um einerseits den Phänotyp und die Frequenz von CMV-spezifischen CD8-T-Zellen bei gesunden CMV-positiven Personen und bei verschiedenen Patientengruppen zu bestimmen , andererseits, um die Rolle eines weiteren CMV-Proteins, des IE-1 oder ‘Major Immediate Early’ Proteins für die T-Zell-Antwort zu analysieren und dabei neue Epitope zu kartieren .

Was den Phänotyp betraf, zeigte sich, daß tatsächlich ein Großteil der CMV-spezifischen auf die Stimulation mit Peptiden reagierenden CD8-T-Zellen einen CD57-positiven Phänotyp aufwies. Im Mittel (Median) waren 75% der IFN-gamma-positiven und 77% der TNF-alpha-positiven CMV-spezifischen CD8-T-Zellen CD57-positiv. Vergleichbare Verteilungen fanden sich bei Patienten nach Nierentransplantation . Damit hatte sich unsere Arbeitshypothese zumindest zum Teil bestätigt. Außerdem zeigte sich, daß sowohl CD45RO-positive CD8-T-Zellen (überwiegend CD45RA-negativ oder -schwach) als auch CD45RO-negative CD8-T-Zellen (überwiegend CD45RA-positiv) zu dieser Effektor-Zytokinsynthese beitrugen.

Die Frequenzen der CMV-spezifischen CD8-T-Zellen lagen, wie schon zuvor bemerkt überraschend hoch, zum Teil im Bereich von Prozenten, wurden aber in


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dieser Größenordnung noch vielfach bestätigt . Auch die von Waldrop et al. 1997 beschriebenen Frequenzen von CD4-positiven CMV-spezifischen T-Zellen lagen in dieser Größenordnung . Der Unterschied zu den CD8-T-Zellen war aber, daß zur Stimulation von CD4-T-Zellen virale Lysate eingesetzt worden waren, bei den CD8-T-Zellen dagegen einzelne Peptide aus einzelnen ausgewählten Proteinen. So war nicht ausgeschlossen, daß die Frequenzen gegen CMV als Ganzes bei den CD8-T-Zellen noch wesentlich höher liegen könnten.

Schließlich konnten die Frequenzen gegen CMV-gerichteter CD8-T-Zellen in ihrer Größenordnung auch mit der neu entwickelten ‘Tetramer‘-Technologie bestätigt werden. Dabei werden rekombinant hergestellte MHC-I-Moleküle mit Peptiden komplexiert und biotinyliert und anschließend an fluoreszenz-markierte Streptavidin-Moleküle gebunden. Da am Streptavidin 4 Bindungsstellen für Biotin existieren, entstehen tetramere Komplexe. Diese können dann mit ausreichender Avidität direkt an die T-Zellen mit der entsprechenden Spezifität binden und sie so mit einem Fluorochrom markieren. Die Auswertung erfolgt ebenfalls durchflußzytometrisch. Diese elegante Technik wurde erstmals 1996 von J. Altman beschrieben . Solche Tetramere stehen aber bis heute nur begrenzt zur Verfügung. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass antigenspezifische T-Zellen unabhängig von Ihrer Funktion angefärbt werden können, ein Nachteil, dass über ihre Funktion eben nichts ausgesagt wird. Ferner müssen bereits Epitope und die dazu gehörigen HLA-Moleküle bekannt sein, damit man entsprechende Tetramere herstellen kann. Das Tetramer für HLA-A*0201/NLVPMVATV (ein Peptid aus dem CMV-pp65-Protein) wurde uns dankenswerterweise von Immunotech/Marseille über Prof. Jan Gratama in Rotterdam zu Verfügung gestellt. Die damit gemessenen Frequenzen CMV-spezifischer CD8-T-Zellen entsprachen fast genau


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den Frequenzen, die wir über die CD8-T-Zellstimulation ermittelt hatten (eigene noch unveröffentlichte Daten).

Die T-Zellstimulation nach unserer Methodik mit Peptiden und die Anfärbung der spezifischen T-Zellen mit Tetrameren ergänzen sich indessen bestens. So kann zum Beispiel die Reaktivität peripherer T-Zellen einer bestimmten gegebenen Spezifität getestet werden, und man kann dabei genau zeigen, welcher Anteil dieser Zellen Zytokine produziert und welcher nicht. Appay und Mitarbeiter konnten dank der Kombination beider Methoden zeigen, daß die bei HIV-Patienten zirkulierenden HIV-spezifischen T-Zellen, obwohl sie zur Synthese proinflammatorischer Zytokine fähig waren, deutlich weniger Perforin enthielten als die CMV-spezifischen T-Zellen .

Unsere Entdeckung, dass das IE-1-Protein des humanen CMV eine erhebliche Rolle als T-Zell-Antigen spielte, war eigentlich nicht so überraschend . Zum einen waren Proteine aus der analogen IE-Region des murinen CMV-Genoms (MCMV) schon viel früher im Maus-System als Antigen beschrieben worden und zum anderen hatte bereits 1991 Nicholas Alp beschrieben, dass auch im humanen System das CMV-IE-1 Protein von T-Zellen erkannt wurde . Niemand hatte jedoch einen wirklich systematischen, dem Stand der Technik entsprechenden Versuch unternommen, im humanen CMV nach Epitopen im IE-1-Protein zu suchen. In unserer Arbeitsgruppe wurden mehrere neue Epitope definiert, darunter beispielsweise eines, welches im Zusammenhang mit HLA-B7 präsentiert wird, und ein weiteres, welches im Zusammenhang mit HLA-B8 und/oder HLA-A1 zur Präsentation kommt. Die entscheidende Entdeckung dabei war vielleicht, daß einige Personen eine starke T-Zellantwort gegen das IE-Protein haben, aber kaum eine Antwort gegen das pp65-Protein und umgekehrt. Die von Mark Wills postulierte Dominanz von pp65 für die zytotoxische T-Zellantwort war damit in Frage gestellt.


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Mon Sep 16 13:54:24 2002