Kettritz, Ralph: Untersuchungen zu zellulären Mechanismen bei ANCA-assoziierten nekrotisierenden Vaskulitiden Grundlagen der Aktivierung und der Apoptose neutrophiler Granulozyten

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Nosologie der nekrotisierenden systemischen Vaskulitiden

Adolf Kussmaul und Rudolf Maier berichteten im Jahre 1866 über einen Patienten mit einer systemischen nekrotisierenden Vaskulitis (Kussmaul und Maier, 1866). Der 27-jährige Carl Seufarth stellte sich in der Medizinischen Klinik zu Freiburg vor und klagte über akute Krankheitssymptome wie Fieber, Parästhesien, Myalgien bis hin zu Muskellähmungen sowie über ein rückläufiges Urinvolumen. Der Patient verstarb am Ende eines 4-wöchigen Krankenhausaufenthaltes. Bei der Autopsie fielen Gefäßnekrosen mit knötchenförmigen Verdickungen zahlreicher mittelgroßer Arterien auf. Kussmaul und Maier prägten deshalb für dieses Krankheitsbild den Begriff Periarteritis nodosa. In den nächsten Jahrzehnten wurden eine ganze Reihe von Patienten mit nekrotisierender Vaskulitis beschrieben.

Friedrich Wegener, ein Pathologe in Breslau, beschrieb 1936 vier Patienten, die neben der nekrotisierenden Vaskulitis granulomatöse Veränderungen aufwiesen (Wegener, 1939). Pearl Zeek berichtete zu Beginn der 50-er Jahre von Krankheitsformen, die durch einen Befall der kleinen Gefäße mit Einbeziehung der Lunge und eine Nierenbeteiligung mit nekrotisierender Glomerulonephritis auffielen (Zeek, 1952). Zeek nannte dieses Krankheitsbild "Hypersensitivitäts-Vaskulitis", da eine Reihe der Patienten im Rahmen der Prodromalsymptome Medikamente, häufig Sufonamide, eingenommen hatte. Wir wissen heute, daß dieser Zusammenhang nicht kausal war. Churg und Strauss beschrieben 1951 dreizehn Patienten mit nekrotisierender Vaskulitis, die gleichzeitig Asthma bronchiale, Eosinophilie, granulomatöse Entzündungen und eine nekrotisierende Glomerulonephritis aufwiesen, ein Krankheitsbild, das heute unter dem Namen Churg-Strauss-Syndrom bekannt ist (Churg und Strauss, 1951).

Es wurde offensichtlich, daß es sich - trotz vieler Gemeinsamkeiten - um eine heterogene Gruppe von Krankheiten handelte. Einen Meilenstein beim Versuch der Klassifizierung nekrotisierender Vaskulitiden stellte der Artikel von Godman und Churg aus dem Jahre 1954 dar (Godman und Churg, 1954). Es erfolgte die Abtrennung von vier Krankheitsbildern: die klassische Periarteritis nodosa, die mikroskopische Form der Periarteritis nodosa, die Wegener'sche Granulomatose und die allergische Angiitis mit Granulomatose, das Churg-Strauss-Syndrom. 1994 fand in Chapel Hill, N.C. eine Konsensuskonferenz statt, auf der die heute gültige Nomenklatur der inzwischen angewachsenen Gruppe systemischer Vaskulitiden festlegt wurde (Jennette, 1994). Der gemeinsame histologische Befund besteht in einer nekrotisierenden Vaskulitis. Ein wichtiges Klassifizierungskriterium ist die Größe des betroffenen Gefäßabschnitts (Abbildung 1).


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Abbildung 1: Betroffene Gefäßabschnitte bei systemischen Vaskulitiden. Es läßt sich eine deutliche Überlappung erkennen. Small-vessel-Vaskulitiden stellen eine Krankheitsgruppe dar, die immer auch Gefäße distal der Arteriolen befällt. Die mit einem Stern gekennzeichneten Erkrankungen sind durch das Auftreten von ANCA charakterisiert.

Trotz einer deutlichen Überlappung läßt sich eine Gruppe von Erkrankungen abtrennen, bei der stets Gefäße distal der Arteriolen betroffen sind. Diese Vaskulitiden der kleinen Gefäße werden als small-vessel-Vasculitis bezeichnet. Eine Untergruppe dieser small-vessel-Vaskulitiden zeichnet sich durch das Fehlen signifikanter Immunkomplexablagerungen aus. Hierbei handelt es sich um die Wegener'sche Granulomatose, die mikroskopische Polyangitis und das Churg-Strauss-Syndrom. Neue Impulse für das Verständnis zugrundeliegender Mechanismen dieser Krankheitsgruppe löste der Artikel von Davies und Mitarbeitern aus, die 1982 von 8 Patienten mit systemischer nekrotisierender Vaskulitis berichteten, die einen bisher nicht bekannten Auto-Antikörper gegen zytoplasmatische Bestandteile neutrophiler Granulozyten (ANCA) aufwiesen (Davies, 1982). Drei Jahre später wurde in einer holländisch-dänischen Studie festgestellt, daß diese ANCA einen diagnostischen und prognostischen Marker bei Patienten mit Wegener'scher Granulomatose darstellen (van der Woude, 1985). Inzwischen ist die Assoziation von ANCA mit 3 Krankheitsbildern, nämlich der Wegener'schen Granulomatose, der mikroskopischen Polyangitis und dem Churg-Strauss-Syndrom gesichert. Ergebnisse von in vitro- und in vivo-Untersuchungen der letzten Jahre haben zu einem pathophysiologischen Konzept geführt, in dem diese Auto-Antikörper eine zentrale Rolle spielen.


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1.2 Die Pathophysiologie ANCA-assoziierter systemischer Vaskulitiden

Das Kernstück in den pathophysiologischen Vorstellungen ANCA-assoziierter systemischer Vaskulitiden bildet die Interaktion zwischen ANCA, neutrophilen Granulozyten und dem Endothel (Abbildung 2). Es wird darüberhinaus spekuliert, daß zusätzlich andere Zellarten wie Monozyten und Lymphozyten, aber auch ein genetischer Hintergrund an der Krankheitsentstehung beteiligt sind (rev. in Kallenberg, 1994; Jennette und Falk, 1997; Nowack, 1998).

Abbildung 2: Schematische Darstellung zentraler pathophysiologischer Abläufe bei der Entstehung ANCA-assoziierter Vaskulitiden und Glomerulonephritiden. 1) Priming von PMN durch geringe Zytokinkonzentrationen im Rahmen von Infektionen 2) Aktivierung der geprimten PMN durch ANCA 3) Schädigung von Endothelzellen durch adhärierende ANCA- aktivierte PMN

1.2.1 Charakterisierung der ANCA

ANCA stellen eine Gruppe von Auto-Antikörpern mit verschiedenen Antigen-Spezifitäten dar. Zwei Haupt-Muster von ANCA in Ethanol-fixierten Neutrophilen können mittels indirekter Immunfluoreszenz unterschieden werden. C-ANCA zeigen ein diffuses zytoplasmatisches Färbemuster, während p-ANCA durch ein perinukleäres Muster gekennzeichnet sind. Eine 29-kDa-Serin-Protease, Proteinase 3 (PR3), wurde als Haupt-Zielantigen für c-ANCA beschrieben (Goldschmeding, 1989; Niles, 1989; Ludemann, 1990), wohingegen die überwiegende Mehrzahl von p-ANCA-Seren mit Myeloperoxidase reagiert (Falk und Jennette, 1988). Andere seltenere ANCA-Antigene umfassen neben weiteren Serin-Proteasen wie Elastase und Kathepsin G auch Laktoferrin, Lysosom, BPI (bactericidal permeability-increasing protein) und Azurozidin/CAP 37 (rev. in Kallenberg, 1994). Darüberhinaus wurden in jüngster Vergangenheit alpha-Enolase und Katalase als zwei weitere Ziel-Antigene von ANCA beschrieben (Moodie, 1993; Roozendaal, 1998). C-ANCA mit Spezifität gegen PR3 sind bei der Wegener'schen Granulomatose vorherrschend, während p-ANCA mit Spezifität gegen MPO bei der mikroskopischen Polyangitis, dem Churg-Strauss-Syndrom und bei der nekrotisierenden Glomerulonephritis mit Halbmondbildung dominieren.


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1.2.2 Die Interaktion von ANCA mit neutrophilen Granulozyten

Die ANCA-Zielantigene befinden sich innerhalb der Granula von Granulozyten und in den Lysosomen der Monozyten. Das bedeutet, daß eine Interaktion von ANCA mit ihren Ziel-Antigenen nur dann zustande kommt, wenn entweder die Antikörper in die Zellen gelangen oder die Antigene vom Zellinneren auf die Zelloberfläche transloziert werden. Tatsächlich wird eine solche Antigen-Translokation beobachtet, wenn neutrophile Granulozyten mit geringen Mengen von Zytokinen (z.B. TNFalpha oder IL-1) behandelt werden (Falk, 1990; Charles, 1991). Diese kleinen Mengen liegen unterhalb der Konzentrationen, die erforderlich sind, um eine voll ausgeprägte Aktivierung dieser Zellen zu bewirken; der Vorgang wird deshalb als Priming bezeichnet. Eine Antigen-Translokation während des Zytokin-Priming kann in vitro mittels Immun-Elektronenmikroskopie sowie mit der Durchflußzytometrie demonstriert werden. Virale und bakterielle Infektionen werden bei Patienten in der Prodromalphase der ANCA-Vaskulitiden beobachtet, und die Bedeutung von Staphylokokkus aureus für die Auslösung von Krankheitsrezidiven ist belegt (Stegeman, 1994). Solche Infekte werden als Vermittler eines entsprechenden in vivo-Priming angesehen. Verglichen mit Gesunden und mit Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen konnte in in vivo -Untersuchungen tatsächlich eine erhöhte Expression von PR3 und MPO bei Patienten mit aktiver Wegener'scher Granulomatose auf der Zelloberfläche neutrophiler Granulozyten beobachtet werden (Csernok, 1994; Muller Kobold, 1998). Ein völlig neuer Mechanismus der Translokation von PR3 und MPO wurde kürzlich beschrieben. Gilligan et al. zeigten, daß ANCA-Antigene von apoptotischen, nicht aber von nicht-apoptotischen Neutrophilen exprimiert werden und daß zirkulierende ANCA mit diesen Antigenen interagieren (Gilligan, 1996). Diese Daten implizieren einen alternativen Weg, bei dem Apoptose das "klassische" Zytokin-induzierte Priming ersetzen kann.

ANCA, die über ihre Ziel-Antigene an Zytokin-geprimte neutrophile Granulozyten binden, können deren Aktivierung auslösen. In der Arbeitsgruppe von Falk und Jennette wurde 1990 erstmals gezeigt, daß Seren und Immunglobulin-Präparationen von ANCA-Patienten, nicht aber von Kontrollpersonen die Produktion von Sauerstoffradikalen in geprimten Neutrophilen initiieren (Falk, 1990). Dieser Befund wurde von einer Reihe anderer Arbeitsgruppen bestätigt (Keogan, 1992; Mulder, 1994; Porges, 1994). Neben der Fähigkeit von ANCA, die Generation von Sauerstoffradikalen zu stimulieren, sind ANCA auch in der Lage, eine Degranulation der Granulozyten mit einer Freisetzung von Enzymen zu bewirken. Dieser Effekt wurde am Beispiel von ß-Glukoronidase und N-Acetyl-ß-Glukosaminodase gezeigt (Falk, 1990). Eine weitere biologische Wirkung der ANCA besteht in der Hochregulation von Adhäsionsmolekülen auf neutrophilen Granulozyten und in der Promotion ihrer Adhäsion am Endothel (Keogan, 1993; Mayet und Meyer zum Büschenfelde, 1993; Haller, 1996; Johnson, 1997).


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1.2.3 Die Interaktion von ANCA-aktivierten neutrophilen Granulozyten mit Endothelzellen

In einem nächsten Schritt können ANCA-aktivierte neutrophile Granulozyten, die am Endothel adhärieren, zur Schädigung von Endothelzellen führen. Die schweren vaskulären Läsionen bei ANCA-Vaskulitiden sind durch infiltrierende neutrophile Granulozyten und Monozyten sowie durch fibrinoide Gefäßwandnekrosen gekennzeichnet (Donald, 1976; Jennette, 1991).

Bei einer physiologischen Antwort auf lokale Entzündungsreize kommt es durch proinflammatorische und chemotaktische Zytokine zum Priming von neutrophilen Granulozyten und Monozyten. Hieraus resultieren die Hochregulation von Adhäsionsmolekülen auf der Zelloberfläche und eine Adhäsion am Endothel. In der Abwesenheit von ANCA folgen die Neutrophilen dem chemotaktischen Konzentrationsgradienten, transmigrieren durch das Endothel und erreichen ihre volle Aktivierung erst am Ort der höchsten Konzentration des inflammatorischen Stimulus. Die nachfolgende Generation reaktiver Sauerstoffradikale und die Ausschüttung toxischer Substanzen finden dabei so weit von den Gefäßen entfernt statt, daß keine vaskuläre Schädigung entsteht. Im Gegensatz dazu wird unter Berücksichtigung der bisher diskutierten Daten folgendes in vivo-Szenario für ANCA-Vaskulitiden angenommen: Das initiale Priming durch proinflammatorische Zytokine führt zu einer Expression der ANCA-Ziel-Antigene auf der Oberfläche der neutrophilen Granulozyten. Im Blutstrom zirkulierende ANCA können nun binden und die neutrophilen Granulozyten bereits während ihrer Transmigration durch die Gefäßwand aktivieren, bevor sie das eigentliche Zentrum der Entzündung erreicht haben. Vorzeitig aktivierte, hochtoxische Granulozyten zerstören auf ihrem Weg durch das Gefäß das Endothel und lösen die Entstehung fibrinoider Gefäßwandnekrosen aus. Diese Hypothese wird durch verschiedene in vitro-Beobachtungen gestützt. Die Stimulation mit ANCA bewirkt eine Zunahme der Adhärenz von neutrophilen Granulozyten an Endothelzellen mit einer nachfolgenden Lyse dieser Endothelzellen (Mayet, 1993; Keogan, 1993; Ewert, 1992). Es zeigt sich, daß die von aktivierten Granulozyten abgegebenen Proteasen wie Proteinase 3 und Elastase diese Zytolyse vermitteln können (Ballieux, 1994) und daß Apoptose dabei ein wichtiger Mechanismus ist (Yang, 1996; Taekema Roelvink, 1998).

Um die inflammatorische Reaktion zu beenden, müssen die aktivierten neutrophilen Granulozyten eliminiert werden. Die Apoptose der Granulozyten und ihre nachfolgende Phagozytose sind hierfür entscheidende Mechanismen (Grigg, 1991; Hughes, 1997; Haslett, 1994). Dabei kommt der Balance zwischen der Apoptoserate und der Elimination apoptotischer Zellen eine wichtige Bedeutung zu. Tatsächlich wurden apoptotische neutrophile Granulozyten in den perivaskulären Infiltrationen bei der Vaskulitis nachgewiesen (Savill, 1997).

Aus dem bisher Aufgeführten wird deutlich, daß die ANCA-induzierte Aktivierung, wie in Abbildung 2 dargestellt, durch die transendotheliale Migration der Neutrophilen, deren Kontakt mit extrazellulären Matrixmolekülen und den Prozeß der Apoptose ergänzt werden muß. Ein solches Schema wird in Abbildung 3 dargestellt und als Hypothese der zellulären Mechanismen bei ANCA-Vaskulitiden vorgeschlagen.


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Abbildung 3: Schematische Darstellung pathophysiologischer Abläufe bei der Entstehung ANCA-assoziierter Vaskulitiden und Glomerulonephritiden.1) Priming von PMN durch geringe Zytokinkonzentrationen im Rahmen von Infektionen 2) Aktivierung der geprimten PMN durch ANCA 3) Schädigung von Endothelzellen durch adhärierende ANCA-aktivierte PMN 4) Transmigration der PMN durch die endotheliale Barrierre mit vielfältigen Interaktionen zwischen PMN und ECM 5) Apoptose der aktivierten PMN unter dem Einfluß von Zytokinen und ECM 6) Phagozytose apoptotischer PMN

1.3 Fragestellungen der Arbeit

Innerhalb des vorgeschlagenen Schemas (Abbildung 3) zu pathophysiologischen Abläufen bei ANCA-assoziierten systemischen Vaskulitiden wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Fragen untersucht. Dabei wurden zwei Aspekte, nämlich die Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA und die Regulation der Apoptose dieser Zellen herausgegriffen und zum Gegenstand detaillierter Untersuchungen gemacht. Während die Aktivierung eine wichtige Rolle bei der Initiierung der Krankheit spielt, ist die Regulation der Apoptose für die Auflösung der inflammatorischen Antwort von besonderer Bedeutung.

Mechanismen der Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA

Die Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA besitzt eine zentrale Bedeutung für ANCA-assoziierte Vaskulitiden. Es bestehen allerdings kontroverse Auffassungen darüber, welcher Teil des ANCA-Moleküls und somit welcher Mechanismus die Aktivierung initiiert. Zu dieser Problematik wurden intakte Immunglobuline von Patienten mit PR3-ANCA oder mit MPO-ANCA sowie die korrespondierenden F(ab')2- und Fab-Fragmente präpariert. Die Bindungseigenschaften dieser Moleküle und ihre Fähigkeit, eine Generation von Superoxid auszulösen, wurden getestet.


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Im weiteren wurden die Rolle der Quervernetzung der ANCA-Ziel-Antigene bei der Aktivierung und die Bedeutung des Fcgamma-Rezeptors bei der ANCA-vermittelten Aktivierung untersucht.

Bedeutung und Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten bei ANCA-assoziierten Vaskulitiden

Die Apoptose von Entzündungszellen stellt einen zentralen Mechanismus für die Kontrolle lokaler inflammatorischer Prozesse dar. Dabei kommt der Balance zwischen Apoptoserate und Elimination apoptotischer Zellen eine kritische Bedeutung zu. Neutrophile Granulozyten dominieren das frühe perivaskulitische Infiltrat bei ANCA-assoziierten Vaskulitiden (Donald, 1976; Jennette, 1991), und apoptotische neutrophile Granulozyten wurden in diesen Zellinfiltraten nachgewiesen (Savill, 1997). Gilligan et al. zeigten kürzlich, daß während einer frühen Phase der Apoptose neutrophiler Granulozyten die Translokation von ANCA-Zielantigenen auf die Zelloberfläche erfolgt und daß ANCA ihre Zielantigene auf diesen frühapoptotischen Zellen erkennen und binden (Gilligan, 1996). Somit kann die Apoptose das für die Erkennung und Bindung der ANCA-Antigene notwendige Priming durch Zytokine ersetzen. Die daraus resultierende Interaktion von ANCA mit neutrophilen Granulozyten kann dann zu deren Aktivierung führen. Die Fähigkeit, reaktive Sauerstoff-Radikale zu produzieren, nimmt erst im Verlaufe der Apoptose ab und bleibt für Rezeptor-unabhängige Stimuli sogar bis in späte Phasen erhalten (Whyte, 1993). Der Apoptose kommt unter diesen Umständen somit nicht nur für die Auflösung, sondern auch für die Auslösung der Entzündungsreaktion eine kritische Bedeutung zu.

Die Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten ist bisher unzureichend verstanden. Es wurden zunächst Experimente durchgeführt, die den Effekt von Zytokinen, die bei ANCA-Vaskulitiden eine wichtige Rolle spielen, auf die Neutrophilen-Apoptose untersuchten. Weitere Experimente charakterisierten die Bedeutung der Superoxid-Generation in diesem Prozeß.

Um intrazelluläre Mechanismen der Apoptose zu analysieren, wurden mit Hilfe magnetischer Zellseparationstechniken, der hochauflösenden zweidimensionalen Gelelektrophorese und der Proteinsequenzierung, Untersuchungen zur differentiellen Expression von intrazellulären Proteinen durchgeführt.

Die Adhäsion von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten an das Endothel und die nachfolgende Migration in das umliegende Gewebe sind zentrale Gesichtspunkte der lokalen Entzündung und spielen in der Pathogenese von Vaskulitiden eine wichtige Rolle. Hierbei entsteht eine Interaktion mit extrazellulären Matrixproteinen in der Anwesenheit proinflammatorischer Zytokine. In der vorgelegten Arbeit wurde deshalb der Effekt von extrazellulärer Matrix auf die spontane und die TNFalpha-vermittelte Neutrophilen-Apoptose untersucht. In den darauf folgenden Experimenten wurden die Signaltransduktion der Fibronektin-vermittelten Akzeleration der TNFalpha-induzierten Apoptose charakterisiert und Substrate von regulatorischen Tyrosinkinasen analysiert.


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Thu Apr 19 14:16:02 2001