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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Mechanismen der Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA

Humane ANCA und monoklonale Antikörper gegen menschliche PR3 bzw. MPO können TNF-geprimte neutrophile Granulozyten aktivieren. Diese aktivierten Granulozyten generieren toxische Sauerstoffradikale. Um zugrundeliegende Mechanismen, die für die Auslösung dieser Aktivierung essentiell sind, zu untersuchen, wurden intakte Antikörper und deren korrespondierende F(ab')₂- und Fab-Fragmente präpariert. Diese Präparationen wurden in Bindungsstudien und Aktivierungsassays getestet, wobei ANCA-IgG von jeweils zwei Patienten mit PR3-ANCA bzw. MPO-ANCA und ein monoklonaler Antikörper gegen menschliche PR3 verwendet wurde. In zusätzlichen Untersuchungen wurde die Rolle des FcIIa-Rezeptors charakterisiert.

3.1.1 Bindungsverhalten von ANCA und den korrespondierenden F(ab')₂- und Fab-Fragmenten

ANCA müssen, um neutrophile Granulozyten aktivieren zu können, an deren Zelloberfläche binden. Deshalb wurden zunächst die Bindungseigenschaften von intakten humanen ANCA und deren Fragmenten mittels Durchflußzytometrie untersucht (Abbildung 4, Panel A). Dazu wurden die Antikörper mit Biotin markiert und mit FITC-konjugiertem Avidin gefärbt. In 3 unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, daß intakte humane ANCA und deren F(ab')₂- und Fab-Fragmente an der Oberfläche von TNF-geprimten neutrophilen Granulozyten binden. Die Ergebnisse der Untersuchungen mit F(ab')₂- und Fab-Fragmenten demonstrieren, daß die Entfernung des Fc-Teiles zu einer verminderten Bindung führte. Im Vergleich der Bindungsintensitäten von F(ab')₂- und Fab-Fragmenten ließen sich keine Unterschiede erkennen. Im Gegensatz dazu zeigte sich, daß intaktes IgG von gesunden Kontroll-Personen, nicht aber die korrespondierenden F(ab')₂- und Fab-Fragmente an den Zellen binden. Daraus läßt sich schlußfolgern, daß normales IgG via Fc-Fragment an TNF-behandelten neutrophilen Granulozyten bindet, während ANCA darüberhinaus über die Antigen-bindenden Domänen der Fab-Teile binden.

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Abbildung 4: Mittels Durchflußzytometrie wurden die Bindungseigenschaften von biotinylierten humanen PR3-ANCA, PR3 F(ab')₂- und Fab-Fragmenten mit denen von entsprechenden Kontroll-Präparationen verglichen (Panel A). Das Bindungsverhalten des intakten monoklonalen Antikörpers gegen menschliche PR3 und seines korrespondierenden F(ab')₂-Fragmentes sowie der monoklonalen Kontroll-Präparationen ist in Panel B gezeigt.

Anders stellte sich die Situation bei der Verwendung des monoklonalen Antikörpers gegen menschliche PR3 dar. Während eine Bindung des intakten Antikörpers und des F(ab')₂-Fragmentes beobachtet wurde, zeigte der monoklonale Kontroll-Antikörper keine Bindung. Die Untersuchungen wurden ebenfalls mit der Durchflußzytometrie durchgeführt, wobei ein sekundärer FITC-markierter Antikörper verwendet wurde (Abbildung 4, Panel B).

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3.1.2 Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA und die korrespondierenden F(ab')₂- und Fab-Fragmente

Nachdem das Bindungsverhalten der Antikörper und der Antikörper-Fragmente charakterisiert war, erfolgten Messungen zur Aktivierung neutrophiler Granulozyten. Aufgereinigte Immunglobuline der Patienten K.M. und R.R. mit PR3-ANCA und der Patienten A.A. und T.R. mit MPO-ANCA sowie die korrespondierenden F(ab')₂- und Fab-Fragmente wurden verwendet, um die Superoxid-Produktion in Neutrophilen von gesunden Spendern zu stimulieren. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Superoxidgeneration der Zellen in Anwesenheit (3,4 ± 1,83 nmol O₂^-/2,5x10⁶PMN/45 min; n=34) und Abwesenheit (2,3 ± 1,10 nmol O₂^-/2,5x10⁶PMN/45 min; n=34) der Priming-Dosis von 1,3 ng/ml TNF wurde in jedem Experiment gemessen, als 0-Wert gesetzt und von den Resultaten der ANCA-Stimulation abgezogen.

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Tabelle 1: Superoxid-Produktion in TNF-behandelten neutrophilen Granulozyten nach Stimulation mit humanen ANCA, Maus-Antikörpern gegen humane PR3 und den jeweiligen korrespondierenden Antikörperfragmenten.

Stimulus	Intaktes Ig	Fab2 Fragment	Fab Fragment
PR3-ANCA (K.M.)	15,3 ± 7,39 (n=21) (p<0,01)1	10,2 ± 4,34 (n=9) (p<0,01)2	-1,4 ± 2,47 (n=4) (p<0,05)3
PR3-ANCA (R.R.)	8,4 ± 4,87 (n=6) (p<0,01)1	36,9 (n=1)	-0,6 ± 0,49 (n=5)
MPO-ANCA (A.A.)	10,2 ± 6,70 (n=9) (p<0,01)1	30,7 ± 7,04 (n=3) (p<0,05)2	-1,8 ± 3,67 (n=5) (p<0,05)3
MPO-ANCA (T.R.)	2,6 ± 3,57 (n=9) (n.s.)1	25,9 ± 4,04 (n=4) (p<0,01)2	-2,7 ± 1,54 (n=5) (p<0,05)3
Humane Kontrolle	1,0 ± 1,62 (n=9)	-0,7 ± 1,79 (n=7)	n.d.
Maus-PR3-ANCA	25,7 ± 8,55 (n=11) (p<0,01)1	-0,01 ± 1,31 (n=6)	n.d.
Kontroll IgG1	0,97 ± 0,59 (n=4)	n.d.	n.d.

125 µg/ml humane Antikörper, 4 µg/ml muriner anti-PR3 Antikörper und dieselbe Menge von korrespondierenden Antikörperfragmenten wurden getestet. Die O₂^--Abgabe (nmol O₂^-/2,5 x 10⁶ PMN/30 min) wurde verglichen zwischen: 1intakten ANCA und Kontroll-Antikörpern; 2ANCA-Fab₂ and Kontroll-Fab₂; 3ANCA-Fab₂ und ANCA-Fab; n.d.=not done.

Die in Tabelle 1 aufgeführten Resultate zeigen, daß intakte ANCA-Immunglobuline der verschiedenen Patienten eine unterschiedlich starke Aktivierung auslösten. Die durch die ANCA-Stimulation abgegebenen Mengen an Superoxid reichten von 2.6±3.59 nmol O₂^-/2.5x10⁶PMN/30 min (Patient T.R., n=9) bis zu 15,3±7.39 nmol (Patient K.M., n=21). Zur Kontrolle erfolgte die Inkubation mit Immunglobulinen gesunder Spender (1,0± 1,62 nmol O₂^-, n=9) oder mit 50 ng/ml PMA (44,8±2,53 nmol O₂^-,n=16).

Die Ergebnisse zeigen weiterhin, daß auch ANCA-F(ab')₂ eine signifikante O₂^--Produktion initiierten, wohingegen F(ab')₂-Präparationen von gesunden Kontrollen keine O₂^--Generation bewirkten (1,0±1,62 nmol O₂^-/2.5x10⁶PMN/30 min). Interessanterweise konnte beobachtet werden, daß bei drei von vier Patienten die ANCA-F(ab')₂ stärkere Stimuli waren als die intakten ANCA-Ig. Zum Beispiel fand sich bei dem Patienten T.R., dessen intakte ANCA die geringsten O₂^--Abgaben auslösten (2,6±3,57 nmol O₂^-), eine starke Superoxid-Freisetzung, wenn die F(ab')₂-Fragmente getestet wurden (25,9±4,04 nmol O₂^-). Es wurde eine Dosis-Wirkungsbeziehung mit intakten PR3-

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Abbildung 5: TNF-geprimte neutrophile Granulozyten wurden mit 5, 50, 125, und 250 µg/ml intakte PR3-ANCA und 0,5, 1, 5, 10, 15, 25, 50 und 125 µg/ml des korrespondierenden F(ab')₂-Fragmentes stimuliert. Die Superoxid-Produktion zeigt eine Dosis-Wirkungs-Beziehung.

Im Gegensatz zu intakten ANCA und zu ANCA-F(ab')₂-Fragmenten fand sich keine Aktivierung der neutrophilen Granulozyten, wenn ANCA-Fab eingesetzt wurden. Dieser Befund ließ sich für die Fab-Präparationen von allen vier Patienten erheben. Da die Stärke der Antwort auf die Antikörper-Stimuli zwischen verschiedenen Spender-Zellen variierte, wurden Experimente durchgeführt, bei denen intakte ANCA, F(ab')₂- und Fab-Fragmente simultan an derselben Zell-Präparation getestet wurden (Abbildung 6). Diese Experimente lassen unmittelbare Vergleiche zu und bestätigen, daß die abgegebenen O₂^--Mengen nach Stimulation mit ANCA-F(ab')₂-Fragmenten häufig höher war als mit intakten ANCA, während in keinem der Experimente eine Aktivierung durch ANCA-Fab zu beobachten war.

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Abbildung 6: Der Effekt von intakten ANCA, F(ab')₂- und Fab-Fragmenten auf die Superoxidgeneration wurde parallel an TNF-geprimten neutrophilen Granulozyten derselben Präparation getestet. Die Zellen wurden mit 125 µg/ml intakten ANCA oder den korrespondierenden Antikörper-Fragmenten stimuliert (Panel A-C).

Die bisherigen Ergebnisse demonstrieren, daß Fab-Fragmente ihre Ziel-Ag auf der Oberfläche der geprimten Zellen binden, ohne jedoch die Generation von Superoxid auszulösen. Es wurden daraufhin Untersuchungen durchgeführt, in denen die Fab-Fragmente nach ihrer Bindung an der Zelloberfläche mit zwei verschiedenen Methoden quervernetzt wurden (Abbildung 7). Zur Quervernetzung wurden entweder F(ab')₂-Fragmente eines Ziegen-Antikörpers, der gegen menschliche Immunglobuline gerichtet war, verwendet oder eine Biotinylierung der Fab-Fragmente mit nachfolgender Benutzung von Avidin. Wenn die Fab-Fragmente quervernetzt wurden, kam es in 18 der 19 Experimente zu einem Anstieg von generiertem Superoxid mit einer statistischen Signifikanz bei 3 der 4 Patienten.

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Abbildung 7: Dargestellt ist die Generation von Superoxid durch TNF-geprimte neutrophile Granulozyten, die mit 125 µg/ml humanen ANCA-Fab-Fragmenten ohne oder mit nachfolgender Gabe von quervernetzenden F(ab')₂-Fragmenten eines Ziegen-Antikörpers gegen menschliche IgG-F(ab')₂ stimuliert wurden.

Bei eine Reihe von veröffentlichten Aktivierungsstudien wurden monoklonale Antikörper gegen menschliches PR3 oder MPO als Ersatz für humane ANCA verwendet. Es wurde überprüft, ob sich die Ergebnisse aus den dargestellten Untersuchungen mit humanen ANCA auf den Maus-Antikörper übertragen lassen, oder ob hinsichtlich der Aktivierung neutrophiler Granulozyten Unterschiede zwischen den polyklonalen humanen ANCA und den monoklonalen Maus-Antikörpern bestehen. Bei Verwendung eines intakten monoklonalen Antikörpers gegen humane PR3 konnte eine Dosis-Wirkungsbeziehung für die Aktivierung neutrophiler Granulozyten nachgewiesen werden. 2 µg/ml dieses Antikörpers führten zur Generation von 18,18±8,1 nmol O₂^-/2,5x10⁶PMN/30 min, während dieser Wert für 4 µg/ml 22,08±3,4 und für 15 µg/ml 28,56±5,2 betrug.

Es erfolgten die Präparation der korrespondierenden F(ab')₂-Fragmente sowie eine simultane Testung beider Moleküle im Superoxid-Assay an Zellen desselben Spenders (Abbildung 8). Im Gegensatz zum intakten monoklonalen Antikörper gegen humane PR3 bewirkte das F(ab')₂-Fragment bei keiner der verwendeten Konzentrationen eine signifikante Superoxidgeneration.

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Abbildung 8: Der Effekt von intaktem monoklonalen Antikörper gegen menschliche Proteinase 3 (schwarze Säulen) und dem korrespondierenden F(ab')₂-Fragment (offene Säulen) auf die Superoxidproduktion TNF-geprimter neutrophiler Granulozyten. Es besteht eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für den intakten monoklonalen Antikörper, während die F(ab')₂-Fragmente bei keiner der eingesetzten Konzentrationen eine Aktivierung auslösten (n=5).

Die durchflußzytometrischen Studien hatten gezeigt, daß F(ab')₂-Fragmente des monoklonalen Antikörpers gegen humanes PR3 an TNF-geprimte neutrophile Granulozyten binden. Das Ausmaß dieser Bindung war mit dem des intakten monoklonalen Antikörpers vergleichbar. Es wurde deshalb geprüft, ob eine Quervernetzung der gebundenen F(ab')₂-Fragmente zu einer Induktion der Superoxid-Produktion führt. Dazu wurden F(ab')₂-Fragmente eines Ziegen-Antikörpers verwendet, die gegen das F(ab')₂-Fragment von Maus-Antikörpern gerichtet sind. Diese Quervernetzung führte nicht zu einem Anstieg der Superoxidproduktion (Abbildung 9). Die abgegebenen Mengen an O₂^- betrugen -0,1±1,27 nmol/2,5x10⁶PMN/30 min, wenn F(ab')₂-Fragmente des monoklonalen Antikörpers gegen humane PR3 allein verwendet wurden und 0,2±0,96 nmol, wenn diese Fragmente quervernetzt wurden.

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Abbildung 9: Die Quervernetzung von F(ab')₂-Fragmenten eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen humane PR3 auf der Oberfläche neutrophiler Granulozyten führt nicht zur Generation von Superoxid.

3.1.3 Rolle des FcIIa-Rezeptors bei der Aktivierung

Humane ANCA-Immunglobuline und monoklonale Antikörper gegen humane Proteinase 3 können mit den Fc-Rezeptoren, die von neutrophilen Granulozyten exprimiert werden, interagieren. Auf diesen Zellen werden sowohl der FcIIa-(CD32) als auch der FcIII-Rezeptor (CD16) konstitutionell exprimiert. In der Literatur fanden sich Hinweise für eine Bedeutung des FcIIa-Rezeptors bei der ANCA-vermittelten Aktivierung neutrophiler Granulozyten. In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt einer Blockade dieser Rezeptoren auf die Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch humane ANCA sowie durch den monoklonalen Maus-Antikörper gegen menschliche Proteinase 3 untersucht. Dazu wurden die Zellen während des TNF-Primings mit einem blockierenden monoklonalen Antikörper gegen den FcIIa-Rezeptor vorinkubiert und nachfolgend mit ANCA aktiviert. Zunächst wurde der Effekt des blockierenden Antikörpers auf die Superoxid-Produktion bestimmt. Die Inkubation TNF-geprimter Granulozyten mit dem kompletten anti-Rezeptor-Antikörper bewirkte eine O₂^--Generation von 3,5±0,75 nmol/2.5x10⁶PMN/30 min und von 2,6±0,87 nmol, wenn ein Fab-Fragment dieses Antikörpers verwendet wurde. Die Unterschiede waren statistisch nicht signifikant, und für die weiteren Versuche wurde ein intakter anti-FcIIa-Rezeptor-Antikörper eingesetzt. Ein Zeitverlauf der ANCA-vermittelten Superoxid-Generation mit und ohne Blockade des FcIIa-Rezeptors (n=2) wurde erstellt. Beide Experimente demonstrierten einen inhibitorischen Effekt der Rezeptor-Blockade auf die Aktivierung. Diese Wirkung war bereits nach 5 min nachweisbar und ließ sich über den gesamten Untersuchungszeitraum beobachten (Abbildung 10).

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Abbildung 10: Die Blockade des FcIIa-Rezeptors mit dem Antikörper IV.3 hemmt die Freisetzung von Superoxid in TNF-geprimten neutrophilen Granulozyten, die mit 125 µg/ml PR3-ANCA (Pat K.M.) stimuliert wurden. Die Superoxid-Generation ohne (offene Symbole) und mit FcIIa-Rezeptor-Blockade (geschlossene Symbole) wurde nach 5, 15, 30 und 60 min. bestimmt.

Basierend auf diesem Zeitverlauf wurde für die nachfolgenden Experimente der 30 min-Zeitpunkt ausgewählt. Die Rolle einer Blockade des FcIIa-Rezeptors bei der Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch entweder humane ANCA (PR3-ANCA, Pat. K.M., n=7) oder durch den monoklonalen Maus-Antikörper gegen menschliche Proteinase 3 (n=5) wurde bestimmt. Die Generation von Superoxid wurde durch die Blockade des FcIIa-Rezeptors in jedem einzelnen der Experimente vermindert (Abbildung 11). Die Hemmung betrug bei der Stimulation mit humanen ANCA 33% (13,1±4,27 nmol/2.5x10⁶PMN/30 min versus 8,6±2,79 nmol, p<0,05) und bei der Aktivierung mit dem monoklonalen anti-PR3-Antikörper 25% (23,5±11,03 nmol versus 17,64±10,81 nmol, n.s.).

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Abbildung 11: Die Blockade des FcIIa-Rezeptors bewirkte eine Inhibition der Superoxid-Freisetzung in TNF-geprimten neutrophilen Granulozyten, die entweder mit humanen ANCA oder mit monoklonalem Antikörper gegen menschliche Proteinase 3 stimuliert wurden. Superoxid wurden in der Abwesenheit (offene Symbole) oder in der Anwesenheit (geschlossene Symbole) eines FcIIa-Rezeptor-blockierenden Antikörpers gemessen.

Abbildung 32: Zweidimensionale hochauflösende Gelelektrophoresen von humanen neutrophilen Granulozyten. Dargestellt sind die Proteinexpressionsmuster von frisch isolierten Zellen (links), 24 h kultivierten nicht-apoptotischen (Mitte) und apoptotischen Zellen (rechts). Die Entwicklung der Gele erfolgte durch Silberfärbung. Die Proteine, die sequenziert wurden, sind im mittleren Gel mit den Zahlen 1-5 numeriert.

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Abbildung 33: Schematischer Ablauf der Proteinsequenzierung

Mit Hilfe dieser Vorgehensweise konnten 5 Proteine durch die Anwendung verschiedener Sequenzierungsmethoden identifiziert werden (Tabelle 2). Es handelt sich mit Aktin um ein Protein mit Bedeutung für Zytoskelett-Funktionen. Die beiden Proteine MRP-8 und MRP-14 (migration inhibition factor-related protein) sind zwei Calcium-bindende Proteine der S-100-Familie. Desweiteren wurden mit alpha-Enolase und Katalase zwei Enzyme mit metabolischer Wirkung identifiziert.

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Tabelle 2: Ergebnisse der Sequenzierung der Proteine 1-5. Es handelt sich um Kandidaten-Proteine mit regulatorischer Funktion für das Überleben neutrophiler Granulozyten.

Spot Nr.:	Protein	identifiziert durch:	MALDI-MS (peptid mass finger-printing)	Sequenz in der Edman-Degradation bzw. Tandem-MS (Aminosäure-Position)
1	Aktin	MALDI -MS	977.8, 1133.3, 1200.2, 1501.2, 1517.7, 1517.7, 1792.9, 1955.8, 2233.4, 2749.1, 3202.7
2	S108; MRP 8; Calgranulin A	MALDI-MS, Edman-Degradation	822.4, 963.2, 1272.7, 1435.8	ALNSIIDVDVYHK (8 to 18)
3	S 109; MRP14; CalgranulinB	MALD I-MS, Edman-Degradation	779.7, 877.7, 1004.8, 1455.1, 1444.7, 1758.8, 1807.1	KDLQNFLK (43 - 50)
4	Humane alpha-Enolase	MALDI-MS, Tandem-MS	1143.6, 1425.7, 1542.8, 1557.8, 1805.9, 1941.2, 1960.5, 2034.0, 2512.1, 3014.0	LFPDFFTR (228 - 235)
5	Humane Katalase	MALDI-MS	968.5, 1119.9, 1295.1, 1482.7, 1529.7, 1710.7, 1828.2, 2185.6, 2206.4, 2519.7

3.1.4 Regulation der Apoptose durch extrazelluläre Matrix-Proteine

Lokale Entzündungen sind durch eine frühzeitige Akkumulation neutrophiler Granulozyten gekennzeichnet. Neutrophile Granulozyten dominieren das initiale perivaskulitische Zellinfiltrat bei Patienten mit ANCA-assoziierten Vaskulitiden. Um den Ort des Entzündungsgeschehens zu erreichen, müssen sie aus dem Blutstrom durch die Gefäßwand in das betroffene Gewebe transmigrieren. Auf diesem Weg erfolgen vielfältige Kontakte mit Endothelzellen und extrazellulären Matrixsubstanzen. In der vorgelegten Arbeit wird die Hypothese untersucht, daß die Interaktion von neutrophilen Granulozyten mit extrazellulären Matrixproteinen das Apoptoseverhalten dieser Zellen modifiziert.

3.1.4.1 Effekt von extrazellulären Matrixproteinen auf die spontane und auf die TNF-vermittelte Apoptose

Neutrophile Granulozyten wurden aus dem Blut gesunder Spender isoliert und unter nicht-adhärenten sowie unter adhärenten Bedingungen kultiviert. Vorgenommen wurden eine Beschichtung der Kulturplatten mit PolyHema, um die Adhärenz zu verhindern, und mit Fibronektin, um eine Interaktion der Zellen mit extrazellulärer Matrixsubstanz zu erlauben. Die Kultur erfolgte für maximal 28 Stunden. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet, und die Apoptose-Rate wurde mittels Durchflußzytometrie quantifiziert (n=5). Aus Abbildung 34 ist zu ersehen, daß während des gesamten Untersuchungszeitraumes keine signifikanten Unterschiede im spontanen Apoptose-Verhalten zu erkennen waren (Prozentsatz apoptotischer Zellen auf Fibronektin versus PolyHema nach 8 h: 1%±0,5 gegen 0,6%±0,2; nach12

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Abbildung 34: Der Effekt von Fibronektin und PolyHema auf die spontane Apoptose-Rate von neutrophilen Granulozyten. Die Zellen wurden entweder auf PolyHema (unterbrochene Linie) oder auf Fibronektin (durchgezogenene Linie) kultiviert und zu den angegebenen Zeitpunkten analysiert. Die Zellen wurden mit Ethanol permeabilisiert und mit Propidium-Jodid gefärbt. Apoptose wurde mittels Durchflußzytometrie gemessen. Die Daten sind als Mittelwerte±SD dargestellt.

Lokale Entzündungsreaktionen finden in einem Milieu statt, das durch die Anwesenheit von proinflammatorischen Zytokinen wie TNF gekennzeichnet ist. Untersucht wurde der Effekt von extrazellulärer Matrix auf die Apoptose-Rate TNF-stimulierter neutrophiler Granulozyten. Die Zellen wurden entweder auf PolyHema oder auf Fibronektin kultiviert und mit 20 ng/ml TNF stimuliert (n=3). Es war eine deutliche zeitabhängige Beschleunigung der Apoptose zu beobachten, wenn die Zellen auf Fibronektin inkubiert wurden (Abbildung 35). Nach einer Stunde war der Anteil apoptotischer Zellen <1% auf beiden Oberflächen, Fibronektin und PolyHema. Nach 2 Stunden lagen diese Werte bei 9±1% versus 5±1% (p<0,05). Nach 4 Stunden war die Differenz 19±2% gegen 9±1%, (p<0,05). Nach 8 Stunden fanden sich 28±2% apoptotische PMN auf Fibronektin, verglichen mit 11±2% auf PolyHema (p<0,001), und nach 12 Stunden lagen diese Werte bei 25±2% versus 9±1%, (p<0,001).

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Abbildung 35: Der Effekt von Fibronektin und PolyHema auf die Apoptose-Rate von TNF-stimulierten neutrophilen Granulozyten. TNF-stimulierte Zellen wurden entweder auf PolyHema (unterbrochene Linie) oder auf Fibronektin (durchgezogene Linie) kultiviert und zu den angegebenen Zeitpunkten analysiert. Die Zellen wurden mit Ethanol permeabilisiert und mit Propidium-Jodid gefärbt. Apoptose wurde mittels Durchflußzytometrie gemessen. Die Daten sind als Mittelwerte±SD dargestellt.

Die Aussage der durchflußzytometrischen Untersuchungen wurde mit einem zusätzlichen Test, dem DNA-Fragmentations-Assay, überprüft. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der FACS-Analyse zeigte auch diese Untersuchung, daß Apoptose, hier gekennzeichnet durch das Auftreten von internukleosomaler DNA-Spaltung, einem Schlüssel-Charakteristikum der Apoptose, nur in den Zellen zu beobachten war, die in Anwesenheit von 20 ng/ml TNF kultiviert wurden (Abbildung 36). Die DNA-Fragmentierung trat dabei auf beiden Kulturoberflächen auf, war jedoch stärker ausgeprägt, wenn die Zellen auf Fibronektin inkubiert wurden. Keine niedrigmolekularen DNA-Fragmente (sog. "DNA-Leitern") fanden sich hingegen bei unbehandelten Kontrollen.

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Abbildung 36: Der Effekt von Fibronektin und PolyHema auf die DNA-Fragmentierung von TNF-behandelten neutrophilen Granulozyten. Keine DNA-Fragmentation wurde in frisch isolierten Zellen (Bahn 1) und in unbehandelten Zellen auf PolyHema (Bahn 2) und Fibronektin (Bahn 3) beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigen TNF-stimulierte Zellen auf PolyHema (Bahn 4) und auf Fibronektin (Bahn 5) typische niedrigmolekulare DNA-Fragmente. Die DNA-Fragmentierung war stärker ausgeprägt, wenn die Zellen auf Fibronektin kultiviert wurden. Bahn M zeigt die 100 bp DNA-Marker. Ein typisches Beispiel von 2 separaten Experimenten ist abgebildet.

Fibronektin ist ein extrazelluläres Matrixprotein, das als Bestandteil des Interstitiums vorkommt, aber auch als lösliches Fibronektin im Blut zirkuliert. Verglichen wurde nachfolgend der Effekt von Fibronektin, das auf den Kulturplatten immobilisiert wurde, mit dem Effekt, den der Zusatz von löslichem Fibronektin zu neutrophilen Granulozyten in Suspension auf die TNF-vermittelte Apoptose hat. Die Zellen wurden für 4 Stunden in Suspension unter Hinzugabe ansteigender Dosen von löslichem humanen Fibronektin (5-75 µg/ml) kultiviert. Die Ergebnisse zeigen, daß lösliches Fibronektin im Gegensatz zu immobilisiertem Fibronektin nicht zu einer Akzeleration der Apoptose führte (Abbildung 37) (n=5).

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Abbildung 37: Der Effekt von löslichem Fibronektin auf die Apoptose von TNF-behandelten neutrophilen Granulozyten in Suspension. TNF-stimulierte Zellen (20 ng/ml) wurden für 4 Stunden in der Anwesenheit ansteigender Konzentrationen von löslichem Fibronektin (5 to 75 mg/ml) in Polypropylen-Röhrchen als Zellsuspension kultiviert. Die Proben wurden nach Ethanol-Permeabilisierung und Propidium-Jodid-Färbung mittels Durchflußzytometrie analysiert. Die Daten sind als Mittelwerte±SEM dargestellt (n=5).

Neben Fibronektin kommen eine Reihe weiterer extrazellulärer Matrixproteine für eine Interaktion mit neutrophilen Granulozyten während der Entzündungsreaktion in Betracht. Untersucht wurde der Einfluß von Kollagen Typ I und Typ IV sowie von Laminin auf die TNF-vermittelte Apoptose. Basierend auf den Experimenten zum Zeitverlauf der TNF-vermittelten Apoptose auf Fibronektin wurde der 8-Stunden-Zeitpunkt für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Zu diesem Zeitpunkt hatte die Apoptose-Rate ein Plateau erreicht. Fibronektin, Kollagen Typ I und Typ IV sowie Laminin wurden auf den 6-well-Kulturplatten immobilisiert und TNF-stimulierte Zellen derselben Spender-Präparation wurden für 8 Stunden auf den verschiedenen Oberflächen kultiviert (n=6). Die Ergebnisse zeigen gegenüber der nicht-adhärenten Beschichtung mit PolyHema einen signifikanten Anstieg der Apoptose auf allen Matrices (Abbildung 38). Die Apoptose-Rate betrug 8±1% auf PolyHema und stieg auf 26±4% für Fibronektin, auf 17±2% für Kollagen I, auf 16±2% für Kollagen IV und auf 17±3% für Laminin an. Der Anstieg auf Fibronektin war signifikant höher als auf allen anderen Matrix-Proteinen (p<0,05).

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Abbildung 38: Der Effekt von verschiedenen extrazellulären Matrix-Proteinen auf die TNF-vermittelte Apoptose. Neutrophile Granulozyten wurden auf PolyHema (PH), Fibronektin (FN), Kollagen I (Col I), Kollagen IV (Col IV) und auf Laminin (Lam) für 8 h kultiviert. Die Zellen wurden mit Ethanol permeabilisiert und mit Propidium-Jodid gefärbt. Apoptose wurde mittels Durchflußzytometrie gemessen. Die Daten sind als Mittelwerte±SEM dargestellt (n=6). *Die Differenzen zwischen allen Matrices und PolyHema (p<0,05) sowie zwischen Fibronektin und allen anderen Matrix-Proteinen (p<0,05) waren signifikant.

3.1.4.2 Signaltransduktion der Fibronektin-induzierten Akzeleration von TNF-vermittelter Apoptose

3.1.4.2.1 Der Effekt von Inhibitoren der Signaltransduktion

Im folgenden wurde die Signaltransduktion der Akzeleration von TNF-vermittelter Apoptose durch extrazelluläre Matrix untersucht. Als erstes erfolgte die Testung der Wirkung verschiedener Hemmer von Signaltransduktionswegen. Die Ergebnisse in Abbildung 39 demonstrieren, daß die Hemmung der Tyrosin-Phosphorylierung mit 50 µM Genistein zu einer starken Inhibierung der Apoptose auf Fibronektin (39±4% auf 21±4%; p<0,0001) und auf Poly-l-lysine (28±4% auf 21±4%; p<0,05) führte, wohingegen kein signifikanter Genistein-Effekt auf PolyHema zu beobachten war (20±4% auf 16±4%) (n=8). Interessanterweise wurde durch Genistein die Apoptose-Rate auf beiden adhärenten Oberflächen auf Werte vermindert, die der Apoptose auf der nicht-adhärenten Bedingung (PolyHema) entsprachen.

Beim Einsatz weiterer Signaltransduktionshemmer konnte in 5 Experimenten kein Effekt der MAP-Kinase-Inhibitoren SB 202190 und PD 98059 (10 nM bis 1 mM) sowie der PKC-Inhibitoren Calphostin und Staurosporin (10 nM) auf die Fibronektin-akzelerierte Apoptose demonstriert werden (Daten nicht gezeigt).

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Abbildung 39 : Der Effekt von Genistein auf die TNF-vermittelte Apoptose. Neutrophile Granulozyten wurden auf Zellkultur-Platten kultiviert, die mit PolyHema, Fibronektin oder Poly-l-lysine beschichtet waren. Es erfolgte eine Stimulation mit 20 ng/ml TNF ohne oder mit Vorinkubation in Genistein (50 µM). Apoptose wurde nach Ethanol-Permeabilisierung und Propidium-Jodid-Färbung der Zellen mittels Durchflußzytometrie analysiert Die Daten sind als Mittelwerte±SEM dargestellt. Eine signifikante Hemmung durch Genistein war in TNF-behandelten Zellen auf Fibronektin (offene Säulen) und auf Poly-l-lysine (schraffierte Säulen), aber nicht auf PolyHema (schwarze Säulen) zu beobachten.

3.1.4.2.2 Charakterisierung der Tyrosin-Phosphorylierung

Der beobachtete Effekt von Genistein auf die TNF-vermittelte Apoptose auf Fibronektin deutet auf eine zentrale Rolle der Tyrosin-Phosphorylierung hin. Es erfolgten deshalb detaillierte Untersuchungen zu diesem Signaltransduktionsweg. Neutrophile Granulozyten wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von 20 ng/ml TNF entweder auf PolyHema oder auf Fibronektin für 15, 30 oder 60 Minuten kultiviert. Die Zellen wurden geerntet, lysiert und mittels SDS-PAGE und Western-Blotting mit einem anti-Phosphotyrosin-Antikörper analysiert (Abbildung 40). Nach 15 Minuten war bei keiner der Bedingungen ein signifikanter Anstieg in der Tyrosin-Phosphorylierung zu erkennen. Nach 30 Minuten ließ sich in den TNF-behandelten Proben auf Fibronektin eine verstärkte Phosphorylierung von Proteinbanden mit einem Molekulargewicht von 54 und 95 kDa feststellen. Die Phosphorylierung dieser Proteine verstärkte sich weiter nach 60 Minuten. Zu diesem Zeitpunkt war auch eine verstärkte Phosphorylierung von Proteinen mit einem Molekulargewicht von 102, 89, 63 und 51 kDa nachweisbar. Von besonderem Interesse war das Auftreten neuer Phosphorylierungsbanden mit einem Molekulargewicht von 185, 85, 66, 56 und 42 kDa.

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Abbildung 40: Messung der Tyrosin Phosphorylierung mittels Western-Blotting. Die Zellen wurden auf Fibronektin oder auf PolyHema in Anwesenheit oder Abwesenheit von 20 ng/ml TNF kultiviert. Die Proben wurden nach 15, 30 und 60 Minuten geerntet. 50 µg Protein pro Bahn wurden für die Elektrophorese eingesetzt, geblottet und mit einem monoklonalen Antikörper (PY20) gegen Phosphotyrosin entwickelt. Die Tyrosin-Phosphorylierung der Proteinbanden mit 102, 95, 89, 63, 54 und 51 kDa war hochreguliert, wenn TNF-behandelte Zellen auf Fibronektin kultiviert wurden. Neue Tyrosin-phosphorylierte Banden waren bei 185, 85, 66, 56 und 42 kDa sichtbar. Ein typisches Beispiel von 3 unabhängigen Experimenten ist gezeigt.

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Abbildung 41: Konfokale Mikroskopie der Tyrosin-Phosphorylierung in TNF-stimulierten neutrophilen Granulozyten auf PolyHema (Panel A) und auf Fibronektin (Panel B). Eine starke Hochregulation der Tyrosin-Phosphorylierung war in den TNF-behandelten Zellen auf Fibronektin zu erkennen (Panel B). Die semi-quantitative Analyse ist in Panel C gezeigt. Die Zellen auf Fibronektin weisen ein charakteristisches Spreading auf. Eine verstärkte Tyrosin-Phosphorylierung ist an den Orten des Zell-Matrix-Kontaktes sowie im Zytoplasma zu sehen (Panel D, horizontaler Schnitt). In Panel E, einer Analyse in der vertikalen Achse (z-Achse), ist die gesteigerte Tyrosin-Phosphorylierung an den Zell-Matrix-Kontaktstellen und im Zytoplasma zu sehen. Eine repräsentative Untersuchung von 3 unabhängigen Experimenten ist abgebildet.

3.1.4.2.3 Identifizierung von Ly-GDI als ein Substrat der Tyrosin-Phosphorylierung

Die vorgelegten Daten demonstrieren überzeugend, daß die Interaktion von TNF-stimulierten neutrophilen Granulozyten mit extrazellulären Matrix-Proteinen zu einer Akzeleration der Apoptose führt und daß dieser Prozeß über die Tyrosin-Phosphorylierung von Proteinen reguliert wird. In den folgenden Untersuchungen standen die Substrate dieser Tyrosin-Phosphorylierung im Mittelpunkt. Zu diesem Zweck wurden 2D-Gel-Elektrophoresen, gefolgt von Western-Blotting mit einem Antikörper gegen Phosphotyrosin durchgeführt. Die Zellen wurden in der Anwesenheit von 20 ng/ml TNF entweder auf Fibronektin oder auf PolyHema für 60 Minuten kultiviert. Zellen auf Fibronektin ohne TNF-Stimulation wurden als Kontrolle im selben Experiment mitgeführt.

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Abbildung 42: 2D-Gelektrophorese und Western-Blotting zur Untersuchung des Effektes von Fibronektin und TNF auf die Tyrosin-Phosphorylierung. Neutrophile Granulozyten wurden auf Fibronektin oder auf PolyHema kultiviert und entweder mit 20 ng/ml TNF stimuliert oder ohne Stimulation kultiviert. Die Proben wurden nach 60 Minuten lysiert, und 100 µg Protein/Gel wurde elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und unter Verwendung eines Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers (PY20) entwickelt. Die Zahl der Tyrosin-phosphorylierten Spots war in TNF-stimulierten PMN auf Fibronektin deutlich hochreguliert (Panel A), wohingegen wenig Phosphorylierung in TNF-stimulierten Zellen auf PolyHema (Panel B) oder in unstimulierten Zellen auf Fibronektin nachweisbar war (Panel C). Der mit einem Stern markierte Spot (*) konnte im korrespondierenden Coomassie-gefärbten Gel identifiziert werden.

Einer dieser Spots (in Abbildung 42 mit einem Stern markiert) konnte auch in den gleichzeitig durchgeführten Coomassie-gefärbten Gelen identifiziert werden. Das Protein wurde aus dem Gel ausgeschnitten, Trypsin-behandelt, gereinigt und anschließend konzentriert. Die Protein-Analyse erfolgte mittels Nanoelektrospray-Massen-Spektrometrie. Mit der Elektrospray-Ionisierungs-Massen-Spektrometrie (ESI-MS) wurde ein Peptid-Massen-Fingerprint durchgeführt (Abbildung 43). Die Identität des identifizierten Proteins wurde in der Tandem-Massen-Spektrometrie bestätigt. Mit diesen Methoden konnte das Protein identifiziert werden. Es handelt sich um Ly-GDI

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Abbildung 43: Die Identifizierung von Ly-GDI mittels Nanoelectrospray-Massen-Spektrometrie. Die Peptid-Ionen-Massen-Karte, die Masse der Framente A-F, die identifizierten Aminosäurensequenzen und deren Position im Ly-GDI Molekül sind dargestellt.

Nachdem Ly-GDI als ein Substrat der Tyrosin-Phosphorylierung identifiziert wurde, erfolgten Untersuchungen zur Protein-Expression. Untersucht wurde dabei der Effekt von TNF und Fibronektin auf die Expression von Ly-GDI. Neutrophile Granulozyten derselben Präparation wurden mit TNF (20 ng/ml) stimuliert und entweder auf Fibronektin oder PolyHema inkubiert, oder die Zellen wurden unstimuliert auf Fibronektin kultiviert. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden die Proben geerntet und mittels SDS-PAGE und Western-Blotting analysiert. Verwendet wurde ein spezifischer polyklonaler Antikörper gegen Ly-GDI. In Abbildung 44 (Panel A-C) läßt sich erkennen, daß neutrophile Granulozyten eine 27-kDa-Protein-Bande aufweisen, die dem intakten Ly-GD-Protein entspricht. Die Expression der 27-kDa-Bande wurde mit Hilfe der optischen Densitometrie quantifiziert und es konnte nachgewiesen werden, daß die Behandlung der Zellen mit TNF zu einer Verminderung der Expression der 27-kDa-Bande führte (Abbildung 45). Die Abnahme an intaktem Ly-GDI begann zwischen der ersten und der zweiten Stunde der TNF-Behandlung und ließ sich auf beiden Oberflächen nachweisen. Fibronektin bewirkte eine stärkere

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Abbildung 44: Zeitverlauf der Spaltung von Ly-GDI. Neutrophile Granulozyten wurden mit 20 ng/ml TNF stimuliert und auf Fibronektin (Panel A) oder PolyHema (Panel B) kultiviert. Kontrollen wurden auf Fibronektin ohne Stimulation inkubiert (Panel C). Die Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet und lysiert. 30 µg Protein wurden elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet, und die Blots wurden mit einem spezifischen Antikörper gegen Ly-GDI entwickelt. TNF führte zur Abnahme von intaktem Ly-GDI und zum Auftreten eines 23-kDa-Spaltproduktes. Die Interaktion TNF-behandelter Zellen mit Fibronektin verstärkt die Spaltung von intaktem Ly-GDI.

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Abbildung 45: Bestimmung der Ly-GDI-Protein-Expression mittels optischer Densitometrie. Die Behandlung der neutrophilen Granulozyten mit TNF führt zu einer zeitabhängigen Abnahme der Ly-GDI-Expression. Im Vergleich zu PolyHema (o) war dieser Effekt stärker, wenn die Zellen auf Fibronektin (•) kultiviert wurden. Die Inkubation auf Fibronektin ohne Stimulation mit TNF führte zu keiner Abnahme der Ly-GDI Expression (?). Für die optische Densitometrie wurden eingescante Röntgenfilme der Western-Blot Analysen verwendet.

Wenn TNF-behandelte neutrophile Granulozyten mit z-DEVD-fmk, einem Tetrapeptid mit Caspase-3-spezifischer Hemmung, vorinkubiert wurden, konnte die Spaltung von intaktem Ly-GDI inhibiert und die Generation des 23 kDa-Spaltproduktes verhindert werden (Abbildung 46).

Abbildung 46: Der Effekt des Caspase-3-Hemmers z-DEVD-cmk auf die TNF-vermittelte Spaltung von Ly-GDI wurde untersucht. Neutrophile Granulozyten wurden mit 100µM z-DEVD-cmk oder mit derselben Menge Lösungsmittel vorinkubiert und anschließend mit 20 ng/ml TNF stimuliert. Nach 8 Stunden Inkubation wurden die Zellen lysiert. 30 µg Protein wurde elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet, und die Blots wurden mit einem spezifischen Antikörper gegen Ly-GDI entwickelt. Die TNF-vermittelte Spaltung von intaktem Ly-GDI sowie die Generation des 23 kDa Fragmentes wurden durch 100 µM z-DEVD-cmk gehemmt.

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Im Anschluß an diese Befunde wurde die Hypothese getestet, daß Caspase-3 die apoptotische Antwort neutrophiler Granulozyten vermittelt. Dazu wurde der Effekt der spezifischen Hemmung von Caspase-3 und Caspase-1 auf die TNF-induzierte Apoptose untersucht. Kontroll-Zellen wurden auf Fibronektin oder auf PolyHema mit 20 ng/ml TNF stimuliert. Zellen derselben Präparation wurden vor der TNF-Stimulation mit ansteigenden Dosen (1-100 µM) von z-DEVD-fmk, zur Hemmung von Caspase-3, oder YVAD-cmk, zur Hemmung von Caspase-1, vorinkubiert. Nach 8 Stunden erfolgte die Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen mittels Propidium-Jodid-Färbung und Durchflußzytometrie. Abbildung 47 zeigt, daß die Vorinkubation mit z-DEVD-fmk zu einer Dosis-abhängigen Hemmung der TNF-vermittelten Apoptose auf beiden Oberflächen führte.

Abbildung 47: Der Effekt des Caspase-3-Hemmers z-DEVD-cmk und des Caspase-1-Hemmers YVAD-cmk auf die TNF-vermittelte Apoptose auf Fibronektin (quadratische Symbole) und auf PolyHema (Kreise) wurde untersucht. Dazu wurden neutrophile Granulozyten mit steigenden Dosen von entweder z-DEVD-cmk (durchgezogene Linie) oder YVAD-cmk (gestrichelte Linie) vorinkubiert und dann mit 20 ng/ml TNF behandelt Nach 8 Stunden Inkubation wurden die Zellen mit Ethanol permeabilisiert und mit Propidium-Jodid gefärbt. Die Auswertung erfolgte mittels Durchfußzytometrie. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte dargestellt (n=5).

Der Prozentsatz apoptotischer Zellen war auf Fibronektin: 23,5%±3,0 für die unbehandelten Kontrollen, 20,9%±3,2 für 1 µM z-DEVD-fmk, 17,5%±5,1 für 10 µM, 15,4%±2,4 für 25 µM und 11,0%±3,1 für 100 µM. Die Behandlung TNF-stimulierter Zellen mit z-DEVD-fmk auf PolyHema führte zu folgenden Apoptoseraten: 9,9%±1,0 für die Kontrollen, 9,0%±1,5 für 1 µM, 4,6%±1,1 für 10 µM, 4,9%±0,9 für 25 µM und 4,7%±1,4 for 100 µM. Der Effekt von z-DEVD-fmk war auf beiden Oberflächen signifikant für die Konzentrationen 10, 25 und 100 µM (p<0,05). Die Vorinkubation der

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