Kettritz, Ralph: Untersuchungen zu zellulären Mechanismen bei ANCA-assoziierten nekrotisierenden Vaskulitiden Grundlagen der Aktivierung und der Apoptose neutrophiler Granulozyten

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Kapitel 4. Diskussion

Am Beginn der vorliegenden Arbeit wurde die zentrale Rolle der "Dreiecksbeziehung" von ANCA, neutrophilen Granulozyten und Endothel im pathogenetischen Konzept ANCA-assoziierter Erkrankungen betont. Dabei ist die Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA für die Auslösung der Schädigung bedeutsam, und diese Problematik wird im ersten Abschnitt der Diskussion erörtert. Die Beseitigung von neutrophilen Granulozyten durch Apoptose ist kritisch für die Auflösung von Entzündungsreaktionen. Auf die Bedeutung der Apoptose bei ANCA-Vaskulitiden soll im zweiten Abschnitt eingegangen werden.

4.1 Mechanismen der Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA

Die dargestellten Ergebnisse demonstrieren, daß die Bindung der ANCA an ihre Ziel-Antigene auf der Zelloberfläche und die effektive Quervernetzung der präsentierten Antigene die Abgabe von Superoxid in neutrophilen Granulozyten stimulieren. Der FcgammaIIa-Rezeptor ist für diesen Initiierungs-Prozeß nicht essentiell. Die Interaktion von ANCA mit dem FcgammaIIa-Rezeptor übt jedoch eine modulierende Wirkung auf die Aktivierung aus. Die Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA nimmt eine zentrale Stellung in den Konzepten zur Pathophysiologie ANCA-assoziierter Vaskulitiden ein. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen helfen, die zugrunde liegenden Mechanismen der Aktivierung durch ANCA besser zu verstehen.

Das Priming neutrophiler Granulozyten, in unseren Experimenten durch die Inkubation mit TNFalpha durchgeführt, bewirkt eine Translokation von PR3 und MPO aus den primären Granula auf die äußere Zelloberfläche (Charles, 1991). Diese Translokation ist notwendig, damit ANCA mit ihren Ziel-Antigenen interagieren und somit die Aktivierung der Granulozyten auslösen können. Tatsächlich ist gezeigt worden, daß neutrophile Granulozyten von Patienten mit Wegener'scher Granulomatose PR3 auf ihrer Zellmembran präsentieren (Csernok, 1994; Muller Kobold, 1998). Mit Hilfe der Durchflußzytometrie wurden in der vorliegenden Arbeit die Bindungseigenschaften humaner ANCA und ihrer korrespondierenden F(ab')2- und Fab-Fragmente untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, daß intakte humane ANCA und monoklonale Maus-Antikörper gegen PR3 an der Oberfläche geprimter Granulozyten binden. Diese Resultate befinden sich in Übereinstimmung mit Berichten aus der Literatur (Falk, 1990; Mulder, 1994; Porges, 1994).

Darüberhinaus wird in der vorliegenden Arbeit demonstriert, daß sowohl ANCA-F(ab')2- und Fab-Fragmente als auch F(ab')2 des monoklonalen anti-PR3-Antikörpers an TNFalpha-geprimte Granulozyten binden. Hieraus läßt sich eine Fcgamma-Rezeptor-unabhängige, Antigen-spezifische Bindung der ANCA erkennen. Die Tatsache, daß intakte humane ANCA eine höhere Bindung als ANCA-F(ab')2- und -Fab-Fragmente aufweisen, spricht für einen zusätzlichen Bindungs-Effekt, der durch die Interaktion von Fc-Teil und Fcgamma-Rezeptor vermittelt wird. Es werden drei Klassen von Fcgamma-Rezeptoren unterschieden. Neutrophile Granulozyten exprimieren die FcgammaII- und FcgammaIII-Rezeptoren konstitutionell, während die Expression der FcgammaI-Rezeptoren durch die Inkubation mit Interferon g induziert wird. Daß die Interaktion von Fc-Teilen mit dem Fcgamma-Rezeptor tatsächlich stattfindet, allerdings alleinig nicht ausreicht, um die Zellen zu aktivieren, wird von unserer Beobachtung unterstützt, daß intakte Immunglobuline von Gesunden in der Durchflußzytometrie an


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der Zelloberfläche binden, ohne jedoch eine Superoxid-Produktion auszulösen. Diese Immunglobuline von gesunden Kontrollen, nicht aber die der ANCA-Patienten, verlieren ihre Fähigkeit zu binden, wenn der Fc-Teil des Antikörper-Moleküls durch Pepsin-Verdau abgespalten wird. ANCA können also über die Ligation ihrer Ziel-Antigene eine zusätzliche, Fcgamma-Rezeptor-unabhängige Bindung eingehen.

Die hier vorgelegten Befunde zeigen, daß intakte humane PR3- und MPO-ANCA sowie murine monoklonale Antikörper gegen menschliche PR3 die Generation von Superoxid in TNFalpha-geprimten neutrophilen Granulozyten bewirken. Diese Antwort zeigt eine Dosis-Wirkungs-Beziehung. Unsere Resultate befinden sich in Übereinstimmung mit denen anderer Studien (Falk, 1990; Mulder, 1994; Reumaux, 1995; Porges, 1994). Wir präsentieren darüberhinaus Daten, die zeigen, daß F(ab')2-Fragmente humaner ANCA TNFalpha-geprimte neutrophile Granulozyten in einer Dosis-abhängigen Weise aktivieren. Über die Aktivierung durch humane ANCA-F(ab')2-Fragmente existieren kontroverse Berichte. Während in zwei Untersuchungen humane ANCA-F(ab')2-Fragmente aktivierten (Falk, 1990; Keogan, 1992), konnten Mulder et al. (Mulder, 1994) und Remaux et al. (Reumaux, 1995) keine Auslösung einer Superoxid-Generation durch F(ab')2-Fragmente heterologer anti-Laktoferrin-Antikörper und monoklonaler Antikörper gegen MPO und PR3 nachweisen. Die Diskrepanz könnte durch die unterschiedlichen Quellen der Antikörper bedingt sein: humane versus Maus versus Kaninchen. Für diese Möglichkeit spricht, daß auch wir keine Superoxid-Generation beobachteten, wenn F(ab')2-Fragmente des monoklonalen Maus-Antikörpers gegen PR3 verwendet wurden. Daß F(ab')2-Fragmente und nicht nur intakte Immunglobuline generell zu einer Aktivierung von Leukozyten führen können, ist bereits 1978 durch Ravid et al. demonstriert worden (Ravid, 1978). Die Untersucher inkorporierten synthetisch hergestellte Antigene in die Oberfläche von Lymphozyten und inkubierten die Zellen anschließend mit intakten Antikörpern oder F(ab')2-Fragmenten, die gegen diese Antigene gerichtet waren. Beide Präparationen, sowohl die kompletten Antikörper-Moleküle als auch die Fragmente lösten eine biologische Antwort aus. Die Studien von Ravid, aber auch die von Shen (Shen, 1995) zeigten darüber hinaus, daß die F(ab')2-Fragmente interessanterweise bessere Aktivatoren als die intakten Antikörper waren. Auch wir fanden, daß bei drei unserer vier humanen ANCA-Präparationen die F(ab')2-Fragmente eine höhere Superoxid-Produktion auslösten als die entsprechenden kompletten ANCA. Es werden Daten vorgelegt, die erstmals demonstrieren, daß die Papainspaltung von ANCA, die die Generation von ANCA-Fab bewirkt, zum Verlust der Aktivierung geprimter neutrophiler Granulozyten führt. Eine Aktivierung wurde allerdings dann initiiert, wenn diese gebundenen Fab-Fragmente auf der Oberfläche der neutrophilen Granulozyten quervernetzt wurden. Dabei war es egal, ob die Quervernetzung mit F(ab')2-Fragmenten eines sekundären Antikörpers oder mit Hilfe des Biotin-Avidin-Systems durchgeführt wurde. Diese Resultate demonstrieren, daß der entscheidende Mechanismus für die ANCA-induzierte Aktivierung neutrophiler Granulozyten die Quervernetzung der ANCA-Ziel-Antigene auf der Zelloberfläche ist. Dieses Prinzip hat Parallelen in der Leukozytenbiologie. So war die Quervernetzung von Ziel-Antigenen, und nicht nur deren Ligation, ein notwendiger Schritt bei der Aktivierung neutrophiler Granulozyten über die Membranproteine CD43 (Kuijpers, 1992) und CD59 (Morgan, 1993).


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Interessanterweise ist der Fcgamma-Rezeptor selbst ein solches Beispiel für die Neutrophilen-Aktivierung durch Quervernetzung (Huizinga, 1990; Crockett Torabi, 1990). Darüber hinaus führt auch die Quervernetzung von Oberflächenmolekülen in anderen Zelltypen zu biologischen Antworten, wie am Beispiel von CD53 auf B-Lymphozyten (Rasmussen, 1994) und von CD45 auf Killer-Zellen (Osterland, 1993) gezeigt werden konnte.

Verschiedene Untersucher haben vorgeschlagen, daß ANCA Granulozyten ausschließlich durch FcgammaIIa-Rezeptor-vermittelte Mechanismen aktivieren und daß F(ab')2-Fragmente keine Rolle im Aktivierungsprozeß spielen (Mulder, 1994; Reumaux, 1995). Unsere Daten zeigen, daß der FcgammaIIa-Rezeptor für die Induktion der Stimulation nicht essentiell ist. Um zu untersuchen, ob dieser FcgammaIIa-Rezeptor möglicherweise einen modulierenden Effekt ausübt, haben wir den Rezeptor mit einem monoklonalen Antikörper geblockt. Die Blockade bewirkte eine Verminderung der Superoxid-Generation um 33%, wenn humane ANCA verwendet wurden und um 25%, wenn ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen humane PR3 eingesetzt wurde. Diese Ergebnisse befinden sich in Übereinstimmung mit denen von Porges et al., die monoklonale Maus-Antikörper gegen humane PR3 und MPO verwendeten und eine Verminderung der Superoxid-Produktion um 27% fanden (Porges, 1994). Der Effekt war davon ahängig, ob die neutrophilen Granulozyten den low-responder- oder den high-responder-Phänotyp des FcgammaIIa-Rezeptors exprimierten. Im Gegensatz zu diesen und zu unseren Daten wurde in zwei Studien eine vollständige Inhibition der Superoxid-Antwort unter der FcgammaIIa-Rezeptor-Blockade gesehen (Reumaux, 1995; Mulder, 1994). Es kann keine schlüssige Erklärung für diese Diskrepanz gegeben werden. Es fällt allerdings auf, daß die Antikörper in den beiden letzten Studien eine eher schwache Aktivierung auslösten. Es ist vorstellbar, daß die FcgammaIIa-Rezeptor-Blockade effektiver ist, wenn nur eine geringe Aktivierung ausgelöst wird.

Die vorliegenden Untersuchungen zeigen darüberhinaus, daß sich monoklonale Maus-Antikörper gegen ANCA-Ziel-Antigene nicht analog zu humanen ANCA verhalten. Eine starke dosis-abhängige Antwort wurde erzielt, wenn TNFalpha-geprimte neutrophile Granulozyten mit intaktem monoklonalem Maus-Antikörper gegen PR3 inkubiert wurden. Im Gegensatz dazu induzierten F(ab')2-Fragmente dieses Antikörpers keine Superoxid-Freisetzung. Auch der Versuch der Quervernetzung dieser Fragmente, die auf der Zelloberfläche gebunden hatten, konnte keine meßbare Antwort stimulieren. Diese Resultate unterscheiden sich von denen der humanen ANCA. Mögliche Erklärungen sind Differenzen in der Epitop-Spezifität zwischen den polyklonalen humanen und dem monoklonalen murinen Antikörper.

Es konnte zusammenfassend demonstriert werden, daß die Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA von der Expression der ANCA-Ziel-Antigene auf der Zelloberfläche abhängt. Obwohl die Bindung der ANCA an ihre Ziel-Antigene für die Aktivierung notwendig ist, ist sie allein nicht ausreichend, um den Prozeß zu initiieren. Nur die Bindung, begleitet von einer effektiven Quervernetzung der präsentierten Antigene, bewirkt die Abgabe von Superoxid in neutrophilen Granulozyten. Der FcgammaIIa-Rezeptor ist für diesen Prozeß nicht essentiell, obwohl die Aktivierung der Zellen durch intakte ANCA durch die Interaktion mit diesem Rezeptor moduliert wird. Diese


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Beobachtungen erweitern unser Verständnis der Mechanismen, durch welche ANCA zur Aktivierung neutrophiler Granulozyten führen können.

4.2 Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten

Die Apoptose neutrophiler Granulozyten spielt eine kritische Rolle sowohl bei der Auslösung als auch bei der Unterhaltung und Auflösung inflammatorischer Reaktionen im Rahmen von ANCA-Vaskulitiden.

In der vorgelegten Arbeit wird gezeigt, daß die Translokation von ANCA-Antigenen aus den Granula auf die Zelloberfläche eine notwendige Voraussetzung für die nachfolgende Aktivierung der Zellen durch ANCA darstellt. Diese Translokation kann durch Zytokine vermittelt werden und wird als Priming bezeichnet. Eine kürzlich veröffentlichte Studie von Gilligan et al. zeigte, daß während der frühen Phase der spontanen Apoptose neutrophiler Granulozyten die Translokation von ANCA-Zielantigenen auf die Zelloberfläche erfolgt und daß humane ANCA ihre Zielantigene auf diesen Zellen erkennen und binden (Gilligan, 1996). Apoptose-assoziierte Vorgänge können somit das "klassische" Zytokinpriming ersetzen.

Schwere vaskuläre Läsionen bei ANCA-Vaskulitiden sind durch die Dominanz infiltrierender neutrophiler Granulozyten und Monozyten gekennzeichnet (Donald, 1976; Jennette, 1991). Die kritische Rolle der Apoptose neutrophiler Granulozyten für die Kontrolle und Auflösung von örtlichen Entzündungen inklusive der Glomerulonephritis und der renalen Vaskulitis ist gezeigt worden (Grigg, 1991; Savill, 1997; Hughes, 1997; Haslett, 1994). Apoptotische Granulozyten werden von Makrophagen erkannt und durch Phagozytose eliminiert. Hierdurch wird die Desintegration der Zellen mit der Konsequenz einer unkontrollierten Abgabe gewebetoxischer, entzündungsunterhaltender Substanzen verhindert (Haslett, 1994). Eine inadäquat verzögerte Apoptose würde zum Persistieren aktivierter Entzündungszellen führen. Im Gegensatz dazu könnte eine stark akzelerierte Apoptose den protektiven Phagozytose-Mechanismus überfordern. Beide Mechanismen wären pro-inflammatorisch und würden die Progression ANCA-positiver Erkrankungen fördern. Mechanismen der Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten sind bisher unzureichend verstanden.

4.2.1 Die Rolle von Zytokinen

Die Apoptose von neutrophilen Granulozyten wird durch lösliche Mediatoren, die während des Entzündungsprozesses freigesetzt werden, modifiziert. Es ist beschrieben worden, daß Substanzen wie GM-CSF, IL-1, IL-15, LPS und C5 in der Lage sind, Apoptose zu verzögern (Lee, 1993; Colotta, 1992; Cox, 1992; Girard, 1996), während die Aktivierung des Fas/Fas-Liganden-Systems zu einer akzelerierten Apoptose führt (Liles, 1996). ANCA-Vaskulitiden werden durch bakterielle Infekte begünstigt und sind durch ein zytokinreiches Milieu gekennzeichnet. So konnten im Blut und im Urin von Patienten mit aktiver ANCA-positiver Vaskulitis erhöhte Spiegel von TNFalpha, IL-6, IL-8 und TGF-ß nachgewiesen werden (Tesar, 1998; Kekow, 1993). Darüberhinaus fand sich


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bei in situ-Untersuchungen eine erhöhte mRNA- und Protein-Expression von TNFalpha, IL-1ß, Interferon g und transforming-growth-factor-ß (TGF-ß) innerhalb der aktiven Läsionen bei Patienten mit ANCA-positiver Glomerulonephritis (Noronha, 1993; Waldherr, 1993). Diese Daten demonstrieren, daß insbesondere lokal, im betroffenen Gewebe, hohe Konzentrationen an Zytokinen erreicht werden. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir den Effekt der krankheitsrelevanten Zytokine TNFalpha und IL-8 und des bakteriellen Peptids FMLP auf die Apoptose neutrophiler Granulozyten. Diese Mediatoren wurden auf Grund ihrer Relevanz für die ANCA-Vaskulitiden ausgewählt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, daß Zytokine, die während der lokalen Entzündung generiert werden, den programmierten Zelltod neutrophiler Granulozyten modulieren. TNFalpha und FMLP führten zu einer Akzeleration der konstitutiven Apoptose. Während die konstitutive und die FMLP-assoziierte Apoptose durch Superoxid vermittelt wurden, konnte ein solcher Zusammenhang für die TNFalpha-induzierte Apoptose nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu bewirkte IL-8 eine Verzögerung sowohl der spontanen als auch der TNFalpha-vermittelten Apoptose, wodurch der interaktive Apoptose-regulierende Effekt der Zytokine nachgewiesen wurde.

TNFalpha bewirkt eine rapide einsetzende Akzeleration der Apoptose. Dieser Effekt trat bereits zwischen der ersten und der zweiten Stunde der Inkubation auf und wies keine Abhängigkeit von der Superoxidproduktion auf. Diese Aussage wird durch mehrere Befunde gestützt. Erstens trat die Steigerung der Apoptose auch dann ein, wenn eine TNFalpha-Dosis verwendet wurde, die in den parallel durchgeführten Aktivierungsstudien zu keiner Induktion einer Superoxid-Generation führte. Zweitens inhibierte exogene Superoxiddismutase, die die spontane und die FMLP-induzierte Apoptose hemmte, nicht die TNFalpha-vermittelte Beschleunigung der Apoptose. TNFalpha führte darüber hinaus zu keiner veränderten Expression der endogenen Mn-Superoxid-Dismutase. Wir konnten drittens zeigen, daß auch neutrophile Granulozyten eines Patienten mit einem genetisch determinierten Defekt im NADPH-Oxidase-System (chronic granulomatous disease, CGD) mit einer akzelerierten Apoptose auf die Behandlung mit TNFalpha reagieren, während diese Zellen auch nach Stimulation kein Superoxid generierten.

Es war für viele Jahre akzeptiert, daß TNFalpha-Zytotoxizität normale Zellen ausspart und nur einige transformierte Zell-Linien betrifft. Erstmals wurde von Laster et al. gezeigt, daß TNFalpha Apoptose induzieren kann und daß die Form des Zelltodes, also apoptotisch versus nicht-apoptotisch, unter verschiedenen ausgetesteten Fibroblasten-Linien differierte (Laster, 1988). Später wurde demonstriert, daß TNFalpha auch in Primärkulturzellen wie Endothelzellen, Hepatozyten und T-Lymphozyten Apoptose auslösen kann (Robaye, 1991; Polunovsky, 1994; Shinagawa, 1991; Zheng, 1995). Unsere Ergebnisse zeigen, daß TNFalpha eine rapide auftretende Apoptose in neutrophilen Granulozyten induziert. Wir befinden uns dabei in Übereinstimmung mit Berichten von Takeda et al. (Takeda, 1993). Im Gegensatz zu unseren und Takeda's Befunden wurden von Colotta et al. Ergebnisse veröffentlicht, die eine Verzögerung der Apoptose durch TNFalpha demonstrieren (Colotta, 1992). Diese Studie analysierte die Wirkung von TNFalpha auf die Apoptose allerdings zu einem viel späteren Zeitpunkt, nämlich nach 48 und 72 Stunden. Frühere Zeitpunkte,


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wie in den hier vorgelegten Untersuchungen, wurden nicht berücksichtigt. Interessanterweise zeigen unsere Befunde, daß sich nach der initialen Akzeleration der Apoptose durch TNFalpha keine Unterschiede im Prozentsatz apoptotischer Zellen nach 24 Stunden ergeben. Betrachtet man die Ergebnisse beider Studien im Zusammenhang, ergibt sich die Möglichkeit, daß nur eine Subpopulation neutrophiler Granulozyten für die TNFalpha-vermittelte Apoptose empfänglich ist. Diese Erklärung könnte für die scheinbare Diskrepanz zwischen unseren und Colotta's Befunden verantwortlich sein.

Es ist gezeigt worden, daß Sauerstoffradikale Apoptose vermitteln können. In vitro-Untersuchungen mit Nervenzellen (Greenlund, 1995; Hockenbery, 1993) und Lymphozyten (Hockenbery, 1993; Sandstrom, 1994) haben bewiesen, daß intrazellulär generiertes Superoxid eine wichtige Rolle für den programmierten Zelltod spielt. Zellkulturbedingungen, die den oxidativen Streß erhöhen, steigern auch die Apoptoserate. Beispiele hierfür sind ein hoher Sauerstoffpartialdruck (Enokido, 1993), die Verarmung an Nerven-Wachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF) (Greenlund, 1995), Diäthyl-Maleat (Kane, 1993) und ß-Amyloid (Loo, 1993). Auch in vivo scheinen Sauerstoffradikale mit Apoptose assoziiert zu sein. Die familiäre amyotrophe Lateralsklerose ist eine fatale Erkrankung, die durch den apoptotischen Tod von motorischen Neuronen gekennzeichnet ist. Patienten mit dieser Krankheit haben eine Mutation der Kupfer/Zink-Superoxiddismutase (Rosen, 1993; Deng, 1993). Ein weiteres Argument für eine kritische Rolle von Sauerstoffradikalen beim programmierten Zelltod stellt die Tatsache dar, daß Bcl-2 vor dem Sauerstoffradikal-vermittelten Zelltod schützt (Reed, 1994). Es wurde gezeigt, daß diese Wirkung sowohl durch eine direkte Reduktion von Sauerstoffradikalen als auch durch eine Unterdrückung ihrer biologischen Wirkungen bedingt wird (Hockenbery, 1993; Kane, 1993). Das Bcl-2-Protein ist in den Mitochondrien, dem endoplasmatischen Retikulum und in der Kernmembran lokalisiert (Hockenbery, 1990; Jacobson, 1993; Monaghan, 1992). Alle drei Orte enthalten Elektronentransport-Ketten, die für die Generation von reaktiven Sauerstoffradikalen notwendig sind. Wir und andere Arbeitsgruppen haben gefunden, daß humane neutrophile Granulozyten kein Bcl-2-Protein exprimieren (Iwai, 1994). Das Fehlen von Bcl-2 könnte zur hohen konstitutiven Apoptose-Rate und somit zur kurzen Lebensspanne neutrophiler Granulozyten beitragen. Die Beobachtung, daß eine Überexpression von Bcl-2 in transgenen Tieren zu einer verlängerten Lebensspanne von Granulozyten führt, unterstützt diese Hypothese (Lagasse, 1994).

Im Gegensatz zu den Befunden bei der TNFalpha-induzierten Apoptose zeigen unsere Untersuchungen, daß das unstimulierte Altern neutrophiler Granulozyten in der Kultur zur konstitutiven Apoptose führt und daß dieser Vorgang durch oxidativen Streß vermittelt wird. Unter diesen Bedingungen konnte durch exogene Superoxid-Dismutase eine Dosis-abhängige Suppression der Apoptose bewirkt werden. Am Beispiel des bakteriellen Peptids FMLP wurde demonstriert, daß eine stimulierte Superoxidgeneration die spontane Apoptose akzelerieren kann.

In nachfolgenden Experimenten wurde Interleukin-8 als ein weiteres für die ANCA-Vaskulitiden relevantes Zytokin ausgewählt, um den Effekt auf die Apoptose neutrophiler Granulozyten zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Prototyp eines chemotaktischen Zytokins den programmierten Zelltod beeinflußt, indem es zu einer Verzögerung sowohl der spontanen als auch


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der TNFalpha-induzierten Apoptose führt. Dieser Effekt ist Zeit- und Dosis-abhängig und wird durch beide Typen von IL-8-Rezeptoren vermittelt. Der Apoptose-hemmenden Wirkung von IL-8 liegt keine Hochregulation der Bcl-2-Expression zugrunde.

Die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten ist ein kritisches Ereignis für die Bekämpfung von Entzündungen und die Aufrechterhaltung der Integrität des Wirtsorganismus. Diese Rekrutierung erfolgt durch Chemotaxis und kann durch Zytokine mit chemotaktischen Eigenschaften, den Chemokinen, vermittelt werden. Interleukin-8 gehört zur Gruppe der a-Chemokine, deren Wirkung sich haupsächlich auf neutrophile Granulozyten richtet (rev. in Miller, 1992; Oppenheim, 1991; Ahuja, 1994; Baggiolini, 1994). Sie bestehen aus 70-80 Aminosäuren und enthalten 4 konservierte Cysteine. Die ersten beiden Cysteine sind durch eine variable Aminosäure getrennt (CXC). Mehr als 12 Mitglieder dieser Familie, darunter das Growth-Related Protein a (Groalpha), sind beschrieben. IL-8 wird durch Endothelzellen, Mesangiumzellen und neutrophile Granulozyten produziert (Baggiolini, 1994; Hoch, 1996). Proteinase-3, die von neutrophilen Granulozyten freigesetzt wird und eines der Haupt-Antigen der ANCA ist, stimuliert die IL-8 Produktion durch Endothelzellen (Berger, 1996). Tatsächlich sind erhöhte Konzentrationen von IL-8 bei Patienten mit aktiver ANCA-Vaskulitis beschrieben worden (Tesar, 1998). Diese Befunde weisen darauf hin, daß während der Inflammation ein IL-8-reiches Milieu geschaffen wird.

Neutrophile Granulozyten zeigen verschiedene biologische Antworten auf eine Stimulation mit IL-8. Hierzu gehören die gerichtete Migration, eine Veränderung der Zellgestalt (sog. shape change) (Wymann, 1987), die Degranulation (Masure, 1991), die Aktin-Polymerisation (Westlin, 1992) und die Hochregulation von Adhäsionsmolekülen (Detmers, 1990). Wir beschreiben eine weitere Wirkung von IL-8, nämlich die Verzögerung des programmierten Zelltodes. Unsere Ergebnisse demonstrieren eine klare Dosis- und Zeit-abhängige Verzögerung der spontanen Apoptose. Im Gegensatz dazu fanden zwei weitere Studien keinen Effekt von IL-8 auf die Apoptose (Cox, 1992; Colotta, 1992). Beide Studien verwendeten mit 48 und 72 Stunden deutlich längere Inkubationszeiten und untersuchten nicht die Wirkung innerhalb der ersten 30 Stunden. Es ist vorstellbar, daß für Granulozyten mit ihrer kurzen Lebensspanne frühe Zeitpunkte von höherer biologischer Relevanz sind, da nach 48 Stunden Monozyten und andere einwandernde Zellen das Entzündungsgeschehen dominieren. Während der Entzündung geben aktivierte Leukozyten proinflammatorische Mediatoren wie TNFalpha ab. Besonders interessant sind in diesem Zusammenhang unsere Resultate, die zeigen, daß IL-8 nicht nur die spontane, sondern auch die TNFalpha-induzierte Apoptose hemmt. Mit einer Verzögerung der Apoptose wird die Lebensspanne neutrophiler Granulozyten verlängert. Diese Zellen sind somit über einen längeren Zeitraum in der Lage, ihre Effektor-Funktionen auszuüben und dabei Sauerstoffradikale zu generieren, zu phagozytieren oder mit der Freisetzung proteolytischer Enzyme zu reagieren. IL-8 würde damit über zwei verschiedene Wege zur Akkumulation neutrophiler Granulozyten am Entzündungsort führen: zum einen über den chemotaktischen Effekt, zum anderen über eine Verlängerung der Lebensspanne der Zellen.


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Neutrophile Granulozyten exprimieren zwei CXC-Rezeptor-Typen, nämlich IL-8 RI und IL-8 RII. Der IL-8 RII besitzt eine hohe Affinität gegenüber allen Mitgliedern der CXC-Zytokin-Familie, einschließlich Groalpha, während der IL-8 RI nur IL-8 mit hoher Affinität bindet (Moser, 1991; Lee, 1992). In den von uns durchgeführten Untersuchungen zur Rolle beider IL-8-Rezeptoren bei der Vermittlung des Apoptose-verzögernden Effektes zeigte sich, daß IL-8 einen stärkeren Effekt auf die Apoptose ausübt als TNFalpha. Die Aktivierung des IL-8 RII vermittelt also eine Verzögerung der Apoptose, und die zusätzliche Aktivierung des IL-8 Typ-I-Rezeptors führt zu einer Verstärkung dieses Effektes. Diese Beobachtung steht im Einklang mit Beispielen von anderen biologischen Antworten neutrophiler Granulozyten auf eine IL-8 Stimulation. So führt IL-8, verglichen mit Groalpha, auch zu einer verstärkten Hochregulation des Integrins CD11ß, einer erhöhten Phospholipase-D-Aktivierung, einer stärkeren Freisetzung von intrazellulärem Kalzium und einer ausgeprägteren chemotaktischen Wirkung (Geiser, 1993; L'Heureux, 1995).

Die Verzögerung der Apoptose durch IL-8 wird nicht über die Expression von Bcl-2 vermittelt. Wir zeigen in Übereinstimmung mit der Literatur, daß Bcl-2 in frisch isolierten neutrophilen Granulozyten nicht nachweisbar ist (Delia, 1992; Iwai, 1994). Darüber hinaus können wir demonstrieren, daß auch die Behandlung mit IL-8, weder auf der mRNA- noch auf der Proteinebene, zu einer induzierten Expression von Bcl-2 führt. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen des Apoptose-verzögernden Effektes von IL-8 bleiben unklar und bedürfen weiterer Untersuchungen.

Diese Untersuchungen zeigen, daß Zytokine, die während der lokalen Entzündung generiert werden, den programmierten Zelltod neutrophiler Granulozyten modulieren. Die Balance zwischen Apoptose-akzelerierenden und Apoptose-verzögernden Effekten und die Wechselwirkung mit dem Phagozytosesytem, das die apoptotischer Granulozyten beseitigt, besitzen somit eine zentrale Bedeutung für eine kontrollierte und effektive Entzündungsreaktion. Störungen dieser Homöostase können zur Entstehung und Unterhaltung von inflammatorischen Reaktionen, wie sie die ANCA-Vaskulitis darstellt, beitragen.

4.2.2 Differentiell exprimierte Proteine bei der Apoptose

Apoptose ist die programmierte Form des Zelltodes, und ihre Bedeutung für physiologische und pathologische Prozesse ist etabliert. Die intrazellulären Ereignisse, die Apoptose regulieren, sind bisher wenig verstanden. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um Kandidaten-Proteine zu identifizieren, die für das Überleben der Zellen eine kritische Bedeutung besitzen. Dazu wurde eine hochreine Population neutrophiler Granulozyten präpariert. Diese Zellen unterzogen sich in der unstimulierten in vitro-Kultur einer konstitutiven Apoptose. Nach der Separation apoptotischer und nicht-apoptotischer Zellen wurden die Protein-Expressionsmuster in der hochauflösenden zweidimensionalen Gelelektrophorese analysiert. Mit Hilfe der Proteinsequenzierung konnten 5 Proteine identifiziert werden, die in nicht-apoptotischen Zellen hochreguliert und in apoptotischen Zellen vermindert exprimiert wurden. Es handelt sich um Aktin, Myeloid-Related Protein-8 und 14 (MRP-8, MRP-14) sowie um alpha-Enolase und Katalase.


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Humane neutrophile Granulozyten haben eine kurze Lebenszeit und eine hohe Bildungsrate. Etwa 1011 Granulozyten werden täglich aus dem Knochenmark in die Blutzirkulation ausgeschüttet (Athens, 1961). Die Lebensspanne wird durch den Einfluß verschiedener extrazellulärer Signale reguliert. Apoptose spielt hierbei eine zentrale Rolle. Humane neutrophile Granulozyten von gesunden Spendern unterziehen sich der spontanen Apoptose, wenn sie unter günstigen Bedingungen wie physiologischem pH, Anwesenheit von Serum etc, kultiviert werden (Savill, 1989). Für diese konstitutive Apoptose sind keine externen Stimuli notwendig. Es entwickeln sich die von Kerr et al. charakterisierten typischen morphologischen Veränderungen der Apoptose (Kerr, 1972), die wir in unseren Untersuchungen ausführlich beschrieben haben. Bei der Kultivierung lassen sich über einen Beobachtungszeitraum von 24 Stunden weder signifikante Zellverluste noch wesentliche Zellnekrosen nachweisen. Wir bevorzugten dieses Apoptose-Modell gegenüber Modellen der stimulierten Apoptose. In einer Reihe von Untersuchungen wurden mehr oder weniger physiologische Stimuli zur Induktion der Apoptose verwendet. Dieses Vorgehen macht es schwierig, die beobachteten intrazellulären Ereignisse als Apoptose-assoziiert einzuordnen. Strukturelle und funktionelle Veränderungen können in solchen Systemen Stimulus-spezifisch und dabei aber Apoptose-unabhängig auftreten.

Um tatsächlich die Proteinexpression neutrophiler Granulozyten zu untersuchen und nicht die kontaminierender Zellen, haben wir eine hoch-reine Präparation hergestellt. Konventionelle Dichte-Gradienten-Techniken ergeben Präparationen neutrophiler Granulozyten, die mit Eosinophilen kontaminiert sind. Wir fanden 4,1% Eosinophile in unseren Präparationen und konnten diesen Anteil durch die Anwendung des magnetischen Sortings auf ca 1% reduzieren. Wir befinden uns damit in Übereinstimmung zu den in der Literatur veröffentlichten Daten (Martin, 1997; Zahler, 1997). Nach einer Inkubation der neutrophilen Granulozyten für 24 Stunden erfolgte in einem zweiten Schritt die Trennung apoptotischer und nicht-apoptotischer Zellen mit Hilfe eines diskriminierenden Antikörpers und magnetischer Teilchen. Die Verwendung eines Antikörpers gegen den FcgammaIII-Rezeptor (CD16) zur Unterscheidung apoptotischer und nicht-apoptotischer neutrophiler Granulozyten ist bereits von anderen Gruppen berichtet worden (Dransfield, 1994; Rossi, 1995; Homburg, 1995). Auf diese Weise wurde eine Anreicherung beider Sub-Populationen auf über 90% bewirkt. Die Protein-Expressionsmuster frisch isolierter neutrophiler Granulozyten sowie kultivierter nicht-apoptotischer und apoptotischer Zellen wurden mit der hochauflösenden zweidimensionalen Gelelektrophorese analysiert. Neutrophile Granulozyten müssen Proteine neu synthetisieren, um zu überleben. Hemmer der mRNA- und der Protein-Synthese führen zu einer Beschleunigung der basalen Apoptose (Cox, 1997). Aus diesem Grund interessierten wir uns besonders für solche Proteine, die nach der Kultivierung in den nicht-apoptotischen Zellen stärker exprimiert waren als in den frisch isolierten Zellen und die andererseits in den apoptotischen Zellen vermindert waren. Mit Hilfe verschiedener Proteinsequenzierungstechniken identifizierten wir Aktin, MRP-8, MRP-14, alpha-Enolase und Katalase.

Aktin ist ein Hauptbestandteil des Zytoskeletts neutrophiler Granulozyten und besitzt Bedeutung für eine Reihe zellulärer Funktionen, wie Zell-Motilität, die Fähigkeit zur Adhäsion, Phagozytose und Veränderungen der Zell-Gestalt (shape change) (rev. in Howard, 1994). Die Studien von Whyte et


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al. haben demonstriert, daß neutrophile Granulozyten im Prozeß der Apoptose wichtige Zytoskelett-Funktionen verlieren, wie die Fähigkeit, ihre Gestalt zu ändern (shape change), zu degranulieren und auf chemotaktische Reize zu migrieren (Whyte, 1993). Es ist kürzlich gezeigt wurden, daß Aktin ein in vitro-Substrat für Caspasen darstellt (Mashima, 1997; Kayalar 1996). Caspasen sind Zystein enthaltende, Aspartat-spezifische Proteasen, die in der Ausführung der Apoptose eine zentrale Rolle spielen (reviewed in Thompson, 1995; Alnemri, 1996; Martin, 1995; Yuan, 1993). Über die Rolle der Caspasen für die in vivo -Prozessierung von Aktin existieren widersprüchliche Daten (Song, 1997; Mashima, 1997). Brown et al. fanden während der spontanen Apoptose neutrophiler Granulozyten eine Verminderung der Expression von Membran-assoziiertem Aktin und das gleichzeitige Auftreten von Aktinfragmenten (Brown, 1997). Sie konnten zeigen, daß Aktin dabei kein direktes Substrat für ICE-ähnliche Caspasen war. Die Hemmung von Calpain führte zu einer gleichzeitigen Inhibierung der Aktinspaltung und der Apoptose. Während die Untersuchungen von Brown et al. an einer gemischten Population apoptotischer und nicht-apoptotischer neutrophiler Granulozyten durchgeführt wurde, konnten wir durch die getrennte Analyse beider Populationen erstmals eindeutig demonstrieren, daß intaktes Aktin in nicht-apoptotischen Zellen erhöht und in apoptotischen Zellen deutlich vermindert war. Unsere Befunde schlagen die Möglichkeit vor, daß der beobachtete Verlust an intaktem Aktin für den Verlust von Zytoskelett-Funktionen in apoptotischen neutrophilen Granulozyten verantwortlich ist. Ob Aktin über die Vermittlung der Zytoskelett-Funktionen hinaus eine Bedeutung für die Regulation der Apoptose besitzt, ist bisher nicht geklärt. Durch Girard et al. konnte gezeigt werden, daß Interleukin-4 und Interleukin-15 die de-novo-Synthese von Aktin induzieren und gleichzeitig die Apoptose neutrophiler Granulozyten verzögern (Girard, 1996; Girard, 1997). Die Tatsache, daß die Überexpression von Gelsolin, einem Aktin-regulierenden Protein, zur Hemmung der Apoptose führte, ist eine weitere Beobachtung, die unterstreicht, daß Aktin eine wichtige Rolle im Prozeß der Apoptose spielt (Ohtsu, 1997; Kothakota, 1997).

Es konnte in unseren Untersuchungen gezeigt werden, daß MRP-8 und MRP-14, zwei Calcium-bindende Proteine, mit einer hohen Expression in nicht-apoptotischen und einer geringen Expression in apoptotischen neutrophilen Granulozyten vorkommen. MRP-8 wurde verschiedendlich auch als L1 light chain, zystische Fibrose-Antigen (CFA), Calgranulin A oder p8 bezeichnet und MRP-14 als L1 heavy chain, Calgranulin B oder p14 (reviewed in Hessian, 1993). Beide Proteine formen in vivo heterodimerische Komplexe, Calprotectin genannt, und machen etwa 45% des zytosolischen Proteins von neutrophilen Granulozyten und etwa 1% von Monozyten aus (Edgeworth, 1991). MRP-8 und MRP-14 werden Zell-spezifisch in neutrophilen Granulozyten und Monozyten exprimiert und lassen sich nicht in anderen Zellen der hämatopoetischen Line (Zwadlo, 1986) nachweisen. Obwohl in den letzten Jahren eine Reihe von Untersuchungen zur Charakterisierung dieser Proteine durchgeführt wurden, sind die biologischen Funktionen letztlich bisher nicht geklärt. Die existierenden Daten zeigen, daß MRP-8 und MRP-14 Casein-Kinase I und II (CKII) inhibieren, die wiederum die RNA-Polymerase-Aktivität regulieren (rev. in Hessian, 1993). Es wurde spekuliert, daß die Blockierung von CKII über eine Limitierung der metabolischen Aktivität für die kurze Lebensspanne der terminal differenzierten neutrophilen Granulozyten


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bedeutsam sein könnte. Für eine Rolle bei der Reifung myeloischer Zellen spricht auch die Tatsache, daß MRP-8 und MRP-14 in der Promyelozyten-Linie HL-60 nur gering exprimiert sind und bei der Differenzierung dieser Zellen zu neutrophilen Granulozyten hochreguliert werden (Koike, 1992). Weitere biologische Effekte umfassen die Chemotaxis, die Steigerung der Zell-Adhäsion, die Hemmung der Gerinnungskaskade, eine antimikrobielle sowie eine wachstumshemmende Wirkung (Hessian, 1993; Yen, 1997; Murthy, 1993; Newton, 1998). Es wird darüber hinaus angenommen, daß MRP-8 und MRP-14 neben intrazellulären auch extrazelluläre Wirkungen besitzen. Beide Proteine co-lokalisieren mit Filamenten des Zytoskeletts (Roth, 1993), können während der Zell-Aktivierung zur Plasmamembran translozieren (Lemarchand, 1992) oder auch in den extrazellulären Raum sezerniert werden (Rammes, 1997; Lugering, 1997). Es konnte demonstriert werden, daß MRP-8/MRP-14-Komplexe den apoptotischen Zelltod in einer Leukämie-Linie induzieren können (Yui, 1997). Wir fanden eine hohe Expression von MRP-8 und MRP-14 in nicht-apoptotischen und eine geringe Expression in apoptotischen neutrophilen Granulozyten. Es wäre denkbar, daß MRP-8 und MRP-14 von einer Subpopulation von Zellen abgegeben werden und durch einen autokrinen Mechanismus die Apoptose begünstigen. Die präzise Bedeutung der von uns beobachteten differentiellen intrazellulären Expression für die Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten muß in weiteren Studien definiert werden.

In den vorliegenden Untersuchungen wurde Katalase als ein weiteres Protein identifiziert, das während der spontanen Apoptose neutrophiler Granulozyten differentiell exprimiert wird. Eine erhöhte Katalase-Expression war in den nicht-apoptotischen Zellen zu beobachten, während eine geringe Expression in apoptotischen Zellen nachweisbar war. Katalase wirkt als Antioxidanz und spielt eine Rolle in der Homöostase des intrazellulären Redoxpotentials. Reaktive Sauerstoffradikale agieren als wichtige Mediatoren der Schädigung von Zellen. Verschiedene intrazelluläre Schutzmechanismen sind darauf ausgerichtet, die Produktion und die biologischen Effekte schädigender Oxidantien zu unterdrücken. Beispiele solcher Schutzmechanismen sind Enzyme wie Superoxiddismutase, Glutathion-Peroxidase und die bereits erwähnte Katalase. Darüberhinaus sind in den Zellmembranen verschiedene Antioxidantien lokalisiert, einschließlich Vitamin E und Quinone (Coenzym Q), während Vitamin C und Glutathione als wasserlösliche Antioxidanzien im Zytoplasma zu finden sind (rev. in Kroemer, 1995). In den letzen Jahren wurde erkannt, daß auch die anti-apoptotische Wirkung von Bcl-2 über Effekte auf Sauerstoffradikale vermittelt wird (Reed, 1994). Es ist an Orten nachweisbar, die Elektronentransport-Ketten enthalten, die für die Generation von reaktiven Sauerstoffradikalen notwendig sind (Hockenbery, 1990; Jacobson, 1993; Monaghan, 1992). Oxidativer Streß als Auslöser der Apoptose ist inzwischen in verschiedenen Zelltypen demonstriert worden (Greenlund, 1995; Hockenbery, 1993; Sandstrom, 1994; Enokido, 1993; Kane, 1993; Loo, 1993). In unseren Untersuchungen konnte die Bedeutung reaktiver Sauerstoffradikale bei der Apoptose neutrophiler Granulozyten nachgewiesen werden, diese Ergebnisse wurden bereits im vorherigen Abschnitt diskutiert. Eine Rolle von Wasserstoffperoxid bei der Vermittlung der Apoptose ist in verschiedenen Zellen, wie in Lymphozyten (Wesch, 1998; Furuke, 1997), humanen Mesangiumzellen (Sugiyama, 1996) und glatten Gefäßmuskelzellen (Li, 1997), demonstriert worden. Katalase bewirkt den Abbau von


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Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff und Wasser und besitzt somit eine potentielle anti-apoptotische Wirkung. Tatsächlich haben Untersuchungen an neutrophilen Granulozyten gezeigt, daß die Stimulation mit Immunkomplexen zu einer Beschleunigung der Apoptose führte und daß dieser Effekt durch Katalase verhindert werden kann (Gamberale, 1998). Die Inhibition der spontanen Apoptose neutrophiler Granulozyten durch Katalase wurde in zwei weiteren Untersuchungen demonstriert (Hannah, 1995; Kasahara, 1997). Unsere Ergebnisse zeigen eine erhöhte Katalase-Expression in den nicht-apoptotischen Zellen, während nur eine geringe Expression in apoptotischen Zellen beobachtet werden konnte. Eine hohe Expression dieses Enzyms stellt, im Einklang mit den Berichten aus der Literatur, einen wirksamen Schutz vor Oxidantien dar und hat somit anti-apoptotische Wirkung. Unsere Untersuchungen schlagen vor, daß die intrazelluläre Expression von Katalase einen wichtigen Mechanismus für die Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten darstellt.

4.2.3 Die Bedeutung von extrazellulären Matrix-Proteinen

Neutrophile Granulozyten spielen eine zentrale Rolle bei ANCA-assoziierten Vaskulitiden. Während der vaskulitischen Entzündungsreaktion verlassen neutrophile Granulozyten den Blutstrom und dominieren das frühe perivaskuläre Infiltrat (Donald, 1976; Jennette, 1991). Auf diesem Wege kommt es zum Kontakt mit extrazellulären Matrixproteinen. In den hier vorgelegten Untersuchungen wurde die Hypothese getestet, daß die Interaktion der Neutrophilen mit der Matrix zu einer Akzeleration der Apoptose führt. Die Resultate zeigen, daß extrazelluläre Matrix eine Steigerung der TNFalpha-vermittelten Apoptose bewirkt, während das spontane Apoptoseverhalten nicht signifikant beeinflußt wird. Studien zur intrazellulären Signaltransduktion demonstrierten eine kritische Rolle der Tyrosin-Phosphorylierung bei der Akzeleration der TNFalpha-vermittelten Apoptose durch Fibronektin. Mittels konfokaler Mikroskopie konnte demonstriert werden, daß die höchste Tyrosin-Phosphorylierung in den Kontaktstellen der Zellen mit der Matrix (focal adhesion sites) und im Zytoplasma auftrat. Wir identifizierten erstmalig Ly-GDI, einen Regulator von kleinen g-Proteinen der Ras-Superfamilie, als ein Substrat der Tyrosin-Phosphorylierung. Wir zeigen, daß Ly-GDI durch TNFalpha gespalten wird und daß diese Spaltung durch Fibronektin verstärkt wurde. Die spezifische Hemmung von Caspase-3 verhinderte die Spaltung von Ly-GDI und verminderte gleichzeitig die TNFalpha-vermittelte Apoptose.

Akute Entzündungen führen zur Rekrutierung und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten. Es kommt zur Adhäsion neutrophiler Granulozyten an das Endothel und zur nachfolgenden Transmigration in den perivaskulären Raum. Auf diesem Wege vollziehen sich vielfältige Interaktionen zwischen neutrophilen Granulozyten und extrazellulären Matrixproteinen. Diese Interaktionen können die Funktion neutrophiler Granulozyten beeinflussen. So konnte eine Steigerung der Produktion von Sauerstoffradikalen, der Phagozytose und der Degranulation neutrophiler Granulozyten durch die Adhäsion demonstriert werden (Nathan, 1989; Richter, 1990; Brown, 1988; Wade, 1983). Apoptose ist ein zentraler Mechanismus, der zur Auflösung örtlicher Entzündungen führt. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß die Adhäsion an Endothelzellen (Ginis, 1997), die transendotheliale Migration (Watson, 1997) und der Kontakt zu Thrombozyten


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(Andonegui, 1997) das Apoptoseverhalten neutrophiler Granulozyten beeinflussen. Wir zeigen erstmals, daß die TNFalpha-induzierte Apoptose durch den Kontakt der neutrophilen Granulozyten mit extrazellulären Matrixsubstanzen wie Fibronektin, Kollagen Typ I und Typ IV sowie Laminin akzeleriert wird. An Hand von Fibronektin konnte demonstriert werden, daß dieser Effekt nur durch die Interaktion mit immobilisierter Matrix auftrat, nicht aber, wenn neutrophile Granulozyten in Suspension mit löslichem Fibronektin, wie es im Plasma vorkommt, reagierten. Um dieses Phänomen besser zu verstehen, führten wir Untersuchungen zur Signaltransduktion durch. Die Signaltransduktion der Apoptose in neutrophilen Granulozyten ist bisher nur unzureichend verstanden. Eine kritische Rolle von PKC (Adachi, 1994) und Protein-Tyrosin-Phosphorylierung (Yousefi, 1994) (Downey, 1998) ist bei der Hemmung der Apoptose durch GM-CSF gezeigt wurden. Auch die durch Ligation des Fas-Rezeptors stimulierte Apoptose konnte durch Blockierung der Tyrosin-Phosphorylierung inhibiert werden (Liles, 1996). Unsere Ergebnisse demonstrieren die kritische Rolle der Tyrosin-Phosphorylierung bei der Fibronektin-vermittelten Akzeleration der TNFalpha-induzierten Apoptose in neutrophilen Granulozyten. Die Kultivierung der Zellen auf Fibronektin, gefolgt von der Behandlung mit TNFalpha, führte zu einem signifikanten Anstieg der Adhäsion und des Zell-Spreadings. Wir fanden eine stark erhöhte Tyrosin-Phosporylierung in den Kontaktstellen zwischen adhärierenden Zellen und Matrixsubstanz, den sog. focal adhesion sites. Interessanterweise konnte dabei beobachtetet werden, daß Genistein sowohl das Zellspreading als auch die Fibronektin-vermittelte Akzeleration der Apoptose inhibierte. Nachfolgende Versuche waren auf die Identifizierung von Substraten der Tyrosin-Phosphorylierung gerichtet. Es wurde nachgewiesen, daß die Interaktion von Fibronektin mit TNFalpha-stimulierten neutrophilen Granulozyten zum Auftreten neuer Tyrosin-phosphorylierter Proteinbanden im Western-Blot führte. Durch den Einsatz der 2D-Gelelektrophorese und der Proteinsequenzierung konnte Ly-GDI als ein wichtiges Substrat dieser Tyrosin-Phosphorylierung identifiziert werden. Ly-GDI oder auch D4-GDI ist ein Protein mit einer Größe von 27 kDa. Ly-GDI reguliert über die Hemmung der Dissoziation von GDP den Aktivitätsstatus von GTP-Bindungsproteinen der Ras-Superfamilie. Ras-Proteine sind aktiv, wenn sie mit GTP besetzt sind und inaktiv, wenn GDP gebunden ist (Joneson, 1997; Quinn, 1995; Bokoch, 1993). Die spezifischen Proteine, die mit Ly-GDI in vivo stabile Komplexe formen, sind bisher nicht charakterisiert. Es wurde berichtet, daß Ly-GDI durch PMA-Stimulation der Zellen phosphoryliert wird (Scherle, 1993; Gorvel, 1998). Diese Phosphorylierung fand vorwiegend an Threonin-Resten statt (Scherle, 1993). Unsere Daten zeigen eine Matrix-vermittelte Tyrosin-Phosphorylierung von Ly-GDI in TNFalpha-stimulierten neutrophilen Granulozyten. Die Aminosäuresequenz zeigt 7 Tyrosine an den Positionen 24, 48, 107, 125, 130, 146 und 172. Es wird spekuliert, daß die Phosphorylierung zu einer Verbesserung des Transfers von Ly-GDI-Komplexen zur Zellmembran führt (Gorvel, 1998). Die Charakterisierung der Tyrosinkinase, die zur Phosphorylierung von Ly-GDI führt, sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.

Die Stimulation der neutrophilen Granulozyten mit TNFalpha bewirkt eine progressive, zeitabhängige Spaltung von intaktem Ly-GDI, wobei ein 23-kDa-Spaltprodukt generiert wird. Ly-GDI weist zwei Angriffsstellen für Caspasen auf. Die Rolle dieser Cystein-enthaltenden Aspartat-spezifischen


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Proteasen (Caspasen) in der Ausführung der Apoptose ist in verschiedenen Systemen gezeigt worden. Caspase-3 (CPP32, Apopain, YAMA) spaltet intaktes Ly-GDI an der Spaltstelle DDDELD19SKLN und generiert dabei ein 23-kDa-Fragment, wohingegen Caspase-1 die LLGD55G Stelle spaltet, wodurch ein 19-kDa-Fragment entsteht (Na, 1996; Danley, 1996). Caspase-3 als wichtiges Mitglied der Cystein-Proteasen spielt eine Schlüsselrolle in der Ausführung der Apoptose. Das Enzym prozessiert Mitglieder seiner eigenen Familie, aber auch eine Reihe anderer Targetproteine, einschließlich Poly-(ADP-Ribose) Polymerase (PARP) (Kaufmann, 1993), FAK p125 (Wen, 1997) , Laminin B1 (Neamati, 1995), Topoisomerase 1 (Voelkel Johnson, 1995), U1-RNP (Casciola Rosen, 1994), DNA-dependent protein kinase (Casciola Rosen, 1995), zytosolische Phospholipase A2 (Wissing 1997), Proteinkinase C delta (Emoto, 1995), Gelsolin (Kothakota, 1997) und p21 activierte Kinase-2 (Rudel, 1997). Unsere Ergebnisse zeigen, daß die Stimulation neutrophiler Granulozyten mit TNFalpha zur Spaltung von intaktem Ly-GDI führt und daß diese Spaltung durch die Interaktion mit Fibronektin gesteigert wird. Die Spaltung war abhängig von der Aktivität der Caspase-3 und konnte durch den spezifischen Inhibitor z-DEVD-fmk gehemmt werden. Die Hemmung der Caspase-3 führt parallel dazu zu einer dosisabhängigen Inhibition der TNFalpha-vermittelten Apoptose. Es ist möglich, daß das generierte 23-kDa-Fragment für die Akzeleration der Apoptose auf Matrix verantwortlich ist. Ein weiterer Mechanismus könnte allerdings auch die durch die Spaltung bewirkte Inaktivierung des intakten Ly-GDI-Proteins sein. Für die letztere Hypothese spricht die Tatsache, daß gespaltenes Ly-GDI die Fähigkeit verliert, die Funktionen der Rho-GTPase zu regulieren (Danley, 1996). Die Resultate aus einem Modell einer Ly-GDI-K.O.-Maus zeigen eine kausale Bedeutung von Ly-GDI bei der Apoptose von Lymphozyten, die durch Wachstumsfaktorentzug induziert wurde (Yin, 1997).

Im Gegensatz dazu demonstrieren wir, daß ein 19-kDa-Fragment konstitutionell, auch in frisch isolierten Zellen, vorhanden ist. Dieses Fragment wird durch Caspase-1 generiert (Danley, 1996). Die Blockierung der Caspase-1 zeigte keine Dosis-Wirkungsbeziehung, wenn die TNFalpha-vermittelte Apoptose untersucht wurde.

Die in den vorgelegten Untersuchungen charakterisierten Signaltransduktionsereignisse sind in Abbildung 48 schematisch dargestellt.


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Abbildung 48: Schematische Darstellung der Signaltransduktion der Matrix-induzierten Akzeleration vonTNFalpha-vermittelter Apoptose in neutrophilen Granulozyten

Unsere Untersuchungen haben demonstriert, daß die Interaktion zwischen TNFalpha-stimulierten neutrophilen Granulozyten und extrazellulären Matrixproteinen zu einer Akzeleration der Apoptose führt. Analysen der zugrunde liegenden Signaltransduktion zeigen, daß die Tyrosin-Phosphorylierung von Ly-GDI, gefolgt von der gesteigerten Spaltung von Ly-GDI, neue, bisher unbekannte intrazelluläre Ereignisse bei der Matrix-akzelerierten Neutrophilen-Apoptose darstellen. Dieser Matrix-abhängige Mechanismus hat potentielle Bedeutung für die Kontrolle von lokalen Entzündungsreaktionen in vivo einschließlich derer bei ANCA-assoziierten Vaskulitiden. So wäre es denkbar, daß der selbstlimitierende Charakter örtlicher Entzündungsreaktionen durch die Steigerung der Apoptose im Gewebe unterstützt würde. Dabei würden mehr neutrophile Granulozyten apoptotische Signale auf ihrer Zelloberfläche exprimieren und phagozytiert werden. Da diese Phagozytose die Desintegration apoptotischer Neutrophiler verhindert, ohne zu einer Aktivierung der Phagozyten zu führen, wäre eine eine anti-entzündliche Wirkung die Folge. Im Gegensatz dazu könnte sich die Akzeleration der Apoptose in einem Tempo vollziehen, das zu einer Überforderung des "Abräumsystems" führt. Die Phagozyten könnten unter diesen Umständen mit der Generation apoptotischer neutrophiler Granulozyten nicht schritthalten. Aktivierte früh-apoptotische Zellen, die nicht beseitigt wurden, würden weiterhin Sauerstoffradikale generieren. Im spätapoptotischen Stadium würde es zum Zellzerfall kommen und dabei zur Freisetzung gewebeschädigender Bestandteile aus den Granula. Das letztere Szenario hätte eine proinflammatorische Wirkung und erinnert an die leukozytoklastische Vaskulitis bei Patienten mit ANCA-assoziierten Erkrankungen.


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Thu Apr 19 14:16:02 2001